專利名稱：一種特異性克倫特羅人工抗原的合成方法
技術領域：
一種高特異性克倫特羅人工抗原的合成方法，屬于生物化工技術領域。
背景技術：
鹽酸克倫特羅(Clenbuterol)，又稱“瘦肉精”，是一種平喘藥。是腎上腺類神經興奮劑，20世紀80年代初，美國Cyanamid公司意外發現其有明顯的促進生長、提高瘦肉率及減少脂肪的效果，于是其被畜牧業作為瘦肉精使用。但由于其副作用，歐共體于1988年I月I日起禁止鹽酸克倫特羅物質當飼料添加劑使用。1991年被FDA禁止。1997年，中華人民共和國農業部下文嚴禁β -腎上腺素類激素在飼料和畜牧生產中使用，鹽酸克倫特羅列為第一位，2002年9月10起在中國境內禁止在飼料和動物飲用水中使用鹽酸克倫特羅。
權利要求
1.一種特異性克倫特羅人工抗原的合成方法，其特征在于以4-氨基-3，5- 二氯苯甲酸為半抗原，將4-氨基_3，5- 二氯苯甲酸上的羧基通過1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺EDC與N-羥基琥珀酰亞胺NHS活化、或者通過三正丁胺與氯甲酸異丁酯活化，再與載體蛋白進行偶聯得到克倫特羅人工抗原，將人工抗原透析，工藝為: (A)將4-氨基-3，5- 二氯苯甲酸用N，N- 二甲基甲酰胺DMF溶解，4-氨基-3，5- 二氯苯甲酸與N-羥基琥珀酰亞胺NHS，1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺EDC的摩爾比為1:1.5:2，在4°C避光攪拌反應lh，再在室溫反應12h，得活化的半抗原溶液； 取牛血清白蛋白，半抗原與牛血清白蛋白的摩爾比為80:1，牛血清白蛋白用0.1MPH9.6碳酸鹽緩沖液溶解，其中溶解后的牛血清白蛋白濃度大于3mg/mL，且碳酸鹽緩沖液與N，N- 二甲基甲酰胺DMF的體積比例為5:1 ;將活化的半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，室溫反應24h，用PBS緩沖液透析2天，期間更換PBS緩沖液4次，得到克倫特羅人工抗原； 或(B)將4-氨基-3，5- 二氯苯甲酸用N，N- 二甲基甲酰胺DMF溶解，4-氨基-3，5- 二氯苯甲酸與三正丁胺，氯甲酸異丁酯的摩爾比為1:1.2:1.2，(TC反應lh，得活化的半抗原溶液； 取牛血清白蛋白，半抗原與牛血清白蛋白的摩爾比為80:1，牛血清白蛋白用0.1MPH9.6碳酸鹽緩沖液溶解，(TC預冷30min，其中溶解后的牛血清白蛋白濃度大于3mg/mL，且碳酸鹽緩沖液與N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的體積比例為5:1 ;在(TC條件下，將活化的半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，0°C條件下反應Ih，然后室溫反應24h ;用PBS緩沖液透析2天，期間更換PBS緩沖液4次，得到克倫特羅人工抗原。
2.根據權利要求1所述的特異性克倫特羅人工抗原的合成方法，其特征在于，所述載體蛋白為:牛血清白蛋白BSA、陽離子化的牛血清白蛋白cBSA、匙孔血藍蛋白KLH、血藍蛋白LPH、雞卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HSA之一種。
3.根據權利要求1所述的特異性克倫特羅人工抗原的合成方法，其特征在于克倫特羅人工抗原的分子結構式如式I所示:
4.用權利要求1所述方法合成的特異性克倫特羅人工抗原的應用，其特征在于制備克倫特羅抗體，所述抗體為多克隆抗體和/或單克隆抗體。
5.用權利要求1所述方法合成的特異性克倫特羅人工抗原的應用，其特征在于在檢測克倫特羅中的應用，檢測食品中的克倫特羅殘留。
全文摘要
一種特異性克倫特羅人工抗原的合成方法，屬于生物化工技術領域。本發明包括如下步驟選擇4-氨基-3,5-二氯苯甲酸作為克倫特羅的半抗原，該分子與克倫特羅分子的同源性大于50%，將該半抗原與載體蛋白進行偶聯，得到克倫特羅人工抗原。實驗結果表明，用本發明的抗原免疫動物得到的抗血清效價可達32000，檢測限為1ng/mL，半抑制濃度IC50為10ng/mL。產生的抗體特異性高、靈敏度高。本發明的抗原或抗體可用于建立酶聯免疫吸附分析方法和膠體金試紙快速檢測法，從而用于快速檢測食品中的克倫特羅殘留，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C07K14/765GK103159852SQ20131010359
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月28日 優先權日2013年3月28日
發明者胥傳來, 劉麗強, 王利兵, 匡華, 徐利廣, 馬偉, 胡擁明 申請人:江南大學