一種魚源膠原蛋白抗凍多肽及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種魚源膠原蛋白抗凍多肽及其制備方法，以魚源膠原蛋白為原料，采用堿性蛋白酶對其進行酶解，分離純化、冷凍干燥得到抗凍多肽，氨基酸全序列為：Gly-Ala-Pro-Gly-Ala-Gln-Gly-Pro-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Met-Pro-Gly-Glu-Arg-Gly-Ala-Ala-Gly-Leu-Pro。本發明突破了國內外現存的抗凍蛋白（多肽）的研究思路和方法，克服從天然生物體中純化抗凍蛋白數量的局限性以及國際FDA組織對轉基因抗凍蛋白在食品應用中的安全性顧慮，獲得基于食品源的高效抗凍多肽，為開發基于食品源的抗凍多肽以及探索其在食品、醫學上的廣泛應用奠定理論基礎。
【專利說明】一種魚源膠原蛋白抗凍多肽及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種抗凍多肽，更具體地涉及了一種利用堿性蛋白酶酶解魚源膠原蛋白制備的抗凍多肽，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]食品和醫藥產品在低溫儲存和運輸過程中由于環境溫度的波動變化而反復地遭受冰晶生長和重結晶的問題越來越受到人們的關注。溫度的反復升降使冰晶不斷生長、凍融和重結晶，嚴重破壞細胞和組織結構而失去產品應有的品質。世界范圍內的科學家正面臨嚴肅的挑戰:如何控制冰晶生長及重結晶，實現低溫冷鏈上的冰晶生長控制，是制約眾多食品和醫藥廣品品質的關鍵所在。
[0003]抗凍蛋白，也稱“冰結構蛋白”，是一類附著在冰晶體表面而抑制冰晶的生長和重結晶的活性蛋白質。抗凍蛋白由于其具有控制冰晶生長、減少細胞損傷及保持產品原有組織結構、質地和品質的特點和突出意義而成為熱點研究主題。同樣的研究還表明，抗凍蛋白的抗凍活性片斷只存在于局部的特異多肽鏈結構域而并不是整體蛋白質在起作用，即使是純化了的抗凍蛋白，抗凍活性往往不高，仍然需要探究其活性域來進一步提高抗凍效率。所以，如何獲得食品源的結構緊湊的高活性抗凍多肽，就成為抗凍蛋白迫切的研究方向。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在 于提供一種魚源膠原蛋白抗凍多肽及其制備方法，突破了國內外現存的抗凍蛋白(多肽)的研究思路和方法，克服從天然生物體中純化抗凍蛋白數量的局限性以及國際FDA組織對轉基因抗凍蛋白在食品應用中的安全性顧慮，獲得基于食品源的高效抗凍多肽，為開發基于食品源的抗凍多肽以及探索其在食品、醫學上的廣泛應用奠定理論基礎。
[0005]為實現上述目的，本發明采用如下技術方案:
一種魚源膠原蛋白抗凍多肽的氨基酸序列為:Gly-Ala-Pr0-Gly-Ala-Gln-Gly-Pr0-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Met-Pro-Gly-Glu-Arg-Gly-Ala-Ala-Gly-Leu-Proo
[0006]制備如上所述的魚源膠原蛋白抗凍多肽的方法，以魚源膠原蛋白為原料，采用堿性蛋白酶對其進行酶解，分離純化、冷凍干燥得到抗凍多肽。
[0007]所述的魚源膠原蛋白包括來自魚皮、魚鱗的魚源膠原蛋白。
[0008]酶解條件為:pH值為9.0，溫度為45°C，時間為30分鐘，酶與底物的質量比為1:20。
[0009]所述分離純化的具體步驟為:酶解產物首先利用Sephadex G_50凝膠色譜進行分離，洗脫液為去離子水，流速為2mL/min，洗脫峰在225nm下進行測量；收集具有最佳抗凍活性的峰，再用Sulfopropyl-Sepadex C-25陽離子交換色譜進行分離,洗脫液為NaCl濃度梯度為0-0.5 M的0.01mol/L pH7.0的磷酸緩沖液，流速為0.5mL/min ;收集具有最佳抗凍活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色譜再進行進一步的分離，反相HPLC的分離條件是用體積分數為10%-90%的乙腈溶液作為洗脫液梯度洗脫，流速為lmL/min，收集體積分數為25%乙腈溶液處的洗脫峰。
[0010]本發明的顯著優點在于:本發明立足于抗凍蛋白的抗凍活性片斷只存在于特異的肽鏈結構域而不是整體蛋白質在起作用的理論基礎，以來自于魚源膠原蛋白為原材料，著眼于通過堿性蛋白酶的切割條件控制，切割為具有特定的肽鏈長度和結構域組成的活性多肽，而使抗凍活性得以高效地實現。本發明為開發基于食品源的抗凍多肽以及探索其在食品、醫學上的廣泛應用奠定理論基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1是純化魚皮膠原蛋白抗凍多肽的CLC - HPLC-C18色譜圖。
[0012]圖2是純化的特異性抗凍多肽對保加利亞乳酸桿菌的低溫保護作用；其中，圖中的A、B分別表示空白保加利亞乳酸桿菌、添加0.5% (w/w)特異性抗凍多肽樣品的保加利亞乳酸桿菌生長情況圖。
【具體實施方式】
[0013]明膠酶解條件的優化
本技術所采用的酶和魚(魚皮、魚鱗)膠原蛋白購自Sigma生物試劑公司(中國?上海，酶為堿性蛋白酶，型號為Alcalase2.4L)。采用單因素實驗，分別對三個酶解因素進行考察，分別為酶解溫度(37°C，45V和50°C )、酶解時間(10，20，30，40和60分鐘)以及酶-底物配比(1: 100，1:50，1:20，1:15 和 1:10 w/w)。稱取 1.65 克魚源膠原蛋白溶解于 6ml Mil1-Q水中，然后用2mol/L NaOH將其pH調節至9.0。先將該溶液水浴加熱到需要溫度，接著再按不同的酶-底物配比加入相應量的酶，按照預定的反應時間開始反應。接著再在沸水浴中滅酶10分鐘，冷卻后再IOOOrpm離心10分鐘。上清液收集后，分別對其抗凍活性進行測定，以確定最佳酶解條件。得到具有最大抗凍活性的酶解液的酶解條件是:酶解pH為pH7-10、溫度30-55°C、酶解時間為20-60分鐘、酶-底物配比為1:15-1:20 (w/w)。
[0014]酶解產物的分離、純化
先在最佳酶解條件下進行酶解，得到的酶解產物先經過Sephadex G-50凝膠色譜(長100cm,直徑2.6cm)進行分離,洗脫液為去離子水,流速為2mL/min,洗脫峰在225nm下進行測量。收集具有最佳抗凍活性的峰，再用Sulfopropyl-Sepadex C-25陽離子交換色譜(長55cm,直徑2.0cm)進行分離,洗脫液為NaCl濃度梯度為0-0.5 M的0.01mol/L pH7.0的磷酸緩沖液，流速為0.5mL/min。收集具有最佳抗凍活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色譜再進行進一步的分離，反相HPLC的分離條件是用10-90%乙腈溶液作為洗脫液，流速為lmL/min，得到高純度的特異性抗凍多肽。
[0015]抗凍活性的測試
本發明按照國際抗凍蛋白活性檢測的標準，建立抗凍活性檢測系統，如抗凍多肽對系列食品、細菌、細胞、活體等低溫凍融的保護作用。本發明抗凍活性采用檢測抗凍多肽對低溫凍融細菌的保護作用來測試。
[0016]將活化的保加利亞乳酸桿菌接種到液體培養基中37°C，130r/min培養過夜作為種子液，將種子液以1:100的比例接種到新的液體培養基中，37°C，130r/min搖床培養至OD600=L O左右。取若干1.5mL已滅菌的離心管，加入經過濾除菌的濃度為250 μ g/mL待測樣品900 μ L，將菌液稀釋IO4倍，吸取100 μ L加入至待測樣品中，混勻，涂布，37°C倒置培養18h，計菌落數。將剩余的樣品-菌液混合液置于_20°C低溫處理24h，取出融化并涂布，370C倒置培養18h，計菌落數，每組做兩個平行。然后根據公式2-1計算保加利亞乳酸桿菌的存活率。
【權利要求】
1.一種魚源膠原蛋白抗凍多肽，其特征在于:所述抗凍多肽的氨基酸序列為=Gly-Ala-Pro-Gly-Ala-Gln-Gly-Pro-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Met-Pro-Gly-Glu-Arg-Gly-Ala-Ala-Gly-Leu-Pro0
2.一種制備如權利要求1所述的魚源膠原蛋白抗凍多肽的方法，其特征在于:以魚源膠原蛋白為原料，采用堿性蛋白酶對其進行酶解，分離純化、冷凍干燥得到抗凍多肽。
3.根據權利要求2所述的魚源膠原蛋白抗凍多肽的制備方法，其特征在于:所述的魚源膠原蛋白包括來自魚皮、魚鱗的魚源膠原蛋白。
4.根據權利要求2所述的魚源膠原蛋白抗凍多肽的制備方法，其特征在于:酶解條件為:pH值為9.0，溫度為45°C，時間為30分鐘，酶與底物的質量比為1:20。
5.根據權利要求2所述的魚源膠原蛋白抗凍多肽的制備方法，其特征在于:所述分離純化的具體步驟為:酶解產物首先利用Sephadex G_50凝膠色譜進行分離，洗脫液為去離子水，流速為2mL/min，洗脫峰在225nm下進行測量；收集具有最佳抗凍活性的峰，再用Sulfopropyl-Sepadex C-25陽離子交換色譜進行分離，洗脫液為NaCl濃度梯度為0-0.5M的0.0lmol/L pH7.0的磷酸緩沖液，流速為0.5mL/min; 收集具有最佳抗凍活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色譜再進行進一步的分離，反相HPLC的分離條件是用體積分數為10%-90%的乙腈溶液作為洗脫液梯度洗脫，流速為lmL/min，收集體積分數為25%乙腈溶液處的洗脫峰。
【文檔編號】C07K1/20GK103467585SQ201310441147
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月25日 優先權日:2013年9月25日
【發明者】汪少蕓, 吳曉蘋, 饒平凡 申請人:福州大學