專利名稱：一種用氣味結(jié)合蛋白15基因檢測昆蟲自殘率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用氣味結(jié)合蛋白15基因檢測昆蟲自殘率的方法。
背景技術(shù)：
害蟲生物防治在農(nóng)林業(yè)可持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮著不可替代的重要作用。天敵昆蟲的大量生產(chǎn)更是生物防治中最基礎(chǔ)也是最重要的環(huán)節(jié)。捕食性天敵昆蟲躅蝽(Arma chinensis)可以控制來自鱗翅目、鞘翅目、半翅目、同翅目、膜翅目等多種農(nóng)林害蟲，尤其是它還可以控制重大外來入侵害蟲馬鈴薯甲蟲和美國白蛾，因此躅蝽是一種應(yīng)用前景很好的天敵昆蟲商品O作為商品，大量減少生產(chǎn)成本是人們追求利潤最大化的一個(gè)途徑。在天敵昆蟲躅蝽生產(chǎn)中就可以應(yīng)用不同的食物來生產(chǎn)躅蝽，例如，不同的昆蟲獵物、含昆蟲成分的人工飼料和不含昆蟲成分的人工飼料，進(jìn)而減少生產(chǎn)成本。但是應(yīng)用不同的食物生產(chǎn)出來的躅蝽的生物學(xué)特性參差不齊，有些釋放后能達(dá)到很好的控制害蟲的作用，有的則在釋放后效果不顯著。由于不同食物飼喂的躅蝽在表型上很難區(qū)分，因此這些天敵昆蟲在釋放前是很難評(píng)估它們的生物學(xué)特性的。種內(nèi)自殘現(xiàn)象是捕食性天敵昆蟲大量群體飼養(yǎng)過程中很嚴(yán)重的一個(gè)問題。自殘率高的昆蟲種群很難在短期內(nèi)大量擴(kuò)繁，因此倍增時(shí)間大大延長，進(jìn)而增加飼養(yǎng)成本。在用人工飼料飼養(yǎng)的躅蝽種群內(nèi)，自殘率較高。但是對(duì)于不同食物來源或不同商家的商品躅蝽自殘率的檢測方法仍舊是在飼 養(yǎng)過程中測試其自殘率的多少，這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力費(fèi)錢。不進(jìn)行生物學(xué)測定就很難對(duì)商品進(jìn)行快速的檢測。氣味結(jié)合蛋白15(odorant binding proteinl5)是昆蟲感受外界氣味的蛋白，氣味結(jié)合蛋白15表達(dá)量的變化會(huì)影響昆蟲感知外界氣味的程度，氣味結(jié)合蛋白15基因表達(dá)量的減少會(huì)使昆蟲對(duì)同類的氣味感知能力下降，這就會(huì)大大增加同類自殘的現(xiàn)象。而這種現(xiàn)象在捕食性天敵昆蟲中更為突出。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于檢測氣味結(jié)合蛋白15編碼基因表達(dá)量的物質(zhì)的用途。本發(fā)明提供了用于檢測氣味結(jié)合蛋白15編碼基因表達(dá)量的物質(zhì)在檢測昆蟲自殘率中的應(yīng)用；所述氣味結(jié)合蛋白15的氨基酸序列為序列表中的序列2。上述應(yīng)用中，所述昆蟲為昆蟲個(gè)體或昆蟲種群；所述昆蟲種群具體為取食不同物質(zhì)昆蟲種群；所述取食不同物質(zhì)昆蟲種群進(jìn)一步具體為取食人工飼料的昆蟲種群或取食獵物的昆蟲種群；所述氣味結(jié)合蛋白15編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第10-273位核苷酸。所述昆蟲具體為躅蝽。上述人工飼料按照如下方法制備生豬肝60g、大豆粉10g、水100ml、雞蛋20ml、干酪素2g、鹿糖8g、VCO. 2g、氯化膽堿O. 4g、泛酸韓8mg、葉酸O. lmg、煙酰胺O. 2mg、慶大霉素
3.9mg ;具體飼喂方法見實(shí)施例2 ；上述獵物為昨蠶(Antheraea pernyi)蛹；具體飼喂方法見實(shí)施例2。上述應(yīng)用中，所述用于檢測氣味結(jié)合蛋白15編碼基因表達(dá)量的物質(zhì)為如下1)-3)中任意一種I)引物對(duì)A :所述引物對(duì)由引物I和引物2組成；所述引物I的核苷酸序列為序列表中序列3 ;所述引物2的核苷酸序列為序列表中序列4 ；2 )含有所述弓I物對(duì)A的RT-PCR試劑；3)含有所述引物對(duì)A或所述RT-PCR試劑的試劑盒。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種引物對(duì)A。本發(fā)明提供的一種弓丨物對(duì)A，由引物I和引物2組成；所述引物I的 核苷酸序列為序列表中序列3 ;所述引物2的核苷酸序列為序列表中序列4。
含有上述的引物對(duì)A的RT-PCR試劑也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；上述RT-PCR試劑具體由水、RT-PCR擴(kuò)增緩沖液、鎂離子、dNTPs、上述的引物對(duì)A、熒光染料(SYBR Green I)和Taq酶組成；所述引物對(duì)A中的各條引物在所述RT-PCR試劑中的終濃度具體為O. 2-1 μ Μ，所述引物對(duì)A中的各條引物在所述RT-PCR試劑中的終濃度進(jìn)一步具體為O. 25 μ M0含有上述的引物對(duì)A或上述的RT-PCR試劑的試劑盒也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述試劑盒還包括內(nèi)參引物對(duì)B，所述內(nèi)參引物對(duì)B由引物3和引物4組成；所述引物3的核苷酸序列為序列表中的序列6 ;所述引物4的核苷酸序列為序列表中的序列7。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種檢測昆蟲自殘率的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟用上述的引物對(duì)A或上述的RT-PCR試劑或上述的試劑盒對(duì)待測的昆蟲A和B進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，所述取食不同物質(zhì)的昆蟲種群為取食人工飼料的昆蟲種群或取食獵物的昆蟲種群；若所述昆蟲A氣味結(jié)合蛋白15基因的表達(dá)量高于所述昆蟲B，則所述昆蟲A的自殘率低于所述昆蟲B。上述方法中，所述昆蟲為昆蟲個(gè)體或昆蟲種群；所述RT-PCR擴(kuò)增的模板為昆蟲的cDNA ；所述昆蟲具體為躅蝽。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述昆蟲A為取食獵物的昆蟲種群；所述昆蟲B為取食人工飼料的昆蟲種群。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種蛋白或其編碼基因。本發(fā)明提供的蛋白的的氨基酸序列為序列表中的序列2 ；本發(fā)明提供的蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第10-273位核苷酸。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的檢測方法可以通過檢測氣味結(jié)合蛋白15基因表達(dá)量來檢測不同種群的昆蟲自殘率，特別是不同營養(yǎng)源的躅蝽的自殘率，用本發(fā)明的檢測方法檢測昆蟲的自殘率僅需2-3天。而用傳統(tǒng)的生物學(xué)方法需要30-60天左右。本發(fā)明的檢測方法涉及的材料來源廣，易購買，操作簡單，省時(shí)，省力，適合于在昆蟲商品檢驗(yàn)檢測中推廣應(yīng)用。
圖1為躅蝽beta-actin內(nèi)參擴(kuò)增曲線圖2為躅蝽beta-actin內(nèi)參融解曲線圖3為躅蝽氣味結(jié)合蛋白15基因擴(kuò)增曲線圖4為躅蝽氣味結(jié)合蛋白15基因融解曲線
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、檢測昆蟲自殘率的氣味結(jié)合蛋白15及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)和專用引物的設(shè)計(jì)研究發(fā)現(xiàn)，氣味結(jié)合蛋白15基因是一種檢測昆蟲自殘率的很好的分子標(biāo)記，因此本發(fā)明通過躅蝽的氣味結(jié)合蛋白15 (odorant binding proteinl5)編碼基因的表達(dá)用來檢測躅蝽的自殘率。 躅蝽的氣味結(jié)合蛋白15編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第10-273位核苷酸，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。根據(jù)躅蝽的氣味結(jié)合蛋白15編碼基因設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增該編碼基因的引物如下上游引物ATTACCGACATTAGGAGAAGATGAA(序列 3);下游引物ACTCAGCAGTGAAGTTCTCCAT(序列 4)。實(shí)施例2、氣味結(jié)合蛋白15或編碼基因或?qū)Ｓ靡镌跈z測躅蝽自殘率中的應(yīng)用下述實(shí)驗(yàn)中米用的螞疇(Armachinensis,記載在 Taxonomic and bionomicnotes on Arma chinensis(Fallou)(Hemiptera:Pentatomidae:Asopinae, Zootaxa,3382:41-52, 2012，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所獲得)根據(jù)取食物質(zhì)的不同分為兩組，每組50只取食人工飼料組躅蝽飼喂人工飼料的躅蝽(27 ±1° C，16:8(L:D)，75±5%RH)每天每頭成蟲飼喂160 μ I人工飼料，一直到躅蝽自然死亡；取食獵物組躅蝽飼喂獵物的躅蝽(27±1° C，16:8(L:D)，75±5%RH)每對(duì)成蟲飼喂一頭獵物，每隔7-15天根據(jù)獵物被取食情況更換一次獵物，一直到躅蝽自然死亡；人工飼料為生豬肝60g、大豆粉IOgjjC 100ml、雞蛋20ml、干酪素2g、鹿糖8g、VC0. 2g、氯化膽堿0. 4g、泛酸I丐8mg、葉酸0. lmg、煙酰胺0. 2mg、慶大霉素3. 9mg ；獵物為昨蠶(Antheraea pernyi )蛹(可商購)。一、躅蝽cDNA的獲得1、躅蝽RNA抽提
步驟如下將各組躅蝽樣品移入加入適量液氮的研缽中，快速、用力研磨成勻漿，移至1. 5ml
離心管中。加1000 μ ITrizol到1. 5ml離心管中，靜置5分鐘。加200 μ I氯仿，旋渦振蕩10秒，靜置5分鐘，放入離心機(jī)中，12，000g4°C離心15分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移至新的1. 5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，振蕩混勻，_20°C放置I小時(shí)，室溫靜置10分鐘。放入離心機(jī)中，12，000g，4°C離心10分鐘。棄上清液，將異丙醇除盡，加入Iml75%的無水乙醇，12，000g，4°C離心5分鐘。棄上清液，待沉淀 干燥后加入DEPC處理水，_80°C保存，得到RNA。2、反轉(zhuǎn)錄米用Superscript III Reverse Transcriptase kit 試劑盒(Invitrogen 18080044)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄a)取一滅菌的無RNA酶的印pendorf管，每個(gè)樣本加入如下表I所示的組分得到mixl ；表I為反轉(zhuǎn)錄加入組分I
權(quán)利要求
1.用于檢測氣味結(jié)合蛋白15編碼基因表達(dá)量的物質(zhì)在檢測昆蟲自殘率中的應(yīng)用； 所述氣味結(jié)合蛋白15的氨基酸序列為序列表中的序列2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述昆蟲為昆蟲個(gè)體或昆蟲種群；所述氣味結(jié)合蛋白15編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第10-273位核苷酸； 所述昆蟲具體為躅蝽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述用于檢測氣味結(jié)合蛋白15編碼基因表達(dá)量的物質(zhì)為如下I) -3)中任意一種 1)引物對(duì)A:所述引物對(duì)由引物I和引物2組成；所述引物I的核苷酸序列為序列表中序列3 ;所述引物2的核苷酸序列為序列表中序列4 ； 2)含有所述引物對(duì)A的RT-PCR試劑； 3)含有所述引物對(duì)A或所述RT-PCR試劑的試劑盒。
4.一種引物對(duì)A，由引物I和引物2組成； 所述引物I的核苷酸序列為序列表中序列3 ;所述引物2的核苷酸序列為序列表中序列4。
5.含有權(quán)利要求4所述的引物對(duì)A的RT-PCR試劑Jy^iRT-PCR試劑具體由水、RT-PCR擴(kuò)增緩沖液、鎂離子、dNTPs、權(quán)利要求4所述的引物對(duì)A、SYBR和Taq酶組成； 所述弓I物對(duì)A中的各條弓I物在所述RT-PCR試劑中的終濃度具體為O. 2-1 μ Μ，所述弓I物對(duì)A中的各條引物在所述RT-PCR試劑中的終濃度進(jìn)一步具體為O. 25 μ Μ。
6.含有權(quán)利要求4所述的引物對(duì)A或權(quán)利要求5所述的RT-PCR試劑的試劑盒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括內(nèi)參引物對(duì)B，所述內(nèi)參引物對(duì)B由引物3和引物4組成；所述引物3的核苷酸序列為序列表中的序列6 ;所述引物4的核苷酸序列為序列表中的序列7。
8.—種檢測昆蟲自殘率的方法，包括如下步驟用權(quán)利要求4所述的引物對(duì)A或權(quán)利要求5所述的RT-PCR試劑或權(quán)利要求6或7所述的試劑盒對(duì)待測的昆蟲A和B進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；若所述昆蟲A的氣味結(jié)合蛋白15基因的表達(dá)量高于所述昆蟲B，則所述昆蟲A的自殘率低于所述昆蟲B。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于 所述昆蟲為昆蟲個(gè)體或昆蟲種群； 所述RT-PCR擴(kuò)增的模板為昆蟲的cDNA ； 所述昆蟲具體為躅蝽。
10.一種蛋白或其編碼基因 所述蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2 ； 所述蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第10-273位核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用氣味結(jié)合蛋白15基因檢測昆蟲自殘率的方法。本發(fā)明提供了用于檢測取食不同物質(zhì)的昆蟲種群的氣味結(jié)合蛋白15編碼基因表達(dá)量的物質(zhì)在檢測取食不同物質(zhì)的昆蟲種群自殘率中的應(yīng)用；所述氣味結(jié)合蛋白15的氨基酸序列為序列表中的序列2。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的檢測方法可以用于檢測昆蟲自殘率，特別是不同營養(yǎng)源的蠋蝽的自殘率，用本發(fā)明的檢測方法檢測昆蟲的自殘率僅需2-3天。而用傳統(tǒng)的生物學(xué)方法需要30-60天左右。本發(fā)明的檢測方法涉及的材料來源廣，易購買，操作簡單，省時(shí)，省力，適合于在昆蟲商品檢驗(yàn)檢測中推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K14/435GK103060467SQ20131003209
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月28日
發(fā)明者鄒德玉, 陳紅印, 張禮生, 王樹英, 陳長風(fēng), 王孟卿, 劉晨曦 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所