專利名稱：一種烏拉力肽的固相合成方法
技術領域：
本發明涉及一種烏拉力肽的合成方法，特別涉及一種烏拉力肽的固相合成法。
背景技術：
烏拉力肽，中文名稱烏拉力肽,英文名稱Ularitide ;Urodilatin,是一種含有32個氨基酸殘基的二硫橋環肽，它的分子式是C145H234N52O44S3,分子量:3506.00，CAS號為:118812-69-4,多妝序列為 Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-1le-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr[DisuIfidebridge: 11-27],結構式如下:
權利要求
1.一種烏拉力肽的固相合成法，其特征在于，包括如下步驟: 1)以Fmoc-Tyr(tbu)-王樹脂為起始樹脂,采用Fmoc固相合成法逐一偶聯每一個保護氨基酸，合成得到側鏈全保護的肽鏈樹脂； 2)用切割試劑對側鏈全保護的肽鏈樹脂進行切割，將三十二肽從樹脂上裂解下來并去除側鏈保護基團，得到烏拉力肽直鏈肽粗品； 3)將烏拉力肽直鏈肽粗品溶解于水中進行空氣氧化成環，得到烏拉力肽粗品肽溶液。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)具體內容包括如下步驟 (1)取Fmoc-Tyr(tbu)-王樹脂用DMF浸泡，使樹脂充分溶脹，抽干，加入Fmoc-Arg (pbf) -OH 、NMM 或 DIEA，用 HBTU/HOBT、TBTU/HOBT、DIC/HOBT、HATU/H0AT 中的一種混合物作為縮合劑，反應0.5-2小時，茚三酮法檢測反應終點，抽干，用DMF洗滌3-5次，抽干，獲得 Fmoc-Arg(pbf)-Tyr (tbu)-王樹脂； (2)在步驟(I)獲得的樹脂中，加入脫帽試劑，反應10-30分鐘，抽干，用DMF洗滌5_10次，抽干，以DMF為溶劑，加入具有芴甲氧羰基保護的氨基酸、NMM或DIEA，用HBTU/H0BT、TBTU/HOBT、DIC/HOBT、HATU/H0AT中的一種混合物作為縮合劑，反應0.5-2小時，茚三酮法檢測反應終點，抽干，用DMF洗滌3-5次，抽干，然后再加入脫保護試劑，脫保護反應，再加入具有芴甲氧羰基保護的氨基酸，如此反復，直至連完最后一個蘇氨酸；用DMF洗滌3-5次，再用甲醇和二氯甲烷交替洗滌3次，最后加甲醇收縮樹脂，抽干，真空干燥，得到側鏈全保護的妝鏈樹脂，即 Thr (tbu) -Ala-Pro-Arg (pbf) -Ser (tbu) -Leu-Arg (pbf) -Arg (pbf) -Ser (tbu)-Ser(tbu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Arg(pbf)-Met-Asp(Otbu)-Arg(pbf)-1le-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(tbu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tbu)-Phe-Arg(pbf)-Tyr(tbu)-王樹脂； 所說的具有荷甲氧羰基保護的氨基酸，依次包括Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser (tbu)-0H,Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Cys(trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Ser (tbu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-1Ie-OH,Fmoc-Arg (pbf) -OH, Fmoc-Asp (Otbu) -OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Arg (pbf) -OH, Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tbu)-OH, Fmoc-Ser(tbu)-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tbu)-OH,Fmoc-Arg(pbf) -OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，Fmoc-Tyr(tbu)-王樹脂的取代度在0.2mmol/g-l.0mmol/g之間,Fmoc-Arg (pbf)-OH的量為樹脂摩爾量的1_5倍；脫帽試劑為體積百分含量10 - 30%的PIP/DMF混合溶液，每一步保護氨基酸的量的是樹脂摩爾量的1_5倍，縮合試劑的量是樹脂摩爾量的1-5倍，NMM或DIEA的量是樹脂摩爾量的2_10倍，每一步反應終點的檢測方法所采用的是茚三酮檢測法。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，Fmoc-Tyr(tbu)-王樹脂的取代度為0.35mmol/g, Fmoc-Arg(pbf)-OH的量為樹脂摩爾量的2倍；脫帽試劑為體積百分含量20%的PIP/DMF混合溶液，每一步保護氨基酸的量的是樹脂摩爾量的2倍，縮合試劑為HBTU/HOBT，其用量是樹脂摩爾量的2倍，NMM的量是樹脂摩爾量的4倍。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2)包括如下步驟:在側鏈全保護的肽鏈樹脂中加入切割試劑，反應1-3小時，抽濾濾掉樹脂顆粒，并收集濾液，然后加入乙醚結晶沉淀，離心收集沉淀，再用乙醚洗滌3-6次，真空干燥，獲得烏拉力肽直鏈肽粗品。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述切割試劑是:體積配比為TFA:苯甲硫BI:苯酚:EDT:H20=87.5:5:2.5:2.5:2.5，反應 2.5 小時。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)包括如下步驟:將烏拉力肽直鏈肽粗品按1-5克每升的濃度溶解于純水中,然后滴加質量百分濃度10%的稀氨水調pH值7-10之間，攪拌反應6-24小時，進行空氣氧化反應成環，并用質譜檢測反應終點，得到烏拉力肽粗品肽溶液。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于將烏拉力肽直鏈肽粗品按2克每升的濃度溶解于純水中，調pH值為8 .5。
全文摘要
本發明涉及一種固相合成烏拉力肽的方法。主要解決目前沒有適于工業化制備烏拉力肽方法的技術問題。本發明采用固相合成方法，主要包括以下幾個步驟1)以Fmoc-Tyr(tbu)-王樹脂為起始樹脂，采用Fmoc固相合成法逐一偶聯每一個保護氨基酸，合成得到側鏈全保護的肽鏈樹；2)用切割試劑對側鏈全保護的肽鏈樹脂進行切割，將三十二肽從樹脂上裂解下來并去除側鏈保護基團，得到烏拉力肽直鏈肽粗品；3)將烏拉力肽直鏈肽粗品溶解于水中進行空氣氧化成環，得到烏拉力肽粗品肽。本發明具備大規模化生產能力，操作簡易、工藝穩定、生產成本低，總收率超過20%。
文檔編號C07K1/06GK103145827SQ201310066800
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月4日 優先權日2013年3月4日
發明者徐紅巖, 竺劍峰, 張所德 申請人:吉爾生化(上海)有限公司, 上海吉爾多肽有限公司, 無錫亞肽生物科技有限公司