一種艾塞那肽高效分離純化方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于提供一種具有高選擇性的艾塞那肽純化分離方法,該方法采用二維的分離純化方法:采用極性共聚的方法將具有特異性的靜電作用引入到?jīng)]有特異性的單純依靠疏水作用的反相色譜中,即反相/陰離子交換(RP/SAX)混合模式和反相/陽(yáng)離子交換(RP/SCX)混合模式,并通過(guò)對(duì)緩沖鹽種類、濃度、pH條件的優(yōu)化以及流動(dòng)相梯度條件的優(yōu)化,使樣品具有適當(dāng)?shù)谋A簦⑶铱梢赃_(dá)到良好分離。
【專利說(shuō)明】一種艾塞那肽高效分離純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于化學(xué)合成多肽的分離與純化【技術(shù)領(lǐng)域】,具體涉及一種艾塞那肽純化分 離方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 多肽是由20種氨基酸以不同的組成和排列方式通過(guò)肽鍵(酰胺鍵)相互連接而成 的化合物,除了是組成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單元,同時(shí)也是生物體內(nèi)的重要活性物質(zhì),在生物 界中分布較為廣泛。在生命活動(dòng)當(dāng)中,涉及到各種毒素、激素??咕?、信息素、細(xì)胞因子等 的生物活性多肽廣泛參與分子識(shí)別信號(hào)傳導(dǎo)、酶活調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)以及細(xì)胞分化等過(guò)程;生 物活性多肽的開(kāi)發(fā)和利用越來(lái)越受到科學(xué)家的重視,在醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)中的應(yīng)用 日益廣泛,尤其是醫(yī)藥行業(yè)當(dāng)中,已經(jīng)有大量的生物活性多肽通過(guò)了臨床試驗(yàn)并投放市場(chǎng), 如降血糖的艾塞那肽、治療乙型肝炎的胸腺肽、咖啡肽等等;
[0003] 研究表明,艾塞那肽是一種由39個(gè)氨基酸組成的多肽,其結(jié)構(gòu)與人的胰高血糖素 (Glucagou)有48%的同源性,與人的GLP-1 (胰高血糖素樣肽-1)有53%的同源性。艾塞 那肽是胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)受體激動(dòng)劑,是促胰島素分泌肽(Exendin-4)的化學(xué)合 成類多肽,是一種新型的治療糖尿病的藥物;艾塞那肽不僅能夠起到降低血糖的作用,同時(shí) 不但不引起患者體重的增加反而可以降低其體重,因此,在今后的一段時(shí)間內(nèi),艾塞那肽在 糖尿病的治療當(dāng)中將會(huì)占據(jù)著舉足輕重的地位。
[0004] 多肽樣品組成比較復(fù)雜,含量低,不同組分之間豐度差異比較大,由于液相色譜峰 容量的限制,基于單維的色譜分離方法和技術(shù)已經(jīng)不能滿足多肽分離的需要;近年來(lái),二維 甚至多維高效液相色譜已經(jīng)成為多肽分離純化的發(fā)展主流,經(jīng)過(guò)20多年的研究,學(xué)者們已 經(jīng)構(gòu)建了多種二維或者多維高效液相色譜系統(tǒng)用于多肽的分離純化及制備;主要有離子交 換-反相液相色譜(IEX-RPLC)、體積排阻-反相液相色譜(SEC-RPLC)、以及親水-反相液相 色譜(HILIC-RPLC)等等;這些二維模式多肽的分離分析及純化制備過(guò)程當(dāng)中顯示了極大 的分離能力。
[0005] 在離子交換-反相的二維分離體系當(dāng)中,離子交換色譜依據(jù)樣品所帶電荷的不同 而導(dǎo)致與固定相的作用力不同從而實(shí)現(xiàn)分離,而反相色譜依據(jù)疏水作用力實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的分 離,由于兩者的作用機(jī)理相互獨(dú)立,因此具有良好的正交性;這種二維的分離模式也是目前 多肽純化中使用較為廣泛的分離技術(shù);體積排阻色譜依據(jù)被分離組分的分子大小而實(shí)現(xiàn)分 離,親水色譜根據(jù)親水性的不同實(shí)現(xiàn)對(duì)不同組分的分離,這二者與反相色譜也有一定的正 交性,適合于多肽的分離純化;目前還沒(méi)有報(bào)道將二維正交的反相/陰離子交換混合模式 色譜(RP/SAX)和反相/陽(yáng)離子交換(RP/SCX)混合模式分離純化方法應(yīng)用于艾塞那肽的純 化分離。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種具有高選擇性的艾塞那肽純化分離方法,該方法采用 二維的分離純化方法:采用極性共聚的方法將具有特異性的靜電作用引入到?jīng)]有特異性的 單純依靠疏水作用的反相色譜中,即反相/陰離子交換(RP/SAX)混合模式和反相/陽(yáng)離子 交換(RP/SCX)混合模式,并通過(guò)對(duì)緩沖鹽種類、濃度、pH條件的優(yōu)化以及流動(dòng)相梯度條件 的優(yōu)化,使樣品具有適當(dāng)?shù)谋A簦⑶铱梢赃_(dá)到良好分離。
[0007] 本發(fā)明提供的艾塞那肽高效分離純化方法,其特征在于,采用二維正交分離純化 體系對(duì)艾塞那肽粗品進(jìn)行分離純化,采用極性共聚的方法將具有特異性的靜電作用引入到 沒(méi)有特異性的單純依靠疏水作用的反相色譜中,即RP/SAX混合模式和RP/SCX混合模式。
[0008] 本發(fā)明所述艾塞那肽高效分離純化方法,其特征在于:所述RP/SAX混合模式色譜 中,RP為直鏈正烷基結(jié)構(gòu),SAX為一種季銨基基團(tuán),RP/SAX的結(jié)構(gòu)式為式I :
[0009]
【權(quán)利要求】
1. 一種艾塞那肽高效分離純化方法,其特征在于,采用二維正交分離純化體系對(duì)艾塞 那肽粗品進(jìn)行分離純化,采用極性共聚的方法將具有特異性的靜電作用引入到?jīng)]有特異性 的單純依靠疏水作用的反相色譜中,即RP/SAX混合模式和RP/SCX混合模式。
2. 按照權(quán)利要求1所述艾塞那肽高效分離純化方法,其特征在于:所述RP/SAX混合模 式色譜中,RP為直鏈正烷基結(jié)構(gòu),SAX為一種季銨基基團(tuán),RP/SAX的結(jié)構(gòu)式為式I :
式I 其中,&為C2?C6的烷基中的一種,R2為Q?C8的烷基中的一種; 所述RP/SCX混合模式色譜中,RP為直鏈正烷基結(jié)構(gòu),SCX為一種磺酸基基團(tuán),RP/SCX 的結(jié)構(gòu)式為式Π :
式II 其中R3為Ci?C6烷基中間的一種,R4為Ci?c8烷基或苯基的一種。
3. 按照權(quán)利要求2所述艾塞那肽高效分離純化方法,其特征在于:在RP/SAX混合模式 色譜中,直鏈正烷基結(jié)構(gòu)與季銨基比例為1:100?100:1在RP/SCX混合模式色譜中,直鏈 正烷基鍵合基團(tuán)與磺酸基鍵合基團(tuán)的比例為1:100?100:1。
4. 按照權(quán)利要求1、2或3所述艾塞那肽高效分離純化方法,其特征在于:所述二維正 交分離純化體系中,第一維使用反相/陰離子交換分離純化體系,即RP/SAX ;第二維使用反 相/陽(yáng)離子交換分離純化體系,即RP/SCX。
5. 按照權(quán)利要求4所述艾塞那肽高效分離純化方法,其特征在于:第一維分離純化體 系流動(dòng)相為,A相:緩沖鹽,B相:水,C相:高氯酸鈉,D相:乙腈。
6. 按照權(quán)利要求5所述艾塞那肽高效分離純化方法,其特征在于,在第一維分離純化 體系中: A相緩沖鹽選自a、b或c,其中: a、 磷酸三乙胺緩沖鹽,濃度50-200mM,pH5. 0-8. Ο ; b、 甲酸三乙胺緩沖鹽,濃度50-200mM,ρΗ5. 0-8. Ο ; c、 乙酸三乙胺緩沖鹽,濃度50-200mM,ρΗ5· 0-8. Ο ; C相高氯酸鈉水溶液的濃度為lOO-lOOOmM ; D相乙腈含量變化特征在于:0-240min,5%?80%。
7. 按照權(quán)利要求4所述艾塞那肽高效分離純化方法,其特征在于:第二維分離純化體 系流動(dòng)相為,A相:緩沖鹽,B相:水,C相:高氯酸鈉,D相:乙腈。
8. 按照權(quán)利要求7所述艾塞那肽高效分離純化方法,其特征在于:在第二維分離純化 體系中: A相緩沖鹽選自a、b或c,其中: a、 磷酸三乙胺緩沖鹽,濃度50-200mM,pH2. 0-5. 0 ; b、 甲酸三乙胺緩沖鹽,濃度50-200mM,pH2. 0-5. 0 ; c、 乙酸三乙胺緩沖鹽,濃度50-200mM,ρΗ2· 0-5. 0 ; C相高氯酸鈉水溶液的濃度為lOO-lOOOmM ; D相乙腈含量變化特征在于:0-240min,5%?80%。
9. 按照權(quán)利要求1?3、5?8任一所述艾塞那肽高效分離純化方法,其特征在于,所述 分離純化方法其色譜操作參數(shù)如下: 進(jìn)樣量:100μ L-1000mL ; 流速:〇. 5-300. OmL/min ; 柱溫:15-60° C; 色譜柱內(nèi)徑:4. 6-100mm ; 色譜柱柱長(zhǎng):250-1000mm。
10. 按照權(quán)利要求1?3、5?8任一所述艾塞那肽高效分離純化方法,其特征在于具體 步驟如下: 1 )、稱取適量艾塞那肽粗品,用Tris鹽-甲醇溶解,配制成濃度為100mg/mL的溶液,用 0. 22m濾膜過(guò)濾,待用; 2) 、一維使用陰離子交換-反相分離:色譜柱內(nèi)徑4. 6-100mm,色譜柱柱長(zhǎng): 250-1000_,流速 0· 5-300. OmL/min,柱溫 15-60° C,進(jìn)樣量 1 μ L ?1000mL ;流動(dòng)相中添加 50-200mM的緩沖鹽和濃度為lOO-lOOOmM的高氯酸納,乙腈為強(qiáng)洗脫溶劑,等度或梯度條件 洗脫,按峰形收集餾分,餾分使用低溫離心濃縮凍干; 3) 、二維使用陽(yáng)離子交換-反相混合模式色譜柱分離;色譜柱內(nèi)徑4. 6-100mm,色譜柱 柱長(zhǎng):250-1000_,流速 0· 5-300. OmL/min,柱溫 15-60° C,進(jìn)樣量 1 μ L ?lOOOmL;流動(dòng)相 中添加50-200mM的緩沖鹽、濃度為lOO-lOOOmM的高氯酸納,乙腈為強(qiáng)洗脫溶劑,梯度條件 洗脫,按峰形收集餾分,餾分使用低溫離心濃縮凍干。
【文檔編號(hào)】C07K1/18GK104250298SQ201310256359
【公開(kāi)日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2013年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月25日
【發(fā)明者】周永正, 秦永杰, 張慧 申請(qǐng)人:浙江華譜新創(chuàng)科技有限公司