新一代宮頸癌特異預警血漿蛋白的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一類新的宮頸癌特異預警血漿蛋白，所述蛋白選自下述中的一種或多種聯用：apoAI、apoE、ATIII、CLU、VIL1、mTOR。本發明公開的宮頸癌特異預警血漿蛋白以及聯用對宮頸癌的早期預警具有較高的特異性、靈敏度、準確度，是宮頸癌腫瘤早期預警和早期診斷的優異指標。
【專利說明】新一代宮頸癌特異預警血漿蛋白
【技術領域】
[0001]本發明涉及某種疾病的幾種特異預警血漿蛋白及其應用，屬于醫學領域。
【背景技術】
[0002]宮頸癌是婦科惡性腫瘤，在發展中國家婦女最為常見，且致死率高。我國宮頸癌的平均發病水平在全球雖處于低發狀態，但在局部地區發病率和死亡率卻一直居高不下。由于我國人口眾多，每年新發病例約13萬，占世界發病人數的28%，嚴重威脅著廣大婦女的身心健康。由于宮頸癌的患者主要以農牧民為主，約80.0%~90.0%的病例在中晚期被診斷，在住院時，多數患者已失去治療良機。早期診斷是有效治療宮頸癌或癌前病變的重要前提，可以大大降低宮頸癌的發生率和死亡率，宮頸癌的診斷方式是否快速、準確就成為很重要的瓶頸問題。目前，宮頸癌的診斷方式包括傳統的宮頸細胞涂片、陰道鏡檢查和液基細胞學檢查。由于宮頸癌發生具有多中心性，采用陰道鏡指導下的多點活檢，依然可能造成宮頸癌的漏診。
[0003]與上述方法相比,腫瘤生物標志物(tumor biomarker)是一類生物活性物質,不僅直接來自腫瘤組織或細胞，也可以由腫瘤形成相關的宿主體內新生物反應而產生，可能融入血液或其他體液循環，其含量與正常參考值存在顯著差異，表現為血漿蛋白質或代謝標志物，對腫瘤診治具有重大意義。
[0004]血漿蛋白質標志物是癌蛋白質組學(oncoproteomics)研究的重要內容和切入點，與腫瘤組織特異性標志物一起，形成腫瘤標志物體系，用于腫瘤診斷的鱗狀上皮癌相關抗原(squamous cell carcinoma associated antigern, SCC-Ag)在宮頸癌的輔助診斷、復發監測和預后判斷手段中發揮重要作用，應用越來越廣泛，但是已有的標志物在診斷宮頸癌病情上靈敏度和特異性并不高。因此，本領域尚需開展宮頸癌的基礎和臨床治療研究，利用蛋白質組學、基因組學等高通量分析手段系統篩查腫瘤標志物，建立特異、靈敏的早期診斷方法，是宮頸癌防治水平的關鍵。
【發明內容】
[0005]針對現有技術的缺陷，本申請發明人通過大量的實驗研究，采用二維液相色譜系統以等電聚焦作為樣品的預分離模式，通過在線的二維反相色譜分離進行偶聯，實現對復雜血清樣品的分離，從而建立宮頸病變各組患者之間的血漿蛋白質組差異表達譜，篩選出差異表達組分；平行地運用二維凝膠熒光電泳進行分離，得到差異蛋白位點，通過高分辨質譜技術鑒定其差異蛋白組分或者差異蛋白位點的蛋白成分，得到差異蛋白質名單，運用在線生物信息學軟件IPAO (Ingenuity Pathway Analysis)系統和MetaCore?對差異蛋白進行功能注釋與富集、調控網絡分析、生物功能分析以及生物標志物篩查，驗證分析確定了宮頸癌特異性血漿差異表達蛋白，對于提高宮頸癌的早期檢測、病情檢測、防治水平具有重要意義。
[0006]一種宮頸癌特異預 警血漿蛋白，所述蛋白選白下述蛋白中的一種或多種的聯用:apoA I (載脂蛋白A-1)、apoE (載脂蛋白E)、AT III (抗凝血酶III蛋白)、CLU(人凝聚素族集蛋白)、VILl (續毛蛋白I)、mTOR (雷帕霉素革巴蛋白)。
[0007] 申請人:對宮頸癌患者及癌前病變患者血漿，通過蛋白質組學分離與鑒定技術和生物信息學方法分析以及單一候選蛋白的驗證，得到了上述在宮頸癌患者血漿中具有特異性表達的血漿蛋白，對宮頸癌的診斷和檢測具有指標性價值。
[0008]為了更好的確診宮頸癌病情，本申請發明人還研究了將上述表達蛋白聯合使用用來檢測宮頸癌，優選的，下述幾個組合具有較好的靈敏度、準確度、特異度，所述蛋白選白mTOR 和 ATIII 組合，或 apoA Ι+mTOR 組合，或 mT0R、ATII1、apoAI 組合，或 ATIII+apoA I 組合，最優選的，所述蛋白選白mTOR和ATIII組合。[0009] 申請人:進行的實驗顯示上述的血漿蛋白可以用來早期診斷和預警宮頸癌的發生，并且評估宮頸癌的發展進程，對宮頸癌的治療療效也有輔助評估作用。因此，相應的本發明提供了上述宮頸癌特異預警血漿蛋白作為宮頸癌早期預警標記物的應用。
[0010]相應的，基于上述應用，本發明還公開了一種用于評估患者是否患有宮頸癌的方法，包括下述步驟:(I)檢測患者樣本中宮頸癌特異預警血漿蛋白的表達水平；(2)檢測正常對照組中宮頸癌特異預警血漿蛋白的表達水平；其中所用的標記物選白下述蛋白:apoA
1、apoE、AT II1、CLU、VILUmTOR中的一種或多種的組合；在患者和正常對照組之間標記物蛋白表達水平的差異表明患者患有宮頸癌的危險性。
[0011]由于上述的宮頸癌特異預警血漿蛋白在宮頸癌患者中特異表達，因此通過檢測患者與正常對照組的預警血漿蛋白表達水平差異或者聯合檢測水平即可評估患者是否患有宮頸癌或者患有宮頸癌的危險性。
[0012]由于宮頸癌的發生發展和病情演化進程會影響上述血漿蛋白的表達水平，因此通過檢測同一患者中這些血漿蛋白的表達水平變化或者聯合水平變化即可確定宮頸病變的進程和宮頸癌發生的危險性。
[0013]在本發明中，宮頸癌進程是指宮頸癌從早期的宮頸炎到宮頸上皮內瘤變I1-1II級到宮頸癌早期到宮頸癌晚期的整個病情的變化過程。
[0014]具體的，包括下述步驟:(1)在第一時間點檢測患者樣本中宮頸癌標記物蛋白的表達水平；(2)在隨后的時間點重復步驟(1) ；(3)比較步驟(1)和(2)中所檢測的宮頸癌早期預警標記物蛋白表達水平；其中apoA KATIII蛋白含量降低，或apoE、CLU、VILl、mT0R含量增高提示患者宮頸病變惡化、患有宮頸癌的危險性增加或者已經患有宮頸癌。
[0015] 申請人:通過實驗驗證了上述宮頸癌特異預警血漿蛋白與宮頸病變進程的相關性，因此可通過檢測不同時間的差異蛋白表達水平對宮頸癌的發生起到預警作用。
[0016]為了實現準確檢測，所述宮頸癌標記物蛋白檢測白外周血血漿標本。
[0017]進一步的，在上述基礎上，本發明提供了用于篩選得到宮頸癌特異預警血漿蛋白的方法，包括下述步驟:
[0018](I)分為三組，構建宮頸癌患者、CIN II / III患者與慢性宮頸炎患者的血漿蛋白樣品;
[0019](2)將血漿蛋白樣品進行蛋白質二維液相色譜分離與分析，得到宮頸癌患者的差異蛋白組分；
[0020](3)將差異蛋白組分經胰蛋白酶處理后進行液質聯用質譜分析得到候選分子標志物差異蛋白；
[0021](4)同時將血漿蛋白樣品運用差異熒光電泳聯合質譜技術，篩選出差異表達蛋白；
[0022](5)將候選分子標志物差異蛋白進行IPA生物信息學分析，生成候選生物標記物列表；
[0023](6)結合步驟(3)、(4)和(5)的結果，確定核心差異蛋白，將核心差異蛋白名單采用MetaCore數據庫進行分析，得到宮頸癌特異預警血漿蛋白。
[0024]為了進一步確證所篩選出的表達蛋白的活性，所述方法進一步還包括將所宮頸癌特異預警血漿蛋白進行ELISA法檢測確定含量變化。
[0025]本專利以宮頸癌高發人群新疆維吾爾族婦女宮頸病變患者血漿為對象，聯合運用多種蛋白質組學篩查技術和策略(2D-HPLC和2D DIGE)，旨在建立蛋白質組差異表達譜基礎上，篩選出宮頸癌及癌前病變特異性的血漿蛋白指標，豐富宮頸癌早期篩查與預警體系。利用系統生物學分支學科——生物信息學方法(IPA、MetaCore?)，針對血漿蛋白指標進行功能注釋與富集，構建功能網絡，尋找主要調控通路或途徑，進一步揭示宮頸病變的發生與發展的生物學本質，預測出一系列腫瘤及癌前病變特異性血漿蛋白標志物，從而最終得到能夠對宮頸癌具有指標性意義的特異血漿預警蛋白，為宮頸癌的預防和早期診療提供科學依據。
[0026] 申請人:進行的臨床檢測實驗結果顯示，本發明所公開的宮頸癌特異預警血漿蛋白的表達水平與宮頸病變具有極好的相關性，用來檢測宮頸病變，尤其是宮頸癌的發生發展、病情程度具有很好的靈敏度、 特異度和準確度。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1-圖6顯示了 apoA I蛋白表達含量、apoE蛋白表達含量、CLU蛋白表達含量、AT III蛋白表達含量、VILl蛋白表達含量、mTOR蛋白表達含量與宮頸病變進程之間的關系;
[0028]圖7-圖12顯示了 apoA I蛋白、apoE蛋白、CLU蛋白、AT III蛋白、VILl蛋白、mTOR蛋白的ROC曲線圖。
【具體實施方式】
[0029]在下述實施例中， 申請人:提供了本發明篩選過程的詳細操作，僅用于說明本發明技術方案如何更好地實現和得到本發明所屬宮頸癌特異預警血漿蛋白的研究過程，并非限制本發明的保護范圍，不采用下述方式而采用其它研究方法得到本發明的宮頸癌特異預警血漿蛋白依舊屬于本發明的保護范圍。任何熟悉本【技術領域】的技術人員在本發明披露的技術范圍內，可顯而易見地得到的技術方案的簡單變化或等效替換均落入本發明的保護范圍內。
[0030]以下是本發明宮頸癌特異預警血漿蛋白的篩選過程:
[0031]1.血漿蛋白組樣品的構建
[0032]取每一個患者血漿樣品取70 μ 1，將同一組患者血漿等體積混合，構建代表一組患者群體的血漿樣品，經三組患者群體的3次重復，制備9份樣品。[0033]1.1基于蛋白質富集柱技術制備低豐度蛋白組樣品
[0034]利用低豐度蛋白富集試劑盒(ProteoMiner Protein Enrichment Kit),運用六肽配體親和層析柱，特異性吸附，并制備血衆低豐度蛋白組(low abundant proteome)待測樣品。通過使用低豐度蛋白富集試劑盒，低豐度蛋白質相對得到了富集與濃縮。
[0035]1.2蛋白質富集柱子的預處理
[0036]富集層析柱裝在一個層析管中，有一個頂蓋和底蓋，在隨后的實驗過程中，這些蓋子被反復使用，不可棄去，其中底蓋倒置時，可以當塞子用，旋轉后，固定在層析柱的底部。首先，卸掉層析柱的頂蓋和底蓋，將層析柱置于一個無蓋的收集管，離心(1000rcf，2min,室溫)，棄去層析柱內的液體(保護液)。再加上底蓋，往柱子內加入Iml去離子水，加上頂蓋；將層析柱上下顛倒混勻5min。卸掉底蓋，置于一個無蓋的收集管中，離心(同上)棄去液體。然后，以Iml washbuffer代替去離子水，重復以上洗滌步驟。最后，經離心(同上)排除層析柱內的殘留wash buffer0加上底蓋后，可以用蛋白質樣品的預處理。
[0037]1.3層析柱與血漿蛋白質樣品的結合
[0038]血漿樣品中存在各種殘留物(細胞殘留或沉積物)，經離心(20000rpm，4°C，15min)棄去沉淀,將Iml血衆樣品加入至層析柱,在室溫條件下,動態混勻柱子2h。
[0039]1.4層析柱子(含血漿蛋白質)的洗滌處理
[0040]混勻后，卸掉底蓋，將層析柱(含血漿蛋白)置于一個無蓋的收集管，離心(1000rcf,2min,室溫)棄去離心后的液體,重復該離心步驟,棄去殘留液體。加上底蓋厚，加入Iml wash buffer,在加上頂蓋,上下顛倒混勻柱子5min。卸掉底蓋,經離心(同上)棄去收集液，以同樣的操作流程，反復使用wash buffer洗滌層析柱子(含血漿蛋白)兩次。
[0041]1.5血漿低豐度蛋白質組分的洗脫(制備)
[0042]采用wash buffer 一樣的步驟,使用Iml去離子水洗漆層析柱子(含血衆蛋白)，再離心一次,排除液體殘留。然后,加入100 μ I水化洗脫液(rehydrated elution reagent,加上頂蓋，并輕輕旋轉混勻5sec，在室溫下孵育15min，期間輕輕旋轉幾次。層析柱子(含血漿蛋白)置于戴蓋的收集管上，標記樣品名稱或編號，經離心(同上)保留被洗脫下來的血漿蛋白質樣品。重復以上樣品洗脫步驟兩次，每一次使用100 μ I水化洗脫液，共收集約300 μ I血漿蛋白質樣品，即低豐度蛋白質組樣品，可以在-20°c保存，或長期保存在-80°c，以備檢測。
[0043]1.6蛋白質濃度測定
[0044]采用BCA(Bicinchoninic acid, 二喹啉甲酸)蛋白質定量方法(Novagen),采用2500次微型測定(25 μ I蛋白樣品加上200 μ I反應試劑，可以在96孔板中進行高通量定量)。試劑盒包括:BCA反應液(0.1MNaOH緩沖的二喹啉甲酸，碳酸鈉，酒石酸鈉，碳酸氫鈉，pHll.25) 500ml>4% Cupric Sulfate (硫酸銅)15ml 和 2mg / ml 的 BSA (牛血清白蛋白)標準品3Xlml。此方法的原理基于雙縮脲反應，在堿性環境下蛋白質分子中的肽鍵結構能和Cu2+結合形成絡合物，同時將Cu2+還原成為Cu++。而BCA試劑可特異地與Cu+結合形成穩定的紫色復合物，在562nm處有高的光吸收值。吸光度值與蛋白質的濃度成正比，可根據吸光度值的大小來計算總蛋白含量，并求得三次測定的平均值。Novagen的BCA試劑盒具體步驟如下:
[0045](1)BSA濃度標準曲線的制備:[0046]下表是制備各稀釋梯度的BSA標準液的方法。每個標準液都需要使用一個新的試管，采用與蛋白樣品一樣的緩沖液來稀釋、配制BSA標準液。如果緩沖液中有干擾BCA法的成分，用去離子水替代樣品的緩沖液，用以配制BSA濃度梯度標準液做標準曲線。具體方法見下表:
[0047]附表1BCA蛋白質定量的標準曲線濃度梯度及試劑配制
【權利要求】
1.新一類宮頸癌特異預警血漿蛋白，其特征在于所述蛋白選自下述蛋白中的一種或多種聯用:apoA 1、apoE、AT II1、CLU、VILl、mTOR。
2.根據權利要求1所述的宮頸癌特異預警血漿蛋白，其特征在于所述蛋白選自mTOR和ATIII 組合，或 apoA I+mTOR 組合，或 mTOR、ATII1、apoA I 組合，或 ATIII+apoA I 組合。
3.權利要求1所述的宮頸癌特異預警血漿蛋白作為宮頸癌早期預警標記物的應用。
4.一種用于評估患者是否患有宮頸癌或者患有宮頸癌危險性的方法，其特征在于包括下述步驟:(I)檢測患者樣本中宮頸癌特異預警血漿蛋白的表達水平；(2)檢測正常對照組中宮頸癌特異預警血衆蛋白的表達水平；其中所用的標記物選自下述蛋白:apoA 1、apoE、AT II1、CLU、VIL1、mTOR中的一種或多種的組合；在患者和正常對照組之間標記物蛋白表達水平的差異表明患者患有宮頸癌或者患有宮頸癌的危險性。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述宮頸癌早期預警標記物蛋白檢測自外周血血漿標本。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于包括下述步驟:(I)在第一時間點檢測患者樣本中宮頸癌特異預警血漿蛋白的表達水平；(2)在隨后的時間點重復步驟(1) ；(3)比較步驟(1)和(2)中所檢測的宮頸癌特異預警血漿蛋白表達水平；其中apoA 1、ATIII蛋白含量降低，或apoE、CLU、VILU mTOR含量增高提示患有宮頸癌的危險性增高或者代表宮頸癌患者病變進程加速、病情惡化。
7.用于篩選宮頸癌特異預警血漿蛋白的方法，其特征在于包括下述步驟:(I)分為三組，構建宮頸癌患者、CIN II/III患者與慢性宮頸炎患者的血漿蛋白樣品；(2)將血漿蛋白樣品進行蛋白質二維液相色譜分離與分析，得到宮頸癌患者的差異蛋白組分；(3)將差異蛋白組分經胰蛋白酶處理后進行 液質聯用質譜分析得到候選分子標志物差異蛋白；(4)同時將血漿蛋白樣品運用差異熒光電泳聯合質譜技術，篩選出差異表達蛋白；(5)將候選分子標志物差異蛋白進行IPA生物信息學分析，生成候選生物標記物列表；(6)結合步驟(3)、(4)和(5)的結果，確定核心差異蛋白，將核心差異蛋白名單采用MetaCore?數據庫進行分析，得到宮頸癌特異預警血漿蛋白。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于進一步還包括將所得宮頸癌特異預警血漿蛋白進行ELISA法檢測確定含量變化，進行驗證。
【文檔編號】C07K14/47GK103570826SQ201310389347
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年8月30日 優先權日:2013年8月30日
【發明者】郭霞, 阿布力孜·阿布杜拉, 郝軼, 劉開江, 伊力努爾·沙比提, 瑪依拉·卡米力江, 阿娜古麗·阿巴白克里, 古扎麗努爾·阿不力孜, 迪麗米娜·伊拉木, 阿仙姑·哈斯木, 武貴臻, 希爾扎提江·蘇來曼, 熱孜宛古麗·約麥爾, 穆耶賽爾·伊敏, 吾尼且木·吐拉克 申請人:新疆醫科大學