一種皮卡那肽的制備方法
【專利摘要】本發明采用固液結合的方法合成皮卡那肽，其中兩對二硫鍵采用定向方法先后形成，避免了二硫鍵錯配情況的發生，有利于后續純化，本發明的方法具有操作簡便、自動化率高、溶劑使用量少、綠色環保等優點。
【專利說明】一種皮卡那肽的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種多肽的制備方法，具體地涉及皮卡那肽的制備方法。
【背景技術】
[0002] 皮卡那肽（Plecanatide)是一種合成的尿鳥苷素類似物(尿鳥苷素是一種促尿鈉 排泄激素，能夠調節胃腸道中離子和液體的轉運)，皮卡那肽進入體內后與胃腸道黏膜內皮 細胞上的鳥苷酸環化酶C結合并將其激活，活化囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白（CFTR)，促 進氯化物和水分進入腸道，從而促進腸道蠕動，改善便秘癥狀。
[0003] Synergy公司于2010年10月6日公布其在研新藥皮卡那肽（代碼：SP304)治療 胃腸道疾病的II a期臨床實驗結果。這項在慢性便秘患者中進行的研究顯示，該藥物能夠 改善患者的腸道功能，促進腸道蠕動，減少腹部不適狀。在試驗中，沒有出現腹瀉等不良反 應，在試驗劑量下也沒有檢測到皮卡那肽被系統吸收。該藥物有望用于治慢性便秘（CC)、便 秘型腸道易激綜合征（IBS-C)以及其他胃腸道疾病。CC和IBS-C都是常見的胃腸道疾病， 可能對患者的工作和生活質量造成嚴重影響。Synergy公司將繼續進行皮卡那肽的其他臨 床試驗。
【發明內容】
[0004] 本發明采用固液結合的方法合成皮卡那肽，具有操作簡便、自動化率高、溶劑使用 量少、綠色環保等優點，同時兩對二硫鍵采用定向方法合成，避免了二硫鍵錯配情況的發 生，有利于后續純化。
[0005] 皮卡那肽的結構為：
[0006] H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-C ys-Leu-〇H(二硫鍵 4-12, 7-15)
[0007] 本發明提供了一種制備皮卡那肽的方法，包括以下步驟：
[0008] 1)將Fmoc-Leu-OH與樹脂偶聯,得到Fmoc-Leu-樹脂；
[0009] 2)按照皮卡那肽的肽序從C端到N端依次將氨基酸原料偶聯到步驟1)得到的 Fmoc-Leu-樹脂上，得到膚樹脂片段 H-Asn (Trt) -Asp (OtBu) -Asp (OtBu) -Cys (X) -Glu (OtBu )-Leu-Cys (Y) -Val-Asn (Trt) -Val-Ala-Cys (X) -Thr (tBu) -Gly-Cys (Y) -Leu-樹脂，其中 X和 Y選自Trt、Acm、mmt或StBu,并且X不同于Y ;
[0010] 3)將步驟2)得到的肽樹脂裂解并脫除除Cys外的氨基酸的側鏈保護基，并分別脫 除Cys的兩種保護基X和Y，經氧化分別形成兩對二硫鍵，得到皮卡那肽。
[0011] 其中，步驟1)所述的樹脂是Wang樹脂或CTC樹脂，所用的偶聯劑為：a)所用樹脂 為wang樹脂時所用偶聯劑為HOBT/DIC/DMAP ;b)所用樹脂為2-CTC樹脂時所用偶聯劑為 DIPEA。
[0012] 步驟1)所述的Fmoc-Leu-樹脂的替代度為0· 25?0· 55mmol/g。
[0013] 步驟2)中所用的偶聯劑為H0BT/DIC。
[0014] 步驟3)中，根據反應條件不同，脫除Cys的保護基X或Y可以與裂解肽樹脂并脫 除除Cys外的其他氨基酸的側鏈保護基同時進行；脫除Cys的保護基X或Y也可與氧化形 成二硫鍵（4-12)或二硫鍵（7-15)同時進行；但是二硫鍵（4-12)和二硫鍵（7-15)的形成是 分別進行的，這樣可避免二硫鍵錯配(例如（4-7 )、（ 12-15 ))情況的發生，有利于后續純化。
[0015] 其中可使用含5%TFA的裂解液，優選TFA :DCM=5 :95 (V/V)將肽片段從CTC樹脂上 裂解下來或將側鏈保護基mmt脫除。
[0016] 可使用含95%TFA的裂解液，優選TFA :EDT :水=95 :2. 5 :2. 5(V/V)將肽片段從CTC 樹脂或wang樹脂上裂解下來，或將側鏈保護基Trt、OtBu、tBu或mmt脫除。
[0017] 可使用I2溶液，優選含300mmol/l I2的乙醇溶液將側鏈保護基Acm脫除。
[0018] 可使用β -巰基乙醇溶液，優選含20% β -巰基乙醇和0. IM N-甲基嗎啉的DMF或 水溶液將側鏈保護基StBu脫除。
[0019] 步驟3)中形成二硫鍵的條件為各種可使脫去側鏈保護基的Cys之間形成二硫鍵 的氧化條件，包括但不限于空氣或氧氣氧化、DMSO氧化、I 2氧化或H2O2氧化。
【具體實施方式】
[0020] 本文的術語"肽樹脂"是指多肽的C端連有樹脂、N端的氨基連有Fmoc保護基的多 肽樹脂。
[0021] 本文中"二硫鍵（4-12)"是指在皮卡那肽氨基酸序列中第4位Cys與第12位Cys 之間形成的二硫鍵；"二硫鍵（7-15)"是指在皮卡那肽氨基酸序列中第7位Cys與第15位 Cys之間形成的二硫鍵。
[0022] "裂解肽樹脂"是指將肽片段從樹脂上裂解下來。
[0023] 本發明中所用縮寫及其含義列于下表：
[0024]
【權利要求】
1. 一種制備皮卡那肽的方法，包括以下步驟： 1) 將Fmoc-Leu-OH與樹脂偶聯，得到Fmoc-Leu-樹脂， 2) 按照皮卡那肽的肽序從C端到N端依次將氨基酸原料偶聯到步驟1)得到的 Fmoc-Leu-樹脂上，得到膚樹脂片段 H-Asn (Trt) -Asp (OtBu) -Asp (OtBu) -Cys (X) -Glu (OtBu )-Leu-Cys (Y) -Val-Asn (Trt) -Val-Ala-Cys (X) -Thr (tBu) -Gly-Cys (Y) -Leu-樹脂，其中 X和 Y選自Trt、Acm、mmt或StBu,并且X不同于Y， 3) 將步驟2)得到的肽樹脂裂解并脫除除Cys外的氨基酸的側鏈保護基，并分別脫除 Cys的兩種保護基X和Y，經氧化分別形成二硫鍵（4-12)與二硫鍵（7-15)，得到皮卡那肽。
2. 權利要求1的方法，其中步驟1)所述的樹脂是Wang樹脂或CTC樹脂。
3. 權利要求1的方法，其中步驟3)中，脫除Cys的保護基X或Y可以與裂解肽樹脂并 脫除除Cys外的其他氨基酸的側鏈保護基同時進行；脫除Cys的保護基X或Y也可與氧化 形成二硫鍵（4-12 )或二硫鍵（7-15 )同時進行；二硫鍵（4-12 )和二硫鍵（7-15 )的形成是分 別進行的。
4. 權利要求1的方法，其中步驟3)中可使用含5%TFA的裂解液，優選TFA :DCM=5 :95 (V/V)將肽片段從CTC樹脂上裂解下來或將側鏈保護基mmt脫除；可使用含95%TFA的裂解 液，優選TFA :EDT :水=95 :2. 5 :2. 5 (V/V)將肽片段從CTC樹脂或wang樹脂上裂解下來，或 將側鏈保護基Trt、OtBu、tBu或mmt脫除。
5. 權利要求1的方法，其中步驟3)中可使用I2溶液，優選含300mmol/ll2的乙醇溶液 將側鏈保護基Acm脫除。
6. 權利要求1的方法，其中步驟3)中可使用β-巰基乙醇溶液，優選含20%β-巰基乙 醇和0. IM N-甲基嗎啉的DMF溶液或水溶液將側鏈保護基StBu脫除。
7. 權利要求1-6任一項的方法，其中步驟3)中氧化形成二硫鍵是采用空氣或氧氣氧 化、DMSO氧化、I2氧化或H 2O2氧化的方法。
8. 權利要求7的方法，其中步驟1)中所用的偶聯劑為：a)所用樹脂為wang樹脂時所 用偶聯劑為HOBT/DIC/DMAP ;b)所用樹脂為2-CTC樹脂時所用偶聯劑為DIPEA。
9. 權利要求7的方法，其中步驟2)中所用的偶聯劑為H0BT/DIC。
10. 權利要求1的方法，其中步驟1)中Fmoc-Leu-樹脂的替代度為0. 25?0. 55_〇1/ g°
【文檔編號】C07K1/04GK104211777SQ201310209459
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年5月30日 優先權日:2013年5月30日
【發明者】宓鵬程, 潘俊鋒, 馬亞平, 袁建成 申請人:深圳翰宇藥業股份有限公司