專利名稱：利用酶膜反應器連續制備蠶蛹蛋白抗氧化肽的方法
技術領域：
本發明涉及食品生物化學領域，可作為功能性添加劑用于食品、化妝品和藥物，具體涉及一種利用酶膜反應器連續制備蠶蛹蛋白抗氧化肽的方法。
背景技術：
自由基與人類許多慢性疾病如癌癥、冠狀動脈心臟病和老年癡呆癥等有關，因此，清除體內自由基能夠提高機體對疾病的抵抗和預防能力，目前已引起社會各界的廣泛關注。人工合成的抗氧化劑如丁基羥基茴香醚(BHA)和2，6- 二叔丁基對甲基酚等(BHT)常被作為食品添加劑用于保鮮，但人工合成的抗氧化劑對人類健康具有一定的危害，因而，開發高效、安全的抗氧化劑成為人們研究的熱點。抗氧化肽作為生物活性肽的一種，具有成本低、效果好和食用安全等特性，適宜作為人類保健的抗氧化劑使用。現已從麥胚蛋白、燕麥蛋白、花生蛋白和膠原蛋白等食源蛋白中獲得了大量高活性的抗氧化肽。蠶蛹中蛋白含量約為60%左右，氨基酸種類齊全，組成合理，但因其在繅絲過程中受到熱和堿液處理，蛋白不僅具有異味，而且蛋白嚴重變性，因而限制了蠶蛹蛋白在工業中的應用。現主要被作為飼料使用，經濟價值極低。開發蠶蛹蛋白抗氧化肽對有效利用蠶蛹資源具有重要意義。中國專利CN102690322A (申請公布號)中公開了一種蠶蛹蛋白酶解抗氧化肽的脫色方法，脫色后的蠶蛹蛋白抗氧化肽可用于保健食品行業。王偉等報道了利用雙酶分步法制備蠶蛹蛋白抗氧化肽，所得的酶解產物具有良好的清除DPPH自由基和羥自由基的能力(王偉，王楠，周兵，等.雙酶分步酶解蠶蛹蛋白及其產物抗氧化活性的研究[J].浙江農業學報，2012，24 (2): 300-304)。李高揚等利用S印hadex G-25凝膠層析法從蠶蛹蛋白的胃蛋白酶水解產物中分離得到一種具有抗氧化活性的多肽，其分子量為892Da，含有酪氨酸殘基(李高揚.蠶蛹抗氧 化多肽的制備及分離純化研究[D].2011，廣州:華南理工大學)。由此可以看出，蠶蛹蛋白適宜制備抗氧化肽。現有研究均是采用間歇酶解法制備蠶蛹蛋白抗氧化肽，該方法存在蛋白酶利用率低、生產周期長、產物質量不穩和勞動強度大等缺點，不宜工業化生產。酶膜反應器能夠很好地解決這些不足，現關于使用酶膜反應器制備抗氧化肽的報道不多，僅有專利“不補料酶解-膜分離耦合制備魚鱗膠原蛋白抗氧化肽的方法(申請號:201010188410.5)”和“一種利用酶膜反應器制備燕麥抗氧化肽的方法(申請號:201110112515.7)公開報道，尚未有利用酶膜反應器連續制備蠶蛹蛋白抗氧化肽的報道。
發明內容
解決的技術問題:本發明的目的是提供一種利用酶膜反應器連續制備蠶蛹蛋白抗氧化肽的方法。技術方案:利用酶膜反應器連續制備蠶蛹蛋白抗氧化肽的方法，先將蠶蛹蛋白用蒸餾水配制成懸浮液，利用均質機均質后，與內切酶一起加入到酶膜反應器中進行連續制備抗氧化肽，酶解產物溶液透過超濾膜，未完全反應的蠶蛹蛋白和內切酶被截留后重新流至反應罐中繼續反應，透過超濾膜的酶解產物透過液被收集，經濃縮后噴霧干燥，即得到粉末狀蠶蛹蛋白抗氧化肽產品。具體步驟為:將蠶蛹蛋白用蒸懼水配制成1.0% 4.0% (w/v, g/mL)溶液,均質后調節其pH至6.0 — 7.5，加熱至40°C — 60°C后和內切酶一起加入到反應罐中，攪拌均勻后進行酶膜反應，加酶量為2000-6000U/g，pH為6.0-7.5，溫度為40°C — 60°C，超濾膜的截留分子量為3-10kDa，超濾壓力為0.6-0.9kg/cm2,出肽速率為4_6mL/min ;酶解產物溶液透過超濾膜，未完全反應的蠶蛹蛋白和內切酶被截留后重新流至反應罐中繼續反應，透過超濾膜的酶解產物透過液被收集得蠶蛹蛋白抗氧化肽；同時，在酶膜反應過程中依據酶解產物透過液中肽的濃度，在反應罐中補充相同濃度的蠶蛹蛋白溶液。將酶膜反應的透過液用真空濃縮至肽含量8 % (w/v, g/mL),在進風溫度1900C -220°C和出風溫度90°C-11(TC下進行噴霧干燥，即得到粉狀蠶蛹蛋白抗氧化肽產品O上述內切酶選用中性蛋白酶。采用清除DPPH自由基能力、清除羥自由基能力和螯合亞鐵離子能力評價蠶蛹蛋白抗氧化肽的抗氧化活性，具體方法如下:I)清除 DPPH 自由基能力的測定(Amarowicz R, Naczk M, Shahidi F.Antioxidantactivity of various fractions of non-tanin phenolics of canola hulls[J].J AgricFood Chem, 2000，48:2755-2759)在2mL樣品中加入2mL濃度為0.04g/L的DPPH無水乙醇溶液，混勻后室溫反應20min, 3500r/min離心IOmin,取上清液,在517nm測其吸光值；另取2mL樣品，加入2mL無水乙醇，混勻后室溫反應20min, 3500r/min離心IOmin,取上清液,在517nm測其吸光值；以2mL0.04g/L DPPH無水乙醇溶液和2mL無水乙醇混合液做為參比，在517nm測其吸光值，計算公式如下:K= [I — (Ai —Aj)/A0] X 100式中K一DPPH自由基清除率，% ；A0—2mL0.04g/L的DPPH無水乙醇溶液加2mL無水乙醇的吸光值九一2mL0.04g/L的DPPH無水乙醇溶液加2mL樣品的吸光值；A」一2mL無水乙醇加2mL樣品的吸光值。2)清除羥自由基能力的測定(徐懷德，聞寧環，陳偉，等.黑莓原花青素超聲波輔助提取優化及抗氧化性研究[J].農業工程學報，2008, 24 (2): 264-269.)取2mL樣品溶液，分別加入2mL6mmol/L FeSO4和2mL6mmol/L H2O2,混勻后靜置IOmin,再加入2mL6mmol/L水楊酸,混勻后靜置30min,在510nm處測其吸光值。按照下式計算羥自由基(.0H)的清除率:Y=Il-(Atl-Afj)IA^y-1m式中Y—輕自由基的清除率，％ A 一樣品參與反應的吸光值；10—無樣品參與反應的吸光值；一無水楊酸參與的樣品反應的吸光值。3)螯合 Fe2+能力測定(Lee Y L, Yen M T, Mau J L.Antioxidant properties ofvarious extracts from Hypsizigus marmoreus[J].Food Chemistry, 2007, 104:1-9)取ImL樣品溶液 ，加入3.7mL雙蒸水，然后加入0.lmL2mmol/L的FeCl2溶液，混勻后加入0.2mL5mmol/L的Ferrozine溶液，混勻后靜置lOmin。在562nm下測定吸光值。按照下式計算Fe2+的螯合率:螯合率=(1—A"/A" 0) X 100%式中A" —樣品參與反應的吸光值；A" C1+空白吸光值。有益效果:1)首次利用連續酶膜反應技術制備蠶蛹蛋白抗氧化肽，實現了酶解產物在線及時分離，避免酶解產物因過度酶解而活性降低。2)實現了蛋白酶循環利用，提高了蛋白酶的利用效率。3)避免了傳統酶解工藝中滅酶工序，實現了連續性制備蠶蛹蛋白抗氧化肽，降低了勞動強度。4 )蠶蛹蛋白為農副產品，價格低，且來源廣泛。5)本發明所得到的蠶蛹蛋白抗氧化肽具有良好的活性，其清除DPPH自由基的IC50為0.9-1.6mg/mL,清除羥自由基能力的IC50為0.2-0.6mg/mL,螯合Fe2+能力的IC50為
1.4-2.7mg/mL。
圖1酶膜反應器連續制備蠶蛹蛋白抗氧化肽的工藝流程圖；圖2本發明所用的酶膜反應器結構示意圖:1 一原料儲存罐；2 —蛋白酶儲存罐；3 一堿液儲存罐；4 - pH檢測器；5_儲存罐恒溫水浴；6 —反應罐；7_反應罐恒溫水浴；8 —攪拌器；9 一泵；10_壓力表；11 一超濾膜組件；12 —透過液儲存罐；13 —控制閥。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。本發明實施例所用的酶膜反應器，如圖2所示通過管道連接各單元，包括原料儲存罐1、蛋白酶儲存罐2和堿液儲存罐3，其中原料儲存罐設于儲存罐恒溫水浴5中，三個儲存罐分別與反應罐6連接，所述反應罐內設有攪拌器8和pH檢測器4探頭，罐體設于反應罐恒溫水浴7中，反應罐出料口與超濾膜組件11進口連接，連接管道上設有泵9和壓力表10，超濾膜組件設有兩個出口，其中回流出口與反應罐連接，連接管道上設有控制閥13，另一個出口與透過液儲存罐12連接。實施例1將蠶蛹蛋白用蒸懼水配制成1.0%(w/v, g/mL)溶液,均質后調節其pH至6.0,加熱至40°C后和中性蛋白酶一起加入到反應罐中，攪拌均勻后進行酶膜反應，加酶量為2000U/g，pH為6.0，溫度為40°C，超濾膜的截留分子量為3kDa，超濾壓力為0.6kg/cm2,出肽速率為6mL/min;酶解產物溶液透過超濾膜，未完全反應的蠶蛹蛋白和中性蛋白酶被截留后重新流至反應罐中繼續反應，透過超濾膜的酶解產物透過液被收集；同時，在酶膜反應過程中依據酶解產物透過液中肽的濃度，在反應罐中補充相同濃度的蠶蛹蛋白溶液。收集的酶解產物透過液用真空濃縮裝置濃縮至肽含量8% (w/v, g/mL)左右，在進風溫度190°C和出風溫度90°C下進行噴霧干燥，即得到粉狀蠶蛹蛋白抗氧化肽產品。該抗氧化肽產品的抗氧化活性為:清除DPPH自由基的IC50是1.2mg/mL,清除羥自由基能力的IC50為0.4mg/mL,螯合Fe2+能力的 IC50 為 1.9mg/mL。實施例2將蠶蛹蛋白用蒸懼水配制成2.0%(w/v, g/mL)溶液,均質后調節其pH至6.5,加熱至50°C后和中性蛋白酶一起加入到反應罐中，攪拌均勻后進行酶膜反應，加酶量為4000U/g，pH為6.5，溫度為50°C，超濾膜的截留分子量為5kDa，超濾壓力為0.8kg/cm2,出肽速率為5mL/min;酶解產物溶液透過超濾膜，未完全反應的蠶蛹蛋白和中性蛋白酶被截留后重新流至反應罐中繼續反應，透過超濾膜的酶解產物透過液被收集；同時，在酶膜反應過程中依據酶解產物透過液中肽的濃度，在反應罐中補充相同濃度的蠶蛹蛋白溶液。收集的酶解產物透過液用真空濃縮裝置濃縮至肽含量8% (w/v, g/mL)左右，在進風溫度200°C和出風溫度100°C下進行噴霧干燥，即得到粉狀蠶蛹蛋白抗氧化肽產品。該抗氧化肽產品的抗氧化活性為:清除DPPH自由基的IC50是0.9mg/mL,清除羥自由基能力的IC50為0.2mg/mL,螯合Fe2+能力的 IC50 為 1.4mg/mL。實施例3將蠶蛹蛋白用蒸懼水配制成4.0%(w/v, g/mL)溶液,均質后調節其pH至7.5,加熱至60°C后和中性蛋白酶一起加入到反應罐中，攪拌均勻后進行酶膜反應，加酶量為6000U/g，pH為7.5，溫度為60°C，超濾膜的截留分子量為IOkDa,超濾壓力為0.9kg/cm2,出肽速率為4mL/min ;酶解產物溶液透過超濾膜，未完全反應的蠶蛹蛋白和中性蛋白酶被截留后重新流至反應罐中繼續反應，透過超濾膜的酶解產物透過液被收集；同時，在酶膜反應過程中依據酶解產物透過液中肽的濃度，在反應罐中補充相同濃度的蠶蛹蛋白溶液。收集的酶解產物透過液用真空濃縮裝置濃縮至肽含量8% (w/v, g/mL)左右，在進風溫度220°C和出風溫度110°C下進行噴霧干燥， 即得到粉狀蠶蛹蛋白抗氧化肽產品。該抗氧化肽產品的抗氧化活性為:清除DPPH自由基的IC5tl是1.6mg/mL,清除羥自由基能力的IC5tl為0.6mg/mL,螯合Fe2+ 能力的 IC50 為 2.7mg/mL。
權利要求
1.利用酶膜反應器連續制備蠶蛹蛋白抗氧化肽的方法，其特征為:先將蠶蛹蛋白用蒸餾水配制成懸浮液，利用均質機均質后，與內切酶一起加入到酶膜反應器中進行連續制備抗氧化肽，酶解產物溶液透過超濾膜，未完全反應的蠶蛹蛋白和內切酶被截留后重新流至反應罐中繼續反應，透過超濾膜的酶解產物透過液被收集，經濃縮后噴霧干燥，即得到粉末狀蠶蛹蛋白抗氧化肽產品。
2.根據權力要求I所述的利用酶膜反應器連續制備蠶蛹蛋白抗氧化肽的方法，其特征在于:將蠶蛹蛋白用蒸懼水配制成1.0% 4.0% (w/v)溶液,均質后調節其pH至6.0 —7.5，加熱至40°C — 60°C后和內切酶一起加入到反應罐中，攪拌均勻后進行酶膜反應，加酶量為2000-6000U/g，pH為6.0 — 7.5，溫度為40°C — 60°C，超濾膜的截留分子量為3-10kDa，超濾壓力為0.6-0.9kg/cm2,出肽速率為4-6mL/min ;酶解產物溶液透過超濾膜，未完全反應的蠶蛹蛋白和內切酶被截留后重新流至反應罐中繼續反應，透過超濾膜的酶解產物透過液被收集得蠶蛹蛋白抗氧化肽；同時，在酶膜反應過程中依據酶解產物透過液中肽的濃度，在反應罐中補充相同濃度的蠶蛹蛋白溶液。
3.根據權力要求I所述的利用酶膜反應器連續制備蠶蛹蛋白抗氧化肽的方法，其特征在于:將酶膜反應的透過液用真空濃縮至肽含量8% (w/v)，在進風溫度190°C -220°C和出風溫度90°C -110°C下進行噴霧干燥，即得到粉狀蠶蛹蛋白抗氧化肽產品。
4.根據權 力要求I或2所述的利用酶膜反應器連續制備蠶蛹蛋白抗氧化肽的方法，其特征在于:選用的內切酶為中性蛋白酶。
全文摘要
利用酶膜反應器連續制備蠶蛹蛋白抗氧化肽的方法，先將蠶蛹蛋白用蒸餾水配制成懸浮液，利用均質機均質后，與內切酶一起加入到酶膜反應器中進行連續制備抗氧化肽，酶解產物溶液透過超濾膜，未完全反應的蠶蛹蛋白和內切酶被截留后重新流至反應罐中繼續反應，透過超濾膜的酶解產物透過液被收集，經濃縮后噴霧干燥，即得到粉末狀蠶蛹蛋白抗氧化肽產品。本發明所得到的蠶蛹蛋白抗氧化肽具有良好的活性，其清除DPPH自由基的IC50為0.9-1.6mg/mL，清除羥自由基能力的IC50為0.2-0.6mg/mL，螯合Fe2+能力的IC50為1.4-2.7mg/mL。
文檔編號C07K1/34GK103233054SQ20131013789
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月19日 優先權日2013年4月19日
發明者賈俊強, 吳瓊英, 桂仲爭, 顏輝 申請人:江蘇科技大學