專利名稱：桑黃菌中環二肽c2的分離技術的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程制藥領域。
背景技術：
桑黃(Phellinus)，子實體無柄，菌蓋扁半球形或馬蹄形，2_12*3_21厘米，厚
1.5-10厘米，木質，淺肝褐色至暗灰色或黑色，老時常龜裂，無皮殼，初期有細微絨毛，后變無毛，有同心環棱.邊緣鈍，深肉桂色至淺咖啡色，下側無子實層.菌肉深咖啡色，硬，木質.菌管與菌肉近同色，多層，但層次不明顯，年老的菌管層充滿白色菌絲.管口銹褐色至醬色，圓形，每毫米4-5個.孢子近球形，光滑，無色，5-6*3-4微米.剛毛頂端尖銳，基部膨大，10-25*5-7微米.菌絲不分枝，無橫隔，直徑3-5微米。目前，真菌產物的純化方法較多，主要有分級沉淀法、制備性高效液相層析、柱層析法、超濾法、離心沉淀色譜法、等幾種方法。而其中應用最多的當屬柱層析法，分為兩類:一是只有分子篩作用的凝膠柱層析，常用的凝膠有葡聚糖凝膠及瓊脂糖凝膠。二是離子交換層析。但，主要用于分離多糖，透明質酸等，多數分離后得到的產物為混合物。本發明使用多種層析技術相結合，分離度高，應用此發明可以精致到純品。
發明內容
本發明公開了一種桑黃菌(火木層孔菌igniarius (L ex Fr) Quel、裂蹄木層孔菌phellinus linteus (Berk et Curt) Teng、鮑氏層孔菌、哈蒂針層孔菌Phellinus hartigii (All esch et Schnabl) Imaz)中環二妝 C2 的分離方法。首先制備桑黃菌粗提物，然后進行正相硅膠層析，采用氯仿甲醇梯度洗脫，進行TLC檢測，再次使用正相硅膠層析，然后是甲醇凝膠層析，經PLC檢測后，進行反相硅膠層析，適當合并洗脫液，減壓干燥，再次進行甲醇凝膠層析，經HPLC檢測，即得環二肽C2，即六氫-7 -羥基-3 -(苯基甲基)批咯并[l，2-a〕吡嗪-1，4 - 二酮。此化合物具有抑制鰻弧菌繁殖作用。本發明的技術方案如下:
桑黃粗提物，由下述方法制得:
(1)發酵培養基配方以克/100毫升計是:
玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5%
蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5%
硫酸鎂 0.1-0.5%磷酸二氫鉀0.01-0.05%
(2)將桑黃菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內，以20 35°C溫度，搖瓶轉速為80 280r/min，pH 3 8條件下，震動培養7 15天；培養中當pH值降到
2.5 4時，將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中，以溫度20 35°C，發酵罐壓力
0.1 0.2公斤/平方厘米，pH 3 8，通氣量0.5 1.1vvm,攪拌速度100 280轉/分的條件，培養7 15天，即可利用桑黃菌絲體發酵全液制備桑黃粗提物；
(3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發酵全液，將其以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2 1/5 ；
(4)用體積百分比為60 95%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2 5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到60 90% ；
(5)對步驟(4)所得提取液在50 70°C條件下，加熱I 2小時；以常規方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 1/10 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得桑黃粗提物。分離環二肽C2的方法:
桑黃菌粗提物一正相硅膠層析一氯仿與甲醇梯度洗脫一TLC檢測一正相硅膠層析一甲醇凝膠層析一TLC檢測一反相硅膠層析一甲醇凝膠層析HPLC檢測一減壓蒸干一環二肽C2。具體方法為: (1)制備桑黃菌粗提物；
(2)將上述步驟(I)所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌，并干燥，進行硅膠正相柱層析，使用洗脫劑洗脫3-5次；
(3)收集步驟(2)中的最后一次洗脫液，減壓干燥，與等體積硅膠拌樣，再次進行正相硅膠層析，使用洗脫劑洗脫；
(4)收集上述步驟(3)中得到的洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當合并洗脫液，減壓干燥；
(5)對步驟(4)得到的產物進行反相硅膠層析，洗脫劑為甲醇和水；
(6)收集洗脫液，減壓蒸干，進行甲醇凝膠層析。(7)HPLC檢測，適度合并洗脫液，減壓干燥，即為環二肽C2。本發明由桑黃菌中環二肽C2的分離技術的顯著優勢:本方法采用多種層析技術相結合，可以精致到結構明確，純度大于95%的環二肽C2。技術路線成熟明確，高效精確。
圖1為環二肽C2的結構式；
圖2為環二肽C2的一維核磁共振H譜。
具體實施例方式實例1:
桑黃粗提物，由下述方法制得:
(1)發酵培養基配方以克/100毫升計是:
玉米淀粉 1%葡萄糖 1%
蛋白胨 0.1%酵母膏 0.1%
硫酸鎂 0.1%磷酸二氫鉀0.01%
(2)將桑黃菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內，以25°C溫度，搖瓶轉速為110r/min，pH 7條件下，震動培養7天；培養中當pH值降到3時，將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中，以溫度25°C，發酵罐壓力0.1公斤/平方厘米，pH 3，通氣量
0.5-1.lvvm，攪拌速度100轉/分的條件，培養7天，即可利用桑黃菌絲體發酵全液制備桑黃粗提物；
(3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發酵全液，將其以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/3 ；
(4)用體積百分比為70%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到55% ；
(5)對步驟(4)所得提取液在70°C條件下，加熱I小時；以常規方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得桑黃粗提物。
將上述粗提物稱取300g與等體積100目正相硅膠混勻攪拌，進行硅膠正相柱層析。層析固定相為200目正相硅膠，柱高lm，直徑20cm，洗脫劑為分別為氯仿，氯仿:甲醇=100:1,50:1,10:1,5:1分別洗脫3個柱體積。并將所得洗脫液分別命名為Fr_l，Fr_2，Fr-3，Fr-4，Fr_5。。將Fr_5等體積硅膠拌樣，使用硅膠為100目正相硅膠，五倍體積硅膠層析，使用的硅膠為200目正相硅膠。洗脫劑為氯仿與甲醇。收集洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，進行甲醇凝膠柱層析，洗脫劑為甲醇。使用TLC檢測收集的洗脫液，適當合并洗脫液，減壓干燥，進行反相硅膠層析，洗脫劑為甲醇:水=15%，TLC檢測收集的洗脫液適當合并，減壓干燥，再次進行甲醇凝膠層析，用甲醇洗脫，將洗脫液減壓蒸干，進行HPLC檢測,Omin, 100%A水一IOmin, 100%甲醇，適當合并洗脫液,減壓干燥,得到環二肽C2,進行ID-HNMR核磁共振分析，頻率為400MHZ，分析結果為δ 7.35 - 7.13 (m, 5H)，4.45 (t,J = 4.1 Hz, 1H), 4.32 (dd, J = 10.9, 5.2 Hz, 1H)，4.24 (d, J = 4.7 Hz, 1H)，
3.66 (dd, J = 13.0, 5.0 Hz, 1H)，3.12 (d, J = 5.0 Hz, 2H)，2.02 (dd, J = 13.0,
5.9Hz, 1H),1.36 -1.26 (m, 1H).證明是六氫_7 -羥基-3 -(苯基甲基)卩比咯并[I, 2-a)吡嗪-1，4 - 二酮。實例2:
桑黃粗提物，由下述方法制得:
(1)發酵培養基配方以克/100毫升計是:
玉米淀粉 3%葡萄糖 2%
蛋白胨 0.5%酵母膏 0.5%
硫酸鎂 0.5%磷酸二氫鉀0.05%
(2)將桑黃菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內，以30°C溫度，搖瓶轉速為180r/min，pH6條件下，震動培養15天；培養中當pH值降到2.5時，將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中，以溫度30°C，發酵罐壓力0.2公斤/平方厘米，pH 3，通氣量0.5-1.lvvm,攪拌速度180轉/分的條件，培養15天，即可利用桑黃菌絲體發酵全液制備桑黃粗提物；
(3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發酵全液，將其以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ；
(4)用體積百分比為90%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的4倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到70% ；
(5)對步驟(4)所得提取液在55°C條件下，加熱2.5小時；以常規方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/10 ;
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得桑黃粗提物。將上述粗提物稱取150g與等體積正相硅膠混勻攪拌，進行硅膠正相柱層析。層析固定相為200目正相硅膠，柱高0.Sm，直徑14cm，洗脫劑為分別為氯仿，氯仿:甲醇=100:1，50:1,10:1,5:1分別洗脫2個柱體積。并將所得洗脫液分別命名為Fr-1，Fr_2，Fr_3，Fr_4，Fr-5。。將Fr-5等體積硅膠拌樣，五倍體積硅膠層析，使用的硅膠為200目正相硅膠。洗脫劑為氯仿與甲醇。收集洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，進行甲醇凝膠柱層析，洗脫劑為甲醇。使用TLC檢測收集的洗脫液，適當合并洗脫液，減壓干燥，進行反相硅膠層析，洗脫劑為甲醇:水=15%，TLC檢測收集的洗脫液適當合并，減壓干燥，再次進行甲醇凝膠層析，用甲醇洗脫，將洗脫液減壓蒸干，進行HPLC檢測，Omin, 100%A水一IOmin, 100%甲醇，出峰時間為
5.45min，適當合并洗脫液，減壓干燥，得到環二肽C2，進行ID-HNMR核磁共振分析，頻率為400MHZ，分析結果為 δ 7.35 - 7.13 (m, 5H)，4.45 (t, J = 4.1 Hz, 1H)，4.32 (dd,J = 10.9, 5.2 Hz, 1H), 4.24 (d, J = 4.7 Hz, 1H)，3.66 (dd, J = 13.0, 5.0 Hz,1H), 3.12 (d, J = 5.0 Hz·, 2H)，2.02 (dd, J = 13.0, 5.9 Hz, 1H)，1.36 -1.26(m, 1H).證明是六氫-7 -羥基-3 -(苯基甲基)卩比咯并[l，2-a〕吡嗪_1，4 - 二酮。
權利要求
1.桑黃菌中環二肽C2的分離方法，其步驟順序如下: (1)制備桑黃菌粗提物； (2)將上述步驟(I)所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌，并干燥，進行硅膠正相柱層析，使用洗脫劑洗脫3-5次； (3)收集步驟(2)中的最后一次洗脫液，減壓干燥，與等體積硅膠拌樣，再次進行正相硅膠層析，使用洗脫劑洗脫； (4)收集上述步驟(3)中得到的洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當合并洗脫液，減壓干燥； (5)對步驟(4)得到的產物進行反相硅膠層析，洗脫劑為甲醇和水； (6)收集洗脫液，減壓蒸干，進行甲醇凝膠層析； (7)HPLC檢測，適度合并洗脫液，減壓干燥，即為環二肽C2。
2.如權利要求1所述的一種從桑黃菌中分離苯乙醇的方法，其特征在于所述桑黃粗提物，由下述方法制得: (1)發酵培養基配方以克/100毫升計是: 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸鎂 0.1-0.5%磷酸二氫鉀0.01-0.05% (2)如權利要求1所述桑黃粗提物的發酵培養方法是，將桑黃菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內，以20 35 °C溫度，搖瓶轉速為80 280r/min，pH 3 8條件下，震動培養7 15天；培養中當pH值降到2.5 4時，將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中，以溫度20 35°C，發酵罐壓力0.1 0.2公斤/平方厘米，pH 3 8，通氣量0.5 1.1vvm,攪拌速度100 280轉/分的條件，培養7 15天，即可利用桑黃菌絲體發酵全液制備桑黃粗提物； (3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發酵全液，將其以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2 1/5 ； (4)用體積百分比為60 95%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2 5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到60 90% ； (5)對步驟(4)所得提取液在50 70°C條件下，加熱I 2小時；以常規方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 1/10 ； (6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得桑黃粗提物。
3.如權利要求1所述的桑黃菌中環二肽C2的分離方法，其特征在于所述的環二肽C2為六氫-7 -羥基-3 -(苯基甲基)吡咯并[1，2-a)吡嗪-1，4 - 二酮。
4.如權利要求1所述的桑黃菌中環二肽C2的分離方法，其特征在于，步驟(2)中所述的拌樣硅膠為100-200目正相硅膠。
5.如權利要求1所述的桑黃菌中環二肽C2的分離方法，其特征在于，步驟⑵中所述的層析硅膠為正相200-300目，洗脫劑為氯仿或甲醇。
6.如權利要求1所述的桑黃菌中環二肽C2的分離方法，其特征在于，步驟(3)中所述的硅膠用量為等體積，洗脫劑為氯仿與甲醇。
7.如權利要求1所述的桑黃菌中環二肽C2的分離方法，其特征在于，步驟(4)中所述的凝膠為S印hadex LH-20或者S印hadex LH-25，洗脫劑為甲醇。
8.如權利要求1所述的桑黃菌中環二肽C2的分離方法，其特征在于，步驟(5)所述的反相材料為C-18或者C-8。
9.如權利要求1所述的桑黃菌中環二肽C2的分離方法，其特征在于，步驟(5)所述的洗脫劑為甲醇:水=15%-70%。
10.如權利要求1所述的桑黃菌中環二肽C2的分離方法，其特征在于，步驟(6)所述的凝膠為甲醇凝膠。
11.如權利要求1所述的桑黃菌中環二肽C2的分離方法，其特征在于，步驟(7)所述的HPLC 條件為，Omin, 100%A 水一1Omin, 100% 甲醇。
12.如權利要求1所 述的桑黃菌中環二肽C2的分離方法，其特征在于，步驟(J)所述的HPLC出鋒時間為5.3-5.9min。
全文摘要
本發明公開了一種桑黃菌(火木層孔菌Phellinusigniarius(LexFr)Quel、裂蹄木層孔菌phellinuslinteus(BerketCurt)Teng、鮑氏層孔菌、哈蒂針層孔菌Phellinushartigii(AlleschetSchnabl)Imaz)中環二肽C2的分離方法。首先制備桑黃菌粗提物，然后進行正相硅膠層析，采用氯仿甲醇梯度洗脫，進行TLC檢測，再次使用正相硅膠層析，然后是甲醇凝膠層析，經PLC檢測后，進行反相硅膠層析，適當合并洗脫液，減壓干燥，再次進行甲醇凝膠層析，經HPLC檢測，既得環二肽C2。
文檔編號C07D487/04GK103073551SQ20131003597
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月30日 優先權日2013年1月30日
發明者宋愛榮, 趙晨, 孫效樂, 田雪梅, 孔超 申請人:青島農業大學