專利名稱：一種黃酮碳苷提取物及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種黃酮碳苷提取物，本發明同時涉及該黃酮碳苷提取物的制備方法，屬藥品和保健食品領域。
背景技術：
黃酮碳苷是一類由黃酮苷元的6或8位與糖基的I位通過碳鍵連接而成的黃酮苷類成分，代表性化合物例如牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、異葒草苷等。本類成分具有較好的抗氧化、抗炎等藥理活性，是多種藥用植物的主要有效成分之一，例如山楂葉、竹葉黃酮、金蓮花、葒草、藍莓等。采用大孔樹脂精制、柱層析或高速逆流層析等分離技術制備該類天然產物的報道已經很豐富。但 由于植物中黃酮碳苷及其它共存成分組成復雜，其制備工藝復雜、產品純度和總轉移率較低，影響了該類成分的實際應用。本發明人長期從事金蓮花總黃酮的研制工作。前期研究證實金蓮花總黃酮主要含有葒草苷和牡荊苷及其酯類衍生物等成分，建立了該類成分的大孔樹脂精制工藝，參見劉江云等“一種黃酮碳苷組合物及其制備方法和用途”(專利申請號CN201110055655.5)。在進一步研制過程中，首次發現采用控制酸水解技術，可以將其它黃酮碳苷衍生物轉化為相應黃酮碳苷類成分，從而顯著提高黃酮碳苷類成分的含量和純度。經進一步深入研究，完成了本發明。
發明內容
本發明的目的是提供一種高純度的黃酮碳苷提取物。本發明提供的制備黃酮碳苷提取物的方法包括以下工藝步驟:(I)選取含有黃酮碳苷的植物原料，采用水或乙醇-水混合溶媒進行提取；并可根據需要進一步采用大孔樹脂、聚酰胺、硅膠、反相硅膠等填料進行分離和純化，濃縮，獲得富含黃酮碳苷的提取物濃縮液。(2)選取(I)所得提取物濃縮液，稀釋溶解于適量水或含醇水溶液中，用適量酸調節溶液酸度，在60-100°C反應1-24小時，用適量堿溶液中和至PH4-7，得提取物水解液。(3)選取(2)所得提取物水解液，根據需要進一步采用大孔樹脂、聚酰胺、硅膠、反相硅膠等填料進行分離和純化，獲得高純度黃酮碳苷提取物。所述工藝步驟(I)中含有黃酮碳苷的植物原料為任意一種植物，如山楂葉、竹葉黃酮、金蓮花、葒草、藍莓等，特征在于該植物中含有所需的目標黃酮碳苷類成分和/或其衍生物，所述目標黃酮碳苷類成分為葒草苷、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷中的任意一種以上。提取溶媒可采用常規的水或乙醇-水(30-95%)混合溶媒提取，提取液合并，濃縮，得所需提取物濃縮液。為進一步提高提取液中黃酮碳苷含量，可根據需要，運用文獻報道或公知的方法，采用大孔樹脂、聚酰胺、硅膠、反相硅膠等填料的一種或多種進行分離和純化，濃縮，獲得富含黃酮碳苷的提取物濃縮液。所述工藝步驟(2)中提取物濃縮液稀釋溶解于適量水或含醇水溶液中，所述醇可為甲醇、乙醇或丙醇，其中優選乙醇，更優選乙醇濃度為20-70%。所述酸可選用鹽酸、硫酸等強酸，所述溶液[H+]酸度范圍為0.1-3.0M，優選0.5-2.0M范圍。所述反應溫度范圍60-100°C，更優選65-85°C范圍。所述反應時間根據具體反應條件設定，以目標產物含量達到最高值、同時副反應較低為宜，一般反應時間1-24小時，更優選反應時間2-8小時。所述中和反應的堿優選氫氧化鈉。所述工藝步驟(3)中所得提取物水解液可根據需要，采用文獻報道或公知的方法，采用大孔樹脂、聚酰胺、硅膠、反相硅膠等填料進行分離和純化，濃縮，干燥，獲得高純度黃酮碳苷提取物，特征在于所述黃酮碳苷單體成分或其組分物含量采用液相檢測大于60%。植物中的黃酮碳苷類成分常以多種黃酮氧苷、黃酮碳苷酯等其它類似物共存，因而其分離提純難度大、相對含量較低。本發明在對金蓮花總黃酮研究過程中，發現酸水解后葒草苷、牡荊苷等黃酮碳苷類組分含量顯著升高，同時其它雜質成分顯著減少，顯著提高了該類組分的純化工作和收率。這是由于黃酮碳苷酯或其寡糖苷衍生物在酸性條件下容易部分水解轉化為黃酮碳苷，其它黃酮氧苷在酸性條件下容易水解后純化除去；黃酮碳苷如葒草苷、牡荊苷一般難以水解，而在較為劇烈的酸性和溫度條件下會發生Wessely-Moser重排，相互轉化為其異構體混合物。本發明通過工藝參數優化，控制反應所需溶劑、溫度、酸度和反應時間，可以在獲得較高轉化率黃酮碳苷組分的同時，減少或避免副反應的發生。根據單體和金蓮花總黃酮組分水解研究結果，可以證明該酸水解轉化反應同時適用于含有黃酮碳苷組分或其單體衍生物的植物提取物。本發明所述酸水解工藝顯著提高了含有黃酮碳苷類組分植物資源的利用率，降低了純化成本，工藝簡潔、可操作性強，易于實現產業化放大。本發明內容是通過大量實驗研究和工藝優化分析完成的，以下述具體實施例進行說明。
圖1為采用本 發明從金蓮花中提取的黃酮碳苷提取物TC-A(上圖)及其酸水解樣品TC-AH(下圖)的液相色譜圖(檢測波長340nm)。圖中，色譜峰1_3依次為2"-半乳糖基葒草苷、葒草苷和牡荊苷。圖2為采用本發明從金蓮花中提取的黃酮碳苷提取物TC-B (上圖)及其酸水解樣品TC-BH(下圖)的液相色譜圖(檢測波長340nm)。圖中，色譜峰1_4依次為異葒草苷、葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷。
具體實施例方式本發明所述的黃酮碳苷提取物是按以下實施例所表示的方法制造，所涉及到的方法是本領域的技術人員能夠掌握和運用的技術手段。但以下實施例不得理解為任何意義上的對本領域發明權利要求的限制。實施例1:黃酮碳苷單體酸水解反應考察對照品異葒草苷、異牡荊苷為市售品。對照品2"-半乳糖基葒草苷、葒草苷、牡荊苷為自制，其純化工藝參見:李勝銀，金蓮花化學成分研究，蘇州大學碩士研究生論文，2008。
酸水解反應:稱取各對照品5mg，分別加入10mL2M HC1，分別于60°C和80°C兩種溫度水浴反應6h，用4M NaOH中和至pH5-7。HPLC法分析水解產物中葒草苷和牡荊苷等成分，色譜分析條件=ODS色譜柱(4.6X250mm);乙腈-0.1 %乙酸-水為流動相梯度洗脫(0-5min, 13 % 乙腈；5_25min，13-15 % 乙腈；25_30min，15-18 % 乙腈；30_50min，18-28 %乙腈；50-60min, 28-40 %乙腈；60-65min,40 %乙腈);檢測波長340nm ;柱溫30 °C ;流速1.0mT,/mi η η結果:2"-半乳糖基葒草苷在60°C反應產物中僅有葒草苷，同時有少量2"-半乳糖基葒草苷；在801:反應產物中同時有葒草苷和少量異葒草苷。葒草苷、牡荊苷在80°C反應產物中同時有異葒草苷/葒草苷、異牡荊苷/牡荊苷異構體存在；異葒草苷、異牡荊苷在80°C反應產物中也同時有異葒草苷/葒草苷、異牡荊苷/牡荊苷異構體存在。結果表明，2"-半乳糖基葒草苷在60°C反應時可轉化為葒草苷，在更激烈的水解條件下本類成分會發生異構化反應。通過控制反應條件，可以將2"-半乳糖基葒草苷選擇性轉化為葒草苷。實施例2:金 蓮花組分TC-A酸水解工藝考察金蓮花組分TC-A中主要含有2"-半乳糖基葒草苷(含量30.85%)、葒草苷(含量50.49% )和少量牡荊苷(含量12.67% )，其純化工藝參見:劉江云等.一種黃酮碳苷組合物及其制備方法和用途.專利申請號CN201110055655.5。主要工藝流程為:稱取干燥的金蓮花藥材100g，用IOOOmL的水加熱回流(1.5h)提取2次，提取液合并減壓濃縮至
1.5g生藥/mL，加入等體積的95%的乙醇，不停攪拌，過濾，得到濾液；濾液減壓濃縮，加水制成為1.0g生藥/mL的樣品溶液，上AB-8大孔樹脂柱，分別用1500mL水，2000mL30%乙醇、2000mL70%乙醇洗脫，30%、70%乙醇洗脫部位分別濃縮、干燥，依次為TC-A和TC-B。(I)水解溶劑考察:各稱取TC-A樣品10mg，分別加入IOmL終濃度為IM HCl或
0.5MH2S04的水溶液，或10/30/50乙醇溶液，或10/30/50/70%甲醇溶液，觀察樣品溶解情況。結果:TC_A樣品在水溶液中溶解不完全，而在10-50%乙醇溶液或30-70%甲醇溶液中溶解完全；在IM HCl或0.5M H2SO4的溶解性相似。考慮水解反應的易操作性，后續實驗中選用30%乙醇溶液為反應溶劑。(2)水解溫度考察:稱取TC-A樣品50mg，分別加入10mL2M HC1_30%乙醇溶液，分別于40、60、80和901:四種溫度水浴反應611，用41 NaOH中和至pH5_7。取樣進行HPLC檢測。結果:TC-A樣品在40°C溫度下反應較慢，在60和80°C下反應較完全，在90°C下反應有異葒草苷產物。結果表明以60-80°C下反應較適宜。(3)水解酸度和時間考察:稱取TC-A樣品50mg，分別加入IOmL0.1,0.5、1.0,2.0、
3.0M HCl-30%乙醇，分別于80°C水浴反應l_24h，各時間點取樣，用4M NaOH中和至pH5_7。取樣進行HPLC檢測。結果:TC_A樣品在0.1M時反應較慢，在3.0M反應時有異葒草苷產物，在0.5M(24小時)、1.0M(8小時)、2.0M(5小時)反應較完全。結果表明以0.5M(24小時)-2.0M(5小時)反應較適宜。(4)優化水解條件考察:稱取TC-A樣品lg，分別加入100mL2.0M HCl-30%乙醇，于80°C水浴反應6h，用4M NaOH中和至pH5-7。反應液進一步上AB-8樹脂，依次用水、30%乙醇、70%乙醇洗脫，收集30%乙醇洗脫部位，濃縮，干燥，即得TC-AH產品(0.61g)。結果:反應產物TC-AH樣品中2"-半乳糖基葒草苷基本完全轉化為葒草苷，沒有異葒草苷產物出現，參見附圖1。反應產品經HPLC檢測，其中葒草苷、牡荊苷含量分別為62.41%,13.66%。實施例3:金蓮花組分TC-B酸水解工藝考察金蓮花組分TC-B中主要含有葒草苷酯和牡荊苷酯類衍生物，包括2" -0-(2"'-甲基丁基)異當藥黃素、2" -0-(3" '，4”_ 二甲氧基苯甲酰基)異當藥黃素、2" -0-(2"'-甲基丁基)牡荊苷、2" -0-(2"'-甲基丁基)葒草苷、6"'-羥甲基戊二酰基-2" -O-β-L-半乳糖葒草苷、6"'-羥甲基戊二酰基-2" -O-β-L-半乳糖牡荊苷等。水解條件考察:稱取TC-A樣品lg，分別加入100mL2.0M HCl-50%乙醇，于80°C水浴反應6h，用4M NaOH中和至pH5-7。反應液進一步上AB-8樹脂，依次用水、30%乙醇、70%乙醇洗脫，收集30%乙醇洗脫部位，濃縮，干燥，即得TC-BH產品(0.56g)。結果:反應產物TC-BH樣品中其它黃酮碳苷衍生物基本完全轉化為葒草苷和牡荊苷，同時有部分異構體產生，參見附圖2。反應產品經HPLC檢測，其中葒草苷、牡荊苷含量分別為 26.59%,35.42%。`
權利要求
1.一種黃酮碳苷提取物的制備方法，其特征在于所述制備方法如下: (1)選取含有黃酮碳苷的植物原料，采用水或乙醇-水混合溶媒進行提取；并可根據需要進一步采用大孔樹脂、聚酰胺、硅膠、反相硅膠等填料進行分離和純化，濃縮，獲得富含黃酮碳苷的提取物濃縮液； (2)選取(1)所得提取物濃縮液，稀釋溶解于適量水或含醇水溶液中，用適量酸調節溶液酸度，在60-100°C反應1-24小時，用適量堿溶液中和至PH4-7，得提取物水解液； (3)選取(2)所得提取物水解液，根據需要進一步采用大孔樹脂、聚酰胺、硅膠、反相硅膠等填料進行分離和純化，獲得高純度的黃酮碳苷提取物。
2.根據權利要求1所述黃酮碳苷提取物的制備方法，其特征在于所述植物原料中含有所需的目標黃酮碳苷類成分和/或其衍生物。
3.根據權利要求2所述黃酮碳苷提取物的制備方法，其特征在于所述目標黃酮碳苷類成分為葒草苷、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷中的任意一種以上。
4.根據權利要求2所述黃酮碳苷提取物的制備方法，其特征在于所述植物為山楂葉、竹葉黃酮、金蓮花、葒草、藍莓中的任意一種。
5.根據權利要求1所述黃酮碳苷提取物的制備方法，其特征在于其制備方法步驟(2)中所述醇可為甲醇、乙醇或丙醇，其中優選乙醇，更優選乙醇濃度為20-70%。
6.根據權利要求1所述黃酮碳苷提取物的制備方法，其特征在于其制備方法步驟(2)中所述酸可選用鹽酸、硫酸等強酸，所述溶液[H+]酸度范圍為0.1-3.0M，優選0.5-2.0M范圍。
7.根據權利要求1所述黃酮碳苷提取物的制備方法，其特征在于其制備方法步驟(2)中所述反應溫度范圍優選65-85°C范圍。
8.根據權利要求1所述黃酮碳苷提取物的制備方法，其特征在于其制備方法步驟(2)中所述反應時間優選2-8小時。
9.根據權利要求1所述黃酮碳苷提取物的制備方法，其特征在于其制備方法步驟(2)中所述堿優選氫氧化鈉。
10.根據權利要求1所述黃酮碳苷提取物的制備方法，其特征在于其制備方法步驟(3)中所述黃酮碳苷單體成分或組合物含量采用液相檢測大于60%。
全文摘要
本發明公開了一種高純度黃酮碳苷提取物的制備方法，其主要步驟如下選取富含黃酮碳苷的植物藥材，采用水或乙醇-水混合溶媒進行提取，并可根據需要進一步分離和純化，濃縮，獲得黃酮碳苷提取物濃縮液；該濃縮液稀釋溶解于適量酸性水或含醇水溶液中進行酸水解反應，所得提取物水解液根據需要進一步采用大孔樹脂等填料進行分離和純化，獲得高純度(大于60％)黃酮碳苷提取物。本發明采用控制酸水解技術，可以將植物中其它黃酮碳苷衍生物轉化為相應黃酮碳苷類成分，從而顯著提高黃酮碳苷類成分的含量和純度，工藝簡潔、可操作性強，易于實現產業化放大。
文檔編號C07D407/04GK103159750SQ20131009755
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月26日 優先權日2013年3月26日
發明者劉江云, 孫燕, 苑紅燕, 郝麗莉, 蔡金娜, 蔡培烈, 楊世林 申請人:蘇州大學