專利名稱：抗cd20單克隆抗體可變區序列及其制備方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥技術領域，更具體地，涉及抗⑶20單克隆抗體可變區序列及其制備方法。
背景技術：
⑶20分子是人類B淋巴細胞表面特有的標識，在B淋巴細胞表面以寡聚體形式存在。⑶20的結構與一些離子通道相似，每一個⑶20單體都是4次跨膜，分子的N端和C端在細胞質的同側，可形成多聚體，⑶20可在B淋巴細胞膜上形成鈣離子通道，⑶20抗體在BCR的作用下，可形成鈣離子流。B細胞活化后，BCR — CD20復合物解離，磷蛋白、鈣調素結合蛋白會暫時被招募到CD20，從而參與胞內信號的傳導。在人體中幾乎所有正常或惡性B淋巴細胞都存在⑶20抗原。但是，其他血細胞如T淋巴細胞、NK細胞及粒細胞等不存在CD20抗原。因此，CD20抗原是單克隆抗體治療的一個理想的靶抗原。現在已經合成了一種針對CD20抗原的特異性抗體，稱為抗CD20，用于治療病情緩慢、侵襲性低的B細胞非霍奇金淋巴瘤，有效率達30% -50%。人體對鼠源抗體具有免疫反應，這也是鼠源抗體應用于臨床治療的主要障礙。通過基因工程抗體技術可以在基因水平上改造抗體，降低鼠源抗體的免疫原性，提高抗體特異性、穩定性和親和力。對鼠源抗體進行人源化改造，可保留抗體可變區與人源抗體恒定區融合，提高抗體親和力；或改造抗體結構，構建只保留抗體可變區的scFv或含抗體可變區和部分恒定區的Fab，可提高抗體在體內的吸收百分比和半衰期。
發明內容
如上所述,抗⑶20應用于B淋巴細胞瘤的臨床治療,療效顯著,毒副作用小，如今對抗CD20的分析研究越來越多，基于這一背景，本發明的目的是構建抗CD20單克隆抗體的重鏈可變區的核苷酸序列和輕鏈可變區的核苷酸序列，同上提供制備上述核苷酸序列的方法。為實現上述目的，本發明用CD20蛋白作為抗原來免疫小鼠，然后檢測出相應抗體表達呈陽性的小鼠，取表達呈陽性小鼠的脾臟，分離脾細胞，然后融合脾細胞和骨髓瘤細胞，得到雜交瘤細胞；在HAT培養基中培養后，檢測得到抗體表達陽性克隆，提取陽性雜交瘤細胞總RNA，以總RNA中的mRNA為模板，反轉錄得到相應抗體基因的cDNA，再通過PCR擴增獲得相應抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，由此實現本發明。本發明提供了下述各項:抗CD20單克隆抗體可變區序列，包含兩種核苷酸序列，所述核苷酸序列分別為51802-VH 和 51802-VL。優選的，所述核苷酸序列51802-VH和51802-VL由保藏號為407CT20.1.2的雜交瘤細胞株制備而成。優選的，所述51802-VH編碼117個氨基酸，分子量為13273D，其中⑶R1、⑶R2和CDR3 的區域分別為 26aa_33aa, 51aa_60aa 和 99aa_106aa。優選的，所述51802-VL編碼113個氨基酸，分子量為12297D，其中CDR1、CDR2和CDR3 的區域分別為 27aa_37aa, 55aa_57aa 和 94aa_102aa。優選的，還包括與上述兩種核苷酸序列具有相同氨基酸序列產物的核苷酸序列。優選的,還包括經過一個或者幾個堿基替換、缺失或添加后仍具有與所述核苷酸序列產生的氨基酸序列具有相同活性的核苷酸序列。制備抗⑶20單克隆抗體可變區序列的方法，包括以下步驟:(1)雜交瘤細胞的制備:首先用CD20蛋白抗原免疫雌性健康的BALB/c小鼠，挑選出免疫后抗體表達呈陽性的小鼠，取其脾臟細胞，然后將分離的小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞融合，得到雜交瘤細胞；(2)單克隆細胞的篩選:將上述雜交瘤細胞在HAT培養基中培養，對ELISA檢測呈陽性的單克隆細胞進行ELISA復篩，然后將篩選出的ELISA陽性單克隆細胞進行WB復篩，再將WB陽性細胞進行亞克隆，經過2次亞克隆，篩選出能夠穩定分泌抗體的單克隆細胞，將陽性的單克隆細胞擴大培養后定株、凍存；(3)雜交瘤細胞抗CD20單克隆抗體的獲得:首先鑒定步驟(2)所制備的單克隆細胞的亞類亞型，然后將陽性的單克隆細胞注射到小鼠體內進行腹水生產，再將產生的腹水通過層析純化后得到抗CD20單克隆抗體；(4)抗⑶20單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區基因的克隆:提取步驟(3)中所用的單克隆細胞的總RNA，以總RNA中的mRNA為模板，反轉錄得到cDNA，最后克隆得到抗CD20單克隆抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區。本發明提供了抗CD20單克隆抗體可變區序列，及其克隆測序方法，其可用于用于制備重組抗體、ScFv抗體、人源化抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、單域抗體等；在制備用于B淋巴細胞瘤的治療和診斷藥物中具有重要價值。
圖1.407CT20.1.2克隆抗體的免疫印跡圖其中1-5 條帶分別表示 8ug/mL, 4ug/mL, 3ug/mL, lug/mL,0.5ug/mL 表示陰性血清；“ + ”表示陽性血清。圖2.407CT20.1.2克隆抗體可變區VH和VL的RT-PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖分
析結果其中泳道I為VH基因，泳道2為VL基因，泳道3為DL2000DNA Marker。圖3.407CT20.1.2克隆抗體可變區VH和VL目的片段構建到pMD18_T載體上酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖其中泳道1 為 pMD18-T/VH，泳道 2 為 pMD18_T/VL，泳道 3 為 DL2000DNAMarker。
具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發明做進一步描述，應理解的是，這些實施例僅用于說明本發明，而不是對本發明的限制，在本發明的構思前題下對本發明制備方法的簡單改進，對本發明可變區核苷酸序列的利用都屬于本發明要求保護的范圍。
實施例1.抗CD20單克隆抗體可變區序列的制備與鑒定1、雜交瘤細胞制備1.1動物免疫以⑶20蛋白抗原同時免疫3只6-8周齡的雌性健康的BALB/c小鼠，3次免疫后，7天采血并測血清中抗體的效價,選擇1:4000稀釋時ELISA檢測OD值大于1.0的血清，同時血清WB檢測呈陽性的BALB/c小鼠用于融合，融合之前的3天，用不加佐劑的抗原腹腔加強免疫注射，注射劑量為50ug/只。1.2收集B淋巴細胞追加免疫后3天，小鼠摘眼球取血，離心后獲得血清作陽性對照；無菌狀態下取小鼠脾臟，并將脾臟放在IO mL預溫不完全培養基中，去除結締組織，置于100目不銹鋼網中，用注射器的內芯研磨，邊研磨邊滴加不完全培養基沖洗；收集過濾后的細胞懸液于離心管中，離心后棄上清液，然后用不完全培養基懸浮細胞，取I X IO8個細胞，在室溫下放置待用。1.3小鼠骨髓瘤細胞的制備融合前10天，將骨髓瘤細胞從液氮中取出，迅速放入37 °C水浴中，在Imin內使凍存液完全溶解；離心，棄上清液，置MDM完全培養基中，37°C，5%C02細胞擴大培養；融合前
2-3天，細胞應處于對數生長期。融合前將對數生長期小鼠骨髓瘤細胞收集到離心管中，計數，取2 X 107-3 X IO7個細胞，離心棄上清液，用不完全培養基懸浮細胞，置室溫待用。1.4細胞融合融合前將50%PEG置37°C，5%C02細胞培養箱中調整溫度，將2 X 107-3 X IO7個骨髓瘤細胞懸液和IX IO8個脾臟B淋巴細胞懸液移至一個50mL離心管中，補加30mL不完全培養基，在轉速1200rpm的條件下離心lOmin，棄去上清液，輕輕彈擊管底，使細胞團松散，一邊均勻地轉動離心管，一邊用ImL吸量管吸取ImL預溫的PEG融合劑，在離心管的離管底約2cm處沿管壁慢慢加入細胞中，邊加邊轉動離心管，從加入到加完的時間控制在60s，輕搖離心管30s，靜置60s，然后立即加入20mL不完全培養液,使PEG稀釋而失去促融作用，具體加法是第一分鐘加ImL,第二分鐘加4mL，隨后的三分鐘之內將剩余液體加完，在37°C水浴中靜置lOmin，1200rpm,離心lOmin，棄去上清，加入含有HAT的完全培養基，制成細胞懸液，鋪到96孔細胞培養板上，置37°C，5%C02細胞培養箱中。1.5單克隆細胞的篩選細胞在HAT培養基中培養，未融合的骨髓瘤細胞和未融合的淋巴細胞逐漸死亡；融合的雜交瘤細胞能在HAT培養基中存活和增殖。在37°C，5%C02細胞培養箱中培養7_10天；用抗原包被酶標板，37°C包被2h，然后用2%BSA封閉；吸取96孔板中生長克隆的細胞上清加到封閉好的酶標板中，37°C孵育Ih ;洗滌5遍后，加入HRP標記的羊抗鼠IgG，37°C孵育Ih ;洗滌后加入TMB顯色液，然后加2M硫酸終止反應，在酶標儀上進行讀數；將ELISA檢測陽性的克隆挑入24孔細胞培養板培養，3天后進行ELISA復篩，將篩選出的ELISA陽性克隆進行WB復篩，WB陽性細胞進行亞克隆，經過2次亞克隆，篩選出能夠穩定分泌抗體的單克隆細胞，將陽性的單克隆擴大培養后定株、凍存。2、雜交瘤細胞抗⑶20單克隆抗體的獲得及生物學鑒定2.1雜交瘤細胞抗⑶20單克隆抗體的獲得將定株的單克隆細胞的細胞上清液用美國BD公司Mouse Monoclonal AntibodyIsotyping Kit鑒定單抗的亞類亞型，然后將陽性的單克隆細胞注射到小鼠體內進行腹水生產，生產的腹水通過層析純化后的得到抗體。2.2ffestern blot檢測抗體的特異性取已處理的細胞裂解液，在凝膠上進行垂直SDS-PAGE，120v90min,電泳結束后，取下凝膠，置于PVDF膜上，將蛋白用半干法轉染到PVDF膜上，IOv, 120min ;將轉印后的PVDF膜在5%脫脂奶粉中室溫封閉2h ;將抗體溶解于3mL封閉液中，4°C過夜；用洗滌液洗滌3次，每次5min，用封閉液來稀釋HRP標記的羊抗鼠IgG，室溫下孵育2h ;再用洗滌液洗滌3次，將化學發光試劑加到PVDF膜上，到暗室曝光到X膠片上，通過顯影和定影，將結果反映在膠片上；掃描膠片，分析結果，其結果參照圖1。2.3單克隆抗體親和常數測定用包被液將抗原稀釋， 分別加入酶標板，100微升/孔，370C 2h，PBS洗滌5次，拍干，加2%BSA封閉液200微升/孔，4°C過夜，洗滌5次，拍干；將抗體從4ug/mL開始進行梯度稀釋后加入到包被好的酶標板中，100微升/孔，37°C lh，洗滌5次，拍干；加入HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體，工作液100微升/孔，370C Ih,洗滌5次，拍干；加入TMB顯色液，37°C反應5-10min，加終止液50微升/孔，立即在酶標儀上以450nm波長測定OD值，按照公式計算出單克隆抗體親和常數。3、抗⑶20單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區基因的克隆所用細胞株為采用上述方法獲得的能分泌高親和力、高特異性的抗CD20抗體的雜交瘤細胞株，對應的保藏編號為407CT20.1.2，其分泌的抗體分子亞型IgGl。取對數生長期的407CT20.1.2雜交瘤細胞，用QIAGEN公司的試劑盒RNeasy MiniKit (貨號:QIAGEN-74106)提取總RNA，取少量用nanodrop定量及1%非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測，隨后用 SuperScript.1ll First-Strand Synthesis System for RT-PCR 試劑盒(貨號:Invitrogen-18080-051)反轉錄cDNA，用特異引物擴增抗CD20抗體基因的輕鏈或重鏈可變區。將含有相應重鏈可變區或輕鏈可變區片段的PCR反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠分離目的片段。通過膠回收試劑盒(捷瑞-GK2042)純化目的產物后，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的片段的純度；之后，將回收得到的相應重鏈可變區和輕鏈可變區克隆至測序載體PMD18-T，后測序，對測序結果進行同源性和結構分析。相關操作具體步驟如下:3.1RT-PCR擴增CD20抗體輕鏈和重鏈可變區3.1.1引物設計根據IgG可變區的序列，在信號區和恒定區合成5’和3’端引物用于擴增CD20抗體重鏈可變區，引物序列如下:VHF (5，-ACTAGTCGACATGGVTTGGSTGTGGAMCTTGCYATTCCT-3’)，含有 Sal I 酶切位占.
VHR (5，-CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG-3’)，含有 Hind TTT酶切位點。根據IgG可變區的序列，在信號區和恒定區合成5’和3’端引物用于擴增CD20抗體輕鏈可變區，引物序列如下:LHF (5，-ACTAGTCGACATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT-3’)，含有 Sal I 酶切位占.
LHR (5 ’ -CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA-3 ’ ),含有 Hind TTT酶切位點。3.1.2雜交瘤細胞總RNA提取用上述的雜交瘤細胞407CT20.1.2提取總RNA，具體步驟如下:收集對數生長期雜交瘤細胞407CT20.1.2，各2X IO6個，800rpm離心5min，去上清，沉淀下來的細胞可保存于_80°C，或直接用于RNA提取；每份細胞樣品(細胞數約2 X IO6個)中加入350 μ L RTL溶液，渦旋30s ；向以上每體系中加入70%乙醇，用ImL移液槍輕輕吹打均勻；將以上體系混合液轉入RNeasy spin column, 8000x g離心15s,去濾液；向以上RNeasy spin column 中各加入 700 μ L RWl 溶液，8000x g 離心 15s,去濾液；向以上RNeasy spin column 中各加入 500 μ L RPE 溶液，8000x g 離心 15s,去濾液；向以上RNeasy spin column 中各加入 500 μ L RPE 溶液，8000x g 離心 2min,去濾液；將RNeasy spin column換到無RNA酶的2mT,收集管中，全速離心Imin ；將RNeasy spin column 換到無 RNA 酶的 1.5mT,FP 管中，加入 30-50 μ L 無 RNA 酶的 H20,8000x g 離心 Imin,洗脫 RNA。3.1.3 反轉錄 PCR以雜交瘤細胞407CT20.1.2總RNA為模板，用Invitrgen的RT-PCR第一鏈合成SuperScript.1II試劑盒(貨號18080-051),反轉錄cDNA,具體步驟如下:(I)引物與模板變性按表I中所不，配成10 μ L體系,65°C，5min,隨后冰上放置Imin,利于引物與RNA模板結合。表I
權利要求
1.抗CD20單克隆抗體可變區序列，其特征在于，包含兩種核苷酸序列，所述核苷酸序列分別為 51802-VH 和 51802-VL。
2.根據權利要求1所述的抗CD20單克隆抗體可變區序列，其特征在于，所述核苷酸序列51802-VH和51802-VL由保藏號為407CT20.1.2的雜交瘤細胞株制備而成。
3.根據權利要求1所述的抗CD20單克隆抗體可變區序列，其特征在于，所述51802-VH編碼117個氨基酸，分子量為13273D，其中CDR1、⑶R2和⑶R3的區域相應地分別為26aa_33aa, 51aa_60aa 和 99aa_106aa。
4.根據權利要求1所述的抗CD20單克隆抗體可變區序列，其特征在在于，所述51802-VL編碼113個氨基酸，分子量為12297D，其中CDR1、CDR2和CDR3的區域相應地分別為 27aa_37aa, 55aa_57aa 和 94aa_102aa。
5.根據權利要求1所述的抗CD20單克隆抗體可變區序列，其特征在于，還包括:與上述兩種核苷酸序列具有相同氨基酸序列產物的核苷酸序列。
6.根據權利要求5所述的抗⑶20單克隆抗體可變區序列，其特征在于，還包括:經過一個或者幾個堿基替換、缺失或添加后仍具有與所述核苷酸序列產生的氨基酸序列具有相同活性的核苷酸序列。
7.制備權利要求1至6任意一項所述的抗CD20單克隆抗體可變區序列的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)雜交瘤細胞的制備:首先用CD20蛋白抗原免疫雌性健康的BALB/c小鼠，挑選出免疫后抗體表達呈陽性的小鼠，取其脾臟細胞，然后將分離的小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞融合，得到雜交瘤細胞； (2)單克隆細胞的篩選:將上述雜交瘤細胞在HAT培養基中培養，對ELISA檢測呈陽性的單克隆細胞進行ELISA復篩，然`后將篩選出的ELISA陽性單克隆細胞進行WB復篩，再將WB陽性細胞進行亞克隆，經過2次亞克隆，篩選出能夠穩定分泌抗體的單克隆細胞，將陽性的單克隆細胞擴大培養后定株、凍存； (3)雜交瘤細胞抗CD20單克隆抗體的獲得:首先鑒定步驟(2)所制備的單克隆細胞的亞類亞型，然后將陽性的單克隆細胞注射到小鼠體內進行腹水生產，再將產生的腹水通過層析純化后得到抗CD20單克隆抗體； (4)抗CD20單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區基因的克隆:提取步驟(3)中所用的單克隆細胞的總RNA，以總RNA中的mRNA為模板，反轉錄得到cDNA，最后克隆得到抗CD20單克隆抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區。
全文摘要
抗CD20單克隆抗體可變區序列，包含兩種核苷酸序列，所述核苷酸序列分別為51802-VH和51802-VL。用CD20蛋白作為抗原，免疫小鼠后，檢測得到相應抗體表達呈陽性的小鼠，分離其脾細胞后，融合脾細胞和骨髓瘤細胞，在HAT培養基中培養后，檢測得到抗體表達陽性克隆，提取陽性雜交瘤細胞總RNA，以總RNA中的mRNA為模板，反轉錄得到相應抗體基因的cDNA，再用特異引物PCR獲得相應抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，并進行克隆和測序。
文檔編號C07K16/28GK103173457SQ201310066338
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月4日 優先權日2013年3月4日
發明者吳純, 李靜文, 鄒建炫, 汪偉, 楊春花, 周延慶, 李順玲, 孫其玲, 洪揚, 陳媛 申請人:百奇生物科技(蘇州)有限公司