專利名稱：一種蘇丹紅i號衍生物及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于免疫學技術領域，具體涉及一種蘇丹紅I號衍生物及其制備方法和應用。背景技術：
蘇丹紅I號為親脂性偶氮化合物，是一種人工合成的染料，其化學名稱為1-苯基偶氮-2-萘酚，分子式為C16H12N2O15作為一種常用的紅色工業染料，它被廣泛用于溶劑的增色以及紡織品的增光等方面。蘇丹紅I號在人體還原酶的作用下在體內生成苯胺和1-氨基-2-萘酚。研究表明:蘇丹紅I號的致毒性與代謝生成的胺類及萘酚類物質密切相關。肝臟是蘇丹紅I產生致癌性的主要靶器官，當人體誤食或接觸含有蘇丹紅I號的食品后，一方面，其代謝產物苯胺可直接作用于肝細胞，引起中毒性肝臟疾病，同時還有可能誘發肝臟基因變異，增加了人體癌變的幾率；另一方面，苯胺進入人體后的代謝產物可以將與血紅蛋白結合的Fe2+氧化為Fe3+，使得血紅蛋白無法結合氧從而導致患上高鐵血紅蛋白癥。蘇丹紅I號的另一種代謝產物1-氨基-2-萘酚具有致癌、致畸 、致敏、致突變的潛在毒性。國際癌癥研究機構(InternationalAgency for Research on Cancer, IARC)將蘇丹紅I號歸為三類致癌物，即動物致癌物。1995年歐盟等國家禁止蘇丹紅作為食品添加齊U，中國也在1996年的《食品添加劑衛生標 準》中明令禁止使用蘇丹紅。但是由于其價廉易得，色澤鮮亮持久等特點，仍然有一些不法食品生產商、違規加工、違法使用蘇丹紅染料。這一方面給國家的食品安全帶來了很大的隱患；另一方面，也給消費者的身心健康帶來嚴重威脅。目前，國內外對食品中蘇丹紅I號的常用檢測方法是高效液相色譜法(HPLC)、高效液相-質譜聯用法(HPLC-MS)、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)、化學發光法等。最近，極譜法、分子印跡技術(MIT)以及表面等離子共振技術(SPR)都被應用在蘇丹紅I號的測定中。盡管目前有很多種方法和手段可以檢測蘇丹紅I號，但是，這些方法的樣品前處理比較復雜繁瑣，需要精密昂貴的儀器設備，同時還要有專門的儀器操作人員等，很難達到快速、簡便的現場檢測要求，因此限制了其在基層檢測部門的大
規模推廣使用。酶聯免疫檢測分析(Enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)由于具有特異性強、靈敏度高、簡便、快速等優點，近年來備受人們的關注。免疫分析是以抗體作為生物檢測器的分析技術，而蘇丹紅I號作為小分子物質，分子量為248，是半抗原，本身不具有誘導產生抗體的能力，不能直接通過它免疫動物而得到檢測所必須的抗體，因此，合成蘇丹紅I號的人工抗原便成為建立其ELISA分析方法的首要步驟和關鍵所在。
發明內容
蘇丹紅I號分子結構本身沒有可以直接和載體蛋白偶聯的氨基或羧基，因此需要引入。本發明根據威廉姆森合成法成醚的基本原理，在堿性條件下，將蘇丹紅I號中酚羥基變為酚鉀鹽，然后與含有溴的溴酸乙酯反應成酯，用堿水解酯鍵，后酸化得含有羧基的蘇丹紅I號衍生物，將此衍生物以碳二亞胺為偶聯劑與載體蛋白偶聯從而得到蘇丹紅I號的人工抗原。本發明要解決的技術問題是是利用新的合成路線，為蘇丹紅I號提供了一種全新的人工抗原及其制備方法和應用。本發明的技術方案是:
本發明所述的蘇丹紅1號衍生物(半抗原-3)的結構如圖1所示，其中n=3，4，5。由于蘇丹紅1號分子結構本身沒有可以直接和載體蛋白偶聯的氨基或羧基，因此需要引入。本發明根據威廉姆森合成法成醚的基本原理，在堿性條件下，將蘇丹紅I號中酚羥基變為酚鉀鹽，然后與含有溴的溴酸乙酯反應成酯，用堿水解酯鍵，后酸化得含有羧基的蘇丹紅I號衍生物，將此衍生物以碳二亞胺為偶聯劑與載體蛋白偶聯從而得到蘇丹紅I號的人工抗原。1.蘇丹紅1號衍生物的合成
(1)將蘇丹紅1 號(20mmol,4.96g)、6_ 溴己酸乙酯(40mmol, 7.2ml)、碳酸鉀(140mmol,19.32g)溶解于無水丙酮中，攪拌加熱回流2天,薄層色譜(Thin layer chromatography,TLC)鑒定蘇丹紅I號是否反應完全。TLC條件:石油醚:乙酸乙酯(v/v) =1:50 ；
(2)反應液抽濾以除去未反應的碳酸鉀，然后旋蒸以除去丙酮；
(3)過柱:先用完全 石油醚洗脫，將最下面淺黃色層完全洗出，旋蒸，鑒定其為未反應完的6-溴己酸乙酯；接著用石油醚:乙酸乙酯=30:1的洗脫液洗柱，將深紅色的部分洗出，得產物；
(4)產物用乙醇溶解后，加入過量的30%氫氧化鈉，攪拌過夜使其充分水解；
(5)旋蒸除去水解液中的乙醇，后加入10%稀鹽酸酸化，調pH〈7.0，此時有沉淀析出，抽濾，沉淀水洗5次，得蘇丹紅I號衍生物。2.蘇丹紅1與蛋白偶聯物的合成
(1)將蘇丹紅I號衍生物(72.4mg, 200uM)、二環己基碳二亞胺(41.2mg, 200uM)、N_羥基琥珀酰亞胺(23mg，200uM)混合，溶解于400ul無水N，N- 二甲基甲酰胺中，室溫攪拌過夜；
(2)將混合液緩慢逐滴加入到4ml冰浴的167.5mg/ml的BSA溶液中，4°C攪拌反應過
夜；
(3)將反應液轉移至透析袋中，用PBS在4°C條件下透析4天，每12小時換一次透析液，以除去未反應的雜質；
(4)透析結束后，將反應液離心，7000rpm，5min;得蘇丹紅I號的人工抗原，其結構如圖2所示。蘇丹紅1號人工抗原的合成路線見圖3。本發明與已有技術相比其有益效果是:
目前所報道的蘇丹紅I號人工抗原的制備方法中，其衍生物主要是通過丁二酸酐法直接在酚羥基上引入羧基，連接臂很短，在和載體蛋白相偶聯時容易被載體蛋白包裹，抗原在其表面的展示能力大幅度下降。本發明的優勢在于提供了一種4-6個碳長度的連接臂，可以將蘇丹紅I號的整個結構充分展示在載體蛋白的表面，避免了被載體蛋白包被在其結構內部的情況，因此大大增強了蘇丹紅I號被免疫細胞識別的機會，有助于提高抗體的質量。四
圖1蘇丹紅I號衍生物結構圖 圖2蘇丹紅I號與蛋白偶聯物結構圖 圖3蘇丹紅I號人工抗原的合成路線圖 圖4蘇丹紅I號衍生物的核磁共振圖 圖5A蘇丹紅I號與載體蛋白BSA偶聯物的紫外掃描圖譜 圖5B蘇丹紅I號與載體蛋白OVA偶聯物的紫外掃描圖譜 圖6蘇丹紅I號單克隆抗體的純化 圖7蘇丹紅I號單克隆抗體特異性驗證 五具體實施例方式 實施例1 蘇丹紅I號-BSA偶聯物
(1)將蘇丹紅I號4.96g,6-溴己酸乙酯7.2ml,碳酸鉀19.32g溶解于無水丙酮中，攪拌加熱回流2天，TLC鑒定蘇丹紅I號是否反應完全。TLC條件:石油醚:乙酸乙酯(v/v) =1:50 ；
(2)反應液抽濾以除去未反應的碳酸鉀，然后旋蒸以除去丙酮；
(3)過柱:先用完全石油醚洗脫，將最下面淺黃色層完全洗出，旋蒸，鑒定其為未反應完的6-溴己酸乙酯；接著用石油醚:乙酸乙酯=30:1的洗脫液洗柱，將深紅色的部分洗出，得產物；
(4)產物用乙醇溶解后，加入過量的30%氫氧化鈉，攪拌過夜使其充分水解；
(5)旋蒸除去水解液中的乙醇，后加入10%稀鹽酸酸化，調pH〈7.0，此時有沉淀析出，抽濾，沉淀水洗5次，得蘇丹紅I號衍生物； (6)將蘇丹紅I號衍生物72.4mg, 二環己基碳二亞胺41.2mg,N-輕基琥拍酰亞胺23mg混合，溶解于400ul無水N，N- 二甲基甲酰胺中，室溫攪拌過夜；
(7)將混合液緩慢逐滴加入到4ml冰浴的167.5mg/ml的BSA溶液中，4°C攪拌反應過
夜；
(8)將反應液轉移至透析袋中，用PBS在4°C條件下透析4天，每12小時換一次透析液，以除去未反應的雜質；
(9)透析結束后，將反應液離心，7000rpm，5min;得蘇丹紅I號的人工抗原。實施例2 蘇丹紅I號-OVA偶聯物
(1)將蘇丹紅I號衍生物72.4mg, 二環己基碳二亞胺41.2mg,N-輕基琥拍酰亞胺23mg混合，溶解于400ul無水N，N- 二甲基甲酰胺中，室溫攪拌過夜；
(2)將混合液緩慢加入到4ml冰浴的112.5mg/ml的OVA溶液中，4°C攪拌反應過夜；
(3)將反應液轉移至透析袋中，用PBS在4°C條件下透析4天，每12小時換一次透析液，以除去未反應的雜質；
(4)透析結束后，將反應液離心，7000rpm，5min;得蘇丹紅I號-OVA偶聯物。實施例3 蘇丹紅I號衍生物及其偶聯物的鑒定
首先，采用核磁共振的方法對蘇丹紅I號衍生物的結構進行鑒定，根據圖譜所反映出的H的位置和數量顯示其修飾成功；同時，使用紫外分光光度掃描的方法對蘇丹紅I號與載體蛋白偶聯物進行鑒定，根據其特征吸收峰的變化及其峰形鑒定是否偶聯成功。蘇丹紅I號標準品在480nm處有一強的吸收峰，而BSA和OVA的最大吸收峰在280nm左右，但是偶聯物在這兩個波長下均有吸收，是兩個物質吸收峰疊加的結果，表明兩者偶聯成功，計算得出偶聯比約為1:10 (圖5A和圖5B)。實施例4 蘇丹紅I號單克隆抗體的制備
取免疫后抗血清效價較高的小鼠脾臟和骨髓瘤細胞SP2/0做細胞融合，篩選雜交瘤細胞并多次梯度稀釋后，取只長有單克隆的微孔中的上清，純化后得單克隆抗體，并用ELISA鑒定抗體特異性。具體操作如下:
(1)猝死小鼠，用70%酒精消毒，超靜臺內取脾臟。將取出的脾臟放入預先放有IOml1640培養液的小培養皿內；
(2)收集脾細胞。先用手術剪將脾臟剪碎，再用無菌載玻片輕壓研磨。然后將研磨液過細胞篩，將細胞轉移至離心管中，充分混勻，離心，IOOOrpm, 5min ；
(3)裂解紅細胞。取出離心管，吸去上清，用手彈散脾細胞，加Iml紅細胞裂解液裂解Imin后離心，IOOOrpm, 5min ;吸去上清,加培養液20ml,沉降Imin后吸上清移于另一離心管中，以除去裂解細胞后產生的蛋白及結締組織塊；
(4)準備SP2/0細胞。用移液槍吹打SP2/0細胞制成單細胞懸液轉移至離心管中，充分混勻并離心，IOOOrpm, 5min ；
(5)細胞計數及混合。分別計數，根據計數情況，將兩種細胞混合，SP2/0細胞:脾細胞=1:10,充分混勻，離心 IOOOrpm, 5min ；
(6)融合。吸去上清，將細胞團彈開，在水浴條件下加Iml聚乙二醇1500，逐滴加入，邊加邊輕晃，然后加20ml 1640小心吹打；離心800rpm, 5min ；
(7)鋪板。以計數多的細胞 計算，將其稀釋為3xl05個/ml的濃度，并在HAT培養基中培養；
(8)雜交瘤細胞株篩選。融合后7-10天仍用HAT培養液換液。培養3-5天即可見小克隆，雜交細胞較大，呈圓形且透明，其余細胞透光性差并逐漸死亡。當克隆長至孔底面積1/4左右時，可以取培養上清，進行ELISA抗體檢測；將檢測到的分泌預定抗體的克隆，轉移至24孔中培養，再經過有限稀釋法進行多次克隆后，取上清純化，并將細胞凍存保種。實施例5 蘇丹紅I號單克隆抗體的純化與特異性驗證
用經典的硫酸銨-辛酸法純化單克隆抗體，純化結果見圖6 (圖中:M為蛋白Marker，Abl為單抗經硫酸銨-辛酸純化，Ab2為雜交瘤細胞上清，FBS為血清對照，1640為培養基對照)。并用ELISA法鑒定抗體特異性。鑒定的具體操作步驟如下:在酶標孔中分別包被與半抗原-3-0VA結構相似的包被原:半抗原-1-0VA和半抗原-2-0VA，以及半抗原-3-0VA，0VA,BSA。每種包被原IOOul/孔，濃度均為lug/ml，4°C過夜；PBST洗滌3次，并拍干；用封閉液封閉后，PBST洗滌3次，拍干；加入純化的單克隆抗體，IOOul/孔；洗滌4次；拍干，加入I:3000稀釋的酶標二抗，IOOul/孔，37°C溫育Ih,洗滌3次，拍干；加TMB底物，IOOul/孔，避光靜置15min ;加終止液50ul/孔；最后用酶標儀測定在450nm處的吸光值0D45(I。ELISA結果顯示單克隆抗體具有很強的特異性(圖7)，這為蘇丹紅I號的免疫檢測方法的建立奠定了很好的基礎。
權利要求
1.一種蘇丹紅I號衍生物，其結構為:
2.根據權利要求1所述一種蘇丹紅I號衍生物，其特征是連接臂為3-溴丙酸乙酯Ethyl3_bromopropionate 或 4-溴丁酸乙酯 Ethyl4_bromobutyrate 或 5-溴戍酸乙酯Ethyl5-bromopentanoate 或 6_ 溴己酸乙酉旨 Ethyl6_bromocapronate0
3.根據權利要求1所述一種蘇丹紅I號衍生物的制備方法，其特征在于合成步驟為: (O將蘇丹紅I號4.96g,6-溴己酸乙酯7.2ml,碳酸鉀19.32g溶解于無水丙酮中，攪拌加熱回流2天，薄層色譜TLC鑒定蘇丹紅I號是否反應完全，TLC條件:石油醚:乙酸乙酯(v/v) =1:50 ； (2)反應液抽濾除去未反應的碳酸鉀，然后旋蒸除去丙酮； (3)過柱:先用石油醚洗脫，將最下面淺黃色層完全洗出，旋蒸，鑒定其為未反應完的6-溴己酸乙酯；接著用石油醚:乙酸乙酯(v/v) =30:1的洗脫液洗柱，將深紅色的部分洗出，得產物； (4)產物用乙醇完全溶解后，加入3倍量的30%氫氧化鈉，攪拌過夜使其充分水解； (5)旋蒸除去水解液中的乙醇，后加入10%稀鹽酸酸化，調pH〈7.0，此時有沉淀析出，抽濾，沉淀水洗5次，得蘇丹紅I號衍生物。
4.根據權利要求1所述一種蘇丹紅I號衍生物與蛋白的偶聯物，其結構為:
5.根據權利要求4所述一種蘇丹紅I號衍生物與蛋白的偶聯物的制備方法，其特征在于合成步驟為: (1)將蘇丹紅I號衍生物72.4mg,N, N- 二環己基碳二亞胺41.2mg,N-輕基琥拍酰亞胺23mg混合，溶解于400ul無水N，N- 二甲基甲酰胺中，室溫攪拌過夜； (2)將混合液緩慢逐滴加入到4ml冰浴的167.5mg/ml的BSA溶液中，4°C攪拌反應過夜； (3)將反應液轉移至透析袋中，用PBS在4°C條件下透析4天，每12小時換一次透析液，除去未反應的雜質； (4)透析結束后，將反應液離心，7000rpm，5min;得蘇丹紅I號的人工抗原。
6.根據權利要求4所述一種 蘇丹紅I號衍生物與蛋白的偶聯物在制備蘇丹紅I號特異性單克隆抗體中的應用。
全文摘要
本發明屬于免疫學技術領域，具體涉及一種蘇丹紅I號衍生物及其制備方法和應用。該方法根據威廉姆森合成法成醚的基本原理，在堿性條件下，將蘇丹紅I號中酚羥基變為酚鉀鹽，然后與含有溴的溴酸乙酯反應成酯，用堿水解酯鍵，再酸化得含有羧基的中間修飾物。將此中間修飾物以碳二亞胺為偶聯劑與載體蛋白偶聯從而得到蘇丹紅I號的人工抗原，并運用此抗原免疫小鼠后，可制備特異性強的單克隆抗體。整個方法簡單易行，操作簡便，人工抗原得率和純度高。
文檔編號C07C245/10GK103113258SQ20131007254
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月7日 優先權日2013年3月7日
發明者沈萍萍, 徐加發 申請人:南京大學