專利名稱：靶向載體-磷脂綴合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及祀向載體-磷脂綴合物(targeting vector-phospholipidconjugate)，尤其是靶向肽-磷脂綴合物，其可用于治療性和診斷性組合物；以及制備它們的方法。本發明包括靶向超聲造影劑，尤其是包含此靶向載體-磷脂綴合物的靶向微泡。
背景技術：
血管生成，即新血管的形成，不僅在胚胎發育以及正常組織生長和修復過程中發生，而且涉及雌性生殖周期、懷孕的建立和維持以及傷口和骨折的恢復。除了發生在正常個體中的血管生成之外，血管生成事件涉及許多病理過程，尤其是腫瘤生長和轉移，以及其中血管增殖增加的其它病癥，例如糖尿病性視網膜病、銀屑病和關節病。另外，血管生成對于將腫瘤由增生轉變為腫 瘤生長很重要。因此，抑制血管生成已成為活躍的癌癥治療研究領域。一般認為，腫瘤誘導的血管生成取決于腫瘤細胞產生促血管生成生長因子，該生長因子戰勝了趨向于保持現有血管靜止和穩定的其它力量。這些促血管生成物質或生長因子中最佳表征的是血管內皮生長因子(VEGF) (Cohen等，FASEBJ.，13:9_22 (1999))。VEGF由多種細胞類型響應于低氧和某些其它刺激天然產生。許多腫瘤也產生大量的VEGF，和/或誘導鄰近的基質細胞產生VEGF(Fukumura等，Cell，94:715-725 (1998))。VEGF也稱為VEGF-A，其作為121、145、165、189和206個氨基酸的5種不同剪接異構體(spliceisoform)合成。VEGF121和VEGF165是產生的主要形式，尤其是在腫瘤中(參見Cohen等，1999，出處同上)。與VEGF165不同，VEGF121沒有由VEGF基因的外顯子6和7編碼的基礎結構域，且不結合發夾或胞外基質。在本段落中提及的每個參考文獻都整體在此引入作為參考。VEGF家族成員主要通過結合受體酪氨酸激酶起作用。一般而言，受體酪氨酸激酶為糖蛋白，具有能夠結合一種或多種特異性生長因子的胞外結構域、跨膜結構域(通常為α螺旋)、近膜結構域(其中受體可通過例如磷酸化進行調節)、酪氨酸激酶結構域(受體的催化組分)以及在許多受體中涉及酪氨酸激酶底物的識別和結合的羧基末端尾。已知有3個結合VEGF的內皮細胞特異性受體酪氨酸激酶:VEGFR-1 (FIt-1)、VEGFR-2 (KDR或FIk-1)和VEGFR-3(Flt4)。FIt-1和KDR (也稱為VEGFR-2或FIk-1，在本文可互換使用)已被鑒定為主要的高親和力VEGF受體。盡管FIt-1對VEGF具有較高親和力，但KDR表現出更豐富的內皮細胞表達(Bikfalvi等，J.Cell.Physiol.，149:50-59 (1991))。而且，一般認為KDR支配血管生成反應，并因此引起人們極大的治療和診斷興趣(參見Cohen等，1999，出處同上)。KDR表達在血管生成性血管中被高度上調，尤其是在誘導強血管生成反應的腫瘤中(Veikkola等，Cancer Res., 60:203-212 (2000))。在純合KDR敲除小鼠胚胎中完全沒有血管發育凸顯了 KDR在血管生成中的關鍵性作用(Folkman等,Cancer Medicine,第5版(B.C.Decker Inc.；0ntario, Canada, 2000)，第 132-152 頁)。KDR(激酶結構域區)的成熟形式由1336個氨基酸組成。KDR的糖基化形式可在SDS-PAGE凝膠上遷移，其表觀分子量約為205kDa。KDR在其胞外結構域中含有7個免疫球蛋白樣結構域，其中前3個在VEGF結合中最重要(Cohen等，1999，出處同上)。VEGF自身為能夠同時結合2個KDR分子的同二聚體。結果為2個KDR分子在結合和自身磷酸化時被二聚化，變得活性增加很多。增加的激酶活性又啟動了介導VEGF的KDR特異性生物作用的信號轉導途徑。因此，不僅是KDR的VEGF結合活性在體內對血管生成很關鍵，而且檢測內皮細胞上的KDR上調的能力或檢測VEGF/KDR結合復合物的能力對檢測或監測血管生成應當極為有益。眾所周知，含氣超聲造影劑(gas filled ultrasound contrast agent)是用于回波描記術的特別有效的超聲反射體。這些超聲造影劑包括例如含氣微囊泡，例如含氣微泡和含氣微球。含氣微泡是特別優選的超聲造影劑。(在本文公開內容中，術語“微泡”具體地指由磷脂圍繞或穩定的氣泡)。例如，將載液中的含空氣或含氣微泡的混懸液注射到活體的血流中將大大地增強超聲回聲成像，因此有助于顯現內部解剖學結構。血管和內臟的成像可對醫學診斷(例如用于檢測腫瘤、心血管疾病和其它疾病)起到很大的幫助作用。對于診斷和治療目的，將對期望靶表現出高親和力的靶向載體組合物(例如KDR或VEGF/KDR復合物)摻入含 氣超聲造影劑中應當特別有益。例如，靶向載體-磷脂綴合物，尤其是靶向肽-磷脂綴合物，可用于制備靶向含氣超聲造影劑。另外，獲得用于大規模生產高度純化形式的這種靶向載體-磷脂綴合物的方法應特別有益。這些組合物和方法應使得可以生產出用于診斷或治療應用的組合物，例如將報告部分、抗腫瘤劑或血管生成抑制劑精確靶向靶點。
發明概述本發明提供靶向載體-磷脂綴合物，尤其是靶向肽-磷脂綴合物，其可用于制備含氣超聲造影劑。在一個優選的實施方案中，靶向肽-磷脂綴合物包括表現出高KDR結合親和力的靶向肽，因此成為用于血管生成過程成像的造影劑的有用組分。本發明還提供單體和二聚體肽磷脂綴合物(在本文也稱為脂肽)，其可用于制備含氣超聲造影劑，尤其可用于制備靶向KDR并可以用于血管生成過程成像的超聲造影劑。本發明還提供用于大規模生產高度純化的單體和二聚體肽磷脂綴合物、尤其是具有高KDR結合親和力的單體和二聚體肽磷脂綴合物的方法和工藝。本發明還提供用于大規模生產高度純化的、具有三氟乙酸(TFA)水平最低的二聚體肽磷脂綴合物的方法和工藝。本發明還提供用于合成高純度的單體肽的方法以及由多個肽亞單位構建肽磷脂綴合物的方法。
本發明還提供以高親和力結合KDR或VEGF/KDR復合物的單體肽，以及合成和使用這些單體肽的方法。本發明還提供由這些靶向載體-磷脂綴合物制備的靶向超聲造影劑。這些靶向超聲造影劑可用于使攜帶靶的組織成像。在一個優選的實施方案中，靶向超聲造影劑是靶向微泡，靶向載體-磷脂綴合物包括表現出高KDR結合親和力的靶向肽，因此成為用于使攜帶KDR的組織成像、尤其是用于腫瘤成像和血管生成過程成像的造影劑的有用組分。還提供制備和使用這些靶向超聲造影劑的方法。
附圖簡述
圖1圖示了一種用于由線性肽單體⑵生產單體肽磷脂綴合物⑴的方法。圖2圖示了單體肽磷脂綴合物(I)，包括對KDR具有高結合親和力的肽。圖3圖示了一種用于由肽單體生產前體二聚體肽(16)的方法。圖4圖示了一種用于將圖1所示的前體二聚體肽與DSPE-PEG2000-NH2綴合以形成含有以高親和力結合KDR的肽的二聚體肽磷脂綴合物(11)的方法。圖5圖示了二聚體肽-磷脂綴合物(11)，含有以高親和力結合KDR的肽。圖6圖示了一種用于生產具有TFA水平最低的二聚體肽-磷脂綴合物(例如(21))的方法。圖7圖示了另一種用于生產具有TFA水平最低的二聚體肽-磷脂綴合物(例如
(21))的方法。
圖8圖示了另一種用于生產具有TFA水平最低的二聚體肽-磷脂綴合物的方法。圖9圖示了另一種對KDR具有高結合親和力的代表性單體肽(32)。圖10圖示了另一種包含示于圖9的單體肽的單體肽-磷脂綴合物(31)。圖1lA-C顯示了通過在造影劑中使用二聚體肽-磷脂綴合物(11)(示于圖52)在下列情況下所獲得的圖像:1)基線(圖11A) ；2)在25分鐘后(圖11B);和3)在扣除基線和游離循環氣泡之后(圖11C)。圖12A-C顯示了通過在造影劑中使用單體磷脂肽綴合物(I)(示于圖2)在下列情況下所獲得的圖像:基線(圖12A)、在25分鐘后(圖12B)以及在扣除基線和游離循環氣泡之后(圖12C)。
發明詳述申請人:出乎意料地發現了可用于生產靶向超聲造影劑并具有優越的KDR結合效力的肽磷脂綴合物。這些化合物中有兩種為含有以高親和力結合KDR的線性肽單體的單體肽磷脂綴合物，而另一種為含有兩個不同的單體亞單位的二聚體肽磷脂綴合物，每個單體均結合KDR。另外，業已發現了用于大規模生產這些綴合物和前體物質的純化形式的高效方法。這些方法包括生產具有TFA水平最低的二聚體肽磷脂綴合物。所述磷脂可選自:磷脂酰乙醇胺和修飾磷脂酰乙醇胺。特別優選的磷脂包括通過將親水聚合物與其連接而修飾的磷脂酰乙醇胺。經修飾的磷脂酰乙醇胺的實例為用聚乙二醇(PEG)修飾的磷脂酰乙醇胺(PE)，簡稱為“PE-PEG”，即磷脂酰乙醇胺中的親水乙醇胺部分連接可變分子量(例如從300道爾頓到5000道爾頓)的PEG分子，例如DPPE-PEG、DSPE-PEG, DMPE-PEG 或 DAPE-PEG。優選 DSPE-PEG2000、DSPE-PEG3400、DPPE-PEG2000 和DPPE-PEG3400，特別優選DSPE-PEG2000。值得注意的是，可以使用磷脂的鹽形式，例如三甲基銨鹽、四甲基銨鹽、三乙基銨鹽、鈉鹽等。這些化合物可摻入到含氣超聲造影劑中，例如含氣微泡，以形成提供極佳的含靶組織成像的造影劑。在一個優選的實施方案中，將含有以高親和力結合KDR的靶向肽的靶向載體-磷脂綴合物摻入靶向微泡中。如本文所述，這些靶向微泡選擇性定位于具有KDR的組織，允許這些組織成像，尤其允許腫瘤成像和血管生成過程成像，包括允許那些與腫瘤發展相關的過程成像。
單體綴合物 一般描述表I提供了對圖1、2、9和10中顯示的識別標記的描述。
表I
權利要求
1.一種制備具有低水平的TFA的肽磷脂綴合物的方法，所述方法包括以下步驟: 將肽二聚體的TFA鹽經陰離子交換轉變為乙酸鹽；和 使肽二聚體與磷脂綴合。
2.權利要求1 的方法，其中所述肽包括 Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDP GGGK (-Adoa-Adoa-Glut-K)-NH2 環(2-12) 二硫化物]-NH2 環(6-13) 二硫化物。
3.權利要求1的方法，其中所述磷脂是DSPE-PEG2000-NH2。
4.一種制備具有低水平的TFA的肽-磷脂綴合物的方法，所述方法包括洗脫出大小排阻柱中的肽磷脂綴合物和TFA離子。
5.權利要求4的方法，其中所述洗脫在碳酸氫銨存在下進行。
6.權利要求4的方法，其中所述肽磷脂綴合物包含DSPE-PEG2000-NH2。
7.權利要求4的方法，其中所述肽二聚體包含Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[Ac-VCWEDSffGGEVCFRYDP GGGK (-Adoa-Adoa-Glut-K)-NH2 環(2-12) 二硫化物]-NH2 環(6-13) 二硫化物。
8.權利要求4的方法，其中所述肽-磷脂綴合物包含選自以下的單體:SEQID N0.2、Ac-AGPTffCEDDffYYCffLFGTGGGK[K (ivDde) ] -NH2 環(6-13) 二硫化物、Ac-VCffEDSffGGEVCFRYDPGGGK (Adoa-Adoa)-N H2 環(2-12) 二硫化物和 SEQ ID N0.5。
全文摘要
本發明提供具有高KLDR結合親和力的肽載體和制備此載體的方法。肽載體可與磷脂綴合，并包含在超聲造影劑組合物中。此超聲造影劑尤其可用于治療和診斷方法，例如使含KDR組織成像以及評價和治療與腫瘤病癥相關的血管生成過程。本發明也提供用于大規模生產高純度二聚體和單體肽磷脂綴合物以及用于形成綴合物的前體物質的方法。本發明還提供用于大規模生產含有非常低水平的TFA的高純度肽磷脂綴合物的方法。
文檔編號C07K14/00GK103204911SQ20131005290
公開日2013年7月17日 申請日期2006年12月8日 優先權日2005年12月9日
發明者P.比薩, S.沙爾卡維, H.范, B.拉米, P.南加潘, R.K.皮萊, S.波雄, B.宋, R.E.斯溫森 申請人:布拉科瑞士有限公司