具有腦腫瘤靶向和腫瘤組織穿透能力的d構型多肽及其基因遞釋系統的制作方法
【專利摘要】本發明屬藥學領域，涉及D構型多肽及其基因遞釋系統，具體涉及與神經纖毛蛋白NRP-1高結合活性、具有腦腫瘤靶向和腫瘤組織穿透能力的D構型多肽及其修飾的基因遞釋系統。本發明所述D構型多肽可以介導納米遞釋系統向腫瘤靶向遞送藥物，用于實現向腦原位膠質瘤的靶向治療。經體內外實驗表明，D構型多肽修飾的基因載體，可以顯著提高基因轉染效率，所述基因載體包載治療基因pORF-hTRAIL可以顯著延長腦膠質瘤原位模型裸鼠的生存期。
【專利說明】具有腦腫瘤靶向和腫瘤組織穿透能力的D構型多肽及其基因遞釋系統
【技術領域】
[0001]本發明屬藥學領域，涉及D構型多肽及其基因遞釋系統，具體涉及與神經纖毛蛋白NRP-1高結合活性、具有腦腫瘤靶向和腫瘤組織穿透能力的D構型多肽及其修飾的基因遞釋系統。
【背景技術】
[0002]據報道，神經膠質瘤是最為常見的腦部腫瘤之一；由于其惡性程度高、術后易復發和侵襲速度快等特點，導致患者的中位生存期小于16個月。對于成功治療腦腫瘤而言，藥物或治療基因到達腫瘤部位不僅需要跨越血-腦屏障(BBB)，還需要克服血-腦腫瘤屏障(BBTB)。研究顯示，腫瘤細胞上表達的特異性受體是腫瘤靶向遞藥的有效靶點，經其介導的腫瘤靶向治療是一種有效克服BBTB的手段；將腦腫瘤靶向配體，如RGD、葉酸、VEGFR等修飾于給藥系統表面，有助于將足夠的藥物或治療基因遞送到腦腫瘤部位。此外，治療腦腫瘤的另一個關鍵在于，藥物或治療基因到達腦腫瘤部位后需具備腫瘤深層組織穿透能力，才能有效提高神經膠質瘤的治療效果。
[0003]目前已知，神經纖毛蛋白-1(NRP-1)是一種跨膜糖蛋白，是Sema3A和VEGF165的共同受體，在腫瘤新生血管生成、腫瘤生長及轉移中發揮重要作用。有研究表明NRP-1不僅表達于腫瘤血管內皮細胞，同時在許多腫瘤細胞膜上過度表達，包括神經膠質瘤、肺癌、胰腺癌、前瘤列腺癌、乳腺癌和黑色素瘤等。研究和開發可靶向NRP-1的配體，協助給藥系統穿過BBTB，從而提高藥物的腦腫瘤治療效果，具有現實意義。
[0004]噬菌體展示技術一直以來被認為是篩選靶向腫瘤組織有效配體的重要手段之一；通過該技術篩選出來的多肽已經被成功應用于腫瘤診斷和治療；其中，C-end rule (CendR)多肽，其序列結構是R/KXXR/K，由Erkki Ruoslahti [PNAS.2009 ；106: (38)】通過噬菌體展示技術得到，研究表明，CendR多肽能夠與靶細胞表面NRP-1受體結合，增強腫瘤組織攝取和腫瘤細胞內化程度；且CendR多肽還能夠增加血管和腫瘤組織通透性，以提高藥物或治療基因穿透進入腫瘤深層組織的能力。RGERPPR作為L構型CendR多肽，實驗證明其能夠與NRP-1受體結合,進一步增強腫瘤細胞攝取和內化。
[0005]目前，尚未見有關由含有D(RPPREGR)序列多肽修飾的非病毒基因遞釋系統及其在體內外轉染效率評價以及抗腦膠質瘤作用的報道。本發明擬將L型多肽RGERPPR逆序并以D構型的氨基酸替代后得到d(RPPREGR)，作為穿過BBTB的靶向分子，利用其與NRP-1受體的高親和力和深層組織穿透性，將基因遞釋系統靶向遞送至腦內，以實現靶向治療腦原位膠質瘤。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供一種D構型多肽及其基因遞釋系統，具體涉及與神經纖毛蛋白NRP-1高結合活性、具有腦腫瘤靶向和腫瘤組織穿透能力的D構型多肽及其修飾的基因遞釋系統，
[0007]本發明構建了一種D構型多肽，其氨基酸序列為D (RPPREGR)，該多肽與神經纖毛蛋白NRP-1高結合活性、具有腦腫瘤靶向和腫瘤組織穿透能力；本發明提供了由所述D構型多肽修飾的基因遞釋系統，所述D構型多肽可以介導納米遞釋系統向腫瘤靶向遞送藥物，用于實現向腦原位膠質瘤的靶向治療。
[0008]本發明將L型多肽RGERPPR逆序并以D構型的氨基酸替代后得到D (RPPREGR)，作為穿過BBTB的靶向分子，利用其與NRP-1受體的高親和力和深層組織穿透性，將基因遞釋系統靶向遞送至腦內，經體內外實驗表明，本發明將D (RPPREGR)修飾到PEG-PEI表面制得RPPREGR-PEG-PEI基因載體，可以顯著提高基因轉染效率，所述基因載體包載治療基因pORF-hTRAIL可以顯著延長腦膠質瘤原位模型裸鼠的生存期。
[0009]本發明中，所述D (RPPREGR)多肽的N端氨基與含有琥珀酰亞胺-聚乙二醇的陽離子多聚物連接連接，制得非病毒基因載體材料D (RPPREGR)-PEG-X復合物；該復合物可包載報告基因或治療基因形成非病毒基因遞釋系統；其中，該復合物中X是聚乙烯亞胺(PEI)、樹枝狀聚合物(PAMAM)、多聚陽離子氨基酸、殼聚糖或陽離子脂質體；
[0010]制得的基因遞釋系統分別為:D(RPPREGR) -PEG-PE1、D (RPPREGR) -PEG-PAMAM、D(RPPREGR) -PEG-多聚陽離子氨基酸、D(RPPREGR) -PEG-殼聚糖或 D (RPPREGR)-PEG-陽離子脂質體等基因遞釋系統，所述的基因遞釋系統具有腦腫瘤靶向特征，可以提高腦腫瘤體內外基因轉染效率，同時可攜帶治療基因蓄積于腦腫瘤組織，用于腦腫瘤的治療。
[0011]本發明所述的D(RPPREGR)-PEG-X復合物可以包載報告基因或治療基因。
[0012]本發明所述的多肽D(RPPREGR)，還修飾脂質體、納米粒、聚合物膠束和高分子載體等納米給藥系統以實現腫瘤靶向。
[0013]本發明所述的多肽D (RPPREGR)，還與抗癌化學藥物聯合使用，通過D (RPPREGR)激活CendR通路，增加腫瘤部位血管和組織通透性，從而促進聯合給藥中藥物穿透腫瘤深層組織的能力。
[0014]具體而言，本發明通過以下技術方案實現:
[0015]采用固相合成法，制備D (RPPREGR)序列的多肽；按下述合成路線，將D (RPPREGR)多肽通過雙功能分子 NHS-PEG-Mal 連接到 PEI 上，制得 RPPREGR-PEG-PEI ;RPPREGR_PEG_PEI包載pDNA，經細胞定性和定量轉染實驗表明，D (RPPREGR)修飾可以顯著提高PEG-PEI基因轉染效率；藥效學實驗表明，RPPREGR-PEG-PEI/pORF-hTRAIL可以顯著延長腦膠質瘤原位模型裸鼠的生存期。
[0016]
【權利要求】
1.一種D構型多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列為D(RPPREGR)，其通過將L型多肽RGERPPR逆序并以D構型的氨基酸替代后制得。
2.按權利要求1所述的D構型多肽，其特征在于，所述多肽其N端氨基與含有琥珀酰亞胺-聚乙二醇的陽離子多聚物連接，得到D (RPPREGR) -PEG-X復合物。
3.按權利要求2所述的D構型多肽，其特征在于，所述的D(RPPREGR)-PEG-X復合物中，X是聚乙烯亞胺(PEI)、樹枝狀聚合物(PAMAM)、多聚陽離子氨基酸、殼聚糖或陽離子脂質體。
4.按權利要求2或3所述的D構型多肽，其特征在于，所述的D(RPPREGR) -PEG-X復合物包載報告基因或治療基因，形成非病毒基因遞釋系統。
5.按權利要求4所述的D構型多肽，其特征在于，所述的非病毒基因遞釋系統為 D(RPPREGR)-PEG-PE1、D(RPPREGR)-PEG-PAMAM、D(RPPREGR)-PEG-多聚陽離子氨基酸、D (RPPREGR) -PEG-殼聚糖或D (RPPREGR) -PEG-陽離子脂質體基因遞釋系統。
6.一種D構型多肽修飾的基因遞釋系統，其特征在于，通過下方法述制備:采用固相合成法，制備D (RPPREGR)序列的多肽；按下述合成路線，將D (RPPREGR)多肽通過雙功能分子NHS-PEG-Mal 連接到 PEI 上，制得 RPPREGR-PEG-PEI ;RPPREGR_PEG_PEI 包載 pDNA 制得基因遞釋系統，
7.按權利要求1所述的D構型多肽，其特征在于，所述多肽D(RPPREGR)，還修飾脂質體、納米粒、聚合物膠束或高分子載體形成納米給藥系統。
8.按權利要求1所述的D構型多肽，其特征在于，所述多肽D(RPPREGR)，還與抗癌化學藥物聯合使用，通過D(RPPREGR)激活CendR通路，增加腫瘤部位血管和組織通透性，促進藥物穿透腫瘤深層組織的能力。
9.權利要求1所述的D構型多肽在制備腦腫瘤靶向治療藥物中的用途。
10.按權利要求9所述的用途，其中所述的D構型多肽與神經纖毛蛋白NRP-1高結合活性、具有腦腫瘤靶向和腫瘤組織穿透能力。
11.權利要求6的D構型多肽修飾的基因遞釋系統在制備腦腫瘤靶向治療藥物中的用途，其中，所述的基因遞釋系統提高腦腫瘤體內外基因轉染效率，同時攜帶治療基因蓄積于腦腫瘤組織，治療腦腫瘤。
12.按權利要求9或11的 用途，其特征在于，所述的腦腫瘤是腦原位膠質瘤。
【文檔編號】C07K7/06GK104072581SQ201310111290
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年3月29日 優先權日:2013年3月29日
【發明者】劉敏, 王晶, 陸偉躍, 謝操, 雷楊, 謝作旭 申請人:復旦大學