一種海洋地衣芽孢桿菌抗腫瘤蛋白的制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】一種海洋地衣芽孢桿菌抗腫瘤蛋白的制備方法，取干凈、新鮮的海帶并滅菌處理；對海帶進行研磨，將研磨液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板培養基上，在37℃的條件下恒溫培養5~7天；挑取單菌落反復劃線培養至純菌株，得到海帶內生地衣芽孢桿菌DNN6；以抑菌活性為指標優化菌株培養條件，優化的培養條件為菌株DNN6在pH9，蔗糖50g/L和蛋白胨10g/L的培養基中25℃發酵6天。8000r/min離心去除菌體，在上清液中加入硫酸銨，硫酸銨的飽和終濃度為95%，4℃靜置過夜，過濾將沉淀用蒸餾水溶解后，用截留分子量為3600道爾頓的透析袋透析4天，取透析袋中物冷凍干燥，得海洋地衣芽孢桿菌抗腫瘤蛋白。本方法操作簡單、成本低廉。
【專利說明】一種海洋地衣芽孢桿菌抗腫瘤蛋白的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫藥領域中抗腫瘤蛋白的一種制備方法，特別是一種海洋地衣芽孢桿菌抗腫瘤蛋白的制備方法。
【背景技術】
[0002]海帶QMmirmria Japonica Aresch)是一種在低溫海水中生長的大型海生褐藻植物。它生長于水溫較低的海中，分布于中國北部沿海及朝鮮、日本和蘇聯太平洋地區沿岸，在中國北部及東南沿海有大量養殖。海帶主要是自然生長，也有人工養殖，多以干制品行銷于市，質量以色褐、體短、質細而肥厚者為佳。海帶有“長壽菜”、“海上之蔬” “含碘冠軍”的美譽。
[0003]海帶作為一種重要的海洋資源，其食用與藥用價值早為世人所知。從海帶中提取的有效成分具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗HIV和增強免疫功能，對治療心腦血管疾病和中、早期慢性腎衰等均有一定的作用。海帶中還含有一些共附微生物，但這些微生物及其代謝產物迄今未止還沒有在抗腫瘤方面被充分利用。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種操作簡單、成本低廉的海洋地衣芽孢桿菌抗腫瘤蛋白的制備方法，使海帶在抗腫瘤方面得以廣泛應用。
[0005]本發明的一種海洋地衣芽孢桿菌抗腫瘤蛋白的制備方法，步驟如下:
a、取干凈、新鮮的海帶并滅菌處理，所述的滅菌處理是用75%的酒精和1%的氯化汞對海帶的表面進行滅菌處理；
滅菌處理后對海帶進行研磨，研磨成勻漿，將研磨液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板培養基上，在37 V的條件下恒溫培養5~7天；
b、挑取單菌落反復劃線培養至純菌株；得到地衣芽孢桿菌Bacilluslicheniformis ；該菌株已于2012年12月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為 CGMCC N0.7077 ；
C、以抑菌活性為指標優化菌株培養條件，優化的培養條件為菌株DNN6在pH 9，蔗糖50g/L和蛋白胨10 g/L的培養基中25°C發酵6天；
d、8000 r/min離心去除菌體，在上清液中加入硫酸銨，硫酸銨的飽和終濃度為95%，4°C靜置過夜，過濾將沉淀用蒸餾水溶解后，再用截留分子量為3600道爾頓的透析袋透析4天，取透析袋中物冷凍干燥，得到海洋地衣芽孢桿菌抗腫瘤蛋白。
[0006]本發明的海洋地衣芽孢桿菌抗腫瘤蛋白在抗腫瘤方面的應用。
[0007]本發明的一種海洋地衣芽孢桿菌抗腫瘤蛋白的制備方法，操作簡單、成本低廉，從海帶內生地衣芽孢桿菌菌株DNN6的發酵液中所提取的抗腫瘤活性蛋白抗腫瘤活性強，對小鼠體內S180腫瘤生長有抑制活性，對白血病k562細胞株、人肝癌H印G2，乳腺癌MDA-MB-231和MFC-7均有明顯的抑制活性，還可抑制和臍靜脈內皮細胞HuvEc，因此可應用于抗腫瘤藥品的制備，具有產業價值。
[0008]本發明中的海洋地衣芽孢桿菌菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為 CGMCC N0.7077。
【具體實施方式】
[0009]本發明實施例依次按如下步驟進行: a、將剛打撈的新鮮海帶，在超凈工作臺內用無菌水清洗5遍后，再用75%酒精漂洗30-90s (30s 一個梯度)，無菌水沖洗；0.1%氯化汞漂洗6-18s (6s 一個梯度)，無菌水沖洗多次。將不同滅菌時間梯度的海帶片都分成兩份，一份用滅菌研缽研碎后接種到培養皿上作為實驗組，另一份直接放入空白培養基做對照組。倒置于37°C溫室中培養5~14天，觀察選取較好的實驗條件，即選擇實驗組中內生菌生長良好，而對照組中無菌落長出的滅菌時間梯度作為海帶表面滅菌條件。海帶表面滅菌充分研磨后，將200μL研磨液均勻涂布于現有的牛肉膏蛋白胨平板培養基上，37°C恒溫培養5~7天。
[0010]b、挑取單個形態各異的菌落反復劃線培養至出現純菌株，用濾紙片法檢測各純菌株的抑菌活性作為初步篩選標準。
[0011]通過耐鹽性試驗、對溶菌酶抗性試驗、V.P實驗、苯丙氨酸、丙二酸鹽實驗、檸檬酸鹽利用、產糊精結晶、油脂水解、淀粉水解、二羥丙酮的形成、過氧化氫酶、酪氨酸水解、產硫化氫、明膠水解、對溶菌酶抗性、石蕊牛乳實驗、糖發酵、硝酸鹽還原、產生吲哚、動力實驗、卵磷脂酶、甲基紅實驗、酪素水解等生理生化試驗將其鑒定到種，該活性菌株為地衣芽孢桿菌，該菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC N0.7077。
[0012]C、以抑菌圈平均直徑為標準，優化次級代謝產物產生的最佳條件，在pH 9的蔗糖蛋白胨液體培養基中25°C發酵6天，所述蔗糖蛋白胨液體培養基的質量百分比分別為5%和1%。
[0013]d、8000r/min離心去除菌體，在上清液中加入硫酸銨，硫酸銨的飽和終濃度為95%，4°C靜置過夜，過濾，將沉淀用蒸餾水溶解后，再用3600道爾頓的透析袋透析4天，取透析袋中物冷凍干燥；SDS-PAGE電泳結果表明沉淀物為蛋白質。
[0014]e、體外抗腫瘤活性的檢測:取凍干樣品用DMEM溶解，培養腫瘤細胞(將肝癌細胞HePG2、乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7、白血病細胞K562)和臍靜脈內皮細胞HuvEc，樣品設定濃度梯度，用MTT法測蛋白作用后腫瘤細胞存活率。具體操作如下:
首先培養腫瘤細胞，將肝癌細胞HePG2、乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7、白血病細胞K562和臍靜脈內皮細胞HuvEc復蘇到20%的血清培養集中，培養4飛天，接種到六孔板中，換成10%培養基培養，細胞密度達到2 X IO6后接種到96孔板中，每空100μL，過夜；將蛋白用DMEM溶液溶解，然后用DMEM做梯度稀釋(10、20、30、40、60、80、100、150mg/mL)，將96孔板中培養基棄掉加入蛋白樣品孵育6小時，空白對照只加DMEM。配制MTT，6小時后每空加入ΙΟμL ΜΤΤ，孵育4小時，然后將孔內液體棄掉，每空加入100μL DMSO溶解紫色結晶，37°C水浴保持20分鐘。然后用酶標儀在490 nm下測吸光度值進而處理數據計算細胞存活率。結果該蛋白在150mg/mL時對白血病細胞K562抑制率高達94.73%，對臍靜脈內皮細胞HuvEc抑制率61.3%，對肝癌細胞HePG2抑制率為51%，對乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7抑制率分別為33.14%和41.88%，該菌株發酵液在低劑量范圍內抑制腫瘤細胞或血管內皮細胞，因此可作為粉劑或針劑應用于抗腫瘤藥物的制備。
[0015] f、對小鼠體內S180實體瘤的抑制活性:將S180肉瘤細胞接種昆明小鼠，次日開始給藥，連續給藥10日后解剖小鼠檢測各項指標。(給藥劑量:極低劑量:0.05 Pg/kg.d ;低劑量:0.5 Pg/kg.d ;中劑量:5 Pg/kg.d ;高劑量:50 Pg/kg.d ;極高劑量:100 Pg/kg.d,陽性對照:環磷酰胺20 mg/kg.d(腹腔注射給藥)抑瘤率效果呈現劑量效應，從0.5 Pg/kg開始呈現抑制效果，抑制率依次為2.036%，3.908%，48.665%，59.063%,陽性對照抑制率92.1%，在蛋白劑量低于陽性對照200倍就可達到如此好的抑制效果，因此該蛋白可開發成針劑或粉劑用于腫瘤的治療。
【權利要求】
1.一種海洋地衣芽孢桿菌抗腫瘤蛋白的制備方法，其特征在于:步驟如下: a、取干凈、新鮮的海帶并滅菌處理，所述的滅菌處理是用75%的酒精和1%的氯化汞對海帶的表面進行滅菌處理； 滅菌處理后對海帶進行研磨，將研磨液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板培養基上，在37°C的條件下恒溫培養5~7天； b、挑取單菌落反復劃線培養至純菌株,得到地衣芽孢桿菌Bacilluslicheniformis,該菌株已于2012年12月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為 CGMCC N0.7077 ； C、以抑菌活性為指標優化菌株培養條件，優化的培養條件為菌株DNN6在pH 9，蔗糖50g/L和蛋白胨10 g/L的培養基中25°C發酵6天； d、8000 r/min離心去除菌體，在上清液中加入硫酸銨，硫酸銨的飽和終濃度為95%，4°C靜置過夜，過濾將沉淀用蒸餾水溶解后，再用截留分子量為3600道爾頓的透析袋透析4天，取透析袋中物冷凍干燥，得到海洋地衣芽孢桿菌抗腫瘤蛋白。
2.根據權利要求1所述的海洋地衣芽孢桿菌抗腫瘤蛋白在抗腫瘤方面的應用。
【文檔編號】C07K1/36GK103966287SQ201310034692
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月30日 優先權日:2013年1月30日
【發明者】張付云, 徐鳳, 楊陽, 蒼桂璐, 王維才 申請人:大連海洋大學, 張付云