專利名稱：一種抗結核多肽的免疫制備方法
技術領域：
本發明涉及一種抗結核多肽的免疫制備方法，屬免疫醫學和生物制藥領域。
背景技術：
結核病是一種由結合分枝桿菌引起的嚴重危害人民健康的慢性傳染病，目前全球有約20億人被感染。我國是結核病的重災區之一，每年死亡人數是其他傳染病死亡人數的總和的2倍以上。抗結核化學藥物治療對控制結核病具有較好療效，但存在服藥時間長和易產生耐藥性等問題。
抗結核多肽能傳遞結核桿菌的特異性細胞免疫信息，具有調節和增強機體特異性抗結核感染的細胞免疫的功能。當其進入人體后，可使患者的正常T細胞轉變成特異性致敏T細胞。致敏T細胞分為殺傷性致敏T細胞(TC)和遲發型超敏反應性T細胞(TDTH)兩種。殺傷性致敏T細胞(TC)能對帶有結核桿菌寄生的細胞實行特異性殺傷，遲發型超敏反應性T細胞(TDTH)則可釋放出多種淋巴因子，介導炎癥反應，增強殺傷結核桿菌作用。同時釋放的淋巴因子又可使機體內其他淋巴細胞致敏，形成更多的效應淋巴細胞，增強、擴大細胞免疫效應，從而達到調節人體特性免疫功能。尤其對臨床上的難治性結核病人顯示出明顯療效。
國內外多采用純蛋白衍生物(purified protein derivative,PPD)或卡介苗單次免疫制備抗結核多肽，其免疫效果不穩定，進而容易特異性免疫效果低的問題。且其多肽的提取多采用反相色譜法進行分離純化，也有少數用親和色譜法(抗原吸咐柱層析分離純化) 進行分離純化的報道，親和色譜法分離純化特異性有效組分相對快、步驟簡單，但需要大量可溶性抗原擴相應抗體，在短期內難以完成，不利于工業化生產。發明內容
本發明目的在于提供一種抗結核多肽的免疫制備方法，該制備工藝簡便可控，制備的抗結核多肽的白細胞粘附抑制率可達33. 9-38%。
為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是一種抗結核多肽的免疫制備方法，其特征在于它是以卡介苗脂質體皮下注射健康豬， 使其進行免疫反應，其中所述的卡介苗脂質體是由卡介苗和免疫增強劑混合而得；取免疫健康豬的脾和淋巴結，去脂肪及粘膜，得待處理物，向待處理物中加入生理鹽水，搗碎制取勻漿；將勻漿于一 20 一 30°C反復凍融后經超濾膜超濾，得到的濾液為抗結核多肽粗品； 再經白細胞粘附抑制實驗檢測得其白細胞粘附抑制率滿足33. 9-38%的范圍值要求后，經交聯葡聚糖凝膠層析柱分離純化，冷凍干燥，得到抗結核多肽。
按上述方案，所述免疫增強劑為不完全弗氏佐劑和卵磷脂、殼聚糖兩者中至少一種的混合，當不完全弗氏佐劑和卵磷脂兩者混合時，兩種的質量比為1: O. 2-2， 當不完全弗氏佐劑和殼聚糖兩種混合時，兩者的質量比為1:0. 2-1 ;當不完全弗氏佐劑、卵磷脂和殼聚糖三種混合時，三者的質量比為1: O. 2-1 :0. 2-0. 8。
按上述方案，所述的卡介苗脂質體為將卡介苗和免疫增強劑按質量比為1:O.7-3. O，混合后超聲處理30-60min而得，其中卡介苗的用量為O. 1-0. 6mg/Kg豬。
按上述方案，所述的注射為每10天一次，連續注射3 6次。
按上述方案，所述的凍融次數為3 7次。
按上述方案，按重量比計，所述的生理鹽水的用量為待處理物的I 3倍。
按上述方案，所述超濾膜的孔徑為3000 8000道爾頓。
按上述方案，所述交聯葡聚糖凝膠層析柱為交聯葡聚糖凝膠Sephadex G_15層析柱或交聯葡聚糖凝膠Sephadex G_25層析柱。
本發明的有益效果本發明針對特定免疫對象豬，采用設定用量的卡介苗和特定的免疫增強劑混合而得的卡介苗脂質體通過皮下注射健康豬，經周期性多次注射免疫，可顯著地提高其特異性免疫效果，而達到增加特異性抗結核多肽產量的效果，同時降低制備成本，由此制備而得的抗結核多肽的白細胞粘附抑制率可達33. 9-38%。
具體實施方式
以下通過實施例對本發明的發明內容作詳細說明。
實施例1將卡介苗20mg和不完全弗氏佐劑10mg、卵磷脂3mg、殼聚糖2mg于超聲波下混合攪拌 40min,制成卡介苗脂質體。選取50-60公斤的健康豬,皮下注射卡介苗脂質體，每10天注射一次，連續注射4次。宰殺卡介苗免疫的健康豬。取其豬脾和淋巴結，去脂肪及粘膜，得待處理物，向待處理物中加入重量比為1:2的生理鹽水，用組織搗碎勻漿機搗碎制取勻漿。于零下20度反復凍融4次后，再用5000道爾頓超濾膜超濾，得到的濾液為抗結核多肽粗品。經白細胞粘附抑制實驗檢測，得白細胞粘附抑制率為37. 1%，再采用交聯葡 聚糖凝膠Sephadex G-15層析柱分離純化，冷凍干燥，得到抗結核多肽。
實施例2將卡介苗25mg和不完全弗氏佐劑15mg、卵磷脂4mg、殼聚糖3. 5mg于超聲波下混合攪拌60min,制成卡介苗脂質體。選取60-70公斤的健康豬,皮下注射卡介苗脂質體，每10天注射一次，連續注射5次。宰殺卡介苗免疫的健康豬。取其豬脾和淋巴結，去脂肪及粘膜，得待處理物，向待處理物中加入重量比為1:3的生理鹽水，用組織搗碎勻漿機搗碎制取勻漿。 于一 30度反復凍融5次后，再用6000道爾頓膜超濾，得到的濾液為抗結核多肽粗品。經白細胞粘附抑制實驗檢測，得白細胞粘附抑制率為33. 9%，再采用交聯葡聚糖凝膠Sephadex G-15層析柱分離純化，冷凍干燥，得到抗結核多肽。
實施例3將卡介苗15mg和不完全弗氏佐劑8mg、卵磷脂2mg、殼聚糖1. 6mg于超聲波下混合攪拌 60min,制成卡介苗脂質體。選取40-50公斤的健康豬,皮下注射卡介苗脂質體，每10天注射一次，連續注射3次。宰殺卡介苗免疫的健康豬。取其豬脾和淋巴結，去脂肪及粘膜，得待處理物，向待處理物中加入重量比為1:2的生理鹽水，用組織搗碎勻漿機搗碎制取勻漿。于零下30度反復凍融3次后，再用5000道爾頓膜超濾，得到的濾液為抗結核多肽粗品，經白細胞粘附抑制實驗檢測，得白細胞粘附抑制率為35. 2%。再采用交聯葡聚糖凝膠SephadexG-15層析柱分離純化，冷凍干燥，得到抗結核多肽。
實施例4將卡介苗28mg和不完全弗氏佐劑15mg、卵磷脂4mg、殼聚糖3. 5mg于超聲波下混合攪拌60min,制成卡介苗脂質體。選取50-60公斤的健康豬,皮下注射卡介苗脂質體，免疫健康豬每10天一次，連續注射5次。宰殺卡介苗免疫的健康豬。取其豬脾和淋巴結，去脂肪及粘膜，得待處理物，向待處理物中加入重量比為1:1的生理鹽水，用組織搗碎勻漿機搗碎制取勻漿。于零下20度反復凍融4次后，再用5000道爾頓膜超濾，得到的濾液為抗結核多肽粗品。經白細胞粘附抑制實驗檢測，得白細胞粘附抑制率為37.9%，再采用交聯葡聚糖凝膠 Sephadex G_25層析柱分離純化,冷凍干燥,得到抗結核多肽。
實施例5將卡介苗6mg和不完全弗氏佐劑7mg、卵磷脂6mg、殼聚糖5mg于超聲波下混合攪拌 40min,制成卡介苗脂質體。選取50-60公斤的健康豬,皮下注射卡介苗脂質體，每10天注射一次，連續注射4次。宰殺卡介苗免疫的健康豬。取其豬脾和淋巴結，去脂肪及粘膜，得待處理物，向待處理物中加入重量比為1:2的生理鹽水，用組織搗碎勻漿機搗碎制取勻漿。于零下20度反復凍融4次后，再用6000道爾頓超濾膜超濾，得到的濾液為抗結核多肽粗品。經白細胞粘附抑制實驗檢測，得白細胞粘附抑制率為34. 7%，再采用交聯葡聚糖凝膠Sephadex G-15層析柱分離純化，冷凍干燥，得到抗結核多肽。
實施例6將卡介苗30mg和不完全弗氏佐劑15mg、殼聚糖6mg于超聲波下混合攪拌60min,制成卡介苗脂質體。選取50-60公斤的健康豬，皮下注射卡介苗脂質體，每10天注射一次，連續注射5次。宰殺卡介苗免疫的健康豬。取其豬脾和淋巴結，去脂肪及粘膜，得待處理物，向待處 理物中加入重量比為1:2的生理鹽水，用組織搗碎勻漿機搗碎制取勻漿。于零下20度反復凍融4次后，再用5000道爾頓超濾膜超濾，得到的濾液為抗結核多肽粗品。經白細胞粘附抑制實驗檢測，得白細胞粘附抑制率為35. 4%，再采用交聯葡聚糖凝膠Sephadex G_15 層析柱分離純化，冷凍干燥，得到抗結核多肽。
權利要求
1.一種抗結核多肽的免疫制備方法，其特征在于它是以卡介苗脂質體皮下注射健康豬，使其進行免疫反應，其中所述的卡介苗脂質體是由卡介苗和免疫增強劑混合而得；取免疫健康豬的脾和淋巴結，去脂肪及粘膜，得待處理物，向待處理物中加入生理鹽水，搗碎制取勻漿；將勻漿于一 20 一 30°C反復凍融后經超濾膜超濾，得到的濾液為抗結核多肽粗品；再經白細胞粘附抑制實驗檢測得其白細胞粘附抑制率滿足33. 9-38%的范圍值要求后， 經交聯葡聚糖凝膠層析柱分離純化，冷凍干燥，得到抗結核多肽。
2.根據權利要求1所述的抗結核多肽的免疫制備方法，其特征在于所述免疫增強劑為不完全弗氏佐劑和卵磷脂、殼聚糖兩者中至少一種的混合，當不完全弗氏佐劑和卵磷脂兩者混合時，兩種的質量比為1: O. 2-2，當不完全弗氏佐劑和殼聚糖兩種混合時，兩者的質量比為1:0. 2-1 ;當不完全弗氏佐劑、卵磷脂和殼聚糖三種混合時，三者的質量比為1:O.2~1 :0· 2_0· 8ο
3.根據權利要求1所述的抗結核多肽的免疫制備方法，其特征在于所述的卡介苗脂質體為將卡介苗和免疫增強劑按質量比為1:0. 7-3. 0，混合后超聲處理30-60min而得，其中卡介苗的用量為O. 1-0. 6mg/Kg豬。
4.根據權利要求1所述的抗結核多肽的免疫制備方法，其特征在于所述的注射為每 10天一次,連續注射3 6次。
5.根據權利要求1所述的抗結核多肽的免疫制備方法，其特征在于所述的凍融次數為3 7次。
6.根據權利要求1所述的抗結核多肽的免疫制備方法，其特征在于按重量比計，所述的生理鹽水的用量為待處理物的I 3倍。
7.根據權利要求1所述的抗結核多肽的免疫制備方法，其特征在于所述超濾膜的孔徑為3000 8000道爾頓。
8.根據權利要求1所述的抗結核多肽的免疫制備方法，其特征在于所述交聯葡聚糖凝膠層析柱為交聯葡聚糖凝膠Sephadex G_15層析柱或交聯葡聚糖凝膠Sephadex G_25層析柱。
全文摘要
本發明涉及一種抗結核多肽的免疫制備方法。其特征在于它是以卡介苗脂質體皮下注射健康豬，使其進行免疫反應，其中所述的卡介苗脂質體是由卡介苗和免疫增強劑混合而得；取免疫健康豬的脾和淋巴結，去脂肪及粘膜，得待處理物，向待處理物中加入生理鹽水，搗碎制取勻漿；將勻漿于-20～-30℃反復凍融后經超濾膜超濾，得到的濾液為抗結核多肽粗品；再經白細胞粘附抑制實驗檢測得其白細胞粘附抑制率滿足33.9-38%的范圍值要求后，經交聯葡聚糖凝膠層析柱分離純化，冷凍干燥，得到抗結核多肽。該制備工藝簡便可控，制備的抗結核多肽的白細胞粘附抑制率可達33.9-38%。
文檔編號C07K16/12GK103059134SQ20131001816
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月18日 優先權日2013年1月18日
發明者吳建國, 鄧兆群, 張儒林, 楊小鋼, 劉君炎, 劉勝武, 屈雪菊, 譚秋萍 申請人:武漢輝斯特科技有限公司