一種含易被氧化氨基酸的多肽的純化方法
【專利摘要】本發明涉及多肽純化領域，特別涉及一種含易被氧化氨基酸的多肽的純化方法。該純化方法包括：獲得粗肽，經前處理，得到第一粗肽溶液，經第一調節pH值至6.0～8.0，得到第二粗肽溶液；取第二粗肽溶液與還原劑混合，經第二調節pH值至4.0～7.0，經過濾、純化，即得；還原劑選自含有巰基的有機酸，含有硫離子或硫氫離子的酸或無機鹽，含有還原性金屬離子的無機鹽，含有亞硫酸根或亞硫酸氫根的無機鹽，或二氧化硫；易被氧化氨基酸為易發生氧化反應的氨基酸。本發明提供的純化方法可有效去除含有易被氧化氨基酸的多肽中的顏色，提高了藥品的質量，且提高了精肽的收率，操作簡單，成本低，適于工業化生產。
【專利說明】-種含易被氧化氨基酸的多化的純化方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及多膚純化領域，特別涉及一種含易被氧化氨基酸的多膚的純化方法。
【背景技術】
[0002] 乳腺癌是發生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤。全球乳腺癌發病率自20世紀70年代 末開始一直呈上升趨勢。乳腺癌中99%發生在女性，男性僅占1%。據國家癌癥中也和衛生 部疾病預防控制局2012年公布的2009年乳腺癌發病數據顯示；全國腫瘤登記地區乳腺癌 發病率位居女性惡性腫瘤的第1位，女性乳腺癌發病率全國合計約為42. 55/10萬，城市約 為51. 91/10萬，農村約為23. 12/10萬。目前乳腺癌已成為威脅女性身也健康的常見腫瘤。
[0003] 常見的治療乳腺癌的藥物包括醋酸甲輕孕麗片、甲睪麗片、希羅達、倍美力、戈舍 瑞林等。其中，戈舍瑞林是一種合成的十膚化合物，屬于促黃體生成素釋放激素的類似物， 長期使用可抑制垂體的促黃體生成激素的分泌，從而引起女性血清雌二醇的下降，達到治 療乳腺癌的作用。
[0004] 戈舍瑞林膚序中具有色氨酸殘基，色氨酸極易被氧化而產生非常明顯的顏色，一 般為紅色或紫紅色。采用固相合成法、液相合成法合成戈舍瑞林粗膚時，由于合成過程較為 復雜，會用到多種縮合劑和催化劑，因此膚序中的色氨酸殘基易被氧化而使產品帶有紅色 或紫紅色，影響戈舍瑞林藥物的質量。其它的含有色氨酸等易被氧化氨基酸的多膚類藥物 在合成時也會發生不同程度的氧化而使產品帶有顏色，因此在合成含有易被氧化氨基酸的 多膚類藥物過程中，需要去除顏色W保證藥品的質量。一般采用采用HPLC純化法和活性炭 吸附法將氧化雜質去除。在利用HPLC純化法去除顏色時，由于氧化并沒有使整個膚序列發 生變化，其性質與被氧化前差別很小，因此需要多次HPLC純化才能將顏色去除，導致產品 的收率較低；在利用活性炭吸附法去除顏色時，由于活性炭的吸附作用不具備選擇性，在吸 附顏色的同時，還會吸附目標產物，一旦吸附上目標產物就很難解離下來，導致目標產物的 收率偏低，該種情況對于分子量在2000 W下的多膚尤為明顯。因此，提供一種既能有效去 除多膚產品中的顏色，又能保證產品的收率較高的多膚純化方法具有重要的現實意義。
【發明內容】
[0005] 有鑒于此，本發明提供了一種含易被氧化氨基酸的多膚的純化方法。該方法通過 調整粗膚溶液的抑值至6. 0?8. 0,再加入還原劑，從而可去除粗膚溶液中的顏色，且提高 了精膚的收率。
[0006] 為了實現上述發明目的，本發明提供W下技術方案：
[0007] 本發明提供了一種含易被氧化氨基酸的多膚的純化方法，包括如下步驟：
[0008] 獲得粗膚，經前處理，得到第一粗膚溶液，經第一調節pH值至6. 0?8. 0,得到第二 粗膚溶液；
[0009] 取第二粗膚溶液與還原劑混合，經第二調節抑值至4. 0?7. 0。
[0010] 還原劑選自含有琉基的有機酸，含有硫離子或硫氨離子的酸或無機鹽，含有還原 性金屬離子的無機鹽，含有亞硫酸根或亞硫酸氨根的無機鹽，或二氧化硫；
[0011] 易被氧化氨基酸為易發生氧化反應的氨基酸。
[0012] 多膚作為藥物，具有生理活性強、免疫原性低、療效高等諸多優點，但多膚類物質 自身固有的特點如口服利用率較低、酶降解性高W及半衰期極短等，使其作為藥物的開發 應用受到諸多的局限。而導致多膚藥物不穩定的一個重要原因就是含有易被氧化氨基酸 的多膚極易被氧化。含有易被氧化氨基酸的多膚在合成過程中被氧化后會致使多膚帶有顏 色，影響多膚產品的質量，因此需要去除被氧化的多膚。本發明提供了一種利用還原劑的還 原性質去除被氧化的多膚的方法，并提供了還原劑的種類，還提供了被氧化的多膚與還原 劑反應時適宜的抑值范圍，本發明提供的純化方法可避免多膚被過度的還原，不會破壞多 膚的結構，保持了多膚原有的活性。為了避免多膚被過度的還原，多膚的結構不會被破壞， 保持多膚原有的活性作用，作為優選，還原劑選自含有琉基的有機酸，含有硫離子或硫氨離 子的酸或無機鹽，含有還原性金屬離子的無機鹽，含有亞硫酸根或亞硫酸氨根的無機鹽，或 二氧化硫。
[0013] 不同種類的氨基酸穩定性有很大差別，有些氨基酸含有易被氧化的結構，在自然 膽存條件下，容易發生氧化反應，該些易被氧化的氨基酸包括色氨酸、酪氨酸、半脫氨酸、蛋 氨酸等。
[0014] 在本發明提供的一些實施例中，含易被氧化氨基酸的多膚為含有色氨酸的多膚， 但含易被氧化氨基酸的多膚并不局限于含有色氨酸的多膚，只要是本領域技術人員認可的 含易被氧化氨基酸的多膚均在本發明的保護范圍之內，本發明在此不做限定。
[0015] 在本發明提供的一些實施例中，含易被氧化氨基酸的多膚為戈舍瑞林。
[0016] 在本發明提供的一些實施例中，含有琉基的有機酸為半脫氨酸或還原型谷脫甘 膚，但本領域技術人員認為可行的含有琉基的有機酸均在本發明的保護范圍之內，含有琉 基的有機酸種類并不局限于此，本發明在此不做限定。
[0017] 在本發明提供的一些實施例中，含有硫離子或硫氨離子的酸為氨硫酸，但本領域 技術人員認為可行的含有硫離子或硫氨離子的酸均在本發明的保護范圍之內，含有硫離子 或硫氨離子的酸種類并不局限于此，本發明在此不做限定。
[0018] 在本發明提供的一些實施例中，含有硫離子的無機鹽為硫化軸，但本領域技術人 員認為可行的含有硫離子的無機鹽均在本發明的保護范圍之內，含有硫離子的無機鹽種類 并不局限于此，本發明在此不做限定。
[0019] 在本發明提供的一些實施例中，含有硫氨離子的無機鹽為硫氨化軸，但本領域技 術人員認為可行的含有硫氨離子的無機鹽均在本發明的保護范圍之內，含有硫氨離子的無 機鹽種類并不局限于此，本發明在此不做限定。
[0020] 在本發明提供的一些實施例中，含有還原性金屬離子的無機鹽為含亞鐵離子的無 機鹽或含亞銅離子的無機鹽，但本領域技術人員認為可行的含有還原性金屬離子的無機鹽 均在本發明的保護范圍之內，含有還原性金屬離子的無機鹽種類并不局限于此，本發明在 此不做限定。
[0021] 在本發明提供的一些實施例中，含亞鐵離子的無機鹽為硫酸亞鐵或氯化亞鐵，但 本領域技術人員認為可行的含亞鐵離子的無機鹽均在本發明的保護范圍之內，含亞鐵離子 的無機鹽種類并不局限于此，本發明在此不做限定。
[0022] 在本發明提供的一些實施例中，含亞銅離子的無機鹽為硫酸亞銅或氯化亞銅，但 本領域技術人員認為可行的含亞銅離子的無機鹽均在本發明的保護范圍之內，含亞銅離子 的無機鹽種類并不局限于此，本發明在此不做限定。
[0023] 在本發明提供的一些實施例中，含有亞硫酸根的無機鹽為亞硫酸軸或亞硫酸鐘， 但本領域技術人員認為可行的含有亞硫酸根的無機鹽均在本發明的保護范圍之內，含有亞 硫酸根的無機鹽種類并不局限于此，本發明在此不做限定。
[0024] 在本發明提供的一些實施例中，含有亞硫酸氨根的無機鹽為亞硫酸氨軸或亞硫酸 氨鐘，但本領域技術人員認為可行的含有亞硫酸氨根的無機鹽均在本發明的保護范圍之 內，含有亞硫酸氨根的無機鹽種類并不局限于此，本發明在此不做限定。
[0025] 為了保證被氧化的多膚充分去除，使多膚的顏色消失或變淺，提高多膚產品的質 量，在本發明提供的一些實施例中，還原劑與粗膚的質量比為（5?30) :100。
[0026] 作為優選，還原劑與粗膚的質量比為1:10。
[0027] 在本發明提供的一些實施例中，還原劑需配制成還原劑溶液使用，作為優選，還原 劑溶液的質量體積濃度為lOg/L。
[0028] 為了保證還原劑與第二粗膚溶液混合均勻，使被氧化的多膚充分被還原，在本發 明提供的一些實施例中，混合的時間為2?5min。
[0029] 在本發明提供的一些實施例中，第一粗膚溶液的抑值小于6. 0,為了保證還原劑 能夠很好的發揮還原作用，需要調節第一粗膚溶液的抑值至6. 0?8. 0,作為優選，第一調 節抑值采用的試劑為堿溶液。
[0030] 作為優選，第一調節抑值采用的堿溶液中的堿為易溶于水的堿。
[0031] 在本發明提供的一些實施例中，第一調節抑值采用的堿溶液中的堿為氨水、氨氧 化軸或氨氧化鐘。但本領域技術人員認為可行的易溶于水的堿均在本發明的保護范圍之 內，易溶于水的堿的種類并不局限于此，本發明在此不做限定。
[0032] 在本發明提供的一些實施例中，堿溶液的質量百分濃度為5%?40%。
[0033] 在本發明提供的一些實施例中，純化方法中的前處理為將粗膚溶解、稀釋。
[0034] 在本發明提供的一些實施例中，前處理中將粗膚溶解、稀釋具體操作為；將醋酸、 己膳和水混合，獲得混合溶劑；將粗膚溶解于混合溶劑中，再加入水進行稀釋，得到第一粗 膚溶液。
[00巧]在本發明提供的一些實施例中，將醋酸、己膳和水混合后獲得的混合溶劑中，醋 酸、己膳與水的體積比為（6?12): (1?4): (4?13)。
[0036] 在前處理中將粗膚溶解于混合溶劑后粗膚的質量體積濃度優選為20?50g/L。
[0037] 在本發明提供的一些實施例中，將粗膚溶解于混合溶劑后粗膚的質量體積濃度為 20 ?25g/L。
[0038] 在多膚的純化方法中，粗膚經溶解、稀釋后得到第一粗膚溶液，作為優選，第一粗 膚溶液的質量體積濃度為2?45g/L。
[0039] 在本發明提供的一些實施例中，第一粗膚溶液的質量體積濃度為5?14. 3g/L。
[0040] 在本發明提供的一些實施例中，過濾操作后的純化具體采用HPLC系統純化，流動 相A為0. 1%TFA水溶液，流動相B為己膳，按照B%為18%?38%、40min的梯度洗脫分段收 集樣品。
[0041] 在本發明提供的另一些實施例中，過濾操作后的純化具體采用HPLC系統純化，流 動相A為0. 1%TFA水溶液，流動相B為己膳，按照B%為25%?45%、40min的梯度洗脫分段 收集樣品。
[0042] 本發明提供了一種含易被氧化氨基酸的多膚的純化方法，該純化方法包括；獲得 粗膚，經前處理，得到第一粗膚溶液，經第一調節抑值至6. 0?8. 0,得到第二粗膚溶液；取 第二粗膚溶液與還原劑混合，經第二調節抑值至4. 0?7. 0,經過濾、純化，即得；還原劑選 自含有琉基的有機酸，含有硫離子或硫氨離子的酸或無機鹽，含有還原性金屬離子的無機 鹽，含有亞硫酸根或亞硫酸氨根的無機鹽，或二氧化硫；易被氧化氨基酸為易發生氧化反應 的氨基酸。利用本發明提供的純化方法可有效去除含有易被氧化氨基酸的多膚中的顏色， 提高了藥品的質量；利用本發明提供的方法獲得的精膚收率可達90. 9%，而利用活性炭吸 附去除顏色的方法獲得的精膚收率只有43. 1%，利用HPLC純化去除顏色的方法獲得的精膚 收率只有49. 8%，表明本發明提供的純化方法大大提高了精膚的收率。由此可見，本發明提 供的純化方法可有效去除含有易被氧化氨基酸的多膚中的顏色，提高了藥品的質量，且提 高了精膚的收率，操作簡單，成本低，適于工業化生產。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0043] 圖1示實施例1提供的戈舍瑞林的質譜圖。
【具體實施方式】
[0044] 本發明公開了一種含易被氧化氨基酸的多膚的純化方法，本領域技術人員可W借 鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域 技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過 較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和范圍內對本文所述 的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0045] 本發明提供的含易被氧化氨基酸的多膚的純化方法中所用試劑或原料均可由市 場購得。
[0046] 下面結合實施例，進一步闡述本發明：
[0047] 實施例1戈舍瑞林粗膚的制備
[004引將lOg替代度為0. 7mmol/g的Sieber Resin,加入到固相反應柱中，加入DCM溶脹 樹脂30min后，用20%脈巧/DMF溶液兩次去除Fmoc保護，時間分別為lOmin和15min。DMF 洗涂六次，將12g N，N-二玻巧醜亞胺碳酸醋用20血DMF溶解，加入0. 51g DMAP冰水浴預 活化5min，加入固相反應器中，室溫反應2.化。反應終點W巧H麗法檢測為準。反應結束 后DMF洗涂6次，加入25血DMF作為溶劑，慢慢加入14. 1血水合脫，室溫反應3h，反應結束 后，DMF洗涂6次。
[004引 將1. 15g Fmoc-Pro-OH，4. 86g冊At在冰浴情況下溶于DMF中，加入上述樹脂中反 應平衡lOmin后，加入5. 6血DIC，室溫反應化。DMF洗涂3次后，DCM洗3次，用甲醇收縮 3 次，時間分別為 3min、5min、8min，得到11.9gFmoc-P;ro-Azagl5f-SieberResin，檢測替代 度為 0. 495mmol/g。
[0050]稱取 20. 2g 替代度為 0. 495mmol/g 的 Fmoc-Pr〇-Azagl5f-Sieber Resin (lOmmol) 加入反應器中，用DCM溶脹0.化，再用20%脈巧/DMF兩次去除Fmoc保護，時間分別為lOmin 和 15min。洗涂后連接 Fmoc-Arg(N〇2)-〇H。將 12. 9g Fmoc-Arg(N〇2)-〇H，4. 9g 冊Bt，6. 1 血 Die溶于DCM中（可W加入少量DMF助溶)，冰水浴活化5min后，加入固相反應器中，室溫反 應化。反應終點W巧H麗法檢測為準。按照上述連接Fmoc-Arg (N02) -0H的方法依次偶聯 Fmoc-Leu-〇H、Fmoc-D-Ser (tBu) -〇H、Fmoc-Tyr 炬 zl) -〇H、Fmoc-Ser (Trt) -〇H、Fmoc-Trp-〇H、 Fmoc-His (ht) -〇H、Pyr-〇H，得到序列如SEQ ID NO ; 1所示的膚樹脂37. 2g，其序列為Pyr-H is (T;rt)-化p-Ser (Trt) -Tyr 炬zl) -D-Ser (tBu) -Leu-Arg (N02) -Pro-AzaGly-Sieber Resin。 [005。 配制裂解試劑380mU其中H氣己酸38111以水19mL，0〔1323111以在-5°C的條件下預 冷30min ;將上述膚樹脂37. 2g加入到500mL圓底燒瓶中，將裂解試劑加入到上述圓底燒瓶 中，攬拌的同時冰水浴，通入氮氣。反應30min后撤走冰浴，室溫下繼續反應2h。過濾樹脂， 收集濾液。用少量DCM洗涂樹脂，合并濾液。減壓濃縮到60mU將濃縮液緩慢加入600mL冰 己離中沉淀，離也，冰己離洗涂5次，減壓干燥得到序列如SEQ ID NO ;1所示的粗膚16. 2g， 其序列為 Pyr-His-T;rp-Se;r-Ty;r 炬zl) -D-Ser (tBu) -Leu-Arg(N02) -Pro-Azagly-NHg。
[005引將上述粗膚16. 2g溶到160血4. 4%甲酸甲醇溶液中，16. 2gl0%把碳，室溫反應 0. 5h，檢測原料消失，濾掉把碳，濾液檢驗濃縮至30mL，加入到500血冰己離沉淀，離也，干 燥，得到序列如SEQ ID NO ;1所示的戈舍瑞林粗膚11. Og，顏色呈紅色，粗膚收率86. 7%， HPLC純度93. 7%，戈舍瑞林粗膚中戈舍瑞林精膚的含量為5. 28g，由質譜確定結構為Pyr-Hi s-T;rp-Se;r-Ty;r-D-Se;r (tBu) -Leu-Arg-Pro-Azagly-NHs,其質譜數據為 1269. 7,質譜圖見圖 10
[0053] 實施例2戈舍瑞林精膚的制備
[0054] 按體積比6/1/13的比例配制醋酸、己膳和水的混合溶劑500ml，取實施例1制得的 戈舍瑞林粗膚lOg溶解于200血上述混合溶劑中，加入500血水進行稀釋，得到質量體積濃 度為14. 3g/L的戈舍瑞林第一粗膚溶液。滴加質量百分濃度為30%的氨水溶液，調節戈舍 瑞林第一粗膚溶液的抑值至7. 0,得到戈舍瑞林第二粗膚溶液。
[0055] 向上述戈舍瑞林第二粗膚溶液中加入200mL10g/L的亞硫酸軸溶液，攬拌4min，顏 色由紅色轉為淡黃色。滴加醋酸調節抑值至6. 0,過濾，將經過上述處理的戈舍瑞林第二粗 膚溶液上HPLC系統純化，流動相A為0. 1%TFA水溶液，流動相B為己膳，按照B%為18%? 38%、40min的梯度洗脫分段收集樣品，檢測純度，即得到純度為99%的戈舍瑞林精膚溶液， 戈舍瑞林精膚溶液中戈舍瑞林精膚的含量為4. 36g，收率為90. 8%。
[0056] 實施例3戈舍瑞林精膚的制備
[0057] 按體積比4/1/5的比例配制醋酸、己膳和水的混合溶劑500ml，取實施例1制得的 戈舍瑞林粗膚lOg溶解于400血上述混合溶劑中，加入600血水進行稀釋，得到質量體積濃 度為lOg/L的戈舍瑞林第一粗膚溶液。滴加質量百分濃度為10%的氨氧化軸溶液，調節戈 舍瑞林第一粗膚溶液的抑值至6. 0,得到戈舍瑞林第二粗膚溶液。
[0058] 向上述戈舍瑞林第二粗膚溶液中加入50mL10g/L的半脫氨酸溶液，攬拌5min，顏 色由紅色轉為淡黃色。滴加醋酸調節抑值至5. 5,過濾，將經過上述處理的戈舍瑞林第二粗 膚溶液上HPLC系統純化，流動相A為0. 1%TFA水溶液，流動相B為己膳，按照B%為25%? 45%、40min的梯度洗脫分段收集樣品，檢測純度，即得到純度為99. 1%的戈舍瑞林精膚溶 液，戈舍瑞林精膚溶液中戈舍瑞林精膚的含量為4. 22g，收率為87. 9%。
[0059] 實施例4戈舍瑞林精膚的制備
[0060] 按體積比3/1/1的比例配制醋酸、己膳和水的混合溶劑500ml，取實施例1制得的 戈舍瑞林粗膚lOg溶解于500mL上述混合溶劑中，加入1500mL水進行稀釋，得到質量體積 濃度為5g/L的戈舍瑞林第一粗膚溶液。滴加質量百分濃度為40%的氨氧化鐘溶液，調節戈 舍瑞林第一粗膚溶液的抑值至8. 0,得到戈舍瑞林第二粗膚溶液。
[0061] 向上述戈舍瑞林第二粗膚溶液中加入300mL10g/L的硫化軸溶液，攬拌2min，顏色 消失。滴加醋酸調節抑值至5. 7,過濾，將經過上述處理的戈舍瑞林第二粗膚溶液上HPLC 系統純化，流動相A為0. 1%TFA水溶液，流動相B為己膳，按照B%為18%?38%、40min的梯 度洗脫分段收集樣品，檢測純度，即得到純度為99. 3%的戈舍瑞林精膚溶液，戈舍瑞林精膚 溶液中戈舍瑞林精膚的含量為4. 31g，收率為90. 1%。
[0062] 實施例5戈舍瑞林精膚的制備
[006引按體積比3/1/1的比例配制醋酸、己膳和水的混合溶劑500ml，取實施例1制得的 戈舍瑞林粗膚lOg溶解于500mL上述混合溶劑中，加入lOOOmL水進行稀釋，得到質量體積 濃度為6. 7g/L的戈舍瑞林第一粗膚溶液。滴加質量百分濃度為20%的氨水溶液，調節戈舍 瑞林第一粗膚溶液的抑值至6. 5,得到戈舍瑞林第二粗膚溶液。
[0064] 向上述戈舍瑞林第二粗膚溶液中加入lOOmLlOg/L的氨硫酸，攬拌4. 5min，顏色由 紅色轉為淡黃色。滴加醋酸調節pH值至6. 3,過濾，將經過上述處理的戈舍瑞林第二粗膚溶 液上HPLC系統純化，流動相A為0. 1%TFA水溶液，流動相B為己膳，按照B%為25%?45%、 40min的梯度洗脫分段收集樣品，檢測純度，即得到純度為99. 2%的戈舍瑞林精膚溶液，戈 舍瑞林精膚溶液中戈舍瑞林精膚的含量為4. 26g，收率為90. 5%。
[0065] 實施例6戈舍瑞林精膚的制備
[0066] 按體積比4/1/5的比例配制醋酸、己膳和水的混合溶劑500ml，取實施例1制得的 戈舍瑞林粗膚lOg溶解于400mL上述混合溶劑中，加入600mL水進行稀釋，得到質量體積濃 度為lOg/L的戈舍瑞林第一粗膚溶液。滴加質量百分濃度為5%的氨氧化軸溶液，調節戈舍 瑞林第一粗膚溶液的抑值至7. 5,得到戈舍瑞林第二粗膚溶液。
[0067] 向上述戈舍瑞林第二粗膚溶液中加入250血lOg/L的氯化亞鐵溶液，攬拌2. 5min， 顏色由紅色轉為淡黃色。滴加醋酸調節抑值至5. 3,過濾，將經過上述處理的戈舍瑞林第二 粗膚溶液上HPLC系統純化，流動相A為0. 1%TFA水溶液，流動相B為己膳，按照B%為18%? 38%、40min的梯度洗脫分段收集樣品，檢測純度，即得到純度為99. 2%的戈舍瑞林精膚溶 液，戈舍瑞林精膚溶液中戈舍瑞林精膚的含量為4. 27g，收率為90. 5%。
[006引實施例7戈舍瑞林精膚的制備
[0069] 按體積比4/1/5的比例配制醋酸、己膳和水的混合溶劑500ml，取實施例1制得的 戈舍瑞林粗膚lOg溶解于400mL上述混合溶劑中，加入600mL水進行稀釋，得到質量體積濃 度為lOg/L的戈舍瑞林第一粗膚溶液。滴加質量百分濃度為25%的氨氧化鐘溶液，調節戈 舍瑞林第一粗膚溶液的抑值至7. 8,得到戈舍瑞林第二粗膚溶液。
[0070] 向上述戈舍瑞林第二粗膚溶液中加入250血lOg/L的亞硫酸，攬拌2. 5min，顏色消 失。滴加醋酸調節抑值至4. 0,過濾，將經過上述處理的戈舍瑞林第二粗膚溶液上HPLC系 統純化，流動相A為0. 1%TFA水溶液，流動相B為己膳，按照B%為25%?45%、40min的梯度 洗脫分段收集樣品，檢測純度，即得到純度為99. 1%的戈舍瑞林精膚溶液，戈舍瑞林精膚溶 液中戈舍瑞林精膚的含量為4. 38g，收率為90. 9%。
[0071] 對比例1戈舍瑞林精膚的制備
[0072] 取實施例1制得的戈舍瑞林粗膚lOg，利用活性炭吸附的方法對其進行純化，具體 操作為：按體積比4/1/5的比例配制醋酸、己膳和水的混合溶劑500ml，將戈舍瑞林粗膚溶 解于400mL上述混合溶劑中，加入600mL水進行稀釋，得到質量體積濃度為lOg/L的戈舍 瑞林第一粗膚溶液。加入lOg活性炭攬拌化，過濾，取濾液上HPLC系統純化，流動相A為 0. 1%TFA水溶液，流動相B為己膳，按照B%為25%?45%、40min的梯度洗脫分段收集樣品， 檢測純度，即得到純度為99. 1%的戈舍瑞林精膚溶液，戈舍瑞林精膚溶液中戈舍瑞林精膚 的含量為2. 07g，收率為43. 1〇/〇。
[0073] 對比例2戈舍瑞林精膚的制備
[0074] 取實施例1制得的戈舍瑞林粗膚lOg，利用HPLC純化的方法對其進行純化，具體操 作為：按體積比4/1/5的比例配制醋酸、己膳和水的混合溶劑500ml，將戈舍瑞林粗膚溶解 于400mL上述混合溶劑中，加入600mL水進行稀釋，得到質量體積濃度為lOg/L的戈舍瑞林 第一粗膚溶液。將戈舍瑞林第一粗膚溶液上HPLC系統純化，流動相A為0. 1%TFA水溶液， 流動相B為己膳，按照B%為25%?45%、40min的梯度洗脫分段收集樣品，檢測純度，純度在 99% W上的部分合并后加1. 5倍體積的水稀釋后得到第二溶液，將第二溶液再用此條件純 化一次得到第H溶液，將第H溶液用再進行HPLC系統純化，流動相A為0. 2%醋酸饋水溶液 (氨水調抑值6. 5)，流動相B為己膳，按照B%為26%?46%、40min的梯度洗脫分段收集樣 品，檢測純度，純度在99% W上的部分合并后加1. 5倍體積的水稀釋后得到第四溶液，將第 四溶液再用此條件純化一次檢測純度，得到無任何顏色的溶液，即得到純度為99. 3%的戈 舍瑞林精膚溶液，戈舍瑞林精膚溶液中戈舍瑞林精膚的含量為2. 39g，收率為49. 8%。
[0075] W上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本【技術領域】的普通技術人 員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可W做出若干改進和潤飾，該些改進和潤飾也應 視為本發明的保護范圍。
【權利要求】
1. 一種含易被氧化氨基酸的多肽的純化方法，其特征在于，包括如下步驟： 獲得粗肽，經前處理，得到第一粗肽溶液，經第一調節pH值至6. 0?8. 0,得到第二粗肽 溶液； 取所述第二粗肽溶液與還原劑混合，經第二調節pH值至4. 0?7. 0,經過濾、純化，即 得； 所述還原劑選自含有巰基的有機酸，含有硫離子或硫氫離子的酸或無機鹽，含有還原 性金屬離子的無機鹽，含有亞硫酸根或亞硫酸氫根的無機鹽，或二氧化硫； 所述易被氧化氨基酸為易發生氧化反應的氨基酸。
2. 根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述易被氧化氨基酸為色氨酸。
3. 根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述多肽為戈舍瑞林。
4. 根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述含有巰基的有機酸為半胱氨酸 或還原型谷胱甘肽。
5. 根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述含有硫離子或硫氫離子的酸為 氫硫酸。
6. 根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述含有硫離子的無機鹽為硫化鈉。
7. 根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述含有硫氫離子的無機鹽為硫氫 化鈉。
8. 根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述含有還原性金屬離子的無機鹽 為含亞鐵離子的無機鹽或含亞銅離子的無機鹽。
9. 根據權利要求8所述的純化方法，其特征在于，所述含亞鐵離子的無機鹽為硫酸亞 鐵或氯化亞鐵。
10. 根據權利要求8所述的純化方法，其特征在于，所述含亞銅離子的無機鹽為硫酸亞 銅或氯化亞銅。
11. 根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述含有亞硫酸根的無機鹽為亞硫 酸鈉或亞硫酸鉀。
12. 根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述含有亞硫酸氫根的無機鹽為亞 硫酸氫鈉或亞硫酸氫鉀。
13. 根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述還原劑與所述粗肽的質量比為 (5 ?30) : 100。
14. 根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述混合的時間為2?5min。
【文檔編號】C07K1/14GK104447942SQ201310416314
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月12日 優先權日:2013年9月12日
【發明者】趙忠衛, 劉建, 馬亞平, 袁建成 申請人:深圳翰宇藥業股份有限公司