專利名稱：一種膠原蛋白的制備方法
技術領域：
本發明涉及生物活性物質的制備發明，特別是指一種膠原蛋白的制備方法。
背景技術：
膠原蛋白是人體內含量最多的蛋白質，占體內蛋白質總量的三分之一，約占人體重量的6%.它是結締組織的主要組成部分，主要以膠原纖維的形式存在，主要存在于皮膚、肌肉、骨骼、牙齒、內臟(如胃、腸、心腦、血管與食道)與眼睛等部位.膠原蛋白具有美容(抗皺、保濕、塑身)、保障運動系統(骨骼、肌肉和關節)和心腦血管系統健康、調控內分泌、養護臟器、提高人體免疫力等多重功效.另外，因為膠原蛋白還具有良好的生物相容性、營養性、修復性、保濕性、配伍性和親和性，所以可被廣泛應用于生物醫學材料、化妝品、食品及保健品等功能性產品中膠原蛋白與肌體的生長、衰老和疾病有著極其密切的聯系，是可以護佑人一生的重要營養物質.
蛋白質水解產物的生產方式通常有兩種:化學降解法和酶降解法。化學法是用酸、堿等化學試劑在一定溫度下促使蛋白質分子的肽鏈斷裂形成小分子物質的方法。酸法多采用鹽酸、硫酸等強酸在高溫下反應，反應強烈，設備腐蝕嚴重，水解徹底，得到的多肽分子質量分布不均勻，色氨酸完全被破壞，該法目前已逐漸被淘汰；堿法水解會因為不對稱碳原子經過中間狀態的過度階段，發生消旋現象，即產生D型和L型的等摩爾混合物，使氨基酸大多消旋，其中，D-型氨基酸不能作為有效的氨基酸源，有些還具有毒性甚至有致癌、致畸和致突變作用。20世紀80年代，隨著酶制劑工業和食品工業的迅猛發展，人們發現酶法水解反應條件溫和，反應時間短，無環境污染，產品營養價值高，產物以多肽和L型游離氨基酸為主，易于人體消化吸收，因而利用酶水解膠原蛋白逐漸受到了人們的重視。能使膠原蛋白酶解的酶類較多。按照作用位點可以分為內切酶和外切酶；從來源上可分為植物蛋白酶(如菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶等)、動物蛋白酶(如胰蛋白酶、胃蛋白酶等)、微生物蛋白酶(如枯草桿菌1398、放線菌166等)；此外，較常用于水解的蛋白酶還有風味復合酶等。在實際應用中，酶的選取通常要考慮三個方面:一是酶對膠原蛋白作用的強度；二是酶的價格；三是水解產物的要求。如果酶對膠原的作用太弱，則無法得到高的膠原水解率，除此之外，還必須考慮酶對膠原的作用位點，因為這直接影響最后水解產物分子量的分布，是決定能否得到目標產物的一個關鍵因素，目前已知的關于制備膠原蛋白的酶種類也挺多，但是其水解效率普遍不是很高，因此，在水解效率上，還需要發現一種新的酶以進一步提聞。蚯蚓絲氨酸蛋白酶是從蚯蚓體內提取得到的一種酸性蛋白酶，屬于胰蛋白酶，它能水解蛋白質底物(如酪蛋白)，堿性氨基酸的酯及酰胺。PI3-4 ;20-50°C范圍穩定；是一種糖蛋白酶類。蚯蚓絲氨酸蛋白酶作為一組蛋白水解酶，對其酶學性質的研究還不夠深入。多數蚯蚓絲氨酸蛋白酶組分受3種絲氨酸蛋白酶抑制劑苯甲磺酰氟、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮、N-對甲苯磺酰賴氨酰氯甲基酮的抑制，但不同組分對不同種類的蛋白酶抑制劑的敏感性存在差異；蚯蚓絲氨酸蛋白酶直接切割纖溶酶原及降解纖維蛋白原是其同時具有激酶和纖溶酶活性的分子基礎；對不同合成底物具有專一性說明其具有不同活性中心；蚯蚓絲氨酸蛋白酶能對組織纖溶酶原激活劑(t-P A)的專一性底物S-2288有水解作用，說明其對纖溶酶原的激活方式與t-P A相似。
發明內容
本發明提出一種膠原蛋白的制備方法，提高了水解的效率，產物得率更高，同時得到的肽的含量更高，并且產物分離更加徹底，活性高。本發明的技術方案是這樣實現的:一種膠原蛋白的制備方法，包括以下步驟:(1)預處理:將制備膠原蛋白的原料清洗干凈，然后使用3%。_10%。的堿性溶液進行浸泡10-20min，再把原料清洗至中性，晾干待用；(2)稱取一定量的預處理后的原料，按照物料比l:3(w/v)-l:4(w/v)加入純化水，80-85°C滅菌 30-40min，冷卻至 40°C ；(3)按稱取預處理后的原料重量的0.5-2%。加入蚯蚓絲氨酸蛋白酶；(4)酶解工藝控制:通過緩沖溶液使得PH控制在6.0-7.8的范圍內，37_42°C保溫水解6-7h，80-85°C滅活30min，然后離心過濾，取過濾清液；(5)使用截留分子量為6000的超濾設備進行超濾，并補加純化水使超濾更加完全，取透出液；(6)將透出液進行干燥，得到膠原蛋白。優選的，步驟(I)中，所述堿性溶液為5%。的NaOH溶液。優選的，步驟(2)中，滅菌溫度為80°C 30min，溫度過高容易導致蛋白質變性，降低成品的價值。優選的，步驟(3)中，加入蚯蚓絲氨酸蛋白酶的量為稱取預處理后的原料重量的
I %0 O優選的，步驟(4)中，PH控制在6.5，保溫水解的溫度為40°C，水解時間6.5小時，滅活溫度為80°C。優選的，步驟(5 )中，所述超濾設備為中空纖維膜或者卷式膜或者管式膜或者陶瓷膜，當然，可用的超濾設備并不限于此，只要能達到同樣效果的超濾設備，均可以使用。優選的，步驟(6)中，所述干燥為冷凍干燥或噴霧干燥，采用冷凍干燥或噴霧干燥可以防止膠原蛋白發生變性。優選的，步驟(1)中，所述原料為魚皮、魚鱗或者禽類、畜類的皮或蹄，所述原料的選材不限于此，只是不同的選材由于原料本身的不同，產物的得率會稍有不同。本發明的有益效果為:本發明創造性的利用蚯蚓絲氨酸蛋白酶作為酶法制備膠原蛋白的酶原，其水解效率顯著提高，這些可以從水解后的肽含量(達到80%以上)等其他數據上看出，其明顯高于其他已知酶類；本發明中還通過在制備環節中添加使用超濾技術，使酶解產物分離徹底，膠原蛋白分子量均勻分布，3000分子量以下組分達90%以上，分子量小，活性高，更易于人體吸收；本發明一種膠原蛋白的制備方法的整個工藝過程條件溫和，對環境友好。
具體實施例方式為更好地理解本發明，下面通過以下實施例對本發明作進一步具體的闡述，但不可理解為對本發明的限定，對于本領域的技術人員根據上述發明內容所作的一些非本質的改進與調整，也視為落在本發明的保護范圍內。我們采用本發明公開的方法，進行以下操作:(I)預處理:把魚皮用水清洗干凈后，使用5%。NaOH溶液浸泡15min，把魚皮清洗至中性為止，晾干待用；(2)稱取預處理后的魚皮500g，按物料比1:3 (w/v)加入1500ml純化水，80°C滅菌30min，冷卻至40°C ；(3)按稱取的預處理的魚皮重量1%。加入蚯蚓絲氨酸蛋白酶0.5g (來源:珠海博康藥業有限公司)；(4) PH控制在6.5，40°C保溫水解6.5h，80°C滅活30min，離心過濾，得1200ml溶液；(5)使用截留分子量為6000的中空纖維膜超濾，中間再補加1200ml純化水，最后得透出液2100ml，(6)超濾透出液進行冷凍干燥。結果:對得到的產品進行檢測分析，得膠原蛋白36.55g，重量回收率為7.31%。其中，肽含量為80.66%，3000分子量以下組分更是達90%以上；羥基脯氨酸含量為9.5% ;用凝膠色譜法檢測分子量分布及含量結果如下表所示:
權利要求
1.一種膠原蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)預處理:將制備膠原蛋白的原料清洗干凈，然后使用3%。-10%。的堿性溶液進行浸泡10-20min，再把原料清洗至中性，晾干待用； (2)稱取一定量的預處理后的原料，按照物料比l:3(w/v)-l:4(w/v)加入純化水，80-85°C滅菌 30-40min，冷卻至 40°C ； (3)按稱取預處理后的原料重量的0.5-2%。加入蚯蚓絲氨酸蛋白酶； (4 )酶解工藝條件控制:PH控制在6.0-7.8，37-42 V保溫水解6_7h，80-85 V滅活30min,然后離心過濾,取過濾清液； (5)使用截留分子量為6000的超濾設備進行超濾，并補加純化水使超濾更加完全，取透出液； (6)將透出液進行干燥，得到膠原蛋白。
2.如權利要求1中所述的膠原蛋白的制備方法，其特征在于:步驟(I)中，所述堿性溶液為5%。的NaOH溶液。
3.如權利要求1中所述的膠原蛋白的制備方法，其特征在于:步驟(2)中，滅菌溫度為80°C,30min。
4.如權利要求1中所述的膠原蛋白的制備方法，其特征在于:步驟(3)中，加入蚯蚓絲氨酸蛋白酶的量為稱取預處理后的原料重量的I %。。
5.如權利要求1中所述的膠原蛋白的制備方法，其特征在于:步驟(4)中，PH控制在6.5，保溫水解的溫度為40° C，水解時間6.5小時，滅活溫度為80°C。
6.如權利要求1中所述的膠原蛋白的制備方法，其特征在于:步驟(5)中，所述超濾設備為中空纖維膜或者卷式膜或者管式膜或者陶瓷膜。
7.如權利要求1中所述的膠原蛋白的制備方法，其特征在于:步驟(6)中，所述干燥采用冷凍干燥或噴霧干燥。
8.如權利要求1中所述的膠原蛋白的制備方法，其特征在于:步驟(I)中，所述原料為魚皮、魚鱗或者禽類、畜類的皮或蹄。
全文摘要
本發明提出了一種膠原蛋白的制備方法，其通過創造性的使用了蚯蚓絲氨酸蛋白酶作為酶法制備膠原蛋白的酶原，其水解效率顯著提高，本發明中還通過在制備環節中添加使用超濾技術，使酶解產物分離徹底，膠原蛋白分子量均勻分布，分子量小，活性高，更易于人體吸收；本發明一種膠原蛋白的制備方法的整個工藝過程條件溫和，對環境友好。
文檔編號C07K1/34GK103146789SQ201310065180
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月28日 優先權日2013年2月28日
發明者陳東, 黃家升, 方啟舟 申請人:珠海博康藥業有限公司