表達新型defensin抗菌肽的DNA的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物【技術領域】，涉及一種表達新型defensin抗菌肽的DNA，序列如SEQ：1。該DNA表達的抗菌肽及其衍生物可用于水產病害防治，具有廣泛用途。
【專利說明】表達新型defens in抗菌肽的DNA
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，涉及表達抗菌肽的DNA 。
【背景技術】
[0002]目前，由于過度追求經濟效益，高密度、集約化的珍珠養殖模式快速發展，使得養殖病害日趨嚴重，各種病害頻繁爆發，已成為淡水珍珠養殖業健康可持續發展的主要瓶頸。各類農藥、抗生素盲目無序和頻繁使用，不僅對病害的預防與治療沒有起到明顯作用，而且，由于這些藥物的大量使用嚴重破壞了自然生態環境，藥品的殘留已經直接威脅到人類的健康，因此，發現和尋找通用性強、防治效果好、廣譜無污染的新型病害預防和治療藥物，成為人們亟待解決的重要課題之一。抗菌肽(Defensin)又稱抗微生物肽，是參與動物先天性免疫防御功能的重要組分，具有廣譜殺菌、抑病毒、抑真菌、抑寄生蟲等作用的一類膜活性多肽，不易引進微生物的耐藥性，成為抗生素藥物的理想替代品。抗菌肽作用機理非常獨特，研究表明，抗菌肽作用于細菌細胞膜，使細胞膜發生穿孔，破壞膜的完整性，使細菌因不能保證正常滲透壓而死亡(Park, Y., Biochim Biophys Acta.2003, 1645(2):172-182)。
[0003]Defensin是貝類抗菌肽中的一大類群，其典型特征是分子內具有6個或8個保守的半胱氨酸殘基組成的二硫鍵，二級結構包括一個α螺旋和兩個反向平行的β折疊，分子量約 3-5 kDa。在紫貽貝(M.galloprovincialis)、太平洋牡販(Crassostrea gigas)、海灣扇貝(Argopecten irradians)和菲律賓給仔(Ruditapes phiIippinarum)等海水貝類中都有研究過Defensins。研究表明，病原菌刺激貽貝(Mytilus.galloprovincialis)后可增強defensin在血淋巴中的轉錄表達。從牡販(Crassostrea gigas)的觸組織中分離純化到defensin蛋白對革蘭氏陽性和陰性菌均具有較強抑菌活性(Seo, et al., BiochemBiophys Res Commun, 2005, 338 (4): 1998-2004)。此外，已證明無論是化學合成或體外重組表達的一些海水貝類defensins均能表現出較強的殺菌功效(Adhya, et al., CompBiochem Physiol B.2012, 161 (1):25-31; Gueguen, et al., J Biol Chem, 2006,281(1): 313-23; Xu and Faisal, Molecular Immunology, 2010, 47: 2138-2147;Zhao, et al., Molecular Immunology, 2007, 44 (4): 360-368; Zhao, et al., PLoSOne, 2010, 5(10): el3480)。
【發明內容】
[0004]本發明涉及一種表達新型Defensin抗菌肽的DNA,所表達出的新型Defensin抗菌肽具有良好的抗菌性能。
[0005]具體技術方案如下:
表達新型defensin抗菌肽的DNA,序列如SEQ:1所示。
[0006]所述DNA編碼的新型defensin抗菌肽:(a)其氨基酸序列如SEQ: 2所示；或(b)將(a)中的序列經過一個或多個氨基酸的取代，缺失或添加具有抗菌肽功能的由(a)衍生的新型defensin抗菌肽。
[0007]本發明還涉及:
表達新型defensin抗菌肽的DNA的載體。
[0008]所述表達新型defensin抗菌肽的DNA的載體為pGEX-4T-l_defensin。
[0009]由于抗菌肽天然資源有限，鑒于化學合成肽類成本高，而基因工程方法大量生產抗菌肽的途徑較為現實，并顯示出良好應用前景。本發明主要是在一種淡水珍珠貝類鑒定發現了一種抗菌肽Defensin基因序列，并采用一種基因工程手段獲得了其產物，抑菌實驗分析證明其能夠顯示出較強抑菌活性。因此，我們有望通過較廉價大規模的基因工程重組方法獲得大量的此類抗菌肽，將其應用在淡水珍珠養殖過程中既能有效地防治的各種疾病的發生，又可避免了濫用抗生素帶來的日益嚴重的微生物對抗生素的耐藥性問題，同時極大地降低了珍珠養殖過程中用于其病害防治的藥物經濟成本。
[0010]池蝶蛘可用于獲取該分子的天然材料。從嗜水氣單胞菌誘導池蝶蛘血細胞cDNA文庫中，應用通用引物M13進行文庫篩查，PCR擴增，測序，所得序列同源比對及蛋白三維建模等生物信息學分析鑒定為池蝶蛘抗菌肽Defensin基因。病原菌脅迫進一步表明其參與了池蝶蛘免疫防御反應，通過重組方法能夠表達其重組蛋白分子(附圖3)。該重組蛋白抑菌試驗分析表明其具有較強的抑菌活性(附圖4)。該產物可用于淡水珍珠蛘天然免疫防御機制的理論研究，也可作為病害治療藥物、飼料添加劑、免疫增強劑以及珍珠插核手術時用作抗感染藥物等在生產方面進行應用。
[0011]與現有的各類農藥、抗生素等藥劑用于水產病害防控和治療相比，本發明的積極效果是: (I)本發明充分利用了天然抗菌肽具有廣譜殺菌、抑病毒、抑真菌等作用且不易引進微生物的耐藥性等生物特征，在掌握該抗菌肽的基因序列和已證明其表現出較強抑菌作用的基礎上，可應用基因工程技術對其進行大規模生產，成本低廉，可用于珍珠養殖及手術育珠過程中的各種病害防治，尤其是重組抗菌肽的在水產養殖中的應用不會產生任何水環境污染事件。
[0012](2)本發明充分利用了同為帆蛘屬且均作為淡水育珠蛘源的池蝶蛘抗病力優于三角帆蛘的生物特征(徐毛喜，等。南昌大學學報(理科版)，2004，28 (3):262-269)，從池蝶蛘中鑒定到其抗菌肽defensin序列，且證明其重組蛋白表現出較強的抑菌活性，其產品可應用除池蝶蛘外的其他淡水珍珠蛘的病害防控。
[0013](3)本發明不同于已報道的池蝶蛘抗菌肽Defensin序列(Peng K，et al.,Aquaculture, 2012, 334-337:45 - 50)，兩序列差異性比較如圖 9:
因此，本發明作為用于淡水珍珠養殖或水產養殖病害治療藥物、飼料添加劑、免疫增強劑以及淡水珍珠插核手術時用作抗感染藥物等，同源也可應用于淡水珍珠蛘天然免疫防御機制的理論研究。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1池蝶蛘基因核苷酸序列及其推導的氨基酸序列。
[0015]圖2池蝶蛘Defensin氨基酸序列同其他物種抗菌肽defensin同源比較
池蝶蛘，Hyriopsis schlegelii defensin (本發明)；牡販，Crassostrea gigasdefensin: ACQ76287 ;給，phiIippinarum defensin:AFP50003 ;長角血蝶，Haemaphysalis longicornis defensin: ABW08117。
[0016]圖3池蝶蛘中鑒定到抗菌肽Defensin同其他物種抗菌肽Defensin蛋白同源建模分析
池蝶蛘，Hyriopsis schlegelii, defensin (本發明)；牡販，Crassostrea gigasdefensin: ACQ76287 ;給，phiIippinarum defensin:AFP50003 ;長角血蝶，Haemaphysalis longicornis defensin: ABW08117。
[0017]圖4嗜水氣單胞菌刺激后抗菌肽在池蝶蛘血淋巴中轉錄變化。
[0018]圖5 PCR 擴增獲得 Defensin-ORF 片段。
[0019]圖6重組質粒pGEX-4T-l_defensin的雙酶切驗證。
[0020]圖7池蝶蛘抗菌肽defensin重組蛋白的誘導表達。
[0021]M:Protein Marker 1:未誘導的宿主菌所表達的蛋白量2，3，4:分別表示宿主菌在2h、4h、6h誘導后所表達的蛋白量，箭頭所指為目的蛋白。
[0022]圖8抑菌效果圖。
[0023]圖9本發明序列與已報道現有序列對比。 【具體實施方式】
[0024]材料
池蝶蛘
池蝶蛘取自江西撫州市洪門水庫開發公司池蝶蛘良種養殖基地，外殼完好，噴水有力；殼長為(107±6.5) mm。蛘置實驗室水族箱充氣水中暫養一周，水溫為18 — 25°C。
[0025]菌株與載體。
[0026]嗜水氣單胞菌購自中國工業微生物菌種保藏中心、大腸桿菌BL21 (DE3)表達菌珠購自TAKARA寶生物工程(大連)有限公司。pGEX-4t-l表達載體購自Amersham公司。
[0027]主要酶和試劑
Ex Taq酶(TaKaRa)、DNA快速回收試劑盒、質粒抽提試劑盒(QIAGEN)、限制性內切酶(TaKaRa)；T4 DNA連接酶、MMLV反轉錄試劑盒(Progmeg公司)、TRIZ0L Reagent (Invitrogen公司)均為進口原裝試劑。其余試劑均為常規試劑，不再贅述。
[0028]實施例1
1.2.1 cDNA文庫PCR篩查(注:基因工程應用生產重組蛋白則直接從1.2.4步驟開
始)
池蝶蛘血細胞cDNA文庫為本實驗室應用Creator? SMARTTM cDNA LibraryConstruction Kit (Clontech)已構建(謝凱，等。水生生物學報。2011,35 (5):783_789)。
[0029]本發明中，應用M13引物對文庫菌液涂板后挑單克隆搖菌取菌液進行PCR大規模篩查，具體實施如下:取稀釋后的文庫菌液涂布平板，挑取單克隆利用菌液PCR檢測插入片段的大小。PCR程序為94°C預變性5min; 94°C 30s, 45°C 30s, 72°C 90s, 33個循環；72°C延伸7min。擴增產物在1%瓊脂糖凝膠跑電泳參照分子Marker鑒定大小、對選定一定大小的片段送上海生工測序。測序獲得序列利用NCBI vecscreen和BLASTN
2.2.21+程序識別并去除測序結果中的載體序列。[0030]M13引物設計如下:
M13-F: 5， GTAAAACGACGGCCAGT3，；
M13-R: 5’ AACAGCTATGACCATG3’ ；
1.2.2池蝶蛘抗菌肽defensin基因序列確定及蛋白分析
利用NCBI的ORF Finder程序對去除載體序列的樣品序列做開放閱讀框分析，并翻譯所得氨基酸序列在NCBI網上進行BLASTP比對鑒定其同源序列。運用ClustalW方法對序列對應蛋白與其他物種同源序列進行蛋白保守性分析，用Mega4.1軟件NJ(NeighbourJoining)算法產生系統進化樹。利用SWISS-MODEL(版本3.5)程序做同源建模分析。
【權利要求】
1.表達新型defensin抗菌肽的DNA,序列如SEQ:1所示。
2.權利要求1所述DNA編碼的新型defensin抗菌肽:(a)其氨基酸序列如SEQ:2所示；或(b)將(a)中的序列經過一個或多個氨基酸的取代，缺失或添加具有抗菌肽功能的由(a)衍生的新型defensin抗菌肽。
3.包含權利要求1表達新型defensin抗菌肽的DNA的載體。
4.如權利要求3所述表達新型defensin抗菌肽的DNA的載體為pGEX-4T-l_defensin。
【文檔編號】C07K14/435GK103642811SQ201310301542
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年7月18日 優先權日:2013年7月18日
【發明者】彭扣, 洪一江, 王軍花, 盛軍慶 申請人:南昌大學