一種在線二維串聯色譜技術同時分離四種玫瑰紅景天黃酮的方法
【專利摘要】一種在線二維色譜(串聯液相色譜和高速逆流色譜)分離純化四種玫瑰紅景天黃酮的方法，通過離子液體水溶液作提取劑對玫瑰紅景天黃酮進行在線超聲提取和液固吸附色譜富集，對富集后的玫瑰紅景天黃酮進行在線洗脫，然后直接對被洗脫的玫瑰紅景天黃酮進行在線高速逆流色譜分離得到純度超過95％的四種黃酮單體。本方法將提取、柱色譜和高速逆流色譜串聯，避免了繁瑣的溶劑萃取和反復柱色譜過程，分離方法簡單、分離效率和產品的純度高。
【專利說明】一種在線二維串聯色譜技術同時分離四種玫瑰紅景天黃酮的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種二維色譜同時分離玫瑰紅景天黃酮的方法，屬于化工領域。
【背景技術】
[0002]玫瑰紅景天中的黃酮具有抗氧化、抗疲勞、抗微波輻射、抑菌、抑制腫瘤、保肝、調節心肌收縮等作用，顯示了其在醫藥和功能食品的應用前景，因此提取、分離玫瑰紅景天黃酮化合物有重要意義。
[0003]傳統的提取溶劑主要是有機溶劑，這些有機溶劑具有易揮發、易燃、有毒和污染環境的缺點。近來，室溫離子液體被認為是一種可以取代傳統揮發性有機溶劑的環境友好型溶劑，一些室溫離子液體己開始應用于天然產物活性成分的提取。室溫離子液體具有很小的蒸汽壓、好的熱穩定性、好的溶解和提取能力以及可設計的結構。迄今還沒有用離子液體提取玫瑰紅景天黃酮的報道。
[0004]玫瑰紅景天黃酮的分離方法主要是溶劑萃取和萃取后的多步柱色譜技術-硅膠柱色譜、0DS柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜和制備高效液相色譜。傳統的柱層析方法分離玫瑰紅景天酮存在分離時間長、回收率低、溶劑消耗大的缺點。而高速逆流色譜(high-speed countercurrent chromatography, HSCCC)作為一種連續高效的液-液分配色譜分離技術，可以克服上述缺點，特別適合于天然活性成分的分離。
[0005]多維色譜法利用兩根或多根性質不同的色譜柱對復雜樣品中的待分析組分進行分離。樣品先在第一維色譜柱中進行預分離，然后將經過預分離的全部或部分組分選擇性地轉入另一根或多根不同類型的色譜柱中進一步分離。多維高效液相色譜技術具有對樣品進行預處理，分離富集的功能，可提高色譜系統的分離能力和選擇性；能從復雜的多種組分中排除干擾物質，有選擇性地針對感興趣的組分進行分析此外，和維色譜相比，二維色譜技術在峰容量、選擇性和分辨率方面有明顯的優勢。迄今，還沒有二維色譜技術分離玫瑰紅景天黃酮的報道。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是克服現有分離技術的不足之處，將提取、柱色譜和高速逆流色譜串聯，提供一種在線的二維串聯色譜技術同時分離四種玫瑰紅景天黃酮的方法。
[0007]按照本發明提供的技術方案，在線的二維串聯色譜技術同時分離四種玫瑰紅景天黃酮的方法，步驟為:
[0008](1)在線提取和富集:玫瑰紅景天取粉碎后，加入0.5-3mol/L的離子液體水溶液在20-60°C，0.2-lkw功率，30-180min超聲提取玫瑰紅景天黃酮；同時，在0.5-3柱體積(BV)/h流速下，提取液在線流過固相萃取柱富集玫瑰紅景天黃酮；
[0009](2)在線洗脫和洗脫后的分離:將步驟(1)的固相萃取柱依次用平衡后的溶劑系統乙酸乙酯-正丁醇-水的下相和上相進行洗脫，溶劑體積比在3: 2: 5-4: 1: 5，洗脫體積分別為0.5-1個柱體積和1-2.5個柱體積，洗脫流速為0.5-4BV/h，在線收集上相洗脫液；
[0010](3)在線分離:上相的洗脫液直接注入高速逆流色譜柱進行分離，分離參數為:分離溫度為25°C，流動相流速為0.5-3ml/min，轉速為700_900rpm，溶劑系統為乙酸乙酯-正丁醇-水(下相為流動相，上相為固定相)，溶劑體積比在3:2:5-4:1: 5，檢測波長280nm，根據逆流色譜圖在線采集分離成分。
[0011](4)后處理:取步驟(3)所得的分離成分，在40_60°C蒸餾濃縮干燥得到高純度玫瑰紅景天黃酮單體。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]附圖1在線提取和二維串聯色譜系統圖
【具體實施方式】
[0013]實施例1
[0014](1)在線提取和富集:玫瑰紅景天取粉碎后，加入1.5mol/L的1_乙基_3_甲基咪唑氯水溶液，在40°C，350W的超聲功率下，在線超聲提取60min ;在提取的同時，提取液在線流過裝有聚酰胺填料的固相萃取柱，提取液流速為1BV(柱體積)/h ;提取結束后，依次用平衡過的溶劑系統乙酸乙酯-正丁醇-水的下相和上相進行洗脫，洗脫流速為lBV/h，洗脫體積分別為1個柱體積和2個柱體積，收集上相溶劑的洗脫液；上相的洗脫液直接注入高速逆流色譜柱進行分離，溶劑系統是乙酸乙酯-正丁醇-水，體積比為4: 1: 5，以上相為固定，下相為流動相。在分離過程中，流動相流速為1.5ml/min,轉速為800rpm,檢測波長280nm,根據逆流色譜圖在線采集分離組分；將所得的分離組分，在50°C下濃縮干燥得到高純度玫瑰紅景天黃酮單體 I (herbacetin-3-O-β -D-glucopyranosyl-7-0- a -L-rhamnopyranoside), II(kaempferol-3-0-β -D-glucopyranosyl-7-0-a -1-rhamnopyranoside), III (Kaempferol3-0- β -D-glucopyranoside- (2 — 1) - β -D-xylopyranoside), IV (herbacetin-8-0- β-D-glucopyranoside)。它們的純度分別為 98.5%，95.4%，98.1 %和 97.5%。
[0015]實施例2
[0016]在線提取和富集:玫瑰紅景天取粉碎后，加入1.5mol/L的1_乙基_3_甲基咪唑溴水溶液，在25°C，400W的超聲功率下，在線超聲提取45min ;在提取的同時，提取液在線流過裝有LX-8填料的固相萃取柱，提取液流速為1.5BV/h ;提取結束后，依次用平衡后溶劑系統乙酸乙酯-正丁醇-水的下相和上相進行洗脫，洗脫流速為2BV/h，洗脫體積分別為0.5個柱體積和1.5個柱體積，收集上相溶劑的洗脫液；上相的洗脫液直接注入高速逆流色譜柱進行分離，溶劑系統是乙酸乙酯-正丁醇-水，體積比為3: 2: 5，以上相為固定，下相為流動相。在分離過程中，流動相流速為1.0ml/min，轉速為850rpm，檢測波長280nm，根據逆流色譜圖在線采集分離組分；將所得的分離組分，在45°C下濃縮干燥得到高純度玫瑰紅景天黃酮單體 I (herbacetin-3-O- β -D-glucopyranosy 1-7-0- a -L-rhamnopyranoside) ,11(kaempferol-3-0-β -D-glucopyranosyl-7-0-a -L-rhamnopyranoside), III(kaempferol3-0- β -D-glucopyranoside-(2 — 1) - β -D-xylopyranoside), IV(herbacetin-8-0- β _D_glucopyranoside)。它們的純度分別為 97.5%，96.4%，97.8%和 98.1 %。
[0017]實施例3
[0018](1)在線提取和富集:玫瑰紅景天取粉碎后，加入2mol/L的1_ 丁基_3_甲基咪唑氯水溶液，在30°C，450W的超聲功率下，在線超聲提取50min ;在提取的同時，提取液在線流過裝有CT-8填料的固相萃取柱，提取液流速為1.5BV/h ;提取結束后，依次用平衡后的溶劑系統乙酸乙酯-正丁醇-水的下相和上相進行洗脫，洗脫流速為lBV/h，洗脫體積分別為1個柱體積和2.5個柱體積，收集上相溶劑的洗脫液；上相的洗脫液直接注入高速逆流色譜柱進行分離，溶劑系統是乙酸乙酯-正丁醇-水，體積比為3.5: 1.5: 5，以上相為固定，下相為流動相。在分離過程中，流動相流速為2.0ml/min，轉速為750rpm，檢測波長280nm，根據逆流色譜圖在線采集分離組分；將所得的分離組分，在50°C下濃縮干燥得到高純度玫瑰紅景天黃酮單體 I (herbacetin-3-O-β -D-glucopyranosyl-7-0- a -L-rhamnopyranoside), II(kaempferol-3-0-β -D-glucopyranosyl-7-0-a -L-rhamnopyranoside), III (kaempferol3-0- β -D-glucopyranoside- (2 — 1) - β -D-xylopyranoside), IV (herbacetin-8-0- β-D-glucopyranoside)。它們的純度分別為 98.2%，95.8%，98.5%和 97.9%。
【權利要求】
1.一種在線二維色譜技術分離玫瑰紅景天四種黃酮化合物的方法，其特征是，包括以下工藝步驟: (1)在線提取和富集:玫瑰紅景天取粉碎后，加入0.5-3mol/L的離子液體水溶液在20-60°C,0.2-lkw功率，30-180min超聲提取玫瑰紅景天黃酮；同時，在0.5_3柱體積(BV)/h流速下，提取液在線流過固相萃取柱富集玫瑰紅景天黃酮； (2)在線洗脫和洗脫后的分離:將步驟(I)的固相萃取柱依次用平衡后的高速逆流色譜的溶劑系統-乙酸乙酯-正丁醇-水的下相和上相進行洗脫，溶劑體積比在3:2:5-4:1: 5，洗脫體積分別為0.5-1個柱體積和1-2.5個柱體積，洗脫流速為0.5-4BV/h，在線收集上相洗脫液； (3)在線分離:上相的洗脫液直接注入高速逆流色譜柱進行分離，分離參數為流動相流速為0.5-3ml/min，轉速為700_900rpm，溶劑系統為乙酸乙酯-正丁醇-水(下相為流動相，上相為固定相)，溶劑體積比在3:2:5-4:1: 5，檢測波長280nm，根據逆流色譜圖在線米集分尚成分。 (4)后處理:取步驟(3)所得的分離成分，在40?60°C蒸餾濃縮干燥得到高純度玫瑰紅景天黃酮單體。
2.如權利要求1所述一種在線二維色譜技術分離玫瑰紅景天四種黃酮化合物的方法，其特征在于所述的離子液體為1-乙基-3-甲基咪唑氯、1-乙基-3-甲基咪唑溴、1-丁基-3-甲基咪唑氯和1- 丁基-3-甲基咪唑溴。
3.如權利要求1所述一種在線二維色譜技術分離玫瑰紅景天四種黃酮化合物的方法，其特征在于所述固相萃取柱的填料為聚酰胺、LX-8和CT-8。
4.如權利要求1所述一種在線二維色譜技術分離玫瑰紅景天四種黃酮化合物的方法，其特征在于所用的二維色譜是串聯液固吸附色譜和高速逆流色譜。
【文檔編號】C07H1/08GK104277085SQ201310289315
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月11日 優先權日:2013年7月11日
【發明者】王洪新, 馬朝陽, 樊琛 申請人:江南大學