專利名稱：從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及卵巨球蛋白的提取方法，具體為一種從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法。
背景技術：
雞蛋清來源廣泛，價格低廉，干物質中蛋白質含量超過80%，是最理想的蛋白質資源之一。卵巨球蛋白是雞蛋清中一種具有重要生物活性的蛋白質，其含量僅為蛋清蛋白質的0.5%，因其具有抑制蛋白酶的生物活性，表現出抗炎、促進傷口愈合、抑制敗血癥等功能活性，在醫學等領域應用前景廣闊。但是由于卵巨球蛋白在雞蛋清中含量低，且不恰當的制備方法將使其喪失活性，因此如何純化獲得純蛋白成為其研究的難題之一。目前，卵巨球蛋白的分離純化均通過多步層析的方法獲得，步驟繁多、耗時漫長，且多種填料的使用大大增加了生產成本。此外，在分離過程中，每一步驟的操作都將不可避免地導致目標蛋白不同程度的損失，由于操作步驟繁多，導致產品得率很低，僅為20%左右。因此，開發出一種操作簡單、純化周期短、得率高的卵巨球蛋白分離純化方法，將具有重要的應用價值。
發明內容
本發明的目的是為了克服上述缺陷，提供一種簡單、快速和高效的從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法。上述目的是通過以下技術方案實現的:一種從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，該方法包括以下步驟:( 1)雞蛋清溶液的制備采用新鮮雞蛋，將蛋清和蛋黃分開，收集雞蛋清，邊攪拌邊向雞蛋清中緩緩加入0.6 3倍體積的蒸餾水，加入完成后，繼續攪拌2 3h，得雞蛋清溶液；(2)聚乙二醇分離準確稱取上述雞蛋清溶液，按質量加入3 5%的聚乙二醇8000，攪拌2 3h，然后在8000 12000轉/分的轉速下離心8 15min，收集上清液，再向上清液中加入聚乙二醇8000，使聚乙二醇8000在上清液中的質量濃度達到8 10%，攪拌2 3h，然后在8000 12000轉/分的轉速下離心8 15min，收集沉淀；(3)沉淀溶解與處理將所得沉淀置于含有0.3 0.5M氯化鈉的PBS緩沖液中，PBS緩沖液的體積是步驟(I)中的雞蛋清體積的1/8 1/5，攪拌使沉淀溶解，再離心除去少量不溶物，取上清液待下一步純化；(4)凝膠過濾層析純化使用S印hacryl S-200HR作為凝膠過濾層析填料，裝填后用PBS緩沖液對層析柱進行平衡，將第3步獲得的上清液注入到層析柱中，用PBS緩沖液進行洗脫，收集第一個層析峰，即得卵巨球蛋白。優選地，步驟(I)中所述蒸餾水的加入量是雞蛋清體積的I倍。優選地，步驟(2)中第一次加入的聚乙二醇8000是雞蛋清溶液質量的3.2
4.4%，第二次加入的聚乙二醇8000在上清液中的質量濃度為8.4 9.2%。進一步優選地，步驟(2)中第一次加入的聚乙二醇8000是雞蛋清溶液質量的4%，第二次加入的聚乙二醇8000在上清液中的質量濃度為8.8%。優選地,步驟(4)中的洗脫流速為0.5 0.8mL/min。進一步優選地,步驟(4)中的洗脫流速為0.65 0.75mL/min。本發明的有益效果在于:(I)根據雞蛋清蛋白質的特點設計卵巨球蛋白的提取方案:首先根據卵黏蛋白溶解度差的特點，采用聚乙二醇沉淀法將其除去，再利用卵巨球蛋白與其它蛋清蛋白質分子量上的巨大差異采用凝膠過濾層析將其純化。過程中僅使用了一步層析，大大簡化了操作，同時也降低了購買層析填料的成本。(2)整個方法過程僅需10 12小時即可完成，與現有方法2 3天的周期相比，大大縮短了時間，提高了效率，降低了人工和時間成本。(3)所得卵巨球蛋白樣品純度達到95.98%，在保持高純度的同時，回收率也大幅提高，回收率從現有方法的約20%提高至61.4%，充分利用了蛋清蛋白質資源。
圖1為卵巨球蛋白分離純化流程圖；圖2為凝膠過濾層析圖譜；圖3為卵巨球蛋白SDS-PAGE電泳圖；圖4為卵巨球蛋白高相液相色譜圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明進行詳細地說明。實施例1一種從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，該方法包括以下步驟:(I)雞蛋清溶液的制備取當天產出的新鮮雞蛋，人工打蛋，使用分離器將蛋清和蛋黃分開，收集雞蛋清，邊磁力攪拌邊向雞蛋清中緩緩加入等體積的純水，加入完成后，繼續磁力攪拌3h，得雞蛋清溶液。(2)聚乙二醇分離準確稱取上述雞蛋清溶液，按質量加入4%的聚乙二醇8000，充分攪拌3h，然后在10000轉/分的轉速下離心15min，收集上清液，再向上清液中加入聚乙二醇8000，使聚乙二醇8000在上清液中的質量濃度達到8.8%，如前再次攪拌、離心，收集沉淀。(3)沉淀溶解與處理將所得沉淀置于含有0.4M氯化鈉的PBS緩沖液中，PBS緩沖液的體積是步驟(I)中的雞蛋清體積的1/7，攪拌使沉淀溶解，再離心除去少量不溶物，取上清液待進一步純化。
(4)凝膠過濾層析純化使用Sephacryl S-200HR作為凝膠過濾層析填料,層析柱(16 X 600mm)裝填后使用PBS緩沖液對層析柱進行平衡。取步驟(3)中獲得的上清液3mL注入到層析柱中，使用PBS緩沖液以0.65 0.75mL/min的流速進行洗脫，層析圖譜如圖2所示，收集第一個層析峰，即得卵巨球蛋白。實施例2一種從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，該方法包括以下步驟:(I)雞蛋清溶液的制備取新鮮雞蛋，將蛋清和蛋黃分開，收集雞蛋清，邊攪拌邊向雞蛋清中緩緩加入0.6倍體積的蒸餾水，加入完成后， 繼續攪拌2h，得雞蛋清溶液；(2)聚乙二醇分離稱取上述雞蛋清溶液，按質量加入3%的聚乙二醇8000，攪拌2h，然后在12000轉/分的轉速下離心8min，收集上清液，再向上清液中加入聚乙二醇8000，使聚乙二醇8000在上清液中的質量濃度達到8%，攪拌2h，然后在12000轉/分的轉速下離心8min，收集沉淀；(3)沉淀溶解與處理將所得沉淀置于含有0.3M氯化鈉的PBS緩沖液中，PBS緩沖液的體積是步驟(I)中的雞蛋清體積的1/8，攪拌使沉淀溶解，再離心除去少量不溶物，取上清液待下一步純化；(4)凝膠過濾層析純化使用S印hacryl S-200HR作為凝膠過濾層析填料，裝填后用PBS緩沖液對層析柱進行平衡，將步驟(3)中獲得的上清液注入到層析柱中，用PBS緩沖液以0.5 0.8mL/min的流速進行洗脫，收集第一個層析峰，即得卵巨球蛋白。實施例3一種從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，該方法包括以下步驟:( I)雞蛋清溶液的制備取新鮮雞蛋，將蛋清和蛋黃分開，收集雞蛋清，邊攪拌邊向雞蛋清中緩緩加入3倍體積的蒸餾水，加入完成后，繼續攪拌2h，得雞蛋清溶液；(2)聚乙二醇分離稱取上述雞蛋清溶液，按質量加入5%的聚乙二醇8000，攪拌2h，然后在8000轉/分的轉速下離心15min，收集上清液，再向上清液中加入聚乙二醇8000，使聚乙二醇8000在上清液中的質量濃度達到10%，攪拌2h，然后在8000轉/分的轉速下離心15min，收集沉淀；(3)沉淀溶解與處理將所得沉淀置于含有0.5M氯化鈉的PBS緩沖液中，PBS緩沖液的體積是步驟(I)中的雞蛋清體積的1/5，攪拌使沉淀溶解，再離心除去少量不溶物，取上清液待下一步純化；(4)凝膠過濾層析純化使用S印hacryl S-200HR作為凝膠過濾層析填料，裝填后用PBS緩沖液對層析柱進行平衡，將步驟(3)中獲得的上清液注入到層析柱中，用PBS緩沖液進行洗脫，收集第一個層析峰，即得卵巨球蛋白。
實施例4一種從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，該方法包括以下步驟:(I)雞蛋清溶液的制備取新鮮雞蛋，將蛋清和蛋黃分開，收集雞蛋清，邊攪拌邊向雞蛋清中緩緩加入2倍體積的蒸餾水，加入完成后，繼續攪拌2.5h，得雞蛋清溶液；(2)聚乙二醇分離稱取上述雞蛋清溶液，按質量加入3.2%的聚乙二醇8000，攪拌2.5h，然后在8000轉/分的轉速下離心15min，收集上清液，再向上清液中加入聚乙二醇8000，使聚乙二醇8000在上清液中的質量濃度達到8.4%，攪拌2.5h，然后在12000轉/分的轉速下離心8min，收集沉淀；(3)沉淀溶解與處理將所得沉淀置于含有0.5M氯化鈉的PBS緩沖液中，PBS緩沖液的體積是步驟(I)中的雞蛋清體積的1/6，攪拌使沉淀溶解，再離心除去少量不溶物，取上清液待下一步純化；(4)凝膠過濾層析純化使用S印hacryl S-200HR作為凝膠過濾層析填料，裝填后用PBS緩沖液對層析柱進行平衡，將步驟(3)中獲得的上清液注入到層析柱中，用PBS緩沖液進行洗脫，收集第一個層析峰，即得卵巨球蛋白。實施例5—種從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，該方法包括以下步驟:(I)雞蛋清溶液的制備取新鮮雞蛋，將蛋清和蛋黃分開，收集雞蛋清，邊攪拌邊向雞蛋清中緩緩加入I倍體積的蒸餾水，加入完成后，繼續攪拌2.5h，得雞蛋清溶液；(2)聚乙二醇分離稱取上述雞蛋清溶液，按質量加入4.4%的聚乙二醇8000，攪拌2h，然后在12000轉/分的轉速下離心15min，收集上清液，再向上清液中加入聚乙二醇8000，使聚乙二醇8000在上清液中的質量濃度達到9.2%，攪拌3h，然后在8000轉/分的轉速下離心8min，收
集沉淀；(3)沉淀溶解與處理將所得沉淀置于含有0.3M氯化鈉的PBS緩沖液中，PBS緩沖液的體積是步驟(I)中的雞蛋清體積的1/6，攪拌使沉淀溶解，再離心除去少量不溶物，取上清液待下一步純化；(4)凝膠過濾層析純化使用S印hacryl S-200HR作為凝膠過濾層析填料，裝填后用PBS緩沖液對層析柱進行平衡，將步驟(3)中獲得的上清液注入到層析柱中，用PBS緩沖液進行洗脫，收集第一個層析峰，即得卵巨球蛋白。實施例6方法鑒定
( I)聚丙酰胺凝膠電泳鑒定取層析獲得的卵巨球蛋白樣品溶液80微升，加入20微升的蛋白上樣緩沖液(5倍濃度)，混勻后沸水浴加熱約5分鐘，冷卻后取5微升進行常規SDS-PAGE電泳，分離膠濃度為8%,恒定電壓100V。電泳結果如圖3所示(泳道I為蛋白質標準分子量標記，2 4為卵巨球蛋白)，樣品在凝膠上顯示為單一條帶，說明其純度較高，使用軟件計算其分子量，約為175kDa，與文獻報道一致。(2)純度測定采用高相液相色譜法測定，使用G2000SWXl分子排阻色譜柱(7.8x300mm)進行分析，液相系統為Waters2695，檢測波長為280nm，流動相為磷酸鹽緩沖液(0.lmol/L, pH7.0，含0.lmol/L Na2SO4),流速為0.8ml/min。層析圖譜如圖4所示，由軟件對峰面積進行積分，根據峰面積對樣品純度進行定量，計算實施例1 5的純度分別為96.32%,95.84%,96.01%、96.20%,95.55%，平均為 95.98%。(3)回收率計算根據從雞蛋清中純化所得卵巨球蛋白的質量、蛋白含量和純度，使用以下公式計算所得的各個蛋白質的回收率。
權利要求
1.一種從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (1)雞蛋清溶液的制備 取新鮮雞蛋，將蛋清和蛋黃分開，收集雞蛋清，邊攪拌邊向雞蛋清中緩緩加入0.6^3倍體積的蒸餾水，加入完成后，繼續攪拌2 3h，得雞蛋清溶液； (2)聚乙二醇分離 稱取上述雞蛋清溶液，按質量加入:Γ5%的聚乙二醇8000，攪拌2 3h，然后在8000^12000轉/分的轉速 下離心8 15min，收集上清液，再向上清液中加入聚乙二醇8000，使聚乙二醇8000在上清液中的質量濃度達到8 10%，攪拌2 3h，然后在8000 12000轉/分的轉速下離心8 15min，收集沉淀； (3)沉淀溶解與處理 將所得沉淀置于含有0.3^0.5M氯化鈉的PBS緩沖液中，PBS緩沖液的體積是步驟(I)中的雞蛋清體積的1/8 1/5，攪拌使沉淀溶解，再離心除去少量不溶物，取上清液待下一步純化； (4)凝膠過濾層析純化 使用Sephacryl S-200 HR作為凝膠過濾層析填料，裝填后用PBS緩沖液對層析柱進行平衡，將步驟(3)中獲得的上清液注入到層析柱中，用PBS緩沖液進行洗脫，收集第一個層析峰，即得卵巨球蛋白。
2.如權利要求1所述的從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，其特征在于:步驟(I)中所述蒸餾水的加入量是雞蛋清體積的I倍。
3.如權利要求1或2所述的從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，其特征在于:步驟(2)中第一次加入的聚乙二醇8000是雞蛋清溶液質量的3.2^4.4%，第二次加入的聚乙二醇8000在上清液中的質量濃度為8.4 9.2%。
4.如權利要求3所述的從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，其特征在于:步驟(2)中第一次加入的聚乙二醇8000是雞蛋清溶液質量的4%，第二次加入的聚乙二醇8000在上清液中的質量濃度為8.8%。
5.如權利要求1所述的從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，其特征在于:步驟(4)中的洗脫流速為0.5^0.8mL/min。
6.如權利要求5所述的從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，其特征在于:步驟(4)中的洗脫流速為0.65 0.75mL/min。
全文摘要
本發明公開了一種從雞蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，該方法包括雞蛋清溶液的制備、聚乙二醇分離、沉淀溶解與處理、凝膠過濾層析純化四個步驟。本發明解決了卵巨球蛋白分離純化操作復雜、周期長、得率低等問題，建立了一種簡單、快速和高效的卵巨球蛋白提取方法，所得卵巨球蛋白純度達到95.98%，在保持高純度的同時，回收率大幅提高，達到61.4%，該方法整個過程僅需10~12小時即可完成，大大簡化了操作，降低了成本，提高了效率。
文檔編號C07K1/36GK103172724SQ20131007345
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月8日 優先權日2013年3月8日
發明者馬美湖, 耿放, 黃茜 申請人:華中農業大學