專利名稱：一種高純度1-脫氧野尻霉素的提取方法
技術領域：
本發明涉及從植物中提取天然物質的方法，特別涉及一種高純度1-脫氧野尻霉素的提取方法。
背景技術：
桑葉為桑科(Moraceae)桑屬植物(Morus L.)的葉，是國家衛生部公布的藥食兩用植物，全國大部分地區均有栽培生產，以南方蠶桑生產地區產量最多，如江蘇、廣西、浙江、安徽、四川等。桑葉味苦、甘，性寒，歸肺、肝經，具有疏散風熱，清肺潤燥，平肝明目，涼血止血之功效。歷代中醫藥書籍中記載桑葉能夠治療消渴癥。現代醫學在研究桑葉化學成分和動物實驗基礎上，發現桑葉具有降血壓、降血糖、降低膽固醇、抗腫瘤、抗過敏及利尿等功倉泛。在桑葉、桑枝中起 到主要藥理作用的成分是1-脫氧野尻霉素(1-DNJ)是一種哌唳類多輕基生物堿，英文名稱1-Deoxynojirmycin,簡稱1-DNJ,化學名稱是3,4,5-三輕基-2-羥甲基四氫吡啶，分子式為C6H13NO4，分子量為163，具有降血糖、抗病毒、抗腫瘤轉移等多種生物活性。到目前為止的研究成果中，自然界以桑葉中天然含量最高。1-DNJ作為一種糖苷酶抑制劑具有良好的開發前景和用價值因而由桑葉中提取1-DNJ已成為國內外學者研究的焦點。在我國，1-脫氧野尻霉素產品尚未進行工業化生產。國內雖然有大學院校、科研院所進行小試的報道，但主要集中于對粗產品的研制和應用的研究，極少有對高純度1-脫氧野尻霉素提取工藝的研究報道，高純度1-脫氧野尻霉素的工業化生產進展緩慢。中國專利200910192542.2公開了一種1-脫氧野尻霉素(1-DNJ)的提取方法，主要步驟為:(I)將桑葉和40% -80%乙醇按照料液比1: 6-40投料，混合于50_70°C攪拌1_3小時，離心過濾得到濾液A ;(2)濾渣按料液比1: 6-40投料，混合于50_70°C攪拌1-3小時，離心過濾得到濾液B，合并濾液A和B，在50-70°C下減壓濃縮得濃縮液，同時回收乙醇；(3)濃縮液按絮凝劑的使用方法加入絮凝劑進行絮凝沉淀；(4)壓濾除去沉淀，濾液加入連通的多個陽離子交換樹脂柱，并流經與該樹脂柱串連在一起的大孔吸附樹脂柱；(5)濾液加入結束后用純凈水洗，待大孔樹脂流出液無色時，將其斷開，再用
0.1-0.5mol/L的氨水或含氨0.1-0.5mol/L的5% -50%乙醇溶液從陽離子樹脂柱上洗脫1-脫氧野尻霉素(DNJ)，將洗脫液用酸調節至PH3-5，再上陽離子樹脂柱，待洗脫液上完后，用純凈水洗至流出液無色，再用10% -70%的乙醇溶液洗；(6)乙醇洗漆后，用純凈水洗至流出液無乙醇味，再用0.1-0.5mol/L的氨水洗脫，收集洗脫液，用納濾膜濃縮并濾除氨等小分子雜質，濃縮液噴霧干燥，得到黃棕色粉末1-脫氧野尻霉素。該專利方法通過乙醇水溶液提取，經絮凝劑沉淀，再經由連續陽離子交換樹脂和大孔吸附樹脂方法除雜，濃縮，干燥得黃棕色粉末1-脫氧野尻霉素(1-DNJ)。該方法最大的缺陷在于，對桑葉中所含的主要功效成分1-脫氧野尻霉素的提取率不高，而且僅能制取純度低的含1-脫氧野尻霉素的生物總堿，無法提取含量高達98%以上的高純度1-脫氧野尻霉素(1-DNJ)。中國專利200910167602.5中公開了一種提取高純度1-DNJ的方法，其主要步驟為:(I)桑葉經洗滌烘干后粉碎，過40目篩。稱取桑葉粉50Kg，加入400L65%乙醇，600C 800Hz超聲提取30分鐘，過濾，濾渣加入200L65%乙醇，60°C 800Hz超聲提取30分鐘，過濾，合并的濾液A，濾渣待用；(2)濾液A加入2mol/L鹽酸，調節pH = 2，減壓濃縮至20L，抽濾，濾渣待用；將濾液加入100Kg717陰離子交換樹脂，攪拌15分鐘，悶置6小時后將放出液體，流出液加入原陰離子樹脂，重復3次，加入300L水洗脫，收集流出液和洗水，濃縮至20L，得到濃縮液B;(3)將濃縮液B以300Kg732樹脂柱層析純化上樣后，純化水洗至洗水無色，以
0.5mol/L氨水洗脫，收集pH9-12段洗脫液，膜濃縮至10L。加入2mol/L鹽酸，調節pH = 7 ;分3次加入3L氯仿萃取，保留水相、減壓濃縮至6L，分6 = 5次加入IOL正丁醇液萃取；(4)將正丁醇萃取液濃縮至1L，抽濾，濾渣以無水乙醇結晶，析出物溶于IOOml純化水，通過S印Hdex LH-20凝膠柱層析，純化水洗脫，以99%純度1-脫氧野尻霉素標準品對照，收集薄層色譜Rf值和斑點顏色均一致部分，濃縮至干，得成品31.82，其中目標產物1-脫氧野尻霉素(DNJ)含量98.68%。中國專利200910167602.5公開的上述方法通過超聲波提取，經由酸化，陰離子樹脂柱交換，陽離子樹脂柱層析純化得洗脫液，由有機萃取劑多次萃取，結晶，濃縮干燥，得到較高純度的1-脫氧野尻霉 素(1-DNJ)。但該方法大量且多次的使用了氯仿以及正丁醇等有毒有機溶劑，而有毒溶劑難以去除，非常容易混入最終產品中，使該方法存在著加重環保負擔，終產品毒性不確定，產品安全性難以得到保證的缺陷；且提取率較低，僅約為0.06%。綜上，現有提取1-DNJ的方法，主要存在著產品提取率和純度低，產品毒性較大，不利于環保的缺點，并且現有提取方法對原料要求較高，主要選用1-脫氧野尻霉素含量較高的桑葉或桑皮部分，未能對桑樹的其它部位或蠶桑廢棄物加以利用；進一步的，現有提取方法對原料的利用率極低，未能將附加值產品得到充分利用，對資源造成了較大浪費。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中所存在的產品提取率和純度低、產品毒性大的不足，提供一種提取率高、產品安全、利于環保的高純度1-脫氧野尻霉素的提取方法。為了實現上述發明目的，本發明提供了以下技術方案:一種高純度1-脫氧野尻霉素的提取方法，包括如下步驟:(I)原料預處理:取桑葉、桑枝、桑白皮、桑椹和/或蠶桑廢棄物，經由干燥后粉碎，得原料粉末；(2)酶解浸提:向原料粉末加入8-12倍重量水，升溫至45_60°C后，加入原料粉末重量0.5% -1 %的組合酶，保溫，酶解浸提8-12小時，過濾，得濾液；所述組合酶的成分及其重量比為纖維素酶:葡聚糖酶:果膠酶=3-5:2-4:1;
(3)調節浸提濾液pH值為4-5，得酸化濾液；(4)將酸化濾液上強酸性陽離子樹脂柱，用2-4倍樹脂體積量的純化水沖洗，收集得到水洗液，然后用2-4倍樹脂柱體積量的0.1-0.5mol/L氨水進行洗脫，收集pH = 9-12的洗脫液，得到氨水洗脫液；(5)將氨水洗脫液經過納濾膜(200D)進行膜分離濾除大分子雜質，經由薄膜蒸發器濃縮器除氨后得到濃縮液；(6)將濃縮液經過弱酸性陰離子樹脂柱進行柱層析，使用濃度為0.1-0.5mol/L氨水洗脫，分段收集洗脫液，以標準品對照，收集斑點顏色均一致部分，濃縮結晶，真空干燥后，得成品。本發明所述蠶桑廢棄物可以是喂養蠶結束后的桑葉，或蠶的排泄物(蠶砂)等。為了提高上述提取方法 對目標產物的提取率和提取效率，上述步驟(2)所述組合酶的成分及其重量比優選為纖維素酶:葡聚糖酶:果膠酶=4: 3:1。為了進一步提高上述提取方法對目標產物的提取率和提取效率，上述步驟(2)中組合酶的用量優選為0.6-0.8%，以0.7%為最佳。上述步驟(2)中水的用量優選為10倍原料粉末重量。為了充分利用原料，并為了提高上述提取方法對目標產物的提取率，上述步驟(2)優選對原料粉末進行兩次酶解浸提。為了在上述步驟(6)柱層析前對酸化濾液充分除雜，降低上述步驟(5)中納米濾膜負荷，利于上述步驟(6)中層析分離的進行，提高目標產物純度，上述步驟(4)中的強酸性陽離子交換樹脂，優選使用苯乙烯系大孔型陽離子交換樹脂，如DOOl大孔強酸性陽離子交換樹脂、D-101大孔強酸性陽離子交換樹脂或HD-8，以DOOl大孔強酸性陽離子交換樹脂為最佳。為了使上述步驟￠)中層析分離效果佳，進一步提高目標產物純度，上述步驟(6)中的弱酸性大孔陽離子樹脂柱使用的樹脂優選D151、D152或D113弱酸性大孔陽離子樹脂，其中以D152弱酸性大孔陽離子樹脂為最佳。上述步驟⑴中粉碎原料后，優選過10-40目篩。上述提取方法中干燥優選使用烘箱干燥、真空干燥或者噴霧干燥，以烘箱干燥為最佳。為了充分利用原料，從原料中提取高附加值產品桑葉多糖，上述高純度1-脫氧野尻霉素的提取方法優選將步驟(4)中收集的水洗液濃縮加入4-8倍濃縮液體積量的乙醇，所述乙醇的濃度在95%以上，通過在5°C條件下靜置6-24h、析出沉淀、過濾沉淀的沉淀方法，得到桑葉多糖沉淀；用2倍所述桑葉多糖沉淀重量的水溶解，加入5%水溶液重量的活性碳脫色，過濾，向濾液中加入4-8倍體積量的95%乙醇，離心過濾，真空干燥，粉碎，得到灰白色桑葉多糖粉末。所述沉淀方法可以用離心分離、絮凝沉淀、常壓過濾或者減壓過濾替代。上述步驟⑵中所述過濾，優選采用離心過濾。與現有技術相比，本發明的有益效果:本發明高純度1-脫氧野尻霉素的提取方法采用酶解手段，選用利于桑葉、桑枝、桑白皮、桑椹和/或蠶桑廢棄物原料酶解的酶進行復配得組合酶，并與本發明除雜、純化等技術特征的有機結合，使得本發明提取方法具有如下優點:1、極大程度上提高了 1-脫氧野尻霉素的提取率和提取效率，提取率不低于
0.1 % ；2、本發明提取方法環保無污染，在酶解和純化過程中使用具有安全、環保無污染優點的酶和水，不僅利于環保，而且提高了產品質量安全；3、本發明方法目標產物1-脫氧野尻霉素純度高，高于98% ；4、本發明方法在1-脫氧野尻霉素的提取過程中，還對桑葉多糖進行了分離提純，本發明方法通過對多組分的逐步提取，不但能夠有效提高1-脫氧野尻霉素的純度，同時還得到了高附加值的桑葉多糖，充分利用了原料，減少了提取后廢棄物并降低了環保負擔；并且，分離提取得到的桑葉多糖純度高，經檢測多糖含量高于80%，應用價值高。
圖1為實施例1 一種高純度1-脫氧野尻霉素的提取方法流程圖。
具體實施例方式
下面結合試驗例及具體實施方式
對本發明作進一步的詳細描述。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發明內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。實施例1一種高純度1-脫氧野尻霉素的提取方法，包括如下步驟:1.原料預處理:取桑枝經由干燥后粉碎，過40目篩，得到提取用原料粉末；2.酶解浸提:(I)向原料粉末加入8倍重量的水，升溫至47±2°C后，加入原料粉末重量0.5%的組合酶，保溫，酶解浸提8小時，然后經過離心過濾得到濾渣和濾液；所述組合酶的成分及其重量比為纖維素酶:葡聚糖酶:果膠酶=3:2:1;(2)對濾渣重復酶解浸提，操作同步驟(I)，過濾；(3)合并步驟⑴和步驟(2)兩次浸提濾液；3.浸提濾液用離心機離心除渣后用酸調節PH值為4-5 ；4.將經過酸化后的濾液上強酸性陽離子樹脂柱，純化水沖洗3倍樹脂體積，收集得到水洗液，然后用3倍樹脂柱體積的0.2mol/L的氨水進行洗脫，收集PH = 9-12的部分，得到氨水洗脫液；5.純化水洗液濃縮后加入相當于其體積5倍體積的乙醇，5°C條件下靜置過夜，析出沉淀，然后離心過濾沉淀，得到桑葉多糖沉淀，多糖用2倍體積水溶解，加入5%活性碳脫色，過濾，濾液加入5倍體積95%乙醇，過濾多糖沉淀，真空干燥，粉碎，得到灰白色多糖粉末，經檢測(硫酸-苯酚法)多糖含量為85% ；6.將氨水洗脫液經過納濾膜進行膜分離濾除大分子雜質，經由薄膜蒸發器濃縮后得到濃縮液；7.將濃縮液經過弱酸性陽離子樹脂柱進行柱層析，用濃度為0.2mol/L的氨水洗脫，分段收集洗脫液，以標準品對照，收集斑點顏色均一致部分，濃縮結晶，真空干燥后，得成品；經HPLC檢測，目標產物1-脫氧野尻霉素含量為98.5%，提取率為0.21%。本例步驟7中使用的標準品購于Sigma-Aldrich公司生產的1-Deoxynojirimycin (1-DNJ)試劑。實施例2一種高純度1-脫氧野尻霉素的提取方法，包括如下步驟:1.原料預處理:取桑葉經由干燥后粉碎，過40目篩，得到提取用原料粉末；2.酶解浸提:向原料粉末加入12倍重量的水，升溫至58±2°C后，加入原料粉末重量0.8%的組合酶，保溫，酶解浸提10小時，然后經過離心過濾得浸提濾液；所述組合酶的成分及其重量比為纖維素酶:葡聚糖酶:果膠酶=5:4:1;3.浸提濾液用離心機離心除渣后用酸調節PH為4-5 ；4.將經過酸化后的濾液上強酸性陽離子樹脂柱，純化水沖洗4倍樹脂體積，收集得到水洗液，然后用4倍樹脂柱體積的0.lmol/L的氨水進行洗脫，收集PH = 9-12的部分，得到氨水洗脫液；5.水洗液濃縮后中入相當于其體積4倍體積的乙醇，5°C條件下靜置過夜，析出沉淀，然后過濾沉淀，得到桑葉多糖沉淀，多糖用2倍體積水溶解，加入5%活性碳脫色，過濾，濾液加入4倍體積95%乙醇，過濾多糖沉淀，真空干燥，粉碎，得到灰白色多糖粉末，經檢測(硫酸-苯酚法)多糖含量為81% ；6.將氨水洗脫液經過納濾膜(200D)進行膜分離濾除大分子雜質，經由薄膜濃后得到濃縮液； 7.將濃縮液經過弱酸性陽離子樹脂柱進行柱層析，用濃度為0.lmol/L的氨水洗脫，分段收集洗脫液，以標準品(與實施例1相同)對照，收集斑點顏色均一致部分，濃縮結晶，真空干燥后，得成品j^HPLC檢測，目標產物1-脫氧野尻霉素含量為98.2%，提取率為
0.12%。實施例3一種高純度1-脫氧野尻霉素的提取方法，包括如下步驟:1.原料預處理:取蠶桑廢棄物(蠶砂)經由干燥后粉碎，過30目篩，得到提取用原料粉末；2.酶解浸提:(I)向原料粉末加入10倍重量的水，升溫至55±2°C后，加入原料粉末重量0.5%的組合酶，保溫，酶解浸提12小時，然后經過離心過濾得浸提濾液；所述組合酶的成分及其重量比為纖維素酶:葡聚糖酶:果膠酶=4:3:1;(2)對濾渣重復酶解浸提，操作同步驟(I)，過濾；(3)合并步驟(I)和步驟(2)兩次浸提濾液；3.浸提濾液用離心機離心除渣后用酸調節PH為4-5 ；4.將經過酸化后的濾液上強酸性陽離子樹脂柱，純化水沖洗3倍樹脂體積，收集得到水洗液，然后用3倍樹脂柱體積的0.5mol/L的氨水進行洗脫，收集PH = 9-12的部分，得到氨水洗脫液；5.水洗液濃縮后中入相當于其體積8倍體積的乙醇，5°C條件下靜置過夜，析出沉淀，然后過濾沉淀，得到桑葉多糖沉淀，多糖用2倍體積水溶解，加入5%活性碳脫色，過濾，濾液加入8倍體積95%乙醇，過濾多糖沉淀，真空干燥，粉碎，得到灰白色多糖粉末，經檢測(硫酸-苯酚法)多糖含量為83% ；6.將氨水洗脫液經過納濾膜(200D)進行膜分離濾除大分子雜質，經由薄膜蒸發器濃縮后得到濃縮液；7.將濃縮液經過弱堿性陰離子樹脂柱進行柱層析，用濃度為0.5mol/L的氨水洗脫，分段收集洗脫液，以標準品(與實施例1相同)對照，收集斑點顏色均一致部分，濃縮結晶，真空干燥后，得成品j^HPLC檢測，目標產物1-脫氧野尻霉素含量為98.5%，提取率為
0.15 %。
權利要求
1.一種高純度1-脫氧野尻霉素的提取方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)原料預處理:取桑葉、桑枝、桑白皮、桑椹和/或蠶桑廢棄物，經由干燥后粉碎，得原料粉末； (2)酶解浸提:向原料粉末加入8-12倍重量水，升溫至45-60°C后，加入原料粉末重量0.5% -1 %的組合酶，保溫，酶解浸提8-12小時，過濾；所述組合酶的成分及其重量比為纖維素酶:葡聚糖酶:果膠酶=3-5:2-4:1; (3)調節浸提濾液pH值為4-5，得酸化濾液； (4)將酸化濾液上強酸性陽離子樹脂柱，用2-4倍樹脂體積量的純水沖洗，收集得到水洗液，然后用2-4倍樹脂柱體積量的0.1-0.5mol/L氨水進行洗脫，收集pH = 9-12的洗脫液，得到氨水洗脫液； (5)將氨水洗脫液經過納濾膜進行膜分離濾除大分子雜質，經由薄膜蒸發器濃縮后得到濃縮液； (6)將濃縮液經過弱酸性陽離子樹脂柱進行柱層析，用濃度為0.1-0.5mol/L的氨水洗脫，分段收集洗脫液，以標準品對照，收集斑點顏色均一致部分，濃縮結晶，真空干燥后，得成品。
2.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(2)中所述組合酶的成分及其重量比為纖維素酶:葡聚糖酶:果膠酶=4:3:1。
3.根據權利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，步驟(2)中所述組合酶的用量為0.6-0.8%。
4.根據權利要求3所述的提取方法，其特征在于，步驟(2)中所述組合酶的用量為0.7%。
5.根據權利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，步驟(2)中水的用量為10倍原料粉末重量。
6.根據權利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，步驟(2)中對原料粉末進行兩次酶解浸提。
7.根據權利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，步驟(4)中所述強酸性陽離子交換樹脂為D001、D-101或HD-8大孔強酸性陽離子交換樹脂。
8.根據權利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，步驟(6)中所述大孔弱酸性陽離子樹脂柱為D151、D152或D113弱酸性大孔陽離子樹脂。
9.根據權利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，步驟(I)中粉碎原料后，過10-40目篩，得原料粉末。
10.根據權利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，對步驟(4)中收集的水洗液濃縮，加入4-8倍濃縮液體積量的乙醇，所述乙醇的濃度在95%以上，通過在5°C條件下靜置6-24h、析出沉淀、過濾沉淀的沉淀方法，得到桑葉多糖沉淀；用2倍所述桑葉多糖沉淀重量的水溶解，加入5%水溶液重量的活性碳脫色，過濾，向濾液中加入4-8倍體積量的95%乙醇，過濾，真空干燥，粉碎，得到灰白色桑葉多糖粉末。
全文摘要
本發明公開了一種高純度1-脫氧野尻霉素的提取方法，包括如下步驟原料預處理，酶解浸提，酸化濾液，將酸化濾液上強酸性陽離子樹脂柱、用氨水洗脫、得氨水洗脫液，對氨水洗脫液進行膜分離除雜、濃縮，濃縮液經過弱酸性陽離子樹脂柱進行柱層析、氨水洗脫、分段收集洗脫液，濃縮結晶、干燥，得1-脫氧野尻霉素精品；所述酶解浸提步驟使用了組合酶，其成分及其重量比為纖維素酶∶葡聚糖酶∶果膠酶＝3-5∶2-4∶1。本發明高純度1-脫氧野尻霉素的提取方法采用酶解手段，與本發明除雜、純化等技術特征的有機結合，使得本發明提取方法具有目標產物的提取率和純度均較高，純度高于98％；環保無污染，提高了產品質量安全等優點。
文檔編號C07D211/46GK103204800SQ20131005170
公開日2013年7月17日 申請日期2013年5月14日 優先權日2013年5月14日
發明者湯世江 申請人:成都科源生物技術有限公司