具有高抗疲勞活性的梅魚魚鰾膠原蛋白的制備工藝的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種具有高抗疲勞活性的梅魚魚鰾膠原蛋白的制備工藝，采用海產品加工廢料—梅魚魚鰾作為提取原料，先將梅魚魚鰾除雜蛋白、脫脂，然后先用胃蛋白酶提取膠原蛋白，再將胃蛋白酶提取膠原蛋白后所得沉淀用復合酶提取膠原蛋白，合并提取到的膠原蛋白，離心干燥后得到具有高抗疲勞活性的梅魚魚鰾膠原蛋白。膠原蛋白提取率高，能夠有效利用廢棄的梅魚魚鰾，提高了經濟效益，制得的膠原蛋白常溫下可溶于蒸餾水，無異味，苦味，抗疲勞活性好，無明顯毒副作用。
【專利說明】具有高抗疲勞活性的梅魚魚鰾膠原蛋白的制備工藝
【技術領域】
[0001]本發明涉及海洋魚類膠原蛋白提取【技術領域】，特別涉及一種具有高抗疲勞活性的梅魚魚鰾膠原蛋白的制備工藝。
【背景技術】
[0002]梅魚(Pseudosciaena polyactis)屬于脊索動物門硬骨魚綱S盧形目S盧總科,是溫水性近底層的小型經濟魚類，產量較大，在我國近海尤其是舟山海域一帶均有出產。梅魚亦稱“梅大頭”、“梅頭”，形狀像黃魚而小，頭大，尾柄細，腹背和鰭都呈黃色。梅魚作為我國海洋捕撈的重要品種，其分布廣、產量高、價格便宜而為廣大漁民所知。梅魚加工后能獲得大量的魚鰾，現有處理方法常作為廢料處理，無法有效利用。
[0003]梅魚魚鰾內富含有大量的生物大分子物質膠原蛋白，它具有支撐器官和保護肌體的功能，也是組成細胞間質的最重要功能蛋白質。人體對膠原蛋白的吸收和利用能力強，它主要以水溶液的形式貯存于組織中，是人體補充和合成蛋白質的原料，具有改善組織的營養狀況和促進機體新陳代謝的作用。現有研究中對膠原蛋白的注意力越來越多，但未見關于梅魚魚鰾膠原蛋白的相關報道。膠原蛋白的提取方法依據提取介質的不同可分為5類，即酸法、堿法、酶法、鹽法以及熱水浸提法等。把酶提法和其他提取方法相比，酶提法得率顯著高于酸提法(鄭淼.中國林蛙皮膚膠原蛋白的提取純化及性質研究[J].2008.6)。酶法提取膠原蛋白是利用蛋白酶將膠原迸行限制性降解，將末端肽切割下來，由于膠原肽鏈間的共價交聯鍵都是分子末端里的賴氨酸或羥賴氨酸的相互作用形成的，末端肽被切下來后。含三螺旋結構的主體部分可溶于低濃度有機酸或中性溶液中被提取出來。
[0004]CN101234126A的發明公開了一種霞水母來源的具有抗疲勞活性的膠原蛋白活性肽及其制備工藝，將霞水母脫除鹽分，再熔融處理，最后經均質、脫色、脫鹽和干燥后獲得具有抗疲勞活性的膠原蛋白活性肽。`該方法不適用于梅魚魚鰾膠原蛋白的制備。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種具有高抗疲勞活性的梅魚魚鰾膠原蛋白的制備工藝，工藝簡單易行，膠原蛋白提取率高，能夠有效利用廢棄的梅魚魚鰾，提高了經濟效益，制得的膠原蛋白常溫下可溶于蒸餾水，無異味，苦味，抗疲勞活性好，無明顯毒副作用。
[0006]本發明解決其技術問題所采用的技術方案是:
一種具有高抗疲勞活性的梅魚魚鰾膠原蛋白的制備工藝，包括如下步驟:
(I)梅魚魚鰾去除內壁薄膜及血管，清水洗凈，接著將梅魚魚鰾除雜蛋白及脫脂。
[0007](2)將步驟(I)處理得到的梅魚魚鰾按照l:30_40(m/v)的料液比加入pH為
1.9-2.1的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，再加入梅魚魚鰾重量1%_1.5%的胃蛋白酶，在4±0.5°C下酶解24-36h，加入終濃度為20±lmmol/L的EDTA滅酶，室溫離心15_20min，取上清液用活性炭除色素后，在4±0.5°C下離心30-40min，收集上清液，先于pH為3.5-4.0的的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中透析12±lh，再于pH為5.5-6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中透析12±lh，最后于蒸餾水中透析至中性，得到梅魚魚鰾膠原蛋白A提取液。
[0008](3)收集步驟(2)兩次離心產生的沉淀，將沉淀按照l:40-45(m/v)的料液比加入pH為8.4-8.6的磷酸氫二鈉-碳酸鹽緩沖液，加入沉淀重量1%_1.5%的復合酶，在4±0.5V下酶解24-36h，加入終濃度為20±lmmol/L的EDTA滅酶，在4±0.5°C下離心30_40min，取上清液用活性炭除色素后，先于PH為7.9-8.0的磷酸氫二鈉-碳酸鹽緩沖液中透析12±lh，再于pH為7.5-7.7的磷酸氫二鈉-碳酸鹽緩沖液中透析12 ± lh，最后于蒸餾水中透析至中性，得到梅魚魚鰾膠原蛋白B提取液。
[0009](4)合并梅魚魚鰾膠原蛋白A提取液和梅魚魚鰾膠原蛋白B提取液，4±0.5°C下離心15-20min，濃縮后冷凍干燥。
[0010]本發明采用海產品加工廢料一梅魚魚鰾作為提取原料，先將梅魚魚鰾除雜蛋白、脫脂，然后先用胃蛋白酶提取膠原蛋白，再將胃蛋白酶提取膠原蛋白后所得沉淀用復合酶提取膠原蛋白，合并提取到的膠原蛋白，離心干燥后得到具有高抗疲勞活性的梅魚魚鰾膠原蛋白。膠原蛋白提取率高，能夠有效利用廢棄的梅魚魚鰾，提高了經濟效益，制得的膠原蛋白常溫下可溶于蒸餾水，無異味，苦味，抗疲勞活性好，無明顯毒副作用。
[0011]本發明針對梅魚魚 鰾的特性，開發了有效的提取工藝，在一次提取時(即步驟
(2))，采用胃蛋白酶提取，酶解溫度低，優化了胃蛋白酶的使用量和酶解溫度及時間，控制了合適的料液比，獲得了較好的提取效果。梅魚魚鰾與pH為1.9-2.1的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液的料液比控制在1:30-40 (m/v)，當料液比控制在1:30-40時，隨著料液比的增加，提取率增大，到料液比為1: 40提取率最佳，料液比超過1: 40，提取率反而會下降。一次提取時采用胃蛋白酶而非中性蛋白酶、堿性蛋白酶等，實驗發現，胃蛋白酶更適合梅魚魚鰾的提取，提取效果好。PH為1.9-2.1緩沖液與胃蛋白酶配合提取，提取效果好。酶解溫度采用4±0.5°C。而非常規的37°C左右的溫度，這樣提取效果好，酶解溫度在37°C左右時，易于導致梅魚魚鰾膠原蛋白變性，抗疲勞活性差。采用EDTA滅酶，而非常規的高溫加熱滅酶，這樣梅魚魚鰾膠原蛋白不會變性，抗疲勞活性好。
[0012]一次提取后，剩余的沉淀廢渣，本發明還進行了再提取，開發了適合的提取條件，采用復合酶提取，優化復合酶使用量和酶解溫度及時間，控制了合適的料液比，獲得了較好的提取效果。
[0013]作為優選，步驟(I)中梅魚魚鰾除雜蛋白及脫脂具體步驟為:將梅魚魚鰾浸泡在
0.1-0.2mol/L NaOH溶液中攪拌4_6h，至少連續重復6次，然后用蒸餾水反復清洗至中性；再用質量分數為10-15%的正丁醇溶液浸泡4-6h，至少連續重復6次，然后用蒸餾水反復清洗至無正丁醇。
[0014]作為優選，步驟(3)中所述復合酶由胰蛋白酶和堿性蛋白酶組成。
[0015]作為優選，胰蛋白酶與堿性蛋白酶的的重量比為1:1-2。這樣提取效果好。
[0016]作為優選，步驟(4)中離心速度為10000-12000r/min。
[0017]本發明的有益效果是:工藝簡單易行，膠原蛋白提取率高，能夠有效利用廢棄的梅魚魚鰾，提高了經濟效益，制得的膠原蛋白常溫下可溶于蒸餾水，無異味，苦味，抗疲勞活性好，無明顯毒副作用。
【專利附圖】
【附圖說明】[0018]圖1是羥脯氨酸標準曲線。
[0019]圖2梅魚膠原蛋白及標準泳道的電泳圖。
【具體實施方式】
[0020]下面通過具體實施例，并結合附圖，對本發明的技術方案作進一步的具體說明。[0021 ] 本發明中，若非特指，所采用的原料和設備等均可從市場購得或是本領域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規方法。
[0022]實驗材料
新梅魚魚鰾購于舟山南珍菜市場。
[0023]主要試劑
胃蛋白酶(1:3000)；
胰蛋白酶(1:250)；
堿性蛋白酶(200000U/g)；
L-羥脯氨酸:上海朝暉生物科技有限公司；
次高分子量Marker (43000-200000D):中國科學院上海生命科學研究院；
血清尿素氮試劑盒，肝糖原試劑盒，肌糖原試劑盒(均購自南京建成生物工程研究所)。
[0024]乙二醇獨甲醚；十二烷基`磺酸鈉(SDS);巰基乙醇；丙烯酰胺(Acr) ；N, N’ -甲叉雙丙稀酰胺(Bis);對二甲氨基苯甲醛；高氯酸；氯胺T ;冰醋酸；檸檬酸等均為分析純試劑。
[0025]主要儀器
RE-2000型旋轉蒸發儀:上海亞榮生化儀器廠；
CF16RX II型高速冷凍離心機；
LGJ-18冷凍干燥機:北京松源科技有限公司；
SSW-420-2S型電熱恒溫水浴箱:上海博訊實業有限公司；
752N型紫外分光光度計:上海精科電子有限公司；
DS-1組織搗碎機；041BR型電泳儀；
透析袋(截留分子量14000±200D)；
HDM-500mL型數顯恒溫攪拌電熱套等。
[0026]pH 1.9-2.1的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液:
先配制磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(PH4.0):甲液:取檸檬酸21g，加蒸餾水水使溶解成1000ml，置冰箱內保存。乙液:取磷酸氫二鈉71.63g，加水使溶解成1000ml。取上述甲液61.45ml與乙液38.55ml混合，搖勻，即得。
[0027]然后加入冰醋酸調節pH為1.9-2.1得pH 1.9-2.1的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。
[0028]pH為5.5-6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液可在pH4.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液加氫氧化鈉調節。
[0029]pH為8.4-8.6的磷酸氫二鈉-碳酸鹽緩沖液:
0.05mol/L PBS (磷酸緩沖液，PBS)的配制:
甲液:0.05mol/L Na2HPO4溶液:稱取磷酸氫二鈉7.099g,加蒸懼水至IOOOml。乙液:
0.05mol/L KH2PO4溶液:稱取磷酸二氫鉀6.803g，加蒸餾水至IOOOml。將甲乙液分裝在棕色瓶內，于4°C冰箱中保存，用時甲、乙兩液各按1:1比例混合，即得pH為6.81的磷酸緩沖液。
[0030]0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液:稱取 Na2CO3 1.59g,NaHC032.93g加蒸餾水至 1000ml。
[0031]將0.05mol/L PBS與0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液1:1混勻后，用氫氧化鈉調節pH到8.4-8.6，得pH為8.4-8.6的磷酸氫二鈉-碳酸鹽緩沖液。
[0032]7.9-8.0的磷酸氫二鈉-碳酸鈉緩沖液、pH為7.5-7.7的磷酸氫二鈉-碳酸鈉緩沖液根據PH做適應性調節。
[0033]實施例1:
(I)梅魚魚鰾去除內壁薄膜及血管，清水洗凈，接著將將梅魚魚鰾浸泡在0.2mol/LNaOH溶液中攪拌4h，至少連續重復6次，然后用蒸餾水反復清洗至中性；再用質量分數為15%的正丁醇溶液浸泡4h，至少連續重復6次，然后用蒸餾水反復清洗至無正丁醇。
[0034](2)將步驟(I)處理得到的梅魚魚鰾按照1:30 (g/ml)的料液比加入pH為1.9-2.1的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，再加入梅魚魚鰾重量1.5%的胃蛋白酶，在4±0.5°C下酶解36h，加入終濃度為20± lmmol/L的EDTA滅酶，5000r/min室溫離心20min，取上清液用活性炭除色素后，在4±0.5°C下lOOOOr/min離心40min，收集上清液，先于pH為3.5-4.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中透析12±lh，再于pH為5.5-6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中透析12± lh，最后于蒸餾水中透析至中性，得到梅魚魚鰾膠原蛋白A提取液。
[0035]利用不同pH的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液梯度透析，梅魚魚鰾膠原蛋白純化效果好。
[0036](3)收集步驟(2)兩次離`心產`生的沉淀,將沉淀按照1:45 (g/ml)的料液比加入pH為8.4-8.6的磷酸氫二鈉-碳酸鹽緩沖液，加入沉淀重量1.5%的復合酶，所述復合酶由胰蛋白酶和堿性蛋白酶組成，胰蛋白酶與堿性蛋白酶的的重量比為1: 2 ;在4±0.5°C下酶解36h，加入終濃度為20± lmmol/L的EDTA滅酶，在4±0.5°C下離心30min，取上清液用活性炭除色素后，先于PH為7.9-8.0的磷酸氫二鈉-碳酸鹽緩沖液中透析12 土 lh，再于pH為
7.5-7.7的磷酸氫二鈉-碳酸鹽緩沖液中透析12±lh，最后于蒸餾水中透析至中性，得到梅魚魚鰾膠原蛋白B提取液。
[0037]利用不同pH的磷酸氫二鈉-碳酸鹽緩沖液梯度透析，梅魚魚鰾膠原蛋白純化效果好。
[0038](4)合并梅魚魚鰾膠原蛋白A提取液和梅魚魚鰾膠原蛋白B提取液，4±0.5°C下，10000r/min離心20min，濃縮后冷凍干燥，得梅魚魚鰾膠原蛋白。
[0039]實施例2:
(I)梅魚魚鰾去除內壁薄膜及血管，清水洗凈，接著將將梅魚魚鰾浸泡在0.lmol/LNaOH溶液中攪拌6h，至少連續重復6次，然后用蒸餾水反復清洗至中性；再用質量分數為10%的正丁醇溶液浸泡6h，至少連續重復6次，然后用蒸餾水反復清洗至無正丁醇。
[0040](2)將步驟(I)處理得到的梅魚魚鰾按照1: 40 (g/ml)的料液比加入pH為
1.9-2.1的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，再加入梅魚魚鰾重量1%的胃蛋白酶，在4±0.5V下酶解24h，加入終濃度為20 土 lmmol/L的EDTA滅酶，5000r/min室溫離心15min，取上清液用活性炭除色素后，在4 ± 0.5°C下10000r/min離心30min，收集上清液，先于pH為3.5-4.0的的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中透析12±lh，再于pH為5.5-6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中透析12±lh，最后于蒸餾水中透析至中性，得到梅魚魚鰾膠原蛋白A提取液；
(3)收集步驟(2)兩次離心產生的沉淀，將沉淀按照1:40(g/ml)的料液比加入pH為8.4-8.6的磷酸氫二鈉-碳酸鹽緩沖液，加入沉淀重量1%的復合酶，所述復合酶由胰蛋白酶和堿性蛋白酶組成，胰蛋白酶與堿性蛋白酶的的重量比為1:1 ;在4±0.5°C下酶解24h，加入終濃度為20±lmmol/L的EDTA滅酶，在4±0.5°C下離心40min，取上清液用活性炭除色素后，先于PH為7.9-8.0的磷酸氫二鈉-碳酸鹽緩沖液中透析12 土 lh，再于pH為7.5-7.7的磷酸氫二鈉-碳酸鹽緩沖液中透析12±lh，最后于蒸餾水中透析至中性，得到梅魚魚鰾月父原蛋白B提取液；
(4)合并梅魚魚鰾膠原蛋白A提取液和梅魚魚鰾膠原蛋白B提取液，4±0.5°C下，12000r/min離心15min，濃縮后冷凍干燥，得梅魚魚鰾膠原蛋白。
[0041]試驗部分:
1、胃蛋白酶酶解條件的確定
對梅魚魚鰾，選取胃蛋白酶添加量(A )，料液比(B )，酶解溫度(C )和酶解時間(D )為影響因素，以膠原蛋白的提取率為指標，采用L9 (34)正交實驗設計，進行提取工藝研究，確定酶法提取的最佳工藝條件，正交設計表見表1。
【權利要求】
1.一種具有高抗疲勞活性的梅魚魚鰾膠原蛋白的制備工藝，其特征在于:包括如下步驟: (1)梅魚魚鰾去除內壁薄膜及血管，清水洗凈，接著將梅魚魚鰾除雜蛋白及脫脂； (2)將步驟(I)處理得到的梅魚魚鰾按照1:30-40(m/v)的料液比加入pH為1.9-2.1的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，再加入梅魚魚鰾重量1%_1.5%的胃蛋白酶，在4±0.5°C下酶解24-36h，加入終濃度為20±lmmol/L的EDTA滅酶，室溫離心15_20min，取上清液用活性炭除色素后，在4±0.5°C下離心30-40min，收集上清液，先于pH為3.5-4.0的的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中透析12 土 lh，再于pH為5.5-6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中透析12±lh，最后于蒸餾水中透析至中性，得到梅魚魚鰾膠原蛋白A提取液； (3)收集步驟(2)兩次離心產生的沉淀，將沉淀按照1:40-45(m/v)的料液比加入pH為8.4-8.6的磷酸氫二鈉-碳酸鹽緩沖液，加入沉淀重量1%_1.5%的復合酶，在4±0.5°C下酶解24-36h，加入終濃度為20±lmmol/L的EDTA滅酶，在4±0.5°C下離心30_40min，取上清液用活性炭除色素后，先于PH為7.9-8.0的磷酸氫二鈉-碳酸鹽緩沖液中透析12±lh，再于pH為7.5-7.7的磷酸氫二鈉-碳酸鹽緩沖液中透析12±lh，最后于蒸餾水中透析至中性，得到梅魚魚鰾 膠原蛋白B提取液； (4)合并梅魚魚鰾膠原蛋白A提取液和梅魚魚鰾膠原蛋白B提取液，4±0.5°C下離心15-20min,濃縮后冷凍干燥。
2.根據權利要求1所述的具有高抗疲勞活性的梅魚魚鰾膠原蛋白的制備工藝，其特征在于:步驟(I)中梅魚魚鰾除雜蛋白及脫脂具體步驟為:將梅魚魚鰾浸泡在0.1-0.2mol/LNaOH溶液中攪拌4-6h，至少連續重復6次，然后用蒸餾水反復清洗至中性；再用質量分數為10-15%的正丁醇溶液浸泡4-6h，至少連續重復6次，然后用蒸餾水反復清洗至無正丁醇。
3.根據權利要求1或2所述的具有高抗疲勞活性的梅魚魚鰾膠原蛋白的制備工藝，其特征在于:步驟(3)中所述復合酶由胰蛋白酶和堿性蛋白酶組成。
4.根據權利要求3所述的具有高抗疲勞活性的梅魚魚鰾膠原蛋白的制備工藝，其特征在于:胰蛋白酶與堿性蛋白酶的的重量比為1:1-2。
5.根據權利要求1或2所述的具有高抗疲勞活性的梅魚魚鰾膠原蛋白的制備工藝，其特征在于:步驟(4)中離心速度為10000-12000r/min。
【文檔編號】C07K1/34GK103451258SQ201310243516
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年6月19日 優先權日:2013年6月19日
【發明者】丁國芳, 吳飛紅, 徐敏, 張海龍, 王立博, 楊最素, 李 榮 申請人:浙江海洋學院