專利名稱：具有抑菌活性的銀杏葉類脂成分的制備方法
技術領域：
本發明涉及具有抑菌活性的銀杏葉類脂成分的制備方法，屬于生物醫藥領域。
背景技術：
銀杏葉為銀杏科銀杏屬植物銀杏(Ginkgo biloba L.)的葉，近年來國內外學者對銀杏葉中黃酮類、萜內酯、多糖、聚戊烯醇、揮發油及留醇的化學成分進行了廣泛研究。銀杏葉類脂成分主要有烴類、聚戊烯醇類、萜烯醇類、留醇類等化合物，它們極性相似，較難分離；銀杏葉類脂成分主要是以油狀物形態存在，在低溫下通常有白色結晶物析出，根據報道主要是留醇類成分。銀杏葉留醇的報道主要是通過氣質聯用(GC-MS)技術來對其混合物的各自化學結構進行研究。我們利用分子蒸餾技術，將銀杏葉類脂成分分離后得到的輕餾分，通過裂解-氣質聯用(Py-GC-MS)分析，其中單萜、倍半萜類化合物GC含量約為23%，長鏈醇(酮、酯)及二萜類相對含量約為47%，烷基酚、留體類GC含量約為30%;重餾分中主要成分為聚戊烯醇，含量在80%以上。一些分子量大、沸點高的化合物以及受到色譜分離條件和質譜分析等限制，通過GC-MS、HPLC-MS不能完全準確的確定其各自化學結構，因此對銀杏葉類脂成分的分離，以及利用核磁共振(NMR)等技術對其結構鑒定，對弄清楚該化學部位的化學成分是十分有必要的。已報道的銀杏葉抑菌活性成分主要是黃酮、酚酸類等成分，即主要為水溶性和醇溶性的化學部位，脂溶性成分特別是類脂成分抑菌活性報道甚少。
發明內容
為實現上述目的，發明了具有抑菌活性的銀杏葉類脂成分的制備方法，由以下步驟組成:第一步，銀杏葉類脂軟膏的制備:取干燥粉碎銀杏葉粉(直徑0.25 5毫米以下)，加入丙酮或石油醚(60 90°C)或乙酸乙酯或無水乙醇的任一種溶劑，銀杏葉粉與溶劑質量比為1: 5 50 ;30 75°C加熱回流提取，時間2 8h，重復3次或以上提取；合并提取液，回收溶劑，得銀杏葉脂溶性成分軟膏；加I 15% NaOH或KOH的甲醇或乙醇溶液，軟膏與溶劑比1: 2 15 (kg: L)，采用30 75°C熱回流攪拌，攪拌速度為20 200r/min,時間0.5 5h，得到皂化液；加入丙酮或石油醚(60 90°C )或乙酸乙酯的任一種溶齊U，皂化液與溶劑比1: 2 10 (V/V)，合并提取液，回收溶劑，從而得到銀杏葉類脂總不皂化物。第二步，銀杏葉類脂成分的分子蒸餾分離方法:取銀杏葉類脂總不皂化物，放于O _40°C下冷凍結晶I 5h，取出后迅速抽濾，得到結晶物；濾過的油狀物通過刮膜式分子蒸餾裝置分離，刮膜轉速100 300r/min，蒸餾溫度120 250°C，在高真空條件下(真空度大于等于1.0 X IO5)，輕組分以氣體狀態徑直飛向中間冷凝器并凝結成液體，進入輕餾分收集器，得到輕餾分；重組分沿筒體內壁進入重餾分收集器，得到重餾分。第三步，銀杏葉類脂成分的色譜分離方法:將第二步中所得的結晶物與硅膠G按質量比1:1充分混合磨細，上硅膠柱(粒徑0.04 0.1mm)，用洗脫劑三氯甲烷/甲醇(100% 85%: O 15%，V/V)體系洗脫，收集的餾分用薄層色譜碘蒸氣顯色跟蹤；100%三氯甲烷餾分，揮干溶劑后用異丙醇或無水乙醇或乙腈在5 -20°C下，反復重結晶得到化合物4(β-谷甾醇乙酸酯)；三氯甲烷/甲醇(99%: 1%, V/V)餾分，揮干溶劑后上Sephadex LH-20柱，用洗脫劑三氯甲烷/甲醇(30 50%: 70 50%，VN)體系洗脫，收集的餾分用薄層色譜碘蒸氣顯色跟蹤，取三氯甲烷/甲醇(30 35%: 70 65%，V/V)餾分，揮干溶劑后用環己酮或丙酮在O -20°C下，反復重結晶得到化合物5(β -谷留醇)，剩余物揮干溶劑后用正戊醇或正丁醇在5 -10°C下，反復重結晶得到化合物6 (豆留醇)，剩余物揮干溶劑后用乙醚在O -20°C下，反復重結晶得到化合物7 (麥角留醇)；三氯甲烷/甲醇(90%: 10%, V/V)餾分，揮干溶劑后用三氯甲烷或無水乙醇在O -20°C下，反復重結晶得到化合物8(胡蘿卜苷)；第二步中所得的輕餾分與硅膠G按質量比1:1充分混合磨細，上硅膠柱(粒徑0.04 0.1mm)，用洗脫劑石油醚/乙酸乙酯(100% 90%: O 10%，V/V)體系洗脫，收集的餾分用薄層色譜碘蒸氣顯色跟蹤；石油醚/乙酸乙酯(95%: 5%,V/V)餾分，揮干溶劑后用熒光(GF254)硅膠薄層制備板制備，展開劑為石油醚/乙酸乙酯(100% 85%: O 15%，￥八)，36511111紫外光下顯色，取1^值在0.50 0.65處硅膠，用乙酸乙酯或無水乙醇萃取，低溫揮干溶劑得到化合物I (異植物醇)；石油醚/乙酸乙酯(92%: 8%，V/V)餾分，揮干溶劑后上S印hadex LH-20柱，用洗脫劑三氯甲烷/甲醇(40 50%: 60 50%，V/V)體系洗脫，收集的餾分用薄層色譜碘蒸氣顯色跟蹤，取三氯甲烷/甲醇(40 45%: 60 55%，V/V)餾分，低溫揮干溶劑得到化合物2 (橙花叔醇)；石油醚/乙酸乙酯(90%: 10%, V/V)餾分，揮干溶劑后用熒光(GF254)硅膠薄層制備板制備，展開劑為石油醚/乙酸乙酯(95% 75%: 5 25%，￥八)，36511111紫外光下顯色，取1^值在
0.40 0.55處硅膠，用乙酸乙酯或無水乙醇萃取，低溫揮干溶劑得到化合物3 (芳樟醇)；將第二步中所得的重餾分與硅膠G按質量比1:1充分混合磨細，上硅膠柱(粒徑0.04
0.1mm)，用洗脫劑石油醚/乙酸乙酯(100% 95%: O 5%，V/V)體系洗脫，收集的餾分用薄層色譜碘蒸氣顯色跟蹤，取石油醚/乙酸乙酯(99% 97%:1 3%，V/V)餾分，揮干溶劑后加入質量比為1: 5 15丙酮或乙酸乙酯，室溫攪拌溶解；然后將其與活性炭與硅藻土按質量比1:1 5混合的吸 附劑，按固液質量比為1: 10 100混合，在-40°C 30°C攪拌4 20小時，1000 10000轉/分鐘離心后過濾，上清液回收溶劑后即為純化后的聚戊烯醇類脂。本發明中所得的化合物I 8，依次為異植物醇(抑菌圈范圍9.9-13.4μ g/mL，MIC, MBC 和 MFC 值依次為 31.3 μ g/mL, 62.5-125 μ g/mL, 125 μ g/mL)、橙花叔醇(抑菌圈范圍 16.2-20.1 μ g/mL, MIC, MBC 和 MFC 值依次為 3.9-15.6 μ g/mL, 31.3-5-62.5 μ g/mL, 62.5 μ g/mL)、芳樟醇(抑菌圈范圍 14.9-17.9 μ g/mL, MIC, MBC 和 MFC 值依次為 7.8-31.3 μ g/mL, 62.5 μ g/mL, 31.3 μ g/mL)、β -谷甾醇乙酸酯(抑菌圈范圍10.9-11.7 μ g/mL, MIC 和 MBC 值依次為 62.5 μ g/mL，250 μ g/mL)、β-谷甾醇(抑菌圈范圍12.1-14.1 μ g/mL, MIC和MBC值依次為31.3 μ g/mL，125 μ g/mL)、豆甾醇(抑菌圈范圍
7.7-9.2 μ g/mL, MIC和MBC值依次為125μ g/mL，> 250 μ g/mL)、麥角甾醇(抑菌圈范圍
8.1-10.0 μ g/mL，MIC和 MBC 值依次為 62.5-125 μ g/mL,彡 250 μ g/mL)和胡蘿卜苷(抑菌圈范圍 11.1-12.7 μ g/mL, MIC 和 MBC 值依次為 62.5 μ g/mL, 125-250 μ g/mL)對于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉菌具有抑制作用。化合物I和5與銀杏葉聚戊烯醇有協同抑菌作用。化合物I (異植物醇)與銀杏葉聚戊烯醇協同抑菌作用表現為抑菌圈范圍14.1-17.1mm,MIC值為7.8-15.6 μ g/mL，FIC指數范圍為0.25-0.5 ;化合物5(β -谷甾醇)與銀杏葉聚戊烯醇協同抑菌作用表現為10.4-16.3mm，MIC值為15.6-31.3 μ g/mL，FIC指數為0.5。銀杏葉類脂總不皂化物(抑菌圈范圍14.4-16.9 μ g/mL,MIC,MBC和MFC值依次為15.6-31.3 μ g/mL，62.5 μ g/mL, 125 μ g/mL)、類脂結晶物(抑菌圈范圍 12.3-12.8 μ g/mL, MIC 和 MBC 值依次為 62.5 μ g/mL, 125 μ g/mL)、類脂輕餾分(抑菌圈范圍 12.9-14.8 μ g/mL，MIC，MBC 和 MFC值依次為31.3μ g/mL，125y g/mL，125y g/mL)、類脂重餾分(抑菌圈范圍15.0-16.8 μ g/mL, MIC, MBC 和 MFC 值依次為 15.6-31.3 μ g/mL, 62.5 μ g/mL, 62.5 μ g/mL)對于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉菌具有抑制作用。
具體實施例方式以下實施例為本發明的一些舉例，不應被看做是對本發明的限定。實施例1銀杏葉類脂成分的提取分離方法具有抑菌活性的銀杏葉類脂成分的制備方法，由以下步驟組成:第一步，銀杏葉類脂軟膏的制備:取干燥粉碎銀杏葉粉(直徑0.5毫米以下)IOkg,加入石油醚(60 90°C ) 30L, 60°C加熱回流提取，時間4h，重復3次提取；合并提取液，回收溶劑，得銀杏葉脂溶性成分軟膏500g ;加5% NaOH甲醇溶液6L，采用65°C熱回流攪拌，攪拌速度為60r/min，時間2h，得到皂化液；加入石油醚(60 90°C ) 30L萃取3次，合并提取液，回收溶劑，從而得到銀杏葉類脂總不皂化物350g。第二步，銀杏葉類脂成分的分子蒸餾分離方法:取銀杏葉類脂總不皂化物350g，放于-20°C下冷凍結晶5h，取出后迅速抽濾，得到結晶物35g;濾過的油狀物通過刮膜式分子蒸餾裝置分離，刮膜轉速200r/min，蒸餾溫度180°C，在高真空條件下(真空度
1.0 X IO5)，輕組分以氣體狀態徑直飛向中間冷凝器并凝結成液體，進入輕餾分收集器，得到輕餾分44g ;重組分沿筒體內壁進入重餾分收集器，得到重餾分168g。第三步，銀杏葉類脂成分的色譜分離方法:將第二步中所得的結晶物與硅膠G按質量比1:1充分混合磨細，上硅膠柱(粒徑0.05 0.1mm)，用洗脫劑三氯甲烷/甲醇(100% 85%: O 15%，V/V)體系洗脫，收集的餾分用薄層色譜碘蒸氣顯色跟蹤；100%CHCl3餾分，揮干溶劑后用異丙醇在-10°C下，反復重結晶得到化合物4(β-谷甾醇乙酸酯)290mg ;三氯甲烷/甲醇(99%: I %, V/V)餾分，揮干溶劑后上S印hadex LH-20柱，用洗脫劑三氯甲烷/甲醇(30 50%: 70 50%，V/V)體系洗脫，收集的餾分用薄層色譜碘蒸氣顯色跟蹤，取三氯甲烷/甲醇(35%: 65%, V/V)餾分，揮干溶劑后用環己酮_20°C下，反復重結晶得到化合物5(β-谷留醇)29g，剩余物揮干溶劑后用正戊醇在-10°C下，反復重結晶得到化合物6 (豆甾醇)116mg，剩余物揮干溶劑后用乙醚在_20°C下，反復重結晶得到化合物7(麥角甾醇)105mg;三氯甲烷/甲醇(90%: 10%,V/V)餾分，揮干溶劑后用三氯甲烷_20°C下，反復重結晶得到化合物8 (胡蘿卜苷)203mg ;第二步中所得的輕餾分44g與娃膠G按質量比1:1充分混合磨 細，上娃膠柱(粒徑0.05 0.1mm),用洗脫劑石油醚/乙酸乙酯(100% 90%: O 10%，V/V)體系洗脫，收集的餾分用薄層色譜碘蒸氣顯色跟蹤；石油醚/乙酸乙酯(95%: 5%, V/V)餾分，揮干溶劑后用熒光(GF254)硅膠薄層制備板制備，展開劑為石油醚/乙酸乙酯(95%: 5%, V/V)，365nm紫外光下顯色，取Rf值在0.65處硅膠，用乙酸乙酯萃取，低溫揮干溶劑得到化合物I (異植物醇)178mg ;石油醚/乙酸乙酯(92%: 8%, V/V)餾分，揮干溶劑后上S印hadex LH-20柱，用洗脫劑三氯甲烷/甲醇(40 50%: 60 50%，V/V)體系洗脫，收集的餾分用薄層色譜碘蒸氣顯色跟蹤，取三氯甲烷/甲醇(40%: 60%,V/V)餾分，低溫揮干溶劑得到化合物2 (橙花叔醇)51mg ；石油醚/乙酸乙酯(90%: 10%,V/V)餾分，揮干溶劑后用熒光(GF254)硅膠薄層制備板制備，展開劑為石油醚/乙酸乙酯(85%: 15%，￥八)，36511111紫外光下顯色，取1^值在0.40處硅膠，用乙酸乙酯萃取，低溫揮干溶劑得到化合物3 (芳樟醇)20mg ;將第二步中所得的重餾分IOg與硅膠G按質量比1:1充分混合磨細，上硅膠柱(粒徑0.05 0.1mm)，用洗脫劑石油醚/乙酸乙酯(100% 95%: O 5%，V/V)體系洗脫，收集的餾分用薄層色譜碘蒸氣顯色跟蹤，取石油醚/乙酸乙酯(98%: 2%,V/V)餾分，揮干溶劑后加入IOOml丙酮，室溫攪拌溶解；然后將其與活性炭與硅藻土按質量比1:1混合的吸附劑20g，在0°C攪拌5小時，5000轉/分鐘離心后過濾，上清液回收溶劑后即為純化后的聚戊烯醇類脂7.2g。實施例2銀杏葉類脂成分的抑菌活性考察方法1.實驗菌種、原料1.1供試菌種沙門氏菌ATCC14028、金黃色葡萄球菌ATCC25923和黑曲霉菌ATCC164041.2待測樣品實施例1中所得化合物I 8以及聚戊烯醇等樣品2實驗方法2.1濾紙片法測定 樣品的抑菌活性(I)培養基的配制熱溶解，冷卻后，調節pH至7.0 7.2，此為液體培養基，在其中添加2.0g瓊脂粉，此為固體培養基，121°C滅菌20min。(2)液體培養基接種與活化菌種打開凈化工作臺的紫外滅菌燈，殺菌半小時后，打開凈化臺的操作開關，用滅菌后的接種環取一環菌種溶入液體培養基中，輕輕摩擦錐形瓶壁，讓菌落與接種環上分離，取出接種環，封好錐形瓶，輕輕振蕩培養基，使菌種分散均勻，放于生化培養箱中，370C (沙門氏菌和金黃色葡萄球菌)，28°C (黑曲霉菌)下活化24h。(3)實驗所需儀器的滅菌倒平板所用培養皿和裝有6_濾紙片的培養皿用牛皮紙包好，塞好膠塞的試管、裝有移液槍頭的盒子分別用牛皮紙包好，將配制好的生理鹽水、固體培養基分別用紗布和牛皮紙封好。將其在121°C，IOOPa下高壓滅菌20min。(4)調節菌落濃度將溶化的固體培養基倒入20mL左右于培養皿中，置于凈化操作臺上，自流平冷卻。取7支試管，依次稀釋活化好的菌懸液，I號試管為原液經生理鹽水稀釋10倍后的菌懸液，2號試管為稀釋100倍的菌懸液，依次稀釋后，第七號試管為稀釋IO7倍的菌懸液。移取100 μ LI 7號試管中的菌懸液涂布固體培養基,靜置使其滲透于培養基中，后倒置培養皿，于生化培養箱中37°C (沙門氏菌和金黃色葡萄球菌)，280C (黑曲霉菌)培養 24h。根據菌落計算法則:菌落形成單位CfuX稀釋倍數=菌落數，計數可數菌落平皿，推算每皿菌落數，選擇菌落涂布濃度為105cfu/mL。(5)測試樣品的配制用正己烷分別將樣品配制成500 μ g/mL溶液，將經過滅菌的濾紙片浸于樣品溶液中，半小時后測定其抑菌活性。(6)濾紙片法測定供試樣品的抑菌活性用移液器移取100 μ L菌懸液涂布于液體培養基,放置一段時間后待菌液滲透于培養基后，以浸有待測樣品的濾紙片輕輕貼服于皿中，注意不要用力過猛，將其陷于固體培養基中，3片濾紙片等距均勻，以兩皿對照平行試驗，37°C (沙門氏菌和金黃色葡萄球菌)，280C (黑曲霉菌)下倒置生化培養24h，測量樣品對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉菌的抑菌圈直徑。2.2樣品MIC (最小抑菌濃度)、MBC (最小殺細菌濃度)和MFC (最小殺真菌濃度)值的測定以及FIC分級抑菌濃度指數的計算(I)按上法配制培養基、液體培養基接種與活化菌種，調節菌落濃度和配制測試樣品，將樣品配置成不同濃度250，125,62.5,31.3，15.6,7.8,3.9 μ g/mL的溶液。(2)各樣品的MIC、MB C和MFC值的測定將混合了樣品的培養基倒平皿，自流平冷卻凝固，以沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉菌為檢測菌種，涂布平板，放置一段時間待菌懸液滲入，37°C (沙門氏菌和金黃色葡萄球菌)，28°C (黑曲霉菌)下倒置生化培養24h。觀察無菌生長的最低濃度平皿，記為此濃度為樣品對于該菌種的MIC值；100%無菌生長的最高濃度即為MBC和MFC。(3) FIC指數的計算:FIC指數=MIC甲藥聯用/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯用/MIC乙藥單用2.3樣品抑囷圈的考察(I)培養基的配制按要求配制沙門氏菌和金黃色葡萄球菌用培養基；黑曲霉菌用培養基按照查氏培養基配制，為 IOOmL 水，3.0g 蔗糖，2.0g 瓊脂，0.2g NaNO3,0.1g K2HPO470.05g KCl，0.05gMgSO4.7H20,0.0Olg FeSO4 ;以上培養基均置于121°C下高壓滅菌20min。(2)濾紙片法測定抗菌譜用正己烷將樣品配制成500 μ g/mL的溶液，測定其對于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉菌的抑菌圈直徑。2.4抗菌實驗結果所得的化合物I 8，依次為異植物醇(抑菌圈范圍9.9-13.4 μ g/mL, MIC,MBC 和 MFC 值依次為 3L 3 μ g/mL, 62.5-125 μ g/mL, 125 μ g/mL)、橙花叔醇(抑菌圈范圍 16.2-20.1 μ g/mL, MIC, MBC 和 MFC 值依次為 3.9-15.6 μ g/mL, 31.3-5-62.5 μ g/mL, 62.5 μ g/mL)、芳樟醇(抑菌圈范圍 14.9-17.9 μ g/mL, MIC, MBC 和 MFC 值依次為 7.8-31.3 μ g/mL, 62.5 μ g/mL, 31.3 μ g/mL)、β -谷甾醇乙酸酯(抑菌圈范圍10.9-11.7 μ g/mL, MIC 和 MBC 值依次為 62.5 μ g/mL, 250 μ g/mL), β-谷甾醇(抑菌圈范圍12.1-14.1 μ g/mL, MIC和MBC值依次為31.3 μ g/mL，125 μ g/mL)、豆甾醇(抑菌圈范圍
7.7-9.2 μ g/mL, MIC和MBC值依次為125μ g/mL，> 250 μ g/mL)、麥角甾醇(抑菌圈范圍
8.1-10.0 μ g/mL，MIC和 MBC 值依次為 62.5-125 μ g/mL,彡 250 μ g/mL)和胡蘿卜苷(抑菌圈范圍 11.1-12.7 μ g/mL, MIC 和 MBC 值依次為 62.5 μ g/mL, 125-250 μ g/mL)對于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉菌具有抑制作用。化合物I和5與銀杏葉聚戊烯醇有協同抑菌作用。化合物I (異植物醇)與銀杏葉聚戊烯醇協同抑菌作用表現為抑菌圈范圍14.1-17.1mm,MIC值為7.8-15.6 μ g/mL，FIC指數范圍為0.25-0.5 ;化合物5(β -谷甾醇)與銀杏葉聚戊烯醇協同抑菌作用表現為10.4-16.3mm，MIC值為15.6-31.3 μ g/mL，FIC指數為0.5。銀杏葉類脂總不皂化物(抑菌圈范圍14.4-16.9 μ g/mL,MIC,MBC和MFC值依次為15.6-31.3 μ g/mL，62.5 μ g/mL, 125 μ g/mL)、類脂結晶物(抑菌圈范圍 12.3-12.8 μ g/mL, MIC 和 MBC 值依次為 62.5 μ g/mL, 125 μ g/mL)、類脂輕餾分(抑菌圈范圍 12.9-14.8 μ g/mL，MIC，MBC 和 MFC值依次為31.3μ g/mL，125y g/mL，125y g/mL)、類脂重餾分(抑菌圈范圍15.0-16.8 μ g/mL, MIC, MBC 和 MFC 值依次為 15.6-31.3 μ g/mL, 62.5 μ g/mL, 62.5 μ g/mL)對于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉菌具有抑制作用。詳見表格1、2和3。表格1.不同樣品抑菌圈值的大小比較(Tukey檢驗P = 0.05).
權利要求
1.有抑菌活性的銀杏葉類脂成分的制備方法，其特征包括銀杏葉類脂總不皂化物、類脂結晶物、類脂輕餾分和類脂重餾分以及化合物I 8 (依次為異植物醇、橙花叔醇、芳樟醇、β_谷留醇乙酸酯、β_谷留醇、豆留醇、麥角留醇、胡蘿卜苷)和聚戊烯醇類脂成分的制備及抑菌活性。
2.根據權利要求1所述具有抑菌活性的銀杏葉類脂成分的制備方法，其特征在于化合物I 8制備方法包括下幾個步驟: 第一步，銀杏葉類脂軟膏的制備:取干燥粉碎銀杏葉粉(直徑0.25 5毫米以下)，加入溶劑Al，銀杏葉粉與溶劑質量比為1: 5 50 ;30 75°C加熱回流提取，時間2 8h，重復3次或以上提取；合并提取液，回收溶劑，得銀杏葉脂溶性成分軟膏；加1 15%溶液BI，軟膏與溶劑比1: 2 15 (kg: L)，采用30 75°C熱回流攪拌，攪拌速度為20 200r/min,時間0.5 5h，得到皂化液；加入溶劑Cl，皂化液與溶劑比1: 2 10(V/V)，合并提取液，回收溶劑，從而得到銀杏葉類脂總不皂化物。 第二步，銀杏葉類脂成分的分子蒸餾分離方法:取銀杏葉類脂總不皂化物，放于O _40°C下冷凍結晶1 5h，取出后迅速抽濾，得到結晶物；濾過的油狀物通過刮膜式分子蒸餾裝置分離，刮膜轉速100 300r/min，蒸餾溫度120 250°C，在高真空條件下(真空度大于等于1.0 X IO5)，輕組分以氣體狀態徑直飛向中間冷凝器并凝結成液體，進入輕餾分收集器，得到輕餾分；重組分沿筒體內壁進入重餾分收集器，得到重餾分。
第三步，銀杏葉類脂成分的色譜分離方法:將第二步中所得的結晶物與填料A按質量比1:1充分混合磨細，上填料A柱，用洗脫劑三氯甲烷/甲醇體系洗脫，收集的餾分用薄層色譜碘蒸氣顯色跟蹤；100%三氯甲烷餾分，揮干溶劑后用溶劑B在5 _20°C下，重結晶得到化合物4(β- 谷甾醇乙酸酯)；餾分三氯甲烷/甲醇(99%: 1%, V/V)，揮干溶劑后上C色譜柱，用洗脫劑三氯甲烷/甲醇體系洗脫，揮干溶劑后用溶劑D在O -20°C下，重結晶得到化合物5(β -谷甾醇)，剩余物揮干溶劑后用溶劑E在5 -10°C下，重結晶得到化合物6 (豆留醇)，剩余物揮干溶劑后用溶劑F在O _20°C下，重結晶得到化合物7 (麥角甾醇)；三氯甲烷/甲醇(90%: 10%,V/V)餾分，揮干溶劑后用溶劑G在O -20°C下，重結晶得到化合物8(胡蘿卜苷)；第二步中所得的輕餾分與填料A按質量比1:1充分混合磨細，上填料A柱(粒徑0.04 0.1mm)，用洗脫劑石油醚/乙酸乙酯體系洗脫，收集的餾分用薄層色譜碘蒸氣顯色跟蹤；石油醚/乙酸乙酯(95%: 5%, V/V)餾分，揮干溶劑后用填料H薄層制備板制備，Rf值在I處，得到化合物I (異植物醇)；石油醚/乙酸乙酯(92%: 8%,V/V)餾分，揮干溶劑后上C色譜柱，得到化合物2 (橙花叔醇)；石油醚/乙酸乙酯(90%: 10%，V/V)餾分，揮干溶劑后用填料H薄層制備板制備，Rf值在J處，得到化合物3(芳樟醇)；將第二步中所得的重餾分與填料A按質量比1:1充分混合磨細，上填料A柱，用洗脫劑石油醚/乙酸乙酯體系洗脫，收集的餾分用薄層色譜碘蒸氣顯色跟蹤，取石油醚/乙酸乙酯(99% 97%:1 3%，V/V)餾分，揮干溶劑后加入質量比為1: 5 15溶劑K，室溫攪拌溶解；然后將其與吸附劑L，按固液質量比為1: 10 100混合，在_40°C 30°C攪拌4 20小時，1000 10000轉/分鐘離心后過濾，上清液回收溶劑后即為純化后的聚戊烯醇類脂。
3.根據權利要求2所述具有抑菌活性的銀杏葉類脂成分的制備方法，其特征在于第一步中溶劑Al為丙酮或石油醚(60 90°C )或乙酸乙酯或無水乙醇；溶液BI為NaOH或KOH的甲醇或乙醇溶液；溶劑Cl為丙酮或石油醚(60 90°C )或乙酸乙酯。
4.根據權利要求2所述具有抑菌活性的銀杏葉類脂成分的制備方法，其特征在于第三步中填料A為硅膠G，溶劑B為異丙醇或無水乙醇或乙腈；C色譜柱為S^hadex LH-20填料；溶劑D為環己酮或丙酮；溶劑E為正戊醇或正丁醇；溶劑F為乙醚或正己烷；溶劑G為三氯甲烷或無水乙醇；填料H為熒光(GF254)硅膠；Rf值I處在0.50 0.65 ；Rf值J處在`0.40 0.55 ;溶劑K為丙酮或 乙酸乙酯；吸附劑L為質量比1:1 5混合的活性炭與硅藻土。
5.根據權利要求1所述的銀杏葉類脂成分具有抑菌活性，其特征在于所得的化合物I 8，依次為異植物醇(抑菌圈范圍9.9-13.4 μ g/mL，MIC，MBC和MFC值依次為31.3 μ g/mL,62.5-125μ g/mL，125μ g/mL)、橙花叔醇(抑菌圈范圍 16.2-20.1 μ g/mL, MIC, MBC 和MFC 值依次為 3.9-15.6 μ g/mL, 31.3-5-62.5 μ g/mL, 62.5 μ g/mL)、芳樟醇(抑菌圈范圍`14.9-17.9 μ g/mL, MIC, MBC 和 MFC 值依次為 7.8-31.3 μ g/mL, 62.5 μ g/mL, 31.3 μ g/mL)、β-谷甾醇乙酸酯(抑菌圈范圍10.9-11.7yg/mL，MIC和MBC值依次為62.5 μ g/mL，`250 μ g/mL)、β-谷甾醇(抑菌圈范圍 12.1-14.1 μ g/mL, MIC 和 MBC 值依次為 31.3μ g/mL, 125 μ g/mL)、豆甾醇(抑菌圈范圍 .7-9.2 μ g/mL, MIC 和 MBC 值依次為 125 μ g/mL, >`250 μ g/mL)、麥角甾醇(抑菌圈范圍8.1-10.0 μ g/mL, MIC和MBC值依次為62.5-125 μ g/mL,≥250 μ g/mL)和胡蘿卜苷(抑菌圈范圍11.1-12.7 μ g/mL, MIC和MBC值依次為`62.5 μ g/mL, 125-250 μ g/mL)對于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉菌具有抑制作用。
6.根據權利要求1所述的銀杏葉類脂成分具有抑菌活性，還表現在化合物I和5與銀杏葉聚戊烯醇有協同抑菌作用；化合物I (異植物醇)與銀杏葉聚戊烯醇協同抑菌作用表現為抑菌圈范圍14.1-17.lmm, MIC值為7.8-15.6 μ g/mL, FIC指數范圍為0.25-0.5 ；化合物5(β-谷甾醇)與銀杏葉聚戊烯醇協同抑菌作用表現為10.4-16.3mm, MIC值為`15.6-31.3 μ g/mL, FIC 指數為 0.5。
7.根據權利要求1所述的銀杏葉類脂成分具有抑菌活性，還表現在銀杏葉類脂總不皂化物(抑菌圈范圍 14.4-16.9μ g/mL，MIC，MBC 和 MFC 值依次為 15.6-31.3ug/mL, 62.5 μ g/mL, 125 μ g/mL)、類脂結晶物(抑菌圈范圍12.3-12.8 μ g/mL，MIC和MBC值依次為62.5 μ g/mL，125 μ g/mL)、類脂輕餾分(抑菌圈范圍12.9-14.8 μ g/mL, MIC, MBC和MFC值依次為`31.3 μ g/mL, 125 μ g/mL, 125 μ g/mL)、類脂重餾分(抑菌圈范圍 15.0-16.8 μ g/mL,MIC,MBC和MFC值依次為15.6-31.3 μ g/mL, 62.5 μ g/mL, 62.5 μ g/mL)對于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉菌具有抑制作用。
全文摘要
本專利公開具有抑菌活性的銀杏葉類脂成分的制備方法，以銀杏葉為原料，通過非極性溶劑提取，分子蒸餾分離，再經柱層析，重結晶，純化得到8個化合物(依次為異植物醇、橙花叔醇、芳樟醇、β-谷甾醇乙酸酯、β-谷甾醇、豆甾醇、麥角甾醇、胡蘿卜苷)和聚戊烯醇以及銀杏葉類脂總不皂化物、類脂結晶物、類脂輕餾分和類脂重餾分。本專利制備的8個化合物和聚戊烯醇以及銀杏葉類脂總不皂化物、類脂結晶物、類脂輕餾分和類脂重餾分對于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉菌具有抑制作用。
文檔編號C07C33/02GK103083368SQ201310044569
公開日2013年5月8日 申請日期2013年2月5日 優先權日2013年2月5日
發明者王成章, 陶冉 申請人:中國林業科學研究院林產化學工業研究所