棉花同源結構域轉錄因子基因GbHDTF1及應用的制作方法【專利摘要】本發明屬于植物基因工程領域，涉及從海島棉中分離得到一個調控棉花內源抗病相關激素茉莉酸合成和響應的基因GbHDTF1。該基因的cDNA序列如SEQ?ID?NO：1所示；其編碼蛋白質的序列如SEQ?ID?NO：2所示。還公開了含有SEQ?ID?NO.1所示序列的基因的表達載體，通過表達由上述核酸序列形成的雙鏈核酸分子并用于抑制棉花內源基因GbHDTF1的表達以促進茉莉酸的合成及響應。提供了含有表達載體的宿主細胞，其包括大腸桿菌和農桿菌。GbHDTF1基因具有調控棉花內源抗病相關激素茉莉酸合成和響應的功能，通過遺傳轉化可應用于抗黃萎病棉花新材料的培育。【專利說明】棉花同源結構域轉錄因子基因GbHDTFI及應用【
技術領域：
】[0001]本發明屬于植物基因工程領域。具體涉及ー種棉花同源結構域轉錄因子基因GbHDTFl的克隆及在控制棉花黃萎病中的應用。本發明通過采用轉錄組測序的方法，對棉花抗黃萎病反應相關基因的轉錄組分析，分離克隆的GbHDTFl基因為調控棉花抗病相關激素茉莉酸合成及響應的基因，能影響棉花對黃萎病的抗性。【
背景技術：
】[0002]棉花黃萎病被稱為棉花的“癌癥”，是由大麗輪枝菌和黑白輪枝菌引起的土傳真菌維管束病害。病原菌通過棉花根部侵染，引起葉片失綠變黃，萎蔫脫落，甚至造成植株死亡，嚴重威脅棉花產量及纖維品質。棉花黃萎病于1914年在美國被首次發現后，很快蔓延到世界上其他產棉國。隨著1935年從美國引種棉花黃萎病傳入中國，20世紀50-60年代在部分省份造成危害，20世紀90年代后，該病已經蔓延到全國各棉區，是目前危害我國棉花生產的主要病害之一，對棉花常年造成減產10-20%，嚴重時部分地區發病高達70%(簡桂良等，CurrentstatusandcountermeasureofVerticilliumwiltofcottoninChina.中國棉花，2003，(3):13-14)。近年來棉花黃萎病在我國發生日趨嚴重，特別是在黃河流域和新疆等主要棉產區大面積發生。長期的植物生產實踐表明選育和種植抗病棉花品種是防治棉花黃萎病的高效措施。但由于陸地棉抗黃萎病資源缺乏及田間抗病性鑒定結果受多種環境因素影響，傳統育種方法選育抗黃萎病品種進展緩慢，因此生產上還沒有高抗棉花黃萎病的品種大面積推廣應用。[0003]同源盒基因家族是ー類廣泛存在于各種真核生物體內的同源結構域轉錄因子，參與生物體的生長發育和對環境的響應。同源盒基因編碼的蛋白都包含ー個由60個氨基酸組成的DNA結合區域,稱為同源結構域或同源框(Homeodomain,HD)。同源結構域在三維結構上形成3個相鄰的a螺旋，其中第二個和第三個螺旋形成ー個螺旋-轉角-螺旋結構。根據氨基酸序列的相似性，植物體內的同源結構域轉錄因子可以分為14類(R.Derelle1P.Lopez,Homeodomainproteinsbelongtotheancestralmoleculartoolkitoieukaryotes.EvolDev，2007，(9):212-219)。[0004]茉莉酸(JA)是ー種脂肪酸源的信號分子，參與了植物花粉和種子的發育，以及對傷ロ、臭氧、昆蟲和病原微生物的防御反應(CreelmanRA,MulletJE.Biosyntnesisandactionofjasmonatesinplants.AnnRevPlantPhysio丄PlantMolBiolj1997，(48):355-381)。茉莉酸和乙烯(ET)參與不依賴SA的防衛反應。在這ー過程中硫素(thionin，Thil.2，一種含半胱氨酸的植物抗病蛋白)和防衛素(defensin，PDF1.2)會被誘導表達。PDF1.2受JA、ET和非寄主病原真菌(Alternariabrassicola)的誘導表達，但不受SA的誘導。同時發現在nprl和cprl(constitutivePRl)突變體中及NahG轉基因植株中PDF1.2的表達都不受影響，而在ein2和coil(coronatineinsensitivel)突變體中表達受到抑制，這些突變體對JA和ET是不敏感的。而11.2和1.2的表達模式相同。說明Thil.2和TOF1.2參與依賴JA和ET的系統抗病途徑是不同于依賴SA的SAR途徑，PDF1.2的表達需同時依賴于JA和ET(ReymondP，FarmerEE,Jasmonateandsalicylateasglobalsignalsfordefensegeneexpression.CurrOpinPlantBiol,1998，(I):404-411)。[0005]雖然在擬南芥及水稻中克隆到了許多茉莉酸相關的基因，但目前對于棉花，茉莉酸合成及其詳細調控網絡仍不是很清楚。本發明證明了GbHDTFl能參與調控棉花體內茉莉酸的合成以及下游信號的傳遞，從而參與棉花抗黃萎病。申請人:認為利用本發明的基因可通過調控激素響應來影響棉花對黃萎病菌的抗性，對創制抗黃萎病的棉花材料具有極其重要的理論和現實意義。【
發明內容】[0006]本發明的目的在于克服現有技術的不足，在前期研究工作中通過對海島棉(Gossypiumbarbadense)受黃萎病菌(Verticilliumdahliae)誘導的轉錄組進行分析的基礎上，克隆ー個可能參與棉花抗黃萎病反應的基因。通過氨基酸序列分析發現其具有同源結構域轉錄因子的特征，我們將該基因命名為GbHDTFl基因。通過病毒誘導的基因沉默(virus-1nducedgenesilencing,VIGS)技術,在陸地棉(Gossypiumhirsutum)中沉默GbHDTFl基因，表明該基因可調控棉花抗病激素茉莉酸(JA)合成及相關信號路徑，并增強棉花對黃萎病菌的抗性。[0007]本發明的另ー個目的在于提供了ー種用GbHDTFl基因進行高效轉化棉花的方法。還提供了ー種含有SEQIDNO:1所示序列基因的表達載體，該載體通過表達由上述核酸序列形成的雙鏈核酸分子并用于抑制棉花內源基因GbHDTFl的表達。本發明還提供了ー種含有以上表達載體的宿主細胞,所述的宿主細胞包括大腸桿菌和農桿菌。[0008]本發明再ー個目的是在于提供了ー種棉花同源結構域轉錄因子GbHDTFl在控制棉花抗黃萎病中的應用，即通過調控GbHDTFl基因在棉花植株中的表達來達到調控棉花茉莉酸的合成和響應，從而應用于棉花抗黃萎病品系的培育。[0009]本發明GbHDTFl基因的表達載體轉化的宿主是棉花，可用于培育抗黃萎病的棉花品系和品種。[0010]實現本發明的技術方案如下所述:[0011]本發明是申請人:前期工作是研究海島棉‘海7124’接種黃萎病菌后根部轉錄組測序的數據(徐理等，LigninmetabolismhasacentralroleintheresistanceofcottontothewiltfungusVerticilliumdahliaeasrevealedbyRNA—Seq-dependenttranscriptionalanalysisandhistochemistry.JExpBot,2011,(62):5607-5621),發現ー個在接種黃萎病菌后表達下調的基因。將此基因利用半定量PCR(RT-PCR)鑒定表明該基因在抗病的海島棉‘海7124’中具有組織表達特異性，在子葉、真葉和纖維中優勢表達(圖1A)。該基因在葉片接種黃萎病菌‘V991’(中國農科院植物保護所簡桂良副研究員惠贈)和灰霉病菌(華中農業大學李國慶教授惠贈)后與接水的對照相比表現出下調模式(圖1B)，并且在噴施植物抗病信號分子水楊酸和茉莉酸甲酯之后，相對與噴施無水こ醇的對照分別表現出被誘導和被抑制的表達，而其他激素(包括赤霉素、生長素和こ烯利)處理后，相對于水處理的對照GbHDTFl基因表達沒有變化(圖1C)。[0012]在海島棉‘海7124’的總DNA、RNA中擴增得到GbHDTFl的DNA、cDNA和ORF序列。ー種棉花同源結構域轉錄因子基因，其序列為SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，序列長度為1044bp。[0013]通過氨基酸序列比對確定SEQIDNO:1所編碼的氨基酸序列SEQIDN0:2具有同源結構域轉錄因子的結構特征(圖2)。因此我們認為這個序列為ー個同源結構域轉錄因子基因，將該基因命名為GbHDTFl。[0014]本發明還提供了棉花同源結構域轉錄因子基因GbHDTFl在控制棉花抗黃萎病中的應用，其應用方法是:[0015]在將TRV-GbHDTFl載體利用農桿菌接種生長2周的陸地棉品系‘YZ1’(Jin,Identificationofanovelelitegenotypeforinvitrocultureandgenetictransformationofcotton.BiologiaPlantarum,2006，50:519-524)。經農桿菌轉化3周后對沉默棉花植株分單株提取葉片和根部的RNA，對沉默棉花植株進行GbHDTFl的表達量分析。表達分析顯示GbHDTFl沉默的棉花幼苗中GbHDTFl基因的表達相對對照植株明顯下降(圖4A)。[0016]將GbHDTFl沉默后的棉花幼苗用于棉花黃萎病菌接種處理。通過對照植株和GbHDTFl基因沉默植株接種后植株表型和發病情況統計進行分析，表明GbHDTFl基因沉默之后棉花對黃萎病菌的抗性顯著提高，表現為具有黃萎病病癥的棉株明顯減少(圖4B)。病指和發病率的統計也表明發病植株的發病程度在GbHDTFl基因沉默植株中的顯著降低(圖4C)。通過以上分析說明轉GbHDTFl基因沉默棉花的抗病性與GbHDTFl表達量降低相關聯。[0017]此外，利用QRT-PCR方法對GbHDTFl沉默棉花植株和對照植株中的茉莉酸信號路徑的標志基因GbLOXl，Gb0PR3,GbAOS,GbMYC2,GbJAZl,GbJAZ3和GbJAZ6的表達量進行了分析(圖5A)，結果表明GbHDTFl基因沉默之后能激活棉花茉莉酸的合成和響應相關的信號路徑。利用對照植株和GbHDTFl基因沉默植株葉片提取激素，并進行激素含量測定，發現GbHDTFl基因沉默茉莉酸含量上升。證明在棉花中沉默GbHDTFl基因對茉莉酸的合成以及下游響應有正向調控作用。因此GbHDTFl基因可能是ー個負調控棉花體內茉莉酸合成的基因，通過調控GbHDTFl基因表達水平可以影響棉花抗黃萎病，對培育棉花抗黃萎病品系具有重要意義。[0018]與現有技術相比，本發明具有以下優點:[0019]從抗病的海島棉‘海7124’受黃萎病菌誘導的轉錄組中鑒定了參與棉花抗黃萎病反應的基因GbHDTFl，并對其完成了分離克隆、功能驗證和應用。GbHDTFl基因編碼的蛋白質具有同源結構域轉錄因子的典型特征。GbHDTFl基因具有負調控茉莉酸合成及響應的功能，通過遺傳轉化可應用于棉花抗黃萎病品系的培育，同時可作為棉花抗黃萎病反應的標志基因。[0020]1.本發明克隆GbHDTFl基因對棉花茉莉酸合成和響應有顯著影響，這對闡明GbHDTFl的生物學功能和進ー步研究植物茉莉酸和合成調控網絡有重要意義。[0021]2.抑制表達GbHDTFl的棉花能顯著增強對黃萎病菌的抗性，同時提高茉莉酸合成和響應信號路徑的相關基因表達量，這說明GbHDTFl基因對棉花茉莉酸的合成及響應影響很明顯，通過基因工程技術精確調控GbHDTFl基因的表達量能夠控制棉花體內茉莉酸的合成。[0022]3.茉莉酸的合成調控直接影響植物抗病性，通過基因工程技術精確調控GbHDTFl基因的表達量能夠起到控制棉花茉莉酸合成的目的，GbHDTFl基因的克隆將有助于棉花抗黃萎病材料的創制。[0023]4.選育抗病的棉花材料一直為棉花育種家所重視,調控棉花茉莉酸合成響應基因的發現和利用將有助于解決生產上棉花抗黃萎病性差的難題。由于目前生產上黃萎病發生造成的棉花產量損失巨大，使得選育抗黃萎病的品種顯得尤其重要，GbHDTFl基因的克隆和功能驗證將有助于培育高抗的棉花品種。[0024]5.通過GbHDTFl基因深入探討棉花茉莉酸合成和響應的分子機理以及茉莉酸在棉花與黃萎病菌互作過程中的作用具有重要的理論意義和應用價值。【專利附圖】【附圖說明】[0025]序列表SEQIDNO:1是本發明克隆的GbHDTFl基因的核苷酸序列，序列長度為1044bp。[0026]序列表SEQIDNO:2是GbHDTFl基因編碼蛋白質的氨基酸序列，其編碼347個氨基酸。[0027]圖1為ー種利用RT-PCR檢測發現GbHDTFl在棉花不同組織、不同病原菌和激素誘導處理情況下的表達差異。其中:圖1A=GbHDTFl在不同棉花組織中中表達量的示意圖，該基因子葉、真葉和纖維中表達量最高。圖1B:用黃萎病菌和灰霉病菌接種后GbHDTFl在葉片中下調表達。圖1C=GbHDTFl在生長素、赤霉素和こ烯利處理下無變化。在水楊酸、茉莉酸處理之后GbHDTFl分別表現出上調和下調的基因表達模式。[0028]圖2為ー種采用DNAMAN軟件對GbHDTFI蛋白質序列和擬南芥At0CP3、水稻0sGF14c-1nt、葡萄VvSS0AEB28YD18、蕃茄S1LEFL1032DD01蛋白序列進行比對分析的示意圖。結果表明GbHDTFl具有PINTO`X類同源結構域轉錄因子的典型特征PINTOX結構域和同源結構域HD。[0029]圖3:是本發明構建的三種質粒載體的圖譜，其中:圖3A、圖3B和圖3C分別為一種通過病毒誘導的基因沉默(virus-1nducedgenesilencing,VIGS)載體構建pTRV2-GbHDTFl，RNAi載體pHellsgate4_GbHDTFl和超量表達載體pK2GW7.0-GbHDTFl的物理圖譜。[0030]圖4為一種通過VIGS技術在陸地棉品系‘YZ1’中？幾默該基因之后棉花接種黃委病菌的分析示意圖。[0031]利用RT-PCR技術檢測對照植株和沉默植株中GbHDTFl表達量，證實產生表型的沉默植株體內GbHDTFl基因的表達量在根和葉片中均顯著低于對照植株(圖4A)，表明沉默植株GbHDTFl基因通過VIGS技術被抑制。[0032]通過傷根接種法接種棉花黃萎病菌‘V991’表明，干涉植株的抗性明顯增強，植株發病率，病指均顯著低于對照(圖4B，圖4C)。[0033]圖5為ー種利用QRT-PCR的方法鑒定GbHDTFl的的沉默植株中茉莉酸信號途徑相關標志基因的表達變化以及測定榮莉酸含量變化的不意圖。榮莉酸合成途徑相關標志基因GbLOXl、Gb0PR3和GbAOS，茉莉酸響應相關基因GbMYC2和GbJAZ3的表達量均高于對照植株(圖5A)，干涉植物的茉莉酸含量也高于對照植株(圖5B)。【具體實施方式】[0034]實施例1:GbHDTFl基因分離克隆[0035]本發明申請人:前期工作是研究海島棉‘海7124’(中國棉花種質資源庫，北京，中國農業科學院，作物品種資源研究所)接種黃萎病菌后根部轉錄組測序的數據，發現ー個在接種黃萎病菌后表達下調的基因。[0036]利用已得到的EST序列在棉花D基因組數據庫中(http://www.phytozome.net/cotton,php)進行序列比對，得到與基因匹配的候選DNA序列，以該DNA序列為模板，設計引物GbHDTFl-OE-F(5，GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGGCTTCTGCTTTGTCAGT3’)和GbHDTFl-OE-R(5，GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCACATTGTCATCCCTAAACAGTAAAC3’)，在海島棉‘海7124’的總DNA、cDNA中分別擴得GbHDTFl的DNA、cDNA和ORF序列。ー種棉花同源結構域轉錄因子基因，其序列為SEQID勵:1所示的核苷酸序列，序列長度為104仙？。[0037]通過用DNAMAN軟件將GbHDTFl氨基酸序列與其他物種中的同源結構域轉錄因子進行比對確定SEQIDNO:1所編碼的氨基酸序列SEQIDNo:2具有同源結構域轉錄因子的結構特征(圖2)。因此我們認為這個序列為ー個同源結構域轉錄因子基因，并將該基因命名為GbHDTFl。[0038]實施例2=GbHDTFl在棉花不同組織的表達分析和對植物抗病信號分子的響應[0039]以海島棉‘海7124’為材料，提取根、莖、子葉、真葉、纖維、胚珠、花瓣和花藥8個不同組織的RNA,提取方法為異硫氫酸胍法(Zhu等，AnimprovedsimpleprotocolforisolationofhighqualityRNAfromGossypiumspp.suitableforcDNAlibraryconstruction.ActaAgronomicaSinica.2005，31:1657-1659)。RNA提取完成后后用DNaseI(購自Promega公司)處理，RNA完整性通過1.2%(w/v)瓊脂糖膠(EtBr)電泳檢測(5V/cm)。核酸濃度的測定在BeckmanDU800spectrophotometer(購自美國貝克曼公司)上進行。RNA260/280比值在1.9到2.1之間，260/230比值大于2.0的RNA用于下ー步的分析。用RT-PCR檢測GbHDTFl基因的表達水平。cDNA的合成是以3yg總RNA為模版，與Iu1500iig/mloligo-dT(15)引物(購自Promega公司，美國)，IiillOmMdNTP,DEPC-water混合，總體積為12UI;然后65°C變性5min冰上驟冷；再加入8UI含有4UIRTbuffer,2U10.1Mdithiothreitol,40unitsofRNasin?RibonucleaseInhibitor(購自Promega公司)，和200unitsofSuperscriptIIIRT(購自美國Invitrogen公司)的混合液；50°C溫浴Ih合成第一鏈；反應結束后75°C處理15min使SuperscriptIIIRT失活。每份cDNA稀釋到300iU后-20°C保存待用。以上述反轉錄合成的cDNA為模板，以實施例1中獲得的基因設計特異引物GbHDTFlRt-F(5’GGCTTCTGCTTTGTCAGTGAACT3’)和GbHDTFlRt-R(5，CGTCGITGCCGTCTTCCTC3’)對GbHDTFl基因進行PCR擴增。同時用引物UB7-F(5’GAAGGCATTCCACCTGACCAAC3，)和UB7-R(5，CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG3’)對棉花GhUbi7(GenBank登陸號:DQ116441)基因做特異擴增，作為內對照進行相對半定量分析。結果表明:本發明克隆的基因GbHDTFl在棉花各個組織中表達具有組織特異性，在子葉、真葉和纖維中表達量最高。[0040]對照植株和GbHDTFl沉默植株葉片接種黃萎病菌‘V991’(中國農科院植物保護所簡桂良副研究員惠贈)和灰霉病菌(華中農業大學李國慶教授惠贈)，接水作為對照，接種方法為:保存于_80°C的病原菌孢子置于含有PDA培養基的平皿上活化4天，挑取直徑7cm的菌塊于另ーPDA平皿上，生長7天之后在平皿中加入5ml蒸餾水，用涂布器輕刮菌落表面將病原菌孢子洗脫到蒸餾水中。孢子液用雙層醫用紗布過濾，在顯微鏡下對孢子液濃度進行統計。利用蒸餾水稀釋孢子液至其終濃度分別為1O7孢子/ml(黃萎病菌)和IO5孢子/ml(灰霉病菌)，然后對對照植株和GbHDTFl沉默植株葉片分別進行噴施，以蒸餾水噴施作為對照。病原菌接種之后在0h、6h、12h和24h取樣，分離RNA進行RT-PCR鑒定。[0041]對照植株和GbHDTFl沉默植株葉片進行激素誘導處理，具體方法是:赤霉素(GA，購自SIGMA公司)、生長素(D引哚こ酸即IAA，購自SIGMA公司)和こ烯利(ETH，購自SIGMA公司)用蒸餾水溶解，使終濃度分別為0.5PM、5iiM和200PM。茉莉酸甲酯(MeJA，購自SIGMA公司)和水楊酸(SA，購自SIGMA公司)用こ醇溶解，終濃度分別為IOOiiM和10mM。對對照植株和GbHDTFl沉默植株葉片進行噴施，蒸餾水和こ醇噴施作為對照。病原菌接種之后在Oh,0.5h、Ih和3h取樣，分離RNA進行RT-PCR鑒定。利用引物GbHDTFlRt-F和GbHDTFlRt-R對GbHDTFl基因進行PCR擴增。同時用引物UB7-F和UB7-R作為內對照進行相對半定量分析。結果表明:該基因在海島棉‘海7124’接種黃萎病菌‘V991’和灰霉病菌后與接水的對照相比表現出表達下降模式(圖1B)，并且在植物抗病信號分子水楊酸和茉莉酸甲酯的誘導之后，相對與噴施こ醇的對照分別表現出被誘導和被抑制的表達，而其他激素(包括赤霉素、生長素和こ烯利)處理后表達沒有變化(圖1C)。[0042]實施例3:病毒干涉載體、RNAi抑制表達載體和超量表達載體的構建和VIGS介導的轉化[0043]根據GbHDTFl的基因序列設計了如下引物:正向引物GbHDTFl-trv_s(5’CGACGACAAGACCCTGGCGAGGAAGACGGCAACGAC3’)，反向引物GbHDTFl-trv-a(5，GAGGAGAAGAGCCCTATGITTGGITTCAGGCAITGGT3’)，再以GbHDTFl基因cDNA為模板進行PCR擴增，得到的產物及pTRV:RNA2載體(荷蘭瓦格寧根大學Thomma博士惠贈)質粒分別用限制性內切酶BamHl和Kpnl(購自NEB公司，中國)進行雙酶切。將酶切后的PCR產物與酶切回收的pTRV:RNA2質粒片段用T4連接酶(購自Invitrogen公司，美國)進行連接，連接產物即為病毒沉默載體pTRV2-GbHDTFl(見圖3A)(圖4A)，將該載體進行熱激轉化(按照大腸桿菌轉化說明書操作)，轉入大腸桿菌TOPlO(購自天根生化科技(北京)有限公司)中，挑取單克隆用引物GbHDTF1-trv-s和GbHDTFl-trv-a進行檢測，檢測后的陽性克隆擴繁后提取質粒，再轉化農桿MGV3101(Roger等，AguidetoAgroDacteriumbinaryTivectors.Trendsinplantscience.2000.5，1360-1385.)。檢測后于-80保存備用(圖4A)。[0044]設計GbHDTFl基因的RNAi抑制表達載體構建引物，在引物的兩端分別加上用于重組的attB位點序列及保護堿基，即正義引物5’端加上5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGC3’接頭，反義引物5’端加上5’GGGGACCACITTGTACAAGAAAGCTGGGTG3’接頭，分別將該引物命名為GbHDTFl-R1-s(5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCGGCTTCTGCTTTGTCAGTGAACT3’)和GbHDTFl-R1-a(5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCGTCGITGCCGTCTTCCTC3’)，再以GbHDTFl基因cDNA為模板進行PCR擴增，得到的產物通過BP重組反應(BP重組反應試劑盒購自Invitrogen,美國)導入RNAi載體pHellsgate4(購自Invitrogen,美國)。RNAi載體見Wesley等(ConstructdesignIorefficient,effectiveandhigh-throughputgenesilencinginplants.PlantJ.2001.27:581-590)，構建得到RNAi載體pHellsgate4_GbHDTFl(見圖3B)。[0045]根據GbHDTFl基因的ORF設計引物，分別將該引物命名為:GbHDTF1-OE-F和GbHDTFl-OE-R0再以GbHDTFl基因的DNA為模板進行PCR擴增，得到的PCR產物通過BP反應構建到中間載體PDN0R221(購自Invitrogen公司，美國)上，BP反應體系(5yl)如下:PCR產物1，pDN0R221載體IU1，BP酶(購自Invitrogen公司，美國)IuI,TE(pH8.0)IUI。然后再將含有GbHDTFl基因的pDN0R221載體和pK2GW7.0(購自比利時國立根特大學)載體進行LR重組反應，將GbHDTFl基因構建到pK2GW7.0的載體上，從而獲得超量表達載體pK2GW7.0-GbHDTFl(該表達載體含有如序列表SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，見圖3C)。LR反應體系(5ill)如下:含有GbHDTFl基因的pDN0R221載體liil，pK2GW7.0載體2iil，LR酶(購自Invitrogen公司)IuI,TE(pH8.0)Iu10所述的超表達載體pK2GW7.0-GbHDTFl含有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，以及植物表達載體pK2GW7.0(圖3C)。[0046]VIGS介導的棉花基因沉默的方法參考Fradin等(Fradin,E.F.,Z.Zhang,etal.2009.beneticdissectionoiVerticilliumwiltresistancemediatedbytomatoVel.PlantPhysioll50(I):320-332)。具體步驟為:將帶有質粒TRV:RNAl,TRV:RNA2和TRViGbHDTFl的農桿菌菌株在50ug/mLKanamycin(購于Sigma公司)LB培養皿上活化。接種前兩天，挑取ー個單克隆接種于5mlLB培養液。培養液中加入50iig/mLKanamycin。在搖床上28°C，轉速50rpm過夜。將活化后的菌液分別接種于IOOml含有50ug/mL的KanamycinLB培養液中，并加入IOmMMES(2-(4morpholino)-ethanesulfonicacid),20uM乙酸丁香酮。于28°C轉速50rpm的搖床上過夜。當農桿菌液濃度0D600=0.8左右，將菌液收集于50mL離心管中，于4000rpm，離心5分鐘。用重懸液(IOmMMgCl2,IOmMMES和200yM乙酰丁香酮)重懸，調整濃度至0D600=1.2-1.5。重懸后的菌液在常溫放置2h。將要沉默的棉花幼苗每片子葉背面用針頭扎幾個小孔。將重懸液TRV:RNAl，分別與TRV:RNA2和TRV:GbHDTFl按1:1體積混合均勻，用2ml注射器將混合后的菌液沿著小孔注射滲入棉花子葉。用黒色塑料膜將注射接種后的棉花幼苗避光24h。24h后，保持培養條件為25°C,120uEm^S^1光強，16h亮/8h暗。[0047]實施例4:TRV:GbHDTFI轉基因植株相關分析[0048]1、TRV=GbHDTFl轉基因植株基因表達分析[0049]對照植株和GbHDTFl沉默植株分別提取葉片和根系RNA(Zhu等，AnimprovedsimpleprotocolforisolationofhighqualityRNAfrombossypiumspp.suitableforcDNAlibraryconstruction.ActaAgronomicaSinica.2005,31:1657-1659),利用反轉錄酶SuperscriptIII(購自Invitrogen公司，美國)將其反轉錄合成cDNA,以GbHDTFl-Rt-F和GbHDTFl-Rt-R引物進行RT-PCR，同時用引物UB7-F和UB7-R擴增棉花GhUbi7基因做內參，PCR擴增35個循環。對沉默棉花植株進行GbHDTFl的表達量分析。表達分析表明GbHDTFl沉默的棉花幼苗中GbHDTFl基因的表達相對對照植株均明顯下降(圖4A)。[0050]2、TRV=GbHDTFl轉基因植株抗病性鑒定。[0051]農桿菌轉化后3周后的棉花幼苗用于棉花黃萎病菌接種處理，接種方法為傷根接種法(馬平等，AnewinoculationmethodforVerticilliumwiltoncottonanditsapplicationinevaluatingpathogenesisandhostresistance.ActaPhytopathologicaSinica,2004,34(6):536_541)。接種一周之后觀察棉花黃萎病的發病率和病指，統計方法依據國家標準(GB/T22101.5-2009棉花抗病蟲性評價技術規范第5部分:棉花黃萎病)。通過對對照植株和GbHDTFl基因沉默植株接種后植株表型和發病情況統計進行分析，表明GbHDTFl基因沉默之后植物對黃萎病菌的抗性有顯著提高，表現出黃萎病病癥的植株明顯減少(圖4B)。病指和發病率的統計也表明發病植株的發病程度在GbHDTFl基因沉默植株中的顯著降低(圖4C)。[0052]3、TRV=GbHDTFl轉基因植株茉莉酸信號途徑相關基因分析[0053]取對照植株和GbHDTFl沉默植株分別提取葉片提取RNA(Zhu等，AnimprovedsimpleprotocolforisolationofhighqualityRNAfrombossypiumspp.suitableforcDNAlibraryconstruction.ActaAgronomicaSinica.2005,31:1657-1659),用QRT-PCR檢測TRV=GbHDTFl沉默后，茉莉酸路徑相關基因表達變化。相關引物的DNA序列如下:[0054]L0X1-RF(5’GCTTATGTTGCTGTAAATGACTCTGG3’)[0055]L0X1-RR(5’CACACTAAGTTGTCGGTTCGTTG3’)[0056]AOS-RF(5’TGCCACCTGGTCCTTTCATTTC3’)[0057]AOS-RR(5’GCGTGTTTGGGCTCGGAAGGGTCG3’)[0058]0PR3-RF(5，AGAGGTCCACTCCTGGCGGCTT3’)[0059]0PR3-RR(5’CCACCTGTTCTTCATTGTAGATTCC3’)[0060]MYC-2RF(5’GCTCCGCCACTACCGTGCTC3’)[0061]MYC-2RR(5’CTCGAAGCACTTTTTTACGGTGTTC3’)[0062]Jazl-RF(5，AGCCTCAAAAAGGAAGACCTCAAAC3，)[0063]Jazl-RR(5’TGGCTGCTCAATCACCATAGTAATC3’)[0064]JAZ3-RF(5，TGATTTTGCTCAAGGAGATAACGCT3’)[0065]JAZ3-RR(5’TGATTGCCTACTCGTTGCCTGT3’)[0066]JAZ6-RF(5，GGCATCAATATGGCGGTTCAGGAC3’)[0067]JAZ6-RR(5’TTCATCGGGTTTAGGTGGCAGAGT3’)[0068]同時用引物UB7-F和UB7-R對棉花GhUbi7基因做特異擴增作為內對照進行相對定量分析。定量PCR儀為ABI7500，定量PCR試劑購自Bio-Rad公司。PCR反應體系(20yl)包括:1Ul稀釋后的cDNA(等于IOng起始總RNA)，10U12XPCRMasterMix,200nM的引物。反應條件為:95°C30sec；95°C5sec，60°C35sec，40個循環。反應過程中進行熒光檢測實時定量分析。結果表明:在本發明克隆的基因GbHDTFl被干涉植株中，茉莉酸合成相關基因受誘導，茉莉酸下游響應相關基因及茉莉酸下游相關基因都受到不同程度的誘導(參見附圖5A)，表明GbHDTFl基因參與了植物抗病反應信號路徑。[0069]4、TRV=GbHDTFl轉基因植株茉莉酸含量分析[0070]對照植株和沉默植株分別取葉片提取茉莉酸并測定其含量，具體方法參照Shindy等用到的茉莉酸提取方法(IdentificationofPlantHormonesfromCottonOvules.PlantPhysiol.1975,55(3):550-554)。具體過程如下:分別取對照植株和沉默植株的葉片，用液氮研磨成粉末，稱取0.1g粉末，加入80%甲醇溶液600yl，于4°C并避光振蕩24h后，在9000Xg，4°C離心10分鐘，取上清轉入ー支新的離心管中。再往沉淀中加入400u180%甲醇溶液于4°C并避光振蕩4h后，9000g，4°C離心10分鐘。把上清與前一次的上清混合。把兩次的有機相溶液用氮氣吹干，加入200μI甲醇溶解。用HPLC液相色譜測定其茉莉酸濃度。結果表明GbHDTFl被干涉植株中，茉莉酸合成增加(參見附圖5Β)。這與在GbHDTFl被干涉植株中參與茉莉酸合成相關基因受誘導，茉莉酸下游響應相關基因及茉莉酸下游相關基因都受到不同程度的誘導相一致，表明GbHDTFl參與了茉莉酸合成的負調控。【權利要求】1.一種分離的同源結構域轉錄因子基因GbHDTFl，其特征在于，該基因的核苷酸序列如序列表SEQIDN0:1所示。2.如權利要求1所述的GbHDTFl基因，其蛋白質的序列如SEQIDNO:2所示。3.ー種表達載體pK2GW7.0-GbHDTFl，其特征在于含有權利要求1所述的基因。4.ー種表達載體pHellSgate4-GbHDTFl，其特征在于含有權利要求1所述的基因。5.ー種表達載體pTRV2-GbHDTFl，其特征在于含有權利要求1所述的基因。6.權利要求1所述的基因GbHDTFl在控制棉花黃萎病中的應用。【文檔編號】C07K14/415GK103451189SQ201310345168【公開日】2013年12月18日申請日期:2013年8月9日優先權日:2013年8月9日【發明者】朱龍付,張獻龍,高巍,龍璐申請人:華中農業大學