專利名稱：一種殺傷慢性粒細胞白血病細胞的小分子多肽的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫學基礎研究領域，具體的說，涉及一種殺傷慢性粒細胞白血病細胞的小分子多肽。
背景技術：
慢性粒細胞白血病是一種影響血液及骨髓的惡性腫瘤，它的特點是產生大量不成熟的白細胞，這些白細胞在骨髓內聚集，抑制骨髓的正常造血；并且能夠通過血液在全身擴散，導致病人出現貧血、容易出血、感染及器官浸潤等。而由t(9;22)(q34;qll)形成的Bcr-Abl融合蛋白是慢性粒細胞白血病(CML)的主要特征，其異常激活Abl蛋白激酶會引起血細胞惡性增殖、凋亡減少等一系列變化。STI571可以特異性抑制Abl激酶，作為CML的經典治療藥物，廣泛應用于臨床，大多數病人的病情得到控制，但當Abl激酶活化位點發生突變后就會產生STI571耐藥而導致復發。研究表明Abl激酶的活化需要Bciv72單體形成反向平行的同源二聚體再形成同源四聚體。從晶體結構的研究中可知Bciv72單體主要由al螺旋(5-15位氨基酸)，a2螺旋(28-67位氨基酸)及al、a2之間可變的環狀區(16-27位氨基酸)組成。其中Bcr3(l_63是最關鍵的部位。因此，在前期設計CTP-OD-HA融合蛋白的基礎上，將OD分成兩個部分，一部分為30-63位氨基酸，定義為0D2，其余部分1-29位和64-72位拼接在一起定義為ODl，并將其分別與一種新近報道的能攜帶蛋白類大分子穿越細胞膜并定位于細胞漿中的新型轉導肽CTP連接。使用PC0LD-TF-DNA原核表達載體，可以高效表達可溶性的外源性融合蛋白，作為攜帶胞漿蛋白治療肽的穿膜系統，可以使CTP-ODl-HA和CTP-0D2-HA融合蛋白定位在胞漿，與細胞中的Bcr-Abl融合蛋白的單體形成反向平行的異源二聚體后再形成異源聚體而抑制Bcr-Abl激酶的活性使細胞調 亡增加，增殖減少。但是，其中TF-CTP-0D2-HA在使用時需要的濃度高(60 μ mol/L)，易降解，因此產生的生物學效應持續時間短。現有技術的缺點:現有的治療CML的藥物中，0D2需要連接轉導肽CTP才能進入細胞，而且使用藥物的濃度大，穩定性低，容易產生耐藥性，導致疾病的復發。
發明內容
為解決以上技術問題，本發明的目的在于提供一種不連接轉導肽CTP就能使0D2穿過細胞膜進入細胞，可以抵抗蛋白酶的降解、小分子量較小的穩定性高的殺傷慢性粒細胞白血病細胞的小分子多肽。本發明目的是這樣實現的:一種殺傷慢性粒細胞白血病細胞的小分子多肽的課題思路為:研究表明，0D2的結構是α -螺旋，BCR1^72晶體結構中各氨基酸對于其自身螺旋結構穩定性的作用中發現，第38，52，54，57位氨基酸是螺旋結構中最重要，其突變后將不能維持自身螺旋結構，而第41，45，60位氨基酸被其它氨基替換后會使其螺旋結構更加緊密，而第47和51位氨基酸的改變對螺旋結構不影響，(請參見:Christina M.Taylor and AmyE.Keating.0rientation and Oligomerization Specificity of the Bcr Coiled-CoilOligomerization Domain.Biochemistry.2005, 44(49): 16246 - 16256.)因此將 OD2 結構的第30-63位氨基酸縮減為第34-60位，有利于通過化學修飾的方法增加0D2結構的穩定性，而在目前存在的多種化學修飾方法中，以烯烴鍵的修飾增加a螺旋的穩定性并使其本身具備穿膜能力而最為顯著。本課題組在0D2本身結構是a螺旋的基礎上，在a螺旋肽的i，i+4位插入S型的含戍烯支鏈的甲基化的a, a-二取代甘氨酸,通過烯烴閉環復分解反應(ring closemetatiesis, RCM)將兩個非天然氨基酸側鏈戍烯基的碳原子連接形成C=C雙鍵,就像是釘書釘(staple) —樣穩定其螺旋結構，使0D2順利穿過細胞膜進入細胞而不被蛋白酶降解，與Bcr-Abl寡聚化區域形成異源二聚體，從而抑制其同源二聚體的形成；異源二聚體抑制其自身四聚體化，進而抑制Bcr-Abl激酶的活化；Bcr-Abl激酶被抑制后導致細胞凋亡增力口，增殖減少，如圖1所示。根據以上思路按以下步驟進行了實際操作:1、化學烯烴修飾0D2結構根據0D2的結構，設計并合成含有戊烯支鏈的甲基化的a，a_ 二取代甘氨酸，命名為S5 ;再將設計好的含有S5的0D2采用Fmoc固相合成技術合成SAH-0D2，并需要不脫保護，即在0D2結構的14和18位非關鍵氨基酸上插入S5，并將0D2序列中第8、12、27位的S、L、Q分別轉換成R、D、E，最后構成SAH-0D2 ;然后在二氯乙烷中，將上述合成的仍存在于固相中的含有非天然氨基酸S5的多肽與催化劑混合，室溫下反應2h，經TFA脫保護。2、獲得高純度的SAH-0D2采用反相HPLC中 使用C18柱進行純化和質譜鑒定，獲得純化率達到90%或90%以上的 SAH-0D2。3、檢測SAH-0D2在細胞內的定位先在SAH-0D2的前端加上檢測標簽His，His標簽具體為=HHHHHH ;然后將SAH-0D2與K562細胞作用6h，并設立PBS作為陰性對照，收集細胞，做細胞免疫熒光檢測。即利用DAPI對細胞核染色，利用Cy3檢測SAH-0D2，熒光顯微鏡觀察紅色熒光的位置，結果如圖2所示。結果表明SAH-0D2在沒有CTP信號肽的情況下能穿過細胞膜進入細胞。4、SAH-0D2和TF-CTP-0D2-HA融合蛋白對Bcr-Abl細胞增殖的影響a、構建pTF-CTP-0D2-HA原核表達載體:用PCR和直接退火延伸方法擴增0D2和HA,再將0D2和HA插入質粒pC0LD-TF-DNA中，構建pTF-CTP-0D2_HA，然后篩選和鑒定正確后轉化表達菌BL21(DE3)并鑒定其正確性；b、TF-CTP-0D2-HA融合蛋白的表達、純化與鑒定:利用IPTG誘導表達可溶性的TF-CTP-0D2-HA融合蛋白，再利用N1-NTA親和柱純化，超濾濃縮后Bradford法測定濃度，由SDS-PAGE鑒定其純度，western-bolt檢測其特異性獲得高純度的TF-CTP-0D2-HA融合蛋白；C、將濃度為 4、8、10、20、40 μ mol/L 的 SAH-0D2 和 60 μ mol/L 的 TF-CTP-0D2-HA 融合蛋白與K562細胞作用48h，然后收集細胞，MTT檢測其增殖情況，結果如圖3所示。結果表明SAH-0D2和TF-CTP-0D2-HA融合蛋白對K562細胞的增殖均具有抑制作用，但是SAH-0D2與TF-CTP-0D2-HA相比，SAH-0D2在低濃度4 μ mo I /L時對K562細胞增殖的抑制作用與TF-CTP-0D2-HA在高濃度(60 μ mol/L)時的抑制作用相當，說明低濃度的SAH-0D2具有高濃度TF-CTP-0D2-HA的抑制增殖作用，能大大的減少了藥物的使用量，提高生物學效應。5、SAH-0D2和TF-CTP-0D2-HA融合蛋白對Bcr-Abl細胞凋亡的影響將濃度為4、8、10、20、40 μ mol/L 的 SAH-0D2 和 60 μ mol/L 的 TF-CTP-0D2-HA 融合蛋白與K562細胞作用48h，并分別設立對照組，SAH-0D2的陰性對照為DMSO，TF-CTP-0D2-HA融合蛋白的陰性對照為PBS，然后收集細胞，流式細胞儀檢測其凋亡情況，結果如圖4所示，箭頭所指處為細胞凋亡碎片:細胞形態不完整，出現細胞碎片，核脫落，胞核裂解，胞漿芽突并脫落，形成含核碎片和(或)細胞器成份的膜包被凋亡小體樣形態。結果表明:4、8、10、20、40μ mol/L5 種濃度的 SAH-0D2 和 60 μ mol/L 濃度的TF-CTP-0D2-HA融合蛋白對K562細胞的凋亡均具有促進作用，但是低濃度的SAH-0D2具有和高濃度TF-CTP-0D2-HA相同的促進凋亡作用，故能大大的減少了藥物的使用量，提高生物學效應。有益效果:本發明一種殺傷慢性粒細胞白血病細胞的小分子多肽，具有制備簡單，藥物使用濃度低，穩定性高，0D2不需要連接轉導肽CTP就能進入細胞，能有效的抑制CML細胞的增殖，促進CML細胞的凋亡，對于治療CML的研究及藥物的開發具有很大的研究價值。
圖1 為 SAH-0D2 和 CTP-0D2-HA 作用模似圖；圖2為SAH-0D2在K562細胞中的定位圖；圖3為比較SAH-0D2和TF-CTP-0D2-HA融合蛋白對K562細胞增殖抑制情況的柱形圖；圖4為SAH-0D2和TF-CTP-0D2-HA融合蛋白對K562細胞凋亡促進情況的比較圖。
具體實施例方式實施例:一種殺傷慢性粒細胞白血病細胞的小分子多肽，由0D2和S5連接構成SAH-0D2 ；所述0D2的14和18位非關鍵氨基酸上插入S5，并將0D2序列中第8、12、27位的S、L、Q分別轉換成R、D、E，最后構成SAH-0D2。所述S5的結構式為:
權利要求
1.一種殺傷慢性粒細胞白血病細胞的小分子多肽，其特征在于:由0D2和S5連接構成SAH-0D2 ； 所述S5的結構式為:
2.根據權利要求1所述一種殺傷慢性粒細胞白血病細胞的小分子多肽，其特征在于:所述0D2的14和18位非關鍵氨基酸上插入S5，并將0D2序列中第8、12、27位的S、L、Q分別轉換成R、D、E，最后構成SAH-0D2。
全文摘要
本發明公開了一種殺傷慢性粒細胞白血病細胞的小分子多肽，其特征在于由OD2和S5連接構成SAH-OD2。本發明一種殺傷慢性粒細胞白血病細胞的小分子多肽，具有制備簡單，藥物使用濃度低，穩定性高，OD2不需要連接轉導肽CTP就能進入細胞，能有效的抑制CML細胞的增殖，促進CML細胞的凋亡，對于治療CML的研究及藥物的開發具有很大的研究價值。
文檔編號C07K14/00GK103214559SQ201310107969
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月29日 優先權日2013年3月29日
發明者馮文莉, 王海霞, 曾建明, 黃世峰, 肖恒 申請人:重慶醫科大學