抗cd20抗體利妥昔單抗的穩定化的制作方法

抗cd20抗體利妥昔單抗的穩定化的制作方法
【專利摘要】本發明提供經分離穩定的抗CD20抗體和其制造方法以及在診斷與治療動物疾病方面的用途，所述疾病包括人類淋巴瘤、白血病和自體免疫性。
【專利說明】抗CD20抗體利妥昔單抗的穩定化

【背景技術】
[0001] 利妥昔單抗（Rituximab)(也稱為 IDEC-C2B8、RITUXAN、MABTHERA)是嵌合抗 CD20 單克隆抗體，其用于治療非霍奇金氏淋巴瘤（Non-HodgkiY s lymphoma)、慢性淋巴細胞性 白血病、類風濕性關節炎和韋格納氏肉芽腫病（Wegener' s granulomatosis)(顯微鏡下 多血管炎的一種形式）。CD20是在人類B細胞活化期間參與跨膜Ca2+傳導和細胞周期進程 的調節的B淋巴細胞特異性細胞表面分子。CD20首先通過骨髓中的人類前B細胞表達，在 Ig重鏈重組之后顯著表達，其中表達持續到漿細胞分化為止。⑶20在90% B細胞非霍奇 金氏淋巴瘤的表面上表達，但未在造血干細、祖B細胞、正常漿細胞或正常非造血組織上發 現。CD20不從細胞表面脫落并且未在循環中發現游離的CD20抗原。基于體外研究，當前認 為利妥昔單抗Fc結構域補充免疫效應物功能以介導B細胞溶解。
[0002] 抗體是通過免疫系統產生的用于鑒別和中和例如病毒和細菌等外來病原體的蛋 白質分子。由于其極好的結合敏感性和特異性，所以抗體是具有各種治療和診斷用途的有 價值的試劑。抗原是刺激體內合成抗體的分子。當結合到抗原時，抗原可以活化多個可以 用于攻擊贅生性或自體免疫性B細胞的過程，包括例如錨定補體、吞噬抗原攜帶細胞和直 接細胞介導的細胞毒性。
[0003] 然而，與大部分蛋白質分子的情況一樣，抗體需要維持在pH、溫度和溶劑條件的狹 窄范圍內以保持化學和生物穩定性。此外，由于賦予每種抗體其獨特的特異性的氨基酸序 列方面的差異，單獨的抗體在穩定性方面差別很大。近來已經描述了可以增強抗體穩定性 同時維持其抗原結合活性的方法和組合物（參見例如，美國專利申請第13/002013號；公告 號20110130324)。治療性抗體的這種穩定可以改善血清半衰期、降低劑量要求、減少副作 用、改善存放期并降低運送與儲存成本。
[0004] 因此，仍然存在對包括利妥昔單抗在內的所有治療性抗體的穩定形式的長期需 求。


【發明內容】

[0005] 本發明提供經分離穩定的抗CD20抗體，其中（a)所述經分離穩定的抗CD20抗體 輕鏈氨基酸序列包含SEQ ID N0 :1或包含具有以下氨基酸序列變化中的一或多者的SEQ ID NO :1 的變異體：S41Q、S42P、W46L、W46I、S55P、V59A、V59D、S69D、S69N、Y70F 和 A79P ; (b) 所述經分離穩定的抗CD20抗體重鏈氨基酸序列包含SEQ ID NO :2或包含具有以下氨基酸 序列變化中的一或多者的SEQ ID N0 :2的變異體：V37L和M20L、M20L和A92G、Q5V、P7S、 E10G、M20L、M20I、T28S、Y32S、A68F、A68V、T69I、L70I、A72V、K74N、K74T、M81L、S84N、A92G、 附090、41130、￥2631^、￥277142791^和￥3121 ;以及（(：）其中所述經分離穩定的抗〇)20抗體 輕鏈氨基酸序列包含（a)中所列舉的SEQ ID N0 :1中的所述氨基酸序列變化中的至少一 者，或者所述穩定的抗CD20抗體重鏈氨基酸序列包含（b)中所列舉的SEQ ID N0 :2中的 所述氨基酸序列變化中的至少一者。所述經分離穩定的抗CD20抗體和其單獨的免疫球蛋 白輕鏈和重鏈相比于"野生型抗CD20抗體"和其相應單獨的免疫球蛋白輕鏈和重鏈是穩定 的，其中所述"野生型抗CD20抗體"是指具有輕鏈（SEQ ID NO :1)和重鏈（SEQ ID NO :2) 序列（這是基于最初在美國專利第5, 843, 439號中所報導的利妥昔單抗序列，但在本文中 包括重鏈序列的兩個校正）的抗體。
[0006] 本發明還提供經分離核酸，其編碼免疫球蛋白重鏈或輕鏈或兩者，其包含由本發 明提供的所述穩定的抗CD20抗體。本發明提供制造所述穩定的抗CD20抗體的方法。因此， 本發明提供包含表達所述穩定的抗CD20抗體的免疫球蛋白重鏈和輕鏈中的一者或兩者的 載體的細胞。
[0007] 本發明假設根據本發明的經分離穩定的抗CD20抗體包括（不限于）呈以下形式 的抗體：完全抗體、Fv片段、單鏈可變區（ScFv)抗體、單克隆抗體、Fab抗體片段、Fat/抗 體片段或Fab' 2 Fab抗體片段。
[0008] 本發明進一步提供治療患者中的疾病的方法，其包含向所述患者投與治療有效量 的所述穩定的抗CD20抗體中的任何一或多者。在優選實施例中，本發明提供用所述穩定的 抗CD20抗體來治療非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病、類風濕性關節炎、韋格納 氏肉芽腫病和顯微鏡下多血管炎的方法。
[0009] 此外，本發明提供定量檢測患者或生物樣本中的CD20多肽的方法，其包含向所述 患者投與或使所述樣本接觸診斷有效量的由本發明提供的穩定的抗CD20抗體。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1描繪不具有信號序列的野生型抗⑶20抗體輕鏈氨基酸序列SEQ ID N0 :1。
[0011] 圖2描繪不具有信號序列的野生型抗⑶20抗體重鏈氨基酸序列SEQ ID NO :2。序 列是基于由美國專利第5, 843, 439號揭示的抗⑶20序列，其中兩個序列校正通過加單下劃 線和加雙下劃線示出。
[0012] 圖3描繪具有信號序列的野生型抗⑶20抗體輕鏈氨基酸序列SEQ ID N0 :3。
[0013] 圖4描繪具有信號序列的野生型抗⑶20抗體重鏈氨基酸序列SEQ ID NO :4。
[0014] 圖5描繪野生型和變異體抗CD20抗體的毛細管差示掃描熱量測定分析的結果。野 生型抗⑶2認定為樣品RW004。樣品RW005-009由穩定的變異體組成。序列變化和^值示 出在表8中。
[0015] 圖6描繪蛋白質A結合熱挑戰分析的結果。

【具體實施方式】
[0016] 本發明涉及具有增強的穩定性的某些CD20結合抗體、所述抗體的產生和所述抗 體的用途。
[0017] 定義
[0018] "經分離"和"經純化"在本文中可互換地使用并且是指呈某種狀態的分子，其中所 述分子與例如蛋白質、核酸、脂質和多糖等其它生物分子實質上分離。這是相比于此類分子 的正常體內狀態，在正常體內狀態中，所述分子存在于大量其它分子的存在下。
[0019] 如本文中所用，術語"穩定的"、"穩定的蛋白質"和"穩定的多肽"在本文中可互 換地使用并且是指相比于野生型蛋白質（即，不具有所述氨基酸變化的蛋白質），已經產 生了致使蛋白質對例如熱、冷、振動、張力等條件更具有抗性的氨基酸變化的蛋白質，所述 條件傾向于降低蛋白質的正常功能。舉例來說，蛋白質的穩定性與其去折疊的吉布斯自由 能AGu有關，所述AGu與溫度相關。大部分蛋白質的穩定性隨溫度降低；隨著溫度升高， AGu減小并在平衡時變為零，其中折疊和去折疊蛋白質的濃度相同。此時，所述溫度視為 "解鏈溫度"(Tm)。可以使用蛋白質在熒光染料存在下的熱去折疊來評定蛋白質^。雖然不 是平衡方法，但是可以使用所述技術根據相對T m對蛋白質進行排序。（此外參見例如，尼森 F. H. (Niesen F. H.)、伯格倫德 H. (Berglund H.)和維達迪 M. (Vedadi M.):使用差示掃描 突光測定來檢測促進蛋白質穩定性的配體相互作用.（The use of differential scanning f luorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.)〈〈自 然實驗手冊》（Nature Pr〇t〇C〇ls)2007,2:2212-21。）根據本發明的穩定的蛋白質將具有 例如比野生型T m高至少0. 3°C的Tm，優選地比野生型Tm高至少0. 3°C的Tm，更優選地比野生 型Tm高至少0. 5°C的Tm，甚至更是比野生型Tm高至少1. 0°C的Tm，并且甚至更優選地比野 生型Tm高至少5. 01：的Tm，其中Tm通過一般技術者已知的任何合適方法測定。
[0020] "多肽"、"肽"和"蛋白質"在本文中可互換地使用并且是指由通過肽鍵連接的氨基 酸殘基鏈組成的化合物。多肽的"活性部分"意指小于全長多肽，但保留可測量的生物活性 并且保留生物檢測的肽。
[0021] 如本文中所用，術語"腫瘤"是指任何贅生性生長、增殖或細胞團塊，無論良性或惡 性（癌性），無論原發部位病變或轉移。
[0022] 如本文中所用，術語"癌癥"是指由已經丟失對正常生長控制的易感性的細胞的增 殖所引起或以所述增殖為特征的增生性病癥。相同組織類型的癌癥通常起源于相同組織， 并且可以基于其生物特征分成不同亞型。癌癥的四個一般類別是癌瘤（源于上皮細胞）、肉 瘤（源于結締組織或中胚層）、白血病（源于血液形成組織）和淋巴瘤（源于淋巴組織）。 癌癥可以涉及可被感染的身體的每一個器官和組織。癌癥的特定實例（不限制癌癥的定 義）可以包括黑素瘤、白血病、星形細胞瘤、成膠質細胞瘤、成視網膜細胞瘤、淋巴瘤、神經 膠質瘤、霍奇金氏淋巴瘤和慢性淋巴細胞性白血病。可以被各種癌癥感染的器官和組織的 實例包括胰臟、乳房、甲狀腺、卵巢、子宮、睪丸、前列腺、垂體腺、腎上腺、腎、胃、食道、直腸、 小腸、結腸、肝、膽囊、頭頸部、舌、口、眼睛和眼眶、骨頭、關節、腦、神經系統、皮膚、血液、鼻 咽組織、肺、喉、泌尿道、子宮頸、陰道、外分泌腺和內分泌腺。或者，癌癥可以是多中心的或 具有未知的原發部位（CUPS)。
[0023] 如本文中所用，"腫瘤靶向抗體"是指疾病靶向抗體，其中所述疾病是淋巴瘤、白血 病、腫瘤、癌癥、贅瘤等。
[0024] 如本文中所用，"治療有效量"是指減輕（到某種程度，如通過一般熟練的臨床醫 生所判定）哺乳動物中的疾病或病狀的一或多種癥狀的組合物的量。另外，組合物的"治 療有效量"意指部分地或完全地返回到正常的與疾病或病狀相關或導致疾病或病狀的生理 學或生化參數的量。本領域的熟練的臨床醫生可以確定當例如靜脈內、皮下、腹腔內、經口 或通過吸入投與組合物時，為了治療或預防特定疾病病狀或病癥，該組合物的治療有效量。 治療有效所需的組合物的確切量將取決于許多因素，例如，活性劑的比活性、所用的傳遞裝 置、藥劑的物理特性、投藥的目的、外加許多患者特異性考慮因素。但是，根據在本文中所闡 明的本發明的理解，治療有效量的確定在一般熟練的臨床醫生的技能之內。
[0025] 如本文中所用的術語"治療（treating) "、"治療（treatment) "、"療法"和"治療 性治療"全部是指治愈性療法、防治性療法或預防性療法。"預防性療法"的實例是使所靶 向疾病（例如，癌癥或其它增生性疾病）或與其相關的病狀的可能性減少至少5%，優選地 至少10 %，更優選地至少15 %，并且甚至更優選地至少20 %。需要治療的那些包括已經患 有疾病或病狀的那些以及傾向于患有待預防的疾病或病狀的那些。出于對抗疾病或相關病 狀的目的，如本文中所用的術語"治療（treating)"，治療（treatment)"，療法"和"治療 性治療"還描述了哺乳動物的管理和護理，并且包括投與組合物以緩解所述疾病、病狀的癥 狀、副作用或其它并發癥。癌癥的治療性治療包括（但不限于）手術、化學療法、放射線療 法、基因療法和免疫療法。
[0026] 如本文中所用，術語"效應物"、"藥劑"或"藥物"或"治療劑"是指疑似具有治療性 或藥物特性的化學試劑、化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制成的提取物，所述生 物材料例如細菌、植物、真菌或動物（尤其是哺乳動物）細胞或組織。所述藥劑或藥物可以 經純化、實質上純化或部分純化。根據本發明的"藥劑"還包括放射線療法藥劑或"化學治 療劑"（例如，小分子藥物）。
[0027] 如本文中所用，術語"診斷劑"是指允許通過任何合適方法（例如，免疫組織學或 流動式細胞測量術）檢測和/或定量CD20,例如血漿/循環中的CD20的藥劑。
[0028] 如本文中所用，術語"化學治療劑"是指具有抵抗癌癥、贅生性和/或增生性疾病 的活性的化學試劑（例如，小分子藥物）。
[0029] 如本文中所用，術語"放射性治療方案"或"放射線療法"是指投與放射線以殺死癌 細胞。放射線與細胞內的各種分子相互作用，但是導致細胞死亡的初始靶是脫氧核糖核酸 (DNA)。然而，放射線療法通常也引起對細胞膜和核膜以及其它細胞器的損傷。DNA損傷通 常涉及糖-磷酸骨架中的單股和雙股斷裂。此外，可以存在DNA和蛋白質的交聯，其可以擾 亂細胞功能。取決于放射線類型，DNA損傷的機制可以隨相對生物有效性而變化。舉例來 說，重粒子（即，質子、中子）直接損傷DNA并且具有較大的相對生物有效性。然而，電磁輻 射通過主要由細胞水的電離產生的短暫的羥基自由基起作用引起間接電離。放射線的臨床 應用由外射束放射線（來自外部來源）和近接療法（使用植入或插入到患者中的放射線來 源）組成。外射束放射線由X射線和/或Y射線組成，而近接療法采用衰變并發射α粒 子或β粒子以及Υ射線的放射性核。
[0030] 如本文中所用，術語"生物制品"、"生物制劑"、"生物藥劑"、"替代性治療方案" 或"替代性療法"是除手術、化學療法（小分子藥物）或放射線療法以外的療法，包括 例如，受體酪氨酸激酶抑制劑（例如Iressa?(吉非替尼（gefitinib))、Tarceva?(埃羅 替尼（erlotinib))、Erbitux?(西妥昔單抗（cetuximab))、甲橫酸伊馬替尼（imatinib mesilate) (Gleevec?));蛋白體抑制劑（例如硼替佐米（bortezomib) (Velcade?)); VEGFR2抑制劑，例如PTK787 (ZK222584)、極光激酶抑制劑（例如ZM447439);哺乳動物 雷帕霉素革巴（mammalian target of rapamycin;mTOR)抑制劑、環加氧酶-2(C0X_2)抑 制齊U、雷帕霉素抑制劑（例如西羅莫司（sirolimus)、（Rapamune?));法尼基轉移酶抑制 劑(farnesyltransferase inhibitor)(例如，替批法尼(tipifarnib) (Zarnestra?))； 基質金屬蛋白酶抑制劑（例如BAY12-9566;硫酸化多糖替可加蘭（tecogalan));血管生 成抑制劑（例如Avastin?(貝伐單抗（bevacizumab));煙曲霉素（fumagillin)類似物， 例如TNP-4 ;羧胺三唑；BB-94和BB-2516 ;沙利度胺（thalidomide);介白素-12 ;利諾胺 (linomide);肽片段；和血管生長因子與血管生長因子受體的抗體；血小板源性生長因子 受體抑制劑、蛋白激酶C抑制劑、絲裂原活化激酶抑制劑、絲裂原活化蛋白激酶激酶抑制 齊U、羅斯肉瘤（Rouse sarcoma)病毒轉型致癌基因（SRC)抑制劑、組蛋白脫乙酰基酶抑制 齊LI、小缺氧誘導因子抑制劑、刺猬抑制劑（hedgehog inhibitor)、TGF-0信號傳導抑制劑 等。
[0031] 與前述一致，免疫治療劑也應視為替代性治療方案。舉例來說，含有預成型抗體的 血清或Y球蛋白；非特異性免疫刺激佐劑；主動特異性免疫療法；以及過繼性免疫療法。另 夕卜，替代性療法可以包括其它基于生物學的化學實體，例如聚核苷酸，包括反義分子、多肽、 抗體、基因療法載體等。這些替代性治療可以單獨或與在本文中所述的其它治療方案組合 投與。在組合療法中，用于替代性治療方案（包括給藥和投藥方案）中的化學治療劑和其 它藥劑的使用方法也將為本領域一般技術者所知。
[0032] 如本文中所用，如本文中所用的術語"腫瘤定位"或"疾病定位"是指在注射到攜 帶腫瘤的動物中之后，在表達CD20的腫瘤位點中或在所述位點處，抗CD20抗體聚集或濃縮 的程度。腫瘤定位可以通過任何合適的方法測量，包括（但不限于）用熒光染料標記抗體， 將所述熒光抗體注射到具有腫瘤的動物中并測定腫瘤熒光與來自皮膚或遠離任何大體腫 瘤的其它組織的熒光的比率，其中如果所述比率> 20,優選地> 10,更優選地> 5,那么存 在定位。
[0033] 如本文中所用，術語"載體"意指可以包含編碼抗⑶20抗體輕鏈或重鏈或其部分 的序列（即，將"編碼序列"克隆到載體中）并且可以用于細胞的轉型（例如，通過DNA轉染， 因此所述聚核苷酸可以在所述細胞中復制并且例如，可以通過抗生素選擇所述聚核苷酸的 存在）的任何聚核苷酸。因此，如果載體包括可以指導克隆基因的轉錄的控制序列（例如， 啟動子、強化子，同時缺乏抑制因子），那么所述載體可以稱為"能夠表達"被克隆到所述載 體中的基因。如本文中所用，當談到"表達是誘導型"時，這意指可以控制編碼抗⑶20抗體 或其部分的載體序列的轉錄以使得可以開啟或關閉所述轉錄。如果載體序列在細胞中維持 有限的時間段（例如數天），那么細胞可以稱為經載體"短暫轉型";或者如果載體序列在細 胞中無限地維持（尤其是如果選擇如此），那么細胞可以稱為經"穩定轉型"。
[0034] 如本文中所用，術語"序列變化"意指氨基酸或核酸序列中的更改（即，"突變"）。
[0035] 抗 CD20 抗體
[0036] -般來講，抗體由兩個輕鏈和兩個重鏈分子構成；這些鏈形成大體的"Y"形狀，其 中輕鏈和重鏈兩者形成Y的臂并且重鏈形成Y的基底。將輕鏈和重鏈分成具有結構和功能 同源性的結構域。輕（鏈和重（"V H"）鏈兩者的可變結構域決定識別能力和特異 性。輕（"(V'）鏈和重（"CH"）鏈的恒定區結構域賦予重要生物特性，例如，抗體鏈結合、 分泌、經胎盤的流動性、Fc受體結合、補體錨定、調理、活化抗體依賴性細胞毒性（"ADCC"） 等。導致免疫球蛋白基因在產生抗體的細胞中表達的一系列事件是復雜的。可變結構域區 基因序列位于單獨的種系基因片段中，所述基因片段稱為"V H"、"DH "和"JH "或"V，和"叉"。 這些基因片段通過DNA重組連接以形成分別在重鏈和輕鏈中表達的完整V區。重新排列連 接的V片段（'-叉和V H-DH-JH)然后分別編碼輕鏈和重鏈的完整可變區或抗原結合結構域。 (如本文中所用，術語"免疫球蛋白重鏈和輕鏈"、"抗體重鏈和輕鏈"和"重鏈和輕鏈"是可 互換的。）
[0037] 如本文中所用，術語"抗CD20抗體"是特異性識別35, 000道爾頓細胞表面非糖 基化磷蛋白的抗體，所述磷蛋白通常表示為人類B淋巴細胞限制分化抗原Bp35,統稱為 "CD20"。如本文中所用，術語"野生型抗CD20抗體"意指具有免疫球蛋白輕鏈氨基酸序列 SEQ ID N0 :1和免疫球蛋白重鏈氨基酸序列SEQ ID N0 :2或其等效物的⑶20結合抗體，所 述抗體呈Fv片段、單鏈可變區（ScFv)抗體、Fab抗體片段、Fat/抗體片段或Fat/ 2Fab抗 體片段形式。
[0038] 如本文中所用，術語"嵌合"是指抗體包含來自兩種或兩種以上不同物種（例如， 小鼠和人類）的部分。具體來說，當關于抗CD20抗體使用時，所述術語涵蓋最優選地使用 重組脫氧核糖核酸技術產生并且包含人類（包括免疫"相關"物種，例如，黑猩猩）和非人 類組分兩者的抗體：嵌合抗體的恒定區實質上與天然人類抗體的恒定區一致；嵌合抗體的 可變區來源于非人類來源并且具有對CD20細胞表面抗原具有特異性的所需抗原。
[0039] 如本文中所用，短語"免疫活性"當關于嵌合抗CD20抗體使用時，意指抗體結合 人類Clq、錨定補體、調理攜帶CD20的表面細胞、介導人類B淋巴細胞系的補體依賴性溶解 ("⑶C"）并且通過抗體依賴性細胞毒性（"ADCC"）溶解人類靶細胞。
[0040] 利妥昔單抗是具有約145kD的分子量和約8· OnM的⑶20結合親和力的完全抗體 分子。所述抗體結合親和力可以通過一般技術者已知的任何合適方法測定。舉例來說，抗 體與其抗原結合的強度可以通過放射免疫分析（RIA)、ELISA或以柱載體形式結合來評定。 通過增加變性條件或通過與相關抗原或冷抗原競爭進行解離。解離常數Kd可以通過斯卡 查德圖（Scatchard plot)測定（參見例如美國專利第5, 843, 439號和第8, 057, 793號）。
[0041] 近來所描述的用于系統性提高蛋白質穩定性的方法已經揭示于美國專利申請第 13/002, 013號（專利申請公告第20110130324號）中，已經應用于抗體分子單鏈Fv(scFv) 的穩定化。具體來說，使用此方法，可以在抗體輕鏈和重鏈中產生引起穩定化但不顯著影響 抗原結合的氨基酸序列變化。因為所述方法集中于抗體的構架區從而避免修改其結合特 性，因此這是可能的。本發明第一次展示了此穩定化方法適用于全長治療性單克隆抗體。此 多肽穩定化技術利用專有方法來鑒別可能提高抗體穩定性而不影響其結合功能的氨基酸 變化。一般來說，此蛋白質穩定化方法是基于（1)使用已經表征了熱穩定性和熱力學穩定 性的抗體結構域變異體的專有數據庫來評估靶序列和（2)鑒別功能蛋白質、同源蛋白質中 發生的序列變異。
[0042] 因此，本發明提供經分離穩定的抗⑶20抗體和其制造方法與用途，其中（a)所述 經分離穩定的抗CD20抗體輕鏈氨基酸序列或所述輕鏈氨基酸序列的等效物包含SEQ ID NO :1或具有以下氨基酸序列變化中的一或多者的SEQ ID NO :1 :S41Q、S42P、W46L、W46I、 S55P、V59A、V59D、S69D、S69N、Y70F和A79P ; (b)所述經分離穩定的抗CD20抗體重鏈氨基 酸序列或所述重鏈氨基酸序列的等效物包含SEQ ID N0 :2或具有以下氨基酸序列變化中的 一或多者的 SEQ ID NO :2 :V37L 和 M20L、M20L 和 A92G、Q5V、P7S、E10G、M20L、M20I、T28S、 Y32S、A68F、A68V、T69I、L70I、A72V、K74N、K74T、M81L、S84N、A92G、N109D、A113Q、V263L、 V277I、F279L和V312I ; (c)所述經分離穩定的抗⑶20抗體輕鏈氨基酸序列或所述輕鏈氨 基酸序列的所述等效物包含（a)中所列舉的SEQ ID N0 :1中的所述氨基酸序列變化中的至 少一者，或者所述穩定的抗CD20抗體重鏈氨基酸序列或所述重鏈氨基酸序列的所述等效 物包含（b)中所列舉的SEQ ID N0 :2中的所述氨基酸序列變化中的至少一者；和（d)所述 經分離穩定的抗CD20抗體呈完全抗體、Fv片段、單鏈可變區（ScFv)抗體、單克隆抗體、Fab 抗體片段、Fab'抗體片段或Fab' 2 Fab抗體片段形式。"Fv片段"意指通過任何合適的 方式保持在一起的縮短重鏈和輕鏈的任何組合，所述方式包括例如二硫鍵、氨基酸連接序 列或偶聯到兩條鏈的非肽分子。
[0043] 分別通過SEQ ID N0:1和2闡明的輕鏈或重鏈氨基酸序列的"所述等效物"意指 基于局部序列比對并且鑒于其卡巴特（Kabat)或EU殘基編號（參見表1-3)，在所討論的 Fv片段、單鏈可變區（ScFv)抗體、Fab抗體片段、Fab'抗體片段或Fab' 2 Fab抗體片段 的序列中的氨基酸殘基對應于基于如本文中所揭示的SEQ ID N0 :1或2的氨基酸變化。
[0044] 本發明提供經分離穩定的抗CD20抗體和其制造方法與用途，其中所述輕鏈氨基 酸序列包含具有W46L氨基酸變化的SEQ ID N0 :1，以及經分離穩定的抗⑶20抗體，其中 所述重鏈氨基酸序列包含具有以下序列變化中的一者的SEQ ID N0:2:M20L、M20I、M81L、 A92G、N109D 或 V263L。
[0045] 本發明還提供經分離穩定的抗CD20抗體和其制造方法與用途，其中所述輕鏈氨 基酸序列包含具有或不具有W46L或W46I氨基酸變化的SEQ ID N0:1并且所述重鏈氨基酸 序列包含具有M20L、M20I、M81L、A92G、N109D或V263L氨基酸變化的SEQ ID N0 :2 ;所述重 鏈氨基酸序列包含具有M20L、M20I、M81L、A92G和N109D氨基酸變化的SEQIDN0:2 ;以及 所述重鏈氨基酸序列包含具有M20L、M20I、M81L和A92G氨基酸變化的SEQ ID N0:2。
[0046] 本發明進一步提供經分離穩定的抗⑶20抗體和其制造方法與用途，其中當如通 過一般技術者已知的任何合適方法測量，所述抗體的重鏈或輕鏈具有優于野生型抗CD20 抗體的相應重鏈或輕鏈的熱穩定性時，其視為穩定的，所述方法包括例如差示掃描熱量測 定（DSC)、圓二色性（CD)光譜法、熒光發射光譜法、核磁共振（NMR)光譜法、尺寸排阻色譜或 熱挑戰分析。
[0047] 在其它實施例中，本發明提供穩定的抗CD20抗體和其制造方法與用途，其中由于 氨基酸序列變化產生了當與相同數量的野生型抗CD20抗體相比時，具有增強的抗原結合 活性、存放期、血清半衰期、AUC或C max的抗⑶20抗體。
[0048] 本發明提供編碼本文中所述的穩定的抗CD20抗體的輕鏈或重鏈的經分離核酸， 包括例如，其中所述核酸是RNA或DNA。本發明還提供指導所述核酸中的任何一或多者的表 達的經分離載體（即，單、雙或多順反子載體），包括例如，其中所述表達是誘導型。因此，本 發明提供包含這些載體中的一或多者的原核和真核細胞，包括魁並，其中所述細胞是中國 倉鼠卵巢細胞。所述細胞可以經所述載體穩定或短暫轉型并且抗CD20輕鏈和重鏈的表達 可以是組成型或誘導型。
[0049] 本發明提供經分離抗⑶20抗體和其制造方法與用途，其中所述抗⑶20抗體輕鏈 或重鏈氨基酸序列具有其它氨基酸序列變化，所述變化增強抗體結合到CD20分子、錨定補 體、調理CD-20表達細胞、活化抗體依賴性細胞毒性（ADCC)、活化抗體依賴性程序性細胞死 亡、活化巨噬細胞依賴性抗CD20免疫反應、攜帶CD20的細胞對化學療法的敏感性的能力， 或者降低抗CD20抗體錨定補體的能力以及其組合（參見例如美國專利第8, 084, 582號）。
[0050] 本發明提供經分離穩定的抗⑶20抗體和其制造方法與用途，其中所述抗⑶20抗 體偶聯到效應物，包括例如，其中所述效應物是放射性同位素、化學治療劑、毒素、生物反應 調節劑或第二抗體。本發明的經分離抗CD20抗體還包括偶聯到PEG、白蛋白或多唾液酸的 抗CD20抗體和其制造方法與用途。因此，本發明提供藥物組合物，其包含本文中所述的穩 定的抗CD20抗體中的任一者和藥學上可接受的載劑。
[0051] 為了避免免疫原性和免疫反應，通常優選使用人類化CD20結合抗體或合適的片 段，例如Fab'、Fab或Fab2。人類化抗體或其片段可以通過任何合適的方法產生，包括例 如：1)可以使用人類IgG骨架，用抗CD20的抗體的可變CDR區替換所述可變CDR區來構造 人類化抗體，其中重鏈和輕鏈在單獨的啟動子下獨立地表達或在具有IRES序列的一個啟 動子下共表達；2)可以使用經工程改造具有人類免疫系統的小鼠產生抗CD20的人類化單 克隆抗體；3)可以使用噬菌粒（M13, λ大腸桿菌噬菌體，或能夠表面呈現的任何噬菌體系 統）產生抗CD20的人類化抗體。可以通過所述重鏈和輕鏈在例如CH0或293細胞等哺乳 動物細胞中共表達來實現完全抗體的表達。類似地，Fab'、Fab或Fab2片段和單鏈抗體可 以使用一般技術者已知的任何合適的方法制備。
[0052] 使單克隆抗體人類化存在四個通用步驟。這些步驟是：（1)測定起始抗體輕和重 可變結構域的核苷酸和所預測的氨基酸序列；(2)設計人類化抗體，S卩，決定在人類化工藝 期間使用何種抗體構架區；(3)實際的人類化方法/技術；以及（4)人類化抗體的轉染和表 達。參見例如美國專利第4, 816, 567號；第5, 807, 715號；第5, 866, 692號；第6, 331，415 號；第 5, 530, 101 號；第 5, 693, 761 號；第 5, 693, 762 號；第 5, 585, 089 號；第 6, 180, 370 號；以及第6, 548, 640號（其特此以引用的方式并入）。舉例來說，如果所述抗體用于人類 的臨床試驗和治療中，那么可以使所述恒定區工程改造以更類似于人類恒定區，從而避免 免疫反應。參見例如美國專利第5, 997, 867號和第5, 866, 692號（其特此以引用的方式并 入）。
[0053] 或者，可以通過噬菌體呈現技術重組地篩選并制造抗體。參見例如美國專利 第5, 565, 332號；第5, 580, 717號；第5, 733, 743號和第6, 265, 150號（其特此以引用 的方式并入）。或者，可以使用噬菌體呈現技術（麥卡弗蒂（McCafferty)等人，《自然》 (Nature) 348 :552-553(1990))來體外制造人類抗體和抗體片段。
[0054] 穩定的抗⑶20抗體的產生
[0055] 通過"定點突變誘發"產生由本發明提供的穩定的抗CD20抗體。定點突變誘發是 允許DNA序列在特異位點變化以產生預定新序列的已建立的重組DNA技術。可以根據本發 明使用任何合適的定點突變誘發技術。一種例示性合適的定點突變誘發技術是寡核苷酸錯 配突變誘發。此技術使用體外DNA合成以將預定單核苷酸變化引入克隆基因中。通用方法 涉及將所述基因或cDNA克隆到M13或準許恢復單股重組DNA的噬菌粒載體中。然后設計 突變誘發寡核苷酸，其序列與待突變區域中的基因序列互補，但具有單核苷酸差異，既定突 變位點。突變誘發寡核苷酸起作用為新DNA合成做準備，產生含有所需突變的互補全長序 列。允許突變體和野生型序列退火形成異雙螺旋。這些異雙螺旋用于使細胞轉型，并且所 需突變體基因可以通過篩選突變加以鑒別。
[0056] 通過PCR進行的定點突變誘發對于一般技術者是眾所周知的并且存在許多實現 堿基取代、缺失和插入的合適策略。一種此類合適的定點突變誘發PCR技術采用含有所需 序列變化的經修飾PCR引物。PCR引物序列簡單地替換原始序列（只要變化小到足以使 引物退火到既定靶即可）（參見例如門脅H(Kadowaki H)等人："使用通過Taq DNA聚合酶 催化的聚合酶鏈式反應進行位點特異性突變誘發（Use of polymerase chain reaction catalysed by Taq DNA Polymerase for site-specific mutagenesis)，'，〈〈基因〉〉（Gene) (1989)76(1) :161-166)。
[0057] "重疊延伸PCR"是另一種合適的并且例示性的定點突變誘發技術，使用巢式PCR 引物使靶區域突變。使用互補PCR引物和聚合酶鏈式反應來產生兩個具有重疊末端的DNA 片段。這些片段在后續'融合'反應中合并，其中重疊末端退火，允許每一股的3'重疊充當 互補股的3'延伸的引物。所得融合產物通過PCR進一步擴增。可以通過將核苷酸變化并入 重疊引物中而在核苷酸序列中引入特異性更改。（參見例如Ho SN等人："通過使用聚合酶 鏈式反應重疊延伸的定點突變誘發（Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction)，'，《基因》（1989) 77 (1) :51_59〇 )
[0058] 又另一種合適的并且例示性的定點突變誘發技術使用"反向PCR"。此技術用 于使質粒突變。其采用兩個背靠背引物來擴增整個質粒并且然后將線性產物接合回到 環狀形式。可以通過更改引物序列含有所需突變來改變引物結合區。（參見例如赫姆斯 利A(Hemsley A)等人："使用聚合酶鏈式反應進行定點突變誘發的簡單方法（A simple method for site-directed mutagenesis using the polymerase chain reaction)，'，〈〈核 酸研究》（Nucleic Acids Res. )(1989) 17(16) :6545-6551。）
[0059] 可以使用具有編碼包含氨基酸序列SEQ ID NO :1或2或者SEQ ID NO :1或2的部 分的多肽的核酸序列的任何合適的聚核苷酸作為根據本發明定點突變誘發的起始物質。美 國專利第5, 843, 439號（其特此以引用的方式如同其在本文中整體闡述般并入）中所揭示 的具有編碼包含氨基酸序列SEQ ID N0 :1或2或者SEQ ID N0 :1或2的部分的多肽的核酸 序列的聚核苷酸非常適合作為根據本發明定點突變誘發的起始物質。
[0060] 評估熱穩定性
[0061] 熱穩定性可以通過使用任何合適的技術測量本發明組合物的解鏈溫度（Tm)進行 評估。解鏈溫度是熱轉化曲線中點的溫度，其中50%的組合物分子呈折疊狀態。
[0062] 熱穩定性可以通過熱量測定加以評估。一種例示性量熱方法是差示掃描熱量測 定（DSC)。DSC采用對伴隨大部分蛋白質或蛋白質結構域的去折疊發生的吸熱敏感的量 熱計（參見例如桑切斯·魯伊斯（Sanchez-Ruiz)等人，《生物化學》（Biochemistry), 27 : 1648-52,1988,其特此以引用的方式引用并入）。為了測定蛋白質的熱穩定性，將具有所述 蛋白質的樣品插入到量熱計中并升高溫度直到抗體輕鏈或重鏈去折疊為止。蛋白質去折疊 時的溫度指示整體蛋白質穩定性。
[0063] 熱穩定性可以通過分析光譜法評估。一種例示性分析光譜方法是圓二色性（⑶） 光譜法。CD光譜法測量組合物的光學活性隨溫度增加的變化。圓二色性（CD)光譜法測量 由于結構不對稱性而出現的左旋偏振光對比右旋偏振光的吸收差異。無序或去折疊結構 產生極不同于有序或折疊結構的CD光譜。CD光譜反映了蛋白質對增加溫度的變性作用的 敏感性并且因此指示蛋白質的熱穩定性（參見例如范?米爾洛（van Mierlo)和斯滕斯瑪 (Steemsma)，《生物技術雜志》（J. Biotechnol.)，79 (3) :281-98, 2000)。
[0064] 用于測量熱穩定性的另一種例示性分析光譜方法是熒光發射光譜法。用于評估熱 穩定性的基于熒光的方法監控固有熒光團（例如色氨酸和酪氨酸氨基酸）或外源性熒光團 (例如ANS或SYPR0橙染）在熱去折疊之后的熒光變化。（參見例如，尼森F. H.、伯格倫德 H.和維達迪M.:使用差示掃描熒光測定來檢測促進蛋白質穩定性的配體相互作用.《自然 實驗手冊》2007,2:2212-21。）用于測量抗體輕鏈或重鏈熱穩定性的又另一種例示性分析 光譜方法是核磁共振（NMR)光譜法（參見例如范?米爾洛和斯滕斯瑪，《生物技術雜志》， 79(3) :281-98, 2000)。
[0065] 組合物的熱穩定性還可以生化方式測量。用于評定熱穩定性的一種例示性生化方 法是熱挑戰分析。在"熱挑戰分析"中，使本發明的組合物經歷一系列高溫，持續所設定的 時間段。舉例來說，可以使測試抗體、輕鏈或重鏈分子、scFv分子或包含scFv分子的分子 經歷一系列逐漸增加的溫度，例如持續〇. 1-1. 5小時。然后通過相關生化分析來分析蛋白 質的活性。舉例來說，如果蛋白質是結合蛋白（例如，結合到蛋白質A)，那么所述結合蛋白 的結合活性可以通過功能分析或定量ELISA測定。
[0066] 另外，此類分析可以一種高通量形式完成。舉例來說，此類實施例，可以使用本領 域中已知的方法產生scFv變異體的文庫。可以誘導scFv表達并且可以使scFvs經歷熱挑 戰。可以分析受挑戰的測試樣品的結合并且那些穩定的scFv可以按比例擴大并進一步表 征。
[0067] 在相關技術中，通過使用分析量熱技術（例如DSC)測量本發明組合物的比熱或熱 容（Cp)來評估熱穩定性。組合物的比熱是lmol水的溫度升高1°C所需的能量（例如，以 kcal/mol為單位）。由于大Cp是變性或失活蛋白質組合物的特點。通過在組合物熱轉化之 前和之后測定其比熱來測量組合物的熱容變化（SCp)。在其它實施例中，熱穩定性可以通 過測量或測定其它熱力學穩定性參數來評估，所述參數包括去折疊的吉布斯自由能（S G)、 去折疊的焓（S H)或去折疊的熵（δ S)。
[0068] 制造穩定的抗⑶20抗體
[0069] 由本發明提供的穩定的抗CD20抗體可以使用一般技術者眾所周知的技術合成、 檢測、定量和純化。舉例來說，表達構成穩定的抗CD20抗體的輕鏈和重鏈的多肽的細胞可 以通過一般技術者眾所周知的方法，通過在強啟動子/翻譯起始信號的控制下，將經轉染 或轉型的載體中的cDNA放到合適的原核或真核細胞中以驅動構成穩定的抗CD20抗體的輕 鏈和重鏈的多肽的表達而產生。
[0070] 或者，構成穩定的抗CD20抗體的輕鏈和重鏈的多肽可以通過一般技術者眾所周 知的方法以化學方式制成。構成穩定的抗CD20抗體的輕鏈和重鏈的多肽可以通過標準固 相合成制備。正如一般技術者通常所已知，具有必需長度的肽可以使用可商購的設備和試 齊U，遵循制造商的說明書阻斷干擾基團，保護待反應的氨基酸，偶聯，脫除保護基以及對未 反應殘基進行封端來制備。舉例來說，輕鏈和重鏈肽可以使用標準自動化固相合成方案， 采用具有恰當的側鏈保護的叔丁氧羰基-氨基酸合成。從固相載體移出所完成的肽，同 時使用標準的氟化氫方法脫除側鏈保護基。通過半制備型逆相HPLC(Vydac C18)，使用在 0.1%三氟乙酸（TFA)中的乙腈梯度進一步純化粗肽。使所述肽真空干燥以去除乙腈并從 0. 1% TFA于水中的溶液凍干。可以通過分析型RP-HPLC檢驗純度。可以凍干所述肽并且 然后將其按重量計以l_2mg/mL的濃度溶解在水或0. 01M乙酸中。合適的設備可以例如從 加利福尼亞州福斯特市的應用生物系統公司（Applied BioSystems，Foster City,CA)或加 利福尼亞州圣拉菲爾（San Raphael, CA)的生物谷獵頭公司（Biosearch Corporation)獲 得。
[0071] 本發明還提供重組載體，其包含控制聚核苷酸序列的表達的元件，所述聚核苷酸 序列編碼構成穩定的抗CD20抗體的輕鏈和重鏈的多肽中的一者或兩者。另外，本發明提 供包含編碼此類多肽的核酸的細胞，其中所述細胞是原核細胞或真核細胞。微生物和組織 培養的方法對熟練技術人員是眾所周知的（參見例如薩姆布魯克（Sambrook)和拉塞爾 (Russell)，《分子克隆實驗指南》（Molecular Cloning :A Laboratory Manual)，冷泉港實 驗室出版社，紐約（2001)，第16. 1頁到第16. 54頁）。本發明因此提供制造構成穩定的抗 CD20抗體的輕鏈和重鏈的多肽的方法，其包含：（a)用編碼穩定的抗CD20抗體的輕鏈和/ 或重鏈多肽的核酸使細胞轉型；(b)誘導轉型細胞表達這些多肽；(c)純化多肽；以及（d) 組裝功能抗體。
[0072] 多肽表達取決于RNA轉錄水平，RNA轉錄水平又通過DNA信號調節。類似地，mRNA 的翻譯起碼需要AUG起始密碼子，其通常位于編碼序列的5'末端的10到100個核苷酸內。 已經顯示側接AUG起始密碼子的序列影響其識別。舉例來說，關于通過真核核糖體識別，包 埋在與完美的"克扎克共有（Kozak consensus)"序列一致的序列中的AUG起始密碼子產 生最佳翻譯（參見例如克扎克，《分子生物學雜志》（J. Molec. Biol.) 196 :947-950 (1987))。 此外，外源核酸在細胞中的成功表達可能需要所得蛋白質的翻譯后修飾。
[0073] 本文中所述的核酸分子優選地包含可操作地連接到合適啟動子、例如在真核細胞 中起作用的啟動子的編碼區域。可以在本發明中使用病毒啟動子，例如（不限于）RSV啟動 子和腺病毒主要晚期啟動子。合適的非病毒啟動子包括（但不限于）磷酸甘油酸激酶（PGK) 啟動子和延伸因子Ια啟動子。非病毒啟動子宜來源于宿主細胞物種。其它合適的遺傳元 件（其中許多是本領域中已知的）也可以連接到或插入到本發明核酸和構造體中以提供其 它功能、表達水平或表達模式。
[0074] 另外，本文中所述的核酸分子可以可操作地連接到強化子以促進轉錄。強化子是 刺激相鄰基因轉錄的DNA的順式作用元件。在來自許多物種的多個不同細胞類型中賦予連 接基因高轉錄水平的強化子實例包括（不限于）來自SV40的強化子和RSV-LTR。這些強化 子可以與具有細胞類型特異性效應的其它強化子組合，或可以單獨使用任何強化子。
[0075] 為了優化蛋白質在真核細胞中的產生，本發明核酸分子可以進一步包含在核酸分 子的編碼區域之后的聚腺苷酸化位點。如果需要，還可以將外源核酸并入剪接位點（即，剪 接受體和剪接供體位點）以促進mRNA產生同時維持框內全長轉錄物。另外，本發明核酸分 子可以進一步包含用于加工、分泌、細胞內定位等的恰當序列。
[0076] 可以將核酸分子插入到任何合適載體中。合適載體包括（不限于）病毒載體。合 適的病毒載體包括（但不限于）反轉錄病毒載體、α病毒、牛痘、腺病毒、腺相關病毒、皰疹 病毒和禽痘病毒載體。載體優選地具有天然或工程改造能力以使例如CH0-K1細胞等真核 細胞轉型。另外，適用于本發明情況下的載體可以是"裸"核酸載體，例如質粒或游離基因 體，或所述載體可以與其它分子復合。可以適當地與本發明核酸組合的其它分子包括（不 限于）病毒衣、陽離子脂質、脂質體、多元胺、金粒子和靶向部分（例如配體、受體），或靶向 細胞分子的抗體。
[0077] 本文中所述的核酸分子可以經轉型到任何合適的細胞中，通常是真核細胞，例如 CH0、ΗΕΚ293或ΒΗΚ，合乎需要地引起輕鏈或重鏈多肽的表達，所述多肽例如包含如在此所 述的SEQ ID Ν0 :1或2或其變異體或同源物的多肽。可以培養所述細胞以提供核酸分子的 表達。
[0078] 因此，本發明提供經本文中所述的本發明核酸分子轉型或轉染的細胞。用外源DNA 分子使細胞轉型或轉染的方式在本領域中是眾所周知的。舉例來說（但不限于），使用在本 領域中眾所周知的標準轉型或轉染技術將DNA分子引入到細胞中，所述技術例如磷酸鈣或 DEAE-葡聚糖介導的轉染、裸細胞融合、電穿孔、脂質體、陽離子脂質和直接顯微注射（參見 例如薩姆布魯克和拉塞爾，《分子克隆實驗指南》，冷泉港實驗室出版社，紐約（2001)，第1. 1 頁到第1. 162頁，第15. 1頁到第15. 53頁，第16. 1頁到第16. 54頁）。
[0079] 轉型方法的另一實例是原生質體融合方法，將來源于攜帶大量相關質粒的拷貝的 細菌的原生質體與培養的哺乳動物細胞直接混合。在細胞膜（通常與聚乙二醇）融合之后， 細菌的內容物傳遞到哺乳動物細胞的細胞質中，并且質粒DNA轉移到細胞核。
[0080] 電穿孔將短暫的高壓電脈沖施加到各種哺乳動物和植物細胞，促使在質膜中形成 納米級孔。DNA穿過這些孔或由于伴隨所述孔的閉合發生的膜組分重新分布而被直接帶到 細胞質中。電穿孔可以是極其有效的并且可以用于克隆基因的短暫表達和建立攜帶相關基 因的整合拷貝的細胞系兩者。
[0081] 這些技術可以用于真核細胞的穩定和短暫轉型兩者。穩定轉型細胞的分離需要引 入可選擇標記以及用相關基因轉型。這些可選擇標記包括賦予針對新霉素的抗性的基因以 及HPRT陰性細胞中的HPRT基因。或者，可以使用含有DHFR的載體在例如CH0-DG44等DHFR 陰性細胞中制造穩定轉化株。選擇可能需要在選擇培養基中長期培養，至少持續約2-7天， 優選持續至少約1-5周（參見例如薩姆布魯克和拉塞爾，《分子克隆實驗指南》，冷泉港實驗 室出版社，紐約（2001)，第16. 1頁到第16. 54頁）。可以使用依賴于將抗體構造體插入到 轉錄活性區域或系統中的表達系統獲得具有高抗體產率的真核細胞系，所述轉錄活性區域 或系統將抗體基因連接到可擴增基因（例如DHFR)。
[0082] 穩定的抗⑶20抗體多肽的輕鏈或重鏈可以從重組宿主細胞表達和純化。重組宿 主細胞可以是原核細胞或真核細胞，包括（但不限于）細菌，例如大腸桿菌（E.coli);真菌 細胞，例如酵母；昆蟲細胞，包括（但不限于）源于果蠅和蠶的細胞系；以及哺乳動物細胞 和細胞系。
[0083] 關于原核生物中的最佳多肽表達必須考慮的問題包括所用表達系統、宿主菌 株的選擇、mRNA穩定性、密碼子偏倚、包涵體形成和預防、融合蛋白和位點特異性蛋白水 解、區室定向分泌。（參見例如索倫森（Sorensen)等人，《生物技術雜志》（Journal of Biotechnology) 115(2005) 113-128,其特此以引用的方式并入）。
[0084] 通常從由系統相容遺傳背景所持有的質粒誘導表達。表達質粒的遺傳元件包括復 制來源（ori)、抗生素抗性標記、轉錄啟動子、翻譯起始區（TIR)以及轉錄和翻譯終止子。 [0085] 可以使用任何合適的表達系統，例如大腸桿菌有助于通過其相對簡單性、高密度 培養、眾所周知的遺傳學和可用于多肽表達的大量相容工具進行蛋白質表達，所述工具包 括各種可獲得的質粒、重組融合搭配物和突變體菌株。用于重組表達的大腸桿菌菌株或遺 傳背景是非常重要的。表達菌株在大部分有害的天然蛋白酶中應該是缺乏的，穩定地維持 表達質粒并且賦予表達系統相關的遺傳元件（例如DE3)。
[0086] 質粒拷貝數量通過優選地以放松的方式復制的復制來源加以控制。存在于現代 表達質粒中的ColEl復制子來源于pBR322(拷貝數量15-20)或pUC(拷貝數量500-700) 質粒家族，然而P15A復制子來源于pACYC184 (拷貝數量10-12)。重組表達質粒中最 常見的藥物抗性標記賦予針對氨節西林（ampicillin)、卡那霉素（kanamycin)、氯霉素 (chloramphenicol)或四環素（tetracycline)的抗性。
[0087] 合適的大腸桿菌表達系統包括（但不限于）通用pUC載體、基于T7的pET表達 系統（新澤西州吉布斯鎮的EMD化學藥品公司（EMD Chemicals Inc.，Gibbstown，NJ);特 拉華州威明頓的安捷倫技術公司（Agilent Technologies, Inc. , Wilmington, DE))、λ PL 啟動子/cl抑制因子（例如，pLEX(紐約格蘭德島的生命技術（Life Technologies，Grand Island，NY)))、Trc啟動子（例如，pTrc(新澤西州皮斯卡塔韋的通用電氣醫療集團生物科 學（GE Healthcare Biosciences，Piscataway，NJ)))、Tac 啟動子（例如，pGEX(新澤西州 皮斯卡塔韋的通用電氣醫療集團生物科學））和混合lac/T5 (例如，pQE (加利福尼亞州巴 倫西亞的凱杰（Qiagen，Valencia，CA)))和BAD啟動子（例如，pBAD(紐約格蘭德島的生命 技術））。
[0088] 從所轉錄的信使RNA的翻譯起始區（TIR)起始的翻譯需要核糖體結合位點（RBS)， 其包括夏因-達爾加諾（Shine-Dalgarno ;SD)序列和翻譯起始密碼子。夏因-達爾加諾序 列位于起始密碼子上游7±2個核苷酸處，所述起始密碼子是有效重組表達系統中的典型 AUG。最佳翻譯起始從具有SD序列UAAGGAGG的mRNA獲得。
[0089] 大腸桿菌中的密碼子使用由細胞質中可獲得的同源氨基酰化tRNA的水平反映。 主密碼子出現在高度表達基因中而次密碼子或罕用密碼子傾向于在以低水平表達的基因 中。大腸桿菌中罕用的密碼子通常在來自例如真核細胞、古菌和具有不同密碼子頻率偏好 的其它遠親生物體等來源的異源基因中是豐富的。含有罕用密碼子的基因的表達會由于核 糖體在需要并入偶聯到次密碼子tRNA的氨基酸的位置處停止而導致翻譯誤差。當轉錄物 含有成簇的罕用密碼子，例如大量雙聯體和三聯體累積時，密碼子偏倚問題在重組表達系 統中變得非常普遍。當在非人類細胞中表達穩定的抗CD20抗體多肽的輕鏈或重鏈時，無論 體外或體內，可以針對給定細胞類型（即物種）優化針對編碼所述肽的這些聚核苷酸所選 擇的密碼子。許多密碼子優化技術是本領域中已知的（參見例如賈亞拉杰（Jayaraj)等人， 《核酸研究》33 (9) :3011-6(2005);福格桑（Fuglsang)等人，《蛋白質表達與純化》（Protein Expr.Purif. )31(2) :247-9 (2003)) 〇
[0090] 蛋白質活性需要折疊成精確的三維結構。例如熱休克等應激情況削弱體內折疊并 且折疊中間體傾向于結合成稱為包涵體的非晶蛋白質顆粒。
[0091] 包涵體是一組結構上復雜的聚集體，通常在高速表達重組蛋白質時作為應激反應 發生而被察覺到。大腸桿菌細胞質中200-300mg/ml濃度的蛋白質的大分子擁擠表明高度 不利的蛋白質折疊環境，尤其在重組高水平表達期間。包涵體是否是通過去折疊鏈上的暴 露斑點之間的疏水性相互相用或通過特定的成簇機制發生的消極事件形成的尚未知曉。經 純化聚集體可以使用如脲和胍鹽酸鹽等清潔劑溶解。功能蛋白可以通過稀釋、透析或柱上 再折疊方法，通過從溶解的包涵體體外再折疊制備。再折疊策略可以通過包含分子伴隨蛋 白加以改良。然而，針對指定蛋白質優化再折疊程序耗時費力并且并不總是有助于高產品 產量。防止包涵體形成的可能策略是分子伴隨蛋白的共過度表達。
[0092] 為了簡化重組蛋白質的純化和表達，已經研發了各種蛋白質融合搭配物。融合蛋 白或嵌合蛋白通常包括通過特異性蛋白酶的識別位點連接于乘客蛋白或靶蛋白的伴侶或 "標簽"。大部分融合搭配物用于特異性親和純化策略。融合搭配物在體內也是有利的，其 中所述融合搭配物可以保護乘客免遭細胞內蛋白水解，增強溶解度或用作特異性表達報導 子。高表達水平通常可以從N端融合搭配物轉移到不良表達乘客，最有可能是由于mRNA穩 定化。常見親和力標簽是多組氨酸標簽（His-tag)，其可與固定化金屬親和色譜（IMAC)和 用于在基于谷胱甘肽的樹脂上純化的谷胱甘肽S-轉移酶（GST)標簽相容。存在若干其它 親和力標簽并已進行廣泛地綜述。
[0093] 重組表達蛋白原則上可以針對三個不同位置，即細胞質、周質或培養基。各種優點 和缺點與重組蛋白朝向特異性細胞區室的方向有關。在細胞質中表達通常是優選的，因為 產物產量高。二硫鍵形成在大腸桿菌中被隔離并且在周質中通過Dsb系統有效地催化。或 者，可以使用trxB和gor菌株。半胱氨酸在細胞質中的還原通過硫氧還蛋白和谷氧還蛋白 實現。硫氧還蛋白通過硫氧還蛋白還原酶保持還原并且谷氧還蛋白通過谷胱甘肽保持還 原。低分子量谷胱甘肽分子通過谷胱甘肽還原酶還原。編碼兩種還原酶的trxB和gor基 因的破壞允許在大腸桿菌細胞質中形成二硫鍵。
[0094] 已經關于許多不同的原核和真核系統描述了用于體外基因表達和蛋白質合成的 無細胞系統（參見例如遠藤（Endo)和澤崎（Sawasaki)《生物技術新見》(Current Opinion in Biotechnology) 2006,17 :373-380)。從含有用于體外轉錄RNA模板的翻譯所需的所有 組分的粗提取物制備例如兔網織紅細胞裂解物和小麥胚芽提取物等無真核細胞系統。無 真核細胞系統使用體內或體外合成的經分離RNA作為翻譯反應的模板（例如，兔網織紅細 胞裂解物系統或小麥胚芽提取物系統）。偶聯無真核細胞系統將原核噬菌體RNA聚合酶與 真核提取物組合，并使用外源DNA或PCR產生的模板與噬菌體啟動子用于體外蛋白質合成 (例如，TNT?偶聯網織紅細胞裂解物）。
[0095] 穩定的抗⑶20抗體多肽的經純化輕鏈或重鏈的溶解度可以通過本領域中已知的 方法加以改良。舉例來說，為了增加所表達蛋白質（例如，在大腸桿菌中）的溶解度，可以 通過以下各者降低蛋白質合成速率：降低生長溫度、使用較弱啟動子、使用較少拷貝數量的 質粒、降低誘導物濃度、改變生長培養基，如喬治烏（Georgiou)和瓦拉（Valax)，《生物技術 新見》(Current Opinion Biotechnol.) 7 :190-197(1996)中所述。這降低蛋白質合成速率 并且通常獲得可溶性更大的蛋白質。還可以添加用于恰當折疊或用于蛋白質穩定性所必需 的輔基或輔因子，或添加緩沖液以在生長期間控制培養基中的pH波動，或添加1%葡萄糖 以抑制lac啟動子被乳糖誘導，所述乳糖存在于大部分豐富培養基（例如LB、2xYT)中。還 可以向培養基中添加多元醇（例如，山梨糖醇）和蔗糖，因為通過這些添加所引起的滲透壓 增加促使滲透保護劑在細胞中積累，其穩定天然蛋白質結構。可以添加乙醇、低分子量硫醇 和二硫化物以及NaCl。另外，伴隨蛋白和/或折疊酶可以與所需多肽共表達。分子伴隨蛋 白通過與折疊中間體短暫地相互作用而促進恰當異構化和細胞靶向。大腸桿菌伴隨蛋白系 統包括（但不限于）：GroES-GroEL、DnaK-DnaJ-GrpE、CIpB、FkpA、Skp。周質肽基-脯氨酰 基順式，反式-異構酶FkpA是尤其合適的。
[0096] 折疊酶沿著折疊路徑加快了速率限制步驟。三種類型的折疊酶起重要作用：肽基 脯氨酰基順式/反式異構酶（ΡΡΓ S) (FkpA)、二硫鍵氧化還原酶（DsbA)和二硫鍵異構酶 (DsbC)，蛋白質二硫鍵異構酶（roi)是一種真核蛋白質，其催化蛋白質半胱氨酸氧化和二 硫鍵異構化兩者。這些蛋白質中的一或多者與靶蛋白的共表達可以產生較高水平的可溶性 靶蛋白。
[0097] 穩定的抗CD20抗體多肽的輕鏈或重鏈能夠以融合蛋白形式產生以便改善其溶解 度和產量。融合蛋白包含穩定的抗CD20抗體多肽和一起融合在框內的第二多肽的輕鏈或 重鏈。第二多肽可以是本領域中已知的用于提高與其融合的多肽的溶解度的融合搭配物， 例如NusA、細菌鐵蛋白（BFR)、GrpE、硫氧還蛋白（TRX)、麥芽糖結合蛋白（MBP)和谷胱甘 肽-S-轉移酶（GST)。諾瓦根公司（Novagen Inc.)(威斯康星州麥迪遜（Madison，WI))提 供pET43. 1載體系列，其允許形成NusA-靶融合。DsbA和DsbC在用作融合搭配物時也已經 顯示出對表達水平的正效應，因此可以用于與肽配體結構域融合以實現較高溶解度。
[0098] 在這些融合蛋白的一個方面，穩定的抗⑶20抗體多肽的表達輕鏈或重鏈包括連 接子多肽，所述連接子多肽包含蛋白酶裂解位點，所述蛋白酶裂解位點包含可通過蛋白酶 水解的肽鍵。因此，多肽中的肽配體結構域可以在表達之后通過蛋白水解與多肽的其余部 分分離。連接子可以包含在還結合有蛋白酶的催化位點的鍵的任一側上的一或多個其它 氨基酸（參見例如謝克特（Schecter)和伯杰（Berger),《生物化學與生物物理研究通訊》 (Biochem. Biophys. Res. Commun.) 27,157-62 (1967))。或者，連接子的裂解位點可以與蛋 白酶的識別位點隔開并且兩個裂解位點和識別位點可以通過一或多個（例如兩個到四個） 氨基酸隔開。在一個方面，所述連接子包含至少約2、3、4、5、6、7、8、9、約10、約20、約30、約 40、約50或50個以上氨基酸。更優選地，所述連接子的長度是約5到約25個氨基酸，并且 最優選地，所述連接子的長度是約8到約15個氨基酸。
[0099] 舉例來說，通常與細菌產生的融合蛋白一起使用的合適的蛋白酶包括煙草蝕刻病 毒（TEV)蛋白酶、因子Xa蛋白酶、凝血酶和腸激酶。可用于本發明的一些蛋白酶在以下參考 文獻中有所討論：胡珀（Hooper)等人，《生物化學雜志》(Biochem. J.) 321 :265-279(1997); 韋布（Werb)，《細胞》91 :439-442(1997);沃爾夫斯貝格（Wolfsberg)等人，《細胞生物學雜 志》（J. Cell Biol.) 131 :275-278(1995);穆拉卡米（Murakami)和埃特林格（Etlinger)， 《生物化學與生物物理研究通訊》(Biochem. Biophys. Res. Comm.) 146 :1249-1259 (1987)。細 胞表面蛋白酶也可以與根據本發明的可裂解連接子一起使用并且包括（但不限于）：氨基 肽酶N ;嘌呤霉素敏感性氨基肽酶；血管收縮素轉化酶；焦谷氨酰肽酶II ;二肽基肽酶IV ; N-精氨酸二堿轉化酶；內肽酶24. 15 ;內肽酶24. 16 ;類淀粉前驅蛋白分泌酶α、β和γ ; 血管收縮素轉化酶分泌酶；TGFa分泌酶；TNFa分泌酶；FAS配體分泌酶；TNF受體-I和 TNF受體-II分泌酶；⑶30分泌酶；KL1和KL2分泌酶；IL6受體分泌酶；⑶43、⑶44分泌酶； CD16-I和CD16-II分泌酶；L-選擇素分泌酶；葉酸受體分泌酶;MMP1、2、3、7、8、9、10、11、 12、13、14和15 ;尿激酶纖維蛋白溶酶原活化劑；組織纖維蛋白溶酶原活化劑；纖維蛋白溶 酶；凝血酶；BMP-1(原膠原C-肽酶）；ADAM1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11 ;以及顆粒酶A、B、 C、D、E、F、G 和 Η。
[0100] 依賴于細胞相關蛋白酶的替代方案是使用自裂解連接子。舉例來說，可以使用口 蹄疫病毒（FMDV)2A蛋白酶作為連接子。這是具有17個氨基酸的短多肽，其在2Α/2Β接合 點裂解FMDV的多蛋白。FMDV2A前肽的序列是NFDLLKLAGDVESNPGP。裂解發生在最終甘氨 酸-脯氨酸氨基酸對處肽的C端并且與其它FMDV序列的存在無關，并且甚至在異源序列存 在下裂解。
[0101] 親和色譜法可以單獨或與離子交換、分子篩分或HPLC色譜技術結合用于純化構 成穩定的抗CD20抗體的輕鏈和重鏈的多肽。這些色譜方法可以使用管柱或以分批形式進 行。這些色譜純化方法在本領域中是眾所周知的。
[0102] 抗⑶20抗體的大規模生產
[0103] 存在兩種主要類型的生物產物的重組表述，一種是如最常在中國倉鼠卵巢細胞的 使用過程中所看到，通過細胞分泌到營養培養基中的生物產物的可溶性形式；并且另一種 是如最常在使用大腸桿菌進行表達的情況下所看到，生物產物保持在細胞內形成包涵體。 遺傳工程方面的新進展已經能夠編碼將分泌可溶性蛋白質而不是將其保持在內部作為包 涵體的細菌的基因。這是為了避免細胞溶解和包涵體溶解的繁瑣工藝。
[0104] 可以使用任何合適的方法來大規模制備抗CD20抗體。舉例來說，多年來已經研發 出各種器皿和方法以工業規模來實施微生物、尤其是細菌和酵母的發酵。數十萬升的不銹 鋼發酵器皿并不罕見，并且發酵方法包括分批、分批進料、連續或半連續灌注。細胞在這些 器皿內宜保持在懸浮液中，通常通過旋轉位于所述器皿內的攪拌槳葉，并且通過將空氣、氧 氣或二氧化碳注射到所述器皿中促進氣體交換。
[0105] 另外，一般技術者還已知拋棄式發酵器。這些拋棄式發酵器的實例是基于波攪動 的系統。（參見例如美國專利第6, 544, 788號；PCT公告W0 00/66706。）可以使用此類型 發酵器在單一拋棄式容器中培養相對敏感性細胞，例如CH0細胞（例如，皮爾斯（Pierce)， 《生物加工雜志》(Bioprocessing J.) 3 :51-56(2004));雜交瘤細胞（例如，凌（Ling)等人， 《生物技術進展》（Biotech. Prog.) ,19:158-162 (2003));昆蟲細胞（例如韋伯（Weber)等 人，《細胞技術學》（Cytotech.) 38 :77-85(2002))和錨著依賴性細胞（例如，辛格（Singh)， 《細胞技術學》30 :149-158(1999))。這些拋棄式單元相對便宜，由于其單次使用而降低感染 風險并且不需要內部攪拌部件，因為這些容器所處的搖動平臺在使用期間在內部液體中誘 導有助于氣體交換的波狀形式。
[0106] 另一種合適的方法在一個方面提供適用于制備各種生物產物的生物反應器（參 見例如美國專利申請公告第20110117538號）。此生物反應器適用于容納預定體積的包含 營養培養基和生物培養物的液體并且包含：(a)具有至少一個內壁的容器；(b)至少一個入 口； (c)至少一個出口；（d)至少一個氣體入口；（e)至少一個氣體出口；以及（f)至少一個 連接到所述至少一個氣體入口的圓柱形噴灑過濾器，其中所述噴灑過濾器沿著其軸包含多 個孔，其允許氣體從所述噴灑過濾器徑向發射到所述液體中，其中所述多個孔的直徑不超 過約50 μ m，并且其中所述至少一個噴灑過濾器在所述容器內的定位為所述多個孔浸沒在 所述液體內并且所發射的氣體實質上均勻分布在所述液體中做準備。
[0107] 這些生物反應器系統的相關方面揭示于美國專利申請公告第20110117538號中， 其提供一種用于從預定體積的包含營養培養基和生物培養物的液體產生生物產物的方法， 其包含（a)提供生物反應器；(b)將營養培養基和生物培養物引入所述容器中；（c)使氣體 穿過噴灑過濾器并進入所述液體中；（d)以預定時間間隔檢測所述液體中的細胞密度；以 及（e)當所述容器內的液體中的細胞密度達到預定值時從所述容器移出所述液體和由此 產生的任何生物產物。
[0108] 另一種合適的方法提供一種生物反應器，例如美國專利申請公告第20110198286 號中所揭示的生物反應器。此系統利用許多能夠大量結合生物產物的樹脂的新近可用性。 大部分現代樹脂結合每毫升樹脂20-125mg之間的生物產物。這些樹脂中的多數對生物產 物具有高度特異性并且其中多數可以合并以通過簡單的物理化學結合工藝從溶液中移出 任何類型和數量的生物產物，所述結合工藝強到足以在從所述生物反應器去除培養基的同 時保持所述生物產物與所述樹脂連接。生物產物純化領域其中現在具有以下能力：通過調 節洗脫緩沖液的pH、離子強度或其它特征以破壞樹脂與生物產物之間的結合，從樹脂洗脫 這些結合的生物產物。這允許以高度濃縮的溶液形式從生物反應器移出生物產物，所述高 度濃縮的溶液已準備好進一步純化并且在一些情況下其甚至可以是供使用的最終產物。 [0109] 偶聯的抗⑶20抗體組合物
[0110] 本發明提供包含本文中所揭示的本發明抗CD20抗體的組合物。在優選實施例中， 所述組合物是包含抗⑶20抗體和藥學上可接受的載劑的藥學上可接受的組合物。
[0111] 抗體可以通過若干效應機制起作用去除癌細胞。關于完全人類或嵌合的抗體，所 述分子的Fc部分可以有效地活化人類免疫系統并與其相互作用。通過此方法，細胞可以被 免疫系統（補體）的可溶性組分或ADCC介導的細胞殺傷破壞。另外，抗體與靶抗原的結合 可以引發可以引起細胞凋亡的生物反應。此外，抗體分子可以用作用于輸送治療性部分的 傳遞運載工具，所述治療性部分例如藥物、放射性同位素、毒素或酶。
[0112] 本發明的組合物可以進一步包含活性劑。在一些實施例中，所述活性劑是藥學上 活性治療劑或能夠直接施加其藥理作用的"效應物"。在其它實施例中，所述活性劑是診斷 齊U。應該了解，一些活性劑適用作診斷劑和治療劑兩者，并且因此這些術語不是相互排斥 的。在優選實施例中，所述活性劑是與抗CD20抗體結合或偶聯的診斷性或治療性活性劑。
[0113] 用于將合適的治療劑、化學治療劑、放射性核素等偶聯或結合到抗體或其片段的 方法充分描述在本領域中。舉例來說（但不限于），蛋白質中的游離氨基（例如賴氨酸的 ε_氨基）可以與例如碳化二亞胺或異雙官能劑等試劑結合。或者，例如，可以使用巰基進 行結合。另外，可以氧化結合到糖蛋白（包括抗體）的糖部分以形成適用于本領域中已知的 多個偶聯程序的醛基團。根據本發明形成的結合物可以是體內穩定或不穩定的，例如酶可 降解四肽鍵聯或酸不穩定順式-烏頭酰基或腙鍵聯。另外，本發明提供抗CD20抗體融合蛋 白，包括例如（但不限于）其中重鏈或輕鏈編碼序列（或其編碼片段，例如？ &13、？1?&13'和 Fab' 2片段）在診斷上有用的蛋白結構域（例如半抗原、GFP)、免疫活性蛋白結構域（例 如，TF或TNF)或毒素結構域的上游或下游融合。
[0114] 相對于傳遞單獨活性劑，本發明組合物可以用于增強將活性劑傳遞到疾病部位。 在優選實施例中，偶聯到抗CD20抗體使疾病部位處的活性水平相比于在所述疾病部位處 通過未偶聯實現的活性水平增加了至少10 %、至少20 %、至少25 %、至少50 %、至少100 %、 至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍。
[0115] 如本文中所用，短語"間接標記"和"間接標記方法"兩者意指螯合劑共價連接到 抗體并且將至少一種放射性核素插入到螯合劑中。合適的螯合劑和放射性核素在斯瑞瓦 加塔瓦，S.c. (Srivagtava，S.C.)和米斯，R.C. (Mease, R.C.)，"關于用于標記單克隆抗 體的配體、核素和技術的研究進展（Progress in Research on Ligands，Nuclides and Techniques for Labeling Monoclonal Antibodies)"，《核醫學與生物學》（Nucl.Med. Bio. ) 18/6 :589-603(1991)中有所闡述，所述文獻以引用的方式并入本文中。尤其優選的 螯合劑是1-異硫氰酸芐基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸（"MX-DTPA"）；用于間接標記的尤 其優選的放射性核素包括銦-111和釔-90。如本文中所用，短語"直接標記"和"直接標記 方法"兩者意指放射性核素直接共價連接到抗體（通常通過氨基酸殘基）。合適的放射性 核素提供在斯瑞瓦加塔瓦中；或引用用于直接標記的尤其優選的放射性核素是通過酪氨酸 殘基共價連接的碘-131。間接標記方法尤其優選。
[0116] 用于偶聯抗CD20抗體的試劑可以是任何合適的治療劑（或"效應物"）或診斷 齊[J，例如化學治療劑或抗癌劑。合適的診斷劑包括熒光染料、放射性試劑、MRI造影劑、 X射線造影劑、超聲波造影劑和PET造影劑。適用于本發明的合適的化學治療劑或其它 抗癌劑包括（但不限于）酪氨酸激酶抑制劑（染料木素）、生物活性劑（TNF、tTF)、放射 性核素（ 1311、，、111111、21^、呷和其它已知治療性放射性核素）、阿霉素（ &(11^1^(^)、 袢霉素抗生素 （ansamycin antibiotics)、天冬酰胺酶、博萊霉素（bleomycin)、白消 安（busulphan)、順鉬、卡鉬、卡莫司汀（carmustine)、卡培他濱（capecitabine)、苯丁 酸氮芥（chlorambucil)、阿糖胞苷、環磷酰胺、喜樹堿、達卡巴嗪（dacarbazine)、更生 霉素（dactinomycin)、柔紅霉素（daunorubicin)、右雷佐生（dexrazoxane)、多西他賽 (docetaxel)、多柔比星（doxorubicin)、依托泊苷（etoposide)、埃博霉素（epothilones)、 氟尿苷（floxuridine)、氟達拉濱（fludarabine)、氟尿啼陡（fluorouracil)、吉西 他濱（gemcitabine)、輕基脲（hydroxyurea)、伊達比星（idarubicin)、異環磷酰 胺（ifosfamide)、伊立替康（irinotecan)、洛莫司汀（lomustine)、二氯甲二乙胺 (mechlorethamine)、疏基噪呤（mercaptopurine)、美法侖（meplhalan)、甲氨蝶呤 (methotrexate)、雷帕霉素（rapamycin)(西羅莫司（sirolimus))和衍生物、絲裂霉素 (mitomycin)、米托坦（mitotane)、米托蒽醌（mitoxantrone)、亞硝基脲（nitrosurea)、太 平洋紫杉醇（paclitaxel)、帕米膦酸鹽（pamidronate)、噴司他汀（pentostatin)、普卡霉 素（plicamycin)、丙卡巴肼（procarbazine)、利妥昔單抗、鏈佐星（streptozocin)、替尼泊 苷（teniposide)、硫鳥噪呤（thioguanine)、噻替派（thiotepa)、紫杉燒、長春堿、長春新 堿、長春瑞濱（vinorelbine)、紫杉醇（taxol)、考布他汀（combretastatins)、迪斯德莫來 (discodermolides)和反鉬（transplatinum) 0
[0117] 根據本發明適用的其它合適的化學治療劑包括（但不限于）抗代謝物（例如，天 冬酰胺酶）、抗有絲分裂劑（例如，長春花屬生物堿）、DNA損傷劑（例如，順鉬）、促凋亡 劑（誘導程序性細胞死亡或細胞凋亡的試劑）（例如，表鬼臼毒素（印ipodophylotoxin))、 分化誘導劑（例如，類視黃素）、抗生素（例如，博萊霉素）和激素（例如，他莫昔芬 (tamoxifen)、己烯雌酚）。此外，根據本發明適用的合適的化學治療劑包括抗血管生成劑 (血管生成抑制劑），例如IFN-α、煙曲霉素、血管生長抑素、內皮生長抑素、沙利度胺等。
[0118] 另外，藥學活性劑可以是siRNA。在優選實施例中，所述siRNA分子抑制與腫瘤相 關的基因的表達，例如c-Sis和其它生長因子、EGFR、TOGFR、VEGFR、HER2、其它受體酪氨酸 激酶、Src家族基因、Syk-ZAP-70家族基因、BTK家族基因、其它細胞質酪氨酸激酶、Raf激 酶、周期素依賴性激酶、其它細胞質絲氨酸/蘇氨酸激酶、Ras蛋白和其它調節GTP酶。
[0119] 抗⑶20抗體還可以結合到聚乙二醇（PEG)。PEG結合可以增加蛋白質的循環半衰 期，降低蛋白質的免疫原性和抗原性，并提高生物活性。可以使用任何合適的結合方法，包 括（但不限于）例如，使甲氧基-PEG與CD20結合抗體的可獲得氨基或例如組氨酸或半胱 氨酸等其它反應位點反應。另外，可以使用重組DNA方法以將具有PEG反應性基團的氨基 酸添加到本發明CD20結合抗體。可以在PEG與CD20結合抗體反應之前對其進行處理，例 如可以向所述PEG中添加連接基團。此外，根據本發明可以使用可釋放和混合式PEG化策 略，例如使CD20結合抗體PEG化以使得添加到CD20結合抗體中的某些位點的PEG分子在 體內釋放。這些PEG結合方法在本領域中是已知的（參見例如格林沃爾德（Greenwald)等 人，《藥物傳遞進展綜述》（Adv. Drug Delivery Rev.) 55 :217-250(2003))。
[0120] 抗⑶20抗體調配物
[0121] 本發明組合物通常以含載劑（例如藥學上可接受的載劑）的調配物形式提供。通 常，所述載劑將是液體，并且可以是固體，或液體與固體組分的組合。所述載劑合乎需要地 是生理學上可接受（例如，藥學上或藥理學上可接受）的載劑（例如，賦形劑或稀釋劑）。 合適的藥物賦形劑包括穩定劑、抗氧化劑、重量摩爾滲透濃度調節劑、緩沖液和pH調節劑。 合適的添加劑包括生理學上生物相容性緩沖液、添加螯合劑或鈣螯合劑絡合物，或任選地 添加鈣鹽或鈉鹽。可以將藥物組合物包裝呈液體形式以供使用，或可以凍干。優選的生理 學上可接受的載劑介質是水、緩沖水、生理鹽水、〇. 4%生理食鹽水、0. 3%甘氨酸、透明質酸 等。生理學上可接受的載劑是眾所周知的并且可容易獲得。載劑的選擇將至少部分由靶組 織和/或細胞的位置和用于投與組合物的特定方法所決定。
[0122] 可以調配組合物用于通過以下途徑投與：包括靜脈內、動脈內、肌內、腹膜內、鞘 內、硬膜外、皮下、經粘膜（包括，例如經肺）。組合物還可以包含附加組分，例如稀釋劑、佐 齊U、賦形劑、防腐劑和pH調節劑等。
[0123] 適用于可注射投與的調配物包括水性和非水性等張無菌注射溶液，其可以含有抗 氧化劑、緩沖液、抑菌劑和致使所述調配物與既定受體的血液等張的溶質；以及水性和非水 性無菌懸浮液，其可以包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑、凍干保護劑和防腐劑。所述調 配物可以單位劑量或多劑量形式存在于密封容器中，例如安瓿和小瓶，并且可以儲存在經 冷凍干燥的（凍干）的條件下，僅需要在即將使用之前添加無菌液體載劑，例如注射用水。 可以從無菌散劑、顆粒劑或片劑制備即用型注射溶液和懸浮液。
[0124] 無菌可注射溶液可以通過如下方法來制備：視需要將所需量的活性化合物與上文 所列舉的成分中的一者或組合并入適當溶劑中，接著過濾滅菌。優選地，注射用溶液不含內 毒素。通常，通過將活性化合物并入含有堿性分散介質和來自上文所列舉的那些成分的所 需其它成分的無菌媒劑中來制備分散液。在用于制備無菌可注射溶液的無菌散劑的情況 下，優選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，其得到活性成分加上來自其先前經無菌過濾 的溶液的任何其它所需成分的散劑。在所有情況下，所述調配物必須是無菌的并且流動性 必須達到存在流暢注射能力的程度。其在制造和儲存條件下必須是穩定的并且必須保護其 免遭例如細菌和真菌等微生物的污染作用。可以在適當地與例如羥基纖維素等表面活性劑 混合的水中制備呈游離堿或藥學上可接受的鹽形式的活性化合物的溶液。還可以在甘油、 液體聚乙二醇和其混合物中以及在油中制備分散液。在一般儲存和使用條件下，這些制劑 含有防腐劑以防止微生物生長。
[0125] 在優選實施例中，可以將活性成分包覆在所制備的微膠囊中，例如通過凝聚技 術或通過界面聚合，例如羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚_(甲基丙烯酸甲酯）微膠囊， 分別在膠狀藥物傳遞系統（例如脂質體、白蛋白微球、微乳液、納米粒子和納米膠囊）中 或在粗乳液中。合適的技術揭示于雷茨勒（Rezler)等人，《美國化學學會雜志》（J. Am. Chem.Soc. ) 129(16) :4961-72(2007);薩馬德（Samad)等人，《當代藥物傳遞》（Curr. Drug Deliv.) 4 (4) :297-305 (2007);以及美國專利第4, 485, 045號和第4, 544, 545號中。具有增 強的循環時間的脂質體揭示于美國專利第5, 013, 556號中。
[0126] 尤其有用的脂質體可以通過例如逆相蒸發法用脂質組合物產生，所述脂質組合物 包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生化的磷脂酰乙醇胺（PEG-PE)。
[0127] 藥物組合物可以使用藥物傳遞系統傳遞。這些傳遞系統包括膠原蛋白片段的透明 質酸溶液或懸浮液。所述藥物可以調配成用恰當的聚合材料設計用于控制釋放的微膠囊， 所述聚合材料例如聚乳酸、乙羥纖維素、聚己酸內酯、聚己酸內酯二醇、聚賴氨酸、聚乙醇 酸、聚順丁烯二酸、聚[N-(2-羥丙基）甲基丙烯酰胺]等。使用藥物傳遞系統的特定調配 物可以呈液體懸浮液、軟膏、繃帶復合物、膠原蛋白罩等形式。
[0128] 所述組合物可以進一步包含任何其它合適的組分，尤其是用于增強組合物的穩定 性和/或其最終用途的組分。因此，存在本發明組合物的各種合適的調配物。
[0129] 由本發明提供的組合物可以包括例如約0. 5mL到約4mL水性或有機液體，其中活 性劑偶聯到⑶20結合抗體，并且活性劑的濃度是約10mg/mL到約100mg/mL，優選地約lmg/ mL到約10mg/mL，更優選地約0· lmg/mL到約lmg/mL。
[0130] 用抗⑶20抗體治療和診斷的方法
[0131] 本發明提供一種用于通過投與診斷或治療有效量的包含抗CD20抗體的組合物來 診斷或治療動物中的疾病的方法。具體來說，本發明提供治療患者中的疾病的方法，包含向 所述動物投與治療有效量的抗CD20抗體。
[0132] 免疫活性嵌合抗CD20抗體的優選有效劑量（S卩，治療有效量）介于每千克體重約 0. 001到約30mg，更優選地每千克體重約0. 01到約25mg，并且甚至更優選地每千克體重約 0· 4到約20. Omg范圍內。或者，優選有效劑量可以描述為約250mg/m2到約500mg/m2,更優 選地為約375mg/m 2。
[0133] 然而，其它劑量是可行的；影響劑量的因素包括（但不限于）所述疾病的嚴重程 度；先前治療方法；患者的整體健康狀況；所存在的其它疾病等。熟練技術人員能夠容易地 評定特定患者并確定落在所述范圍內或必要時在所述范圍外的合適劑量。
[0134] 因此，根據本發明可以使用抗CD20抗體的任何合適劑量水平，例如大約每投與每 千克體重約1 μ g到l〇〇mg的劑量水平適用于治療疾病。關于合適的劑量，抗體可以在以下 單位劑量下投與：每千克體重小于約75mg，或每千克體重小于約70、60、50、40、30、20、10、 5、2、1、0. 5、0. 1、0. 05、0. 01、0. 005、0. 001 或 0. 0005mg ;并且每千克體重小于 200nmol 抗體， 或每千克體重小于 1500、750、300、150、75、15、7· 5、1· 5、0· 75、0· 15、0· 075、0· 015、0· 0075、 0. 0015、0. 00075、0. 00015nmol抗體。舉例來說，可以通過注射（例如靜脈內或肌內、鞘內或 直接進入器官中）、吸入或局部施用來投與單位劑量。
[0135] 類似地，本發明進一步提供用一或多種抗癌劑和抗CD20抗體來治療動物中的腫 瘤的方法，包含：從所述動物分離生物樣品（樣本），檢測CD20蛋白質或RNA在生物樣品中 的表達，或對生物樣品中的CD20蛋白質或RNA的量進行定量，并且如果生物樣品中的CD20 蛋白質或RNA高于臨界水平存在，那么投與治療有效量的抗癌劑和治療有效量的抗CD20抗 體。
[0136] 樣品中所存在的⑶20蛋白質的水平通常使用抗⑶20抗體在印跡法或ELISA分析 中檢測。然而，在一些實施例中，CD20蛋白質的表達可以使用抗體的僅一部分，使用不是抗 體的CD20結合分子或使用不需要抗體或CD20結合分子來檢測CD20表達的一些其它方法 (例如質譜法）來測定。⑶20RNA水平可以通過任何合適的方法獲得，包括例如Northern 印跡、狹縫印跡、微陣列分析、定量PCR、定量TMA和定量侵入法。
[0137] 本發明還提供一種使用合適的中和抗⑶20抗體抑制⑶20活性的方法。此類中和 抗體可以例如具有阻斷抗CD20與可溶性或細胞表面配體的相互相用或預防信號轉導所需 的CD20構形變化的能力。
[0138] 在其它實施例中，本發明方法包含向哺乳動物投與治療有效量的藥物組合物，所 述藥物組合物包含脂質體結合或白蛋白結合的化學治療劑，其中所述脂質體或白蛋白偶聯 到靶向合適疾病的抗CD20抗體。化學治療劑可以使用任何合適的方法偶聯到抗CD20抗體。 優選地，化學治療劑通過共價鍵（包括例如二硫鍵）以化學方式偶聯到化合物。
[0139] 一或多個劑量的一或多種化學治療劑（例如上文所述的那些）還可以根據本發明 方法投與。本發明方法中所用的化學治療劑的類型和數量將取決于針對特定腫瘤類型的標 準化學治療方案。換句話說，一種特定癌癥可以常規地用單一化學治療劑治療，而另一種特 定癌癥可以常規地用化學治療劑的組合治療。以下實例進一步說明本發明，但當然不應解 釋為以任何方式限制其范圍。
[0140] 根據本發明的方法包括例如組合療法，其中動物還經歷了一或多種選自由以下組 成的群組的癌癥療法：手術、化學療法、放射線療法、溫熱療法、免疫療法、激素療法和激光 療法。術語"共投與"和"組合療法"是指向個體投與兩種或兩種以上治療活性劑。所述藥 劑可以包含在單一藥物組合物中并且同時投與個體，或所述藥劑可以包含在單獨的調配物 中并且連續投與個體。只要可以在個體中同時檢測到兩種藥劑，就稱為共投與所述兩種藥 劑。
[0141] 在本發明中所涵蓋的組合療法包括（但不限于）污染物抗體投與、疫苗投與、細 胞毒性劑、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸類似物和生物反應調節劑的投與。可一起或依次 使用兩種或兩種以上組合化合物。化學治療劑的實例包括烷基化劑、抗代謝物、天然產物、 激素和拮抗劑以及雜類藥劑。烷基化劑的實例包括氮芥，例如二氯甲二乙胺、環磷酰胺、 異環磷酰胺、美法侖（L-溶肉瘤素）和苯丁酸氮芥；乙烯亞胺（ethylenimine)和甲基蜜 胺（methylmelamine)，例如六甲蜜胺（hexamethylmelamine)和噻替派；磺酸燒基酯，例如 白消安；亞硝基脲，例如卡莫司汀（BCNU)、司莫司汀（semustine)(甲基-CCNU)、洛莫司汀 (lomustine) (CCNU)和鏈佐星（鏈佐霉素（streptozotocin)) ;DNA合成拮抗劑，例如磷酸 雌莫司汀（estramustine phosphate);以及三嗪，例如達卡巴嗪（DTIC，二甲基-三氮烯基 咪唑甲酰胺）和替莫唑胺（temozolomide)。抗代謝物的實例包括葉酸類似物，例如甲氨蝶 呤（氨甲蝶呤（amethopterin));嘧啶類似物，例如氟尿嘧啶（5-氟尿嘧啶、5-FU、5FU)、氟 尿苷（氟脫氧尿苷、FUdR)、阿糖胞苷（胞嘧啶阿拉伯糖苷）和吉西他濱；嘌呤類似物，例如 巰基嘌呤（6-巰基嘌呤、6-MP)、硫鳥嘌呤（6-硫鳥嘌呤、TG)和噴司他汀（2'-脫氧助間型 霉素、脫氧助間型霉素）、克拉屈濱（cladribine)和氟達拉濱；以及拓撲異構酶抑制劑，例 如安吖啶（amsacrine)。天然產物的實例包括長春花屬生物堿，例如長春堿（VLB)和長春 新堿；紫杉烷，例如太平洋紫杉醇( Abraxane?)和多西他賽(Taxotere?);表鬼臼毒素，例如 依托泊苷和替尼泊苷；喜樹堿，例如托泊替康（topotecan)和伊立替康；抗生素，例如更生 霉素（放線菌素 D)、柔紅霉素（道諾霉素、紅比霉素）、多柔比星、博萊霉素、絲裂霉素（絲 裂霉素 C)、伊達比星、表柔比星（epirubicin);酶，例如L-天冬酰胺酶；以及生物反應調節 齊[J，例如干擾素 α和白介素2。激素和拮抗劑的實例包括黃體生成素釋放激素激動劑，例 如布舍瑞林（buserelin);腎上腺皮質類固醇，例如潑尼松（prednisone)和相關制劑；孕 酮，例如己酸羥基孕酮、乙酸甲羥孕酮和乙酸甲地孕酮；雌激素，例如己烯雌酚和乙炔雌二 醇和相關制劑；雌激素拮抗劑，例如他莫昔芬和阿那曲唑（anastrozole);雄激素，例如丙 酸睪酮和氟輕甲基睪酮和相關制劑；雄激素拮抗劑，例如氟他胺（flutamide)和比卡魯胺 (bicalutamide);以及促性腺激素釋放激素類似物，例如亮丙瑞林（leuprolide)。雜類藥 劑的實例包括沙利度胺；鉬配位絡合物，例如順鉬（czs-DDP)、奧沙利鉬（oxaliplatin)和 卡鉬；蒽二酮，例如米托蒽醌；被取代的脲，例如羥基脲；甲肼衍生物，例如丙卡巴肼（N-甲 肼、MIH);腎上腺皮質抑制劑，例如米托坦（ο，ρ' -DDD)和氨魯米特（aminoglutethimide); RXR激動劑，例如貝瑟羅汀（bexarotene);以及酪氨酸激酶抑制劑，例如伊馬替尼。
[0142] 在本發明方法中起重要作用的組合物可以單次劑量或多次劑量投與。當通過輸注 投與抗體時，所述輸注可以單次持續劑量或可以通過多次輸液傳遞。可以將藥劑直接注射 到在異常靶基因表達位點處或附近的組織中。可以將藥劑多次注射到在所述位點處或附近 的組織中。
[0143] 本領域一般技術者還可以容易地確定向指定個體投與本發明抗體的恰當給藥方 案。舉例來說，可以單次注射或沉積形式在CD20表達位點處或附近向個體投與抗CD20抗 體組合物一次。本發明組合物可以每天、每半周、每周、每兩周、每半月、每月、每兩月或根據 臨床醫生的判斷投與。在一些實施例中，所述組合物每天向個體投與一次或兩次，持續約三 到約二十八天，更優選地約七到約十天時間。在其它實施例中，比一天一次更不頻繁地投與 單位劑量，例如，小于每2、4、8或30天一次。在其它實施例中，不按頻率（例如不是常規頻 率）投與單位劑量。
[0144] 當給藥方案包含多次投藥時，應了解向個體投與的抗CD20抗體組合物的有效性 可以包括經整個給藥方案投與的抗體的總量。本領域一般技術者將了解，可以取決于各 種因素略微調整準確單獨劑量，所述因素包括要投與的特異性抗⑶20抗體組合物、投藥時 間、投藥途徑、調配物的性質、排泄速率、要治療的特定病癥、所述病癥的嚴重程度、寡核苷 酸藥劑的藥效動力學和患者的年齡、性別、體重與一般健康狀況。鑒于各種投藥途徑的不同 效率，所需劑量水平的大幅變化是可預期的。
[0145] 視需要或在特定情況下視為恰當的，可以單次劑量或者兩次或兩次以上劑量投與 有效劑量。如果需要促進重復或頻繁輸液，植入傳遞裝置可以是可取的，所述傳遞裝置例如 泵、半永久性支架（例如靜脈內、腹膜內、腦池內或囊內）或儲集器。在成功治療之后，可能 需要使患者經歷維持療法以預防疾病病況的復發。抗體組合物的濃度是足以有效治療或預 防病癥或調節人內生理條件的量。所投與的抗體的濃度或量將取決于針對藥劑和投藥方法 所確定的參數。
[0146] 某些因素可以影響有效地治療個體所需的劑量，包括（但不限于）疾病或病癥的 嚴重程度、先前治療、個體的一般健康狀況和/或年齡以及所存在的其它疾病。還應了解， 用于治療的抗體的有效劑量可以在特定治療過程中增加或減少。劑量變化可以由診斷分析 的結果產生并變得顯而易見。舉例來說，可以在投與抗體組合物之后監測個體。基于來自 監測的信息，可以投與額外量的抗體組合物。一般技術者可以容易地確定最佳劑量、給藥方 法和重復速率。
[0147] 以下實例進一步說明本發明，但當然不應解釋為以任何方式限制其范圍。
[0148] 實例 1
[0149] 此實例展示了可以通過定點突變誘發制造具有改變的氨基酸序列的一系列變異 體抗⑶20抗體輕鏈和重鏈。
[0150] 使用一般技術者眾所周知的各種方案完成所克隆的抗CD20輕鏈和重鏈編碼序列 的位點特異性突變，所述方案包括MORPH位點特異性質粒DNA突變誘發試劑盒（5Prime to 3 Prime公司）、QuikChange定點突變誘發試劑盒、QuikChange多定點突變誘發試劑盒和 QuikChange快速多定點突變誘發試劑盒（所有都是來自加利福尼亞州圣克拉拉的安捷倫 技術公司（Agilent Technologies, Santa Clara, CA))。具體來說，QuikChange 方法使用 互補錯配引物對和引物延伸，使用非股置換聚合酶（Pfu)。在轉型之前，親本模板（從使大 腸桿菌菌株甲基化制備）經Dpnl (對甲基化DNA具有特異性并且不消化新合成的雙螺旋 DNA)消化。通過雙脫氧測序檢驗所有突變。如（威爾金斯?斯提芬斯（Wilkins Stevens) 等人：從合成基因產生的重組免疫球蛋白可變結構域提供用于體外表征輕鏈類淀粉蛋白質 的系統（Recombinant immunoglobulin variable domains generated from synthetic genes provide a system for in vitro characterization of light chain amyloid proteins),《蛋白質科學》（Protein Sci. )4 :421-432(1995))所述完成所得輕鏈和重鏈多 肽的表達和純化。抗體VjP'結構域在大腸桿菌宿主菌株BL26中表達。使用小規模（30mL) 振蕩培養物來制備用于評估熱穩定性的足量蛋白質。通過與Ni-NTA瓊脂糖（凱杰）或Ni瓊 脂糖凝膠（新澤西州皮斯卡塔韋的通用電氣醫療集團（GE Healthcare, Piscataway，NJ)) 一起培育，從大腸桿菌周質部分中分離His標記蛋白質。在96孔過濾板上收集親和樹脂并 洗滌。用含有500mM咪唑的緩沖液洗脫蛋白質。
[0151] 表1到表3分別呈現了野生型抗⑶20抗體輕鏈和重鏈，其殘基如根據卡巴特 E. A. (Kabat Ε· A.)、吳 Τ· T. (Wu Τ· T.)、佩里 Η· M. (Perry Η· M.)、戈特斯曼 K. S. (Gottesman K.S.)和弗勒C. (Foeller C. )(1991):《免疫相關的蛋白質序列》（Sequences of Proteins of Immunological Interest)(卡巴特編），第1卷，第5版·美國衛生和公眾服務部（US Department of Health and Human Services)，貝塞斯達（Bethesda),馬里蘭州（MD). (1991) (VL和VH序列）或EU編號（CH2序列）和參看SEQ ID NO :1和2所定義進行編號。 (除非另外說明，否則在此所用的所有氨基酸序列編號都是參考/基于SEQ ID N0 :1和2。）
[0152] 表1.野生型抗CD20輕鏈可變結構域氨基酸序列編號系統
[0153]

【權利要求】
1. 一種經分離穩定的抗CD20抗體，其中 a. 所述經分離穩定的抗⑶20抗體輕鏈氨基酸序列包含SEQ ID NO: 1或具有以下氨基 酸序列變化中的一或多者的 SEQ ID N0:1 :S41Q、S42P、W46L、W46I、S55P、V59A、V59D、S69D、 S69N、Y70F 和 A79P ; b. 所述經分離穩定的抗⑶20抗體重鏈氨基酸序列包含SEQ ID NO :2或具有以下氨 基酸序列變化中的一或多者的SEQ ID NO :2 :V37L和M20L、M20L和A92G、Q5V、P7S、E10G、 M20L、M20I、T28S、Y32S、A68F、A68V、T69I、L70I、A72V、K74N、K74T、M81L、S84N、A92G、N109D、 A113Q、V263L、V277I、F279L 和 V312I ;以及 c. 所述經分離穩定的抗⑶20抗體輕鏈氨基酸序列包含（a)中所列舉的SEQ ID NO: 1中的所述氨基酸序列變化中的至少一者或所述穩定的抗CD20抗體重鏈氨基酸序列包含 (b)中所列舉的SEQ ID NO :2中的所述氨基酸序列變化中的至少一者。
2. 根據權利要求1所述的經分離穩定的抗CD20抗體，其中所述輕鏈氨基酸序列包含具 有W46L氨基酸序列變化的SEQ ID NO :1。
3. 根據權利要求1所述的經分離穩定的抗CD20抗體，其中所述輕鏈氨基酸序列包含具 有W46I氨基酸序列變化的SEQ ID NO :1。
4. 根據權利要求1所述的經分離穩定的抗CD20抗體，其中所述重鏈氨基酸序列包含 具有以下氨基酸序列序列變化中的一者的SEQ ID N0:2:M20L、M20I、M81L、A92G、N109D或 V263L。
5. 根據權利要求1所述的經分離穩定的抗CD20抗體，其中所述重鏈氨基酸序列包含具 有M20L氨基酸序列變化的SEQ ID NO :2。
6. 根據權利要求1所述的經分離穩定的抗CD20抗體，其中所述重鏈氨基酸序列包含具 有M20I氨基酸序列變化的SEQ ID NO :2。
7. 根據權利要求1所述的經分離穩定的抗CD20抗體，其中所述重鏈氨基酸序列包含具 有M81L氨基酸序列變化的SEQ ID N0:2。
8. 根據權利要求1所述的經分離穩定的抗CD20抗體，其中所述重鏈氨基酸序列包含具 有A92G氨基酸序列變化的SEQ ID NO :2。
9. 根據權利要求1所述的經分離穩定的抗CD20抗體，其中所述重鏈氨基酸序列包含具 有N109D氨基酸序列變化的SEQ ID NO :2。
10. 根據權利要求1所述的經分離穩定的抗CD20抗體，其中所述重鏈氨基酸序列包含 具有V263L氨基酸序列變化的SEQ ID NO :2。
11. 根據權利要求1所述的經分離穩定的抗CD20抗體，其中 a. 所述輕鏈氨基酸序列包含具有W46L氨基酸序列變化的SEQ ID N0:1 ;并且 b. 所述重鏈氨基酸序列包含具有M20I、M81L、A92G、N109D和V263L氨基酸序列變化的 SEQ ID NO :2。
12. 根據權利要求1所述的經分離穩定的抗CD20抗體，其中 a. 所述輕鏈氨基酸序列包含SEQ ID NO :1 ;并且 b. 所述重鏈氨基酸序列包含具有M20I、M81L、A92G、N109D和V263L氨基酸序列變化的 SEQ ID NO :2。
13. 根據權利要求1所述的經分離穩定的抗CD20抗體，其中 a. 所述輕鏈氨基酸序列包含具有W46L氨基酸序列變化的SEQ ID NO :1 ;并且 b. 所述重鏈氨基酸序列包含具有M20L、M81L、A92G和N109D氨基酸序列變化的SEQ ID NO :2。
14. 根據權利要求1所述的經分離穩定的抗CD20抗體，其中 a. 所述輕鏈氨基酸序列包含SEQ ID NO :1 ;并且 b. 所述重鏈氨基酸序列包含具有M20L、M81L、A92G和N109D氨基酸序列變化的SEQ ID NO :2。
15. 根據權利要求1所述的經分離抗CD20抗體，其中 a. 所述輕鏈氨基酸序列包含SEQ ID NO :1 ;并且 b. 所述重鏈氨基酸序列包含具有M20L、M81L和A92G氨基酸序列變化的SEQ ID N0:2。
16. 根據權利要求1所述的經分離穩定的抗CD20抗體，其中當如通過以下所測量，所述 抗CD20抗體的重鏈或輕鏈具有優于野生型抗CD20抗體的相應重鏈或輕鏈的熱穩定性時， 其視為穩定的：差示掃描熱量測定DSC、圓二色性CD光譜法、熒光發射光譜法、核磁共振NMR 光譜法、尺寸排阻色譜法或熱挑戰分析。
17. 根據權利要求1所述的經分離穩定的抗CD20抗體，其中當與相同數量的野生型抗 CD20抗體相比時，所述抗CD20抗體具有增強的抗原結合活性、存放期、血清半衰期、AUC或 Cmax。
18. -種經分離穩定的抗⑶20抗體，其中 a. 所述經分離穩定的抗CD20抗體輕鏈氨基酸序列或所述輕鏈氨基酸序列的等效物 包含SEQ ID N0:1或具有以下氨基酸序列變化中的一或多者的SEQ ID N0:1 :S41Q、S42P、 W46L、W46I、S55P、V59A、V59D、S69D、S69N、Y70F 和 A79P ; b. 所述經分離穩定的抗CD20抗體重鏈氨基酸序列或所述重鏈氨基酸序列的等效物包 含SEQ ID NO :2或具有以下氨基酸序列變化中的一或多者的SEQ ID NO :2 :V37L和M20L、 M20L 和 A92G、Q5V、P7S、E10G、M20L、M20I、T28S、Y32S、A68F、A68V、T69I、L70I、A72V、K74N、 K74T、M81L、S84N、A92G、N109D、A113Q、V263L、V277I、F279L 和 V312I ; c. 所述經分離穩定的抗CD20抗體輕鏈氨基酸序列或所述輕鏈氨基酸序列的所述等效 物包含（a)中所列舉的SEQ ID NO :1中的所述氨基酸序列變化中的至少一者，或者所述穩 定的抗CD20抗體重鏈氨基酸序列或所述重鏈氨基酸序列的所述等效物包含（b)中所列舉 的SEQ ID NO :2中的所述氨基酸序列變化中的至少一者；以及 d. 所述經分離穩定的抗⑶20抗體呈完全抗體、Fv片段、單鏈可變區ScFv抗體、單克隆 抗體、Fab抗體片段、Fat/抗體片段或Fat/ 2 Fab抗體片段形式。
19. 一種經分離核酸，其編碼根據權利要求18所述的穩定的抗CD20抗體的單一輕鏈或 重鏈。
20. 根據權利要求19所述的經分離核酸，其中所述核酸是RNA或DNA。
21. -種經分離載體，其指導根據權利要求19所述的核酸中的任一者的表達。
22. 根據權利要求21所述的經分離載體，其中所述表達是誘導型的。
23. -種經分離細胞，其包含根據權利要求19所述的載體中的一或多者。
24. 根據權利要求23所述的細胞，其中所述細胞是原核細胞。
25. 根據權利要求23所述的細胞，其中所述細胞是真核細胞。
26. 根據權利要求25所述的真核細胞，其中所述細胞是中國倉鼠卵巢細胞。
27. 根據權利要求23所述的細胞，其中所述細胞經所述載體中的一或多者短暫轉型。
28. 根據權利要求22所述的細胞，其中所述細胞經所述載體中的一或多者穩定轉型。
29. 根據權利要求1所述的經分離抗CD20抗體，其中所述抗CD20抗體輕鏈或重鏈氨基 酸序列具有如下其它氨基酸序列變化 a. 增強所述抗CD20抗體的以下能力：結合到所述CD20分子、錨定補體、調理CD-20表 達細胞、活化抗體依賴性細胞毒性ADCC、活化抗體依賴性程序性細胞死亡、活化巨噬細胞依 賴性抗CD20免疫反應、攜帶CD20的細胞對化學療法的敏感性； b. 降低所述抗CD20抗體錨定補體的能力；以及 c. (a)和（b)的所述其它氨基酸序列變化的組合。
30. 根據權利要求1中任一權利要求所述的經分離穩定的抗CD20抗體，其中所述抗 CD20抗體偶聯到效應物。
31. 根據權利要求30所述的經分離抗CD20抗體，其中所述效應物是放射性同位素、化 學治療劑、毒素、生物反應調節劑或第二抗體。
32. 根據權利要求1所述的經分離抗CD20抗體，其中所述抗CD20抗體偶聯到PEG、白 蛋白或多唾液酸。
32. -種藥物組合物，其包含根據權利要求1所述的抗⑶20抗體和藥學上可接受的載 劑。
34. -種治療患者中的疾病的方法，其包含向所述患者投與在藥學上可接受的載劑中 的治療有效量的穩定的抗CD20抗體，其中 a. 所述經分離穩定的抗⑶20抗體輕鏈氨基酸序列包含SEQ ID NO: 1或具有以下氨基 酸序列變化中的一或多者的 SEQ ID N0:1 :S41Q、S42P、W46L、W46I、S55P、V59A、V59D、S69D、 S69N、Y70F 和 A79P ; b. 所述經分離穩定的抗⑶20抗體重鏈氨基酸序列包含SEQ ID NO :2或具有以下氨 基酸序列變化中的一或多者的SEQ ID NO :2 :V37L和M20L、M20L和A92G、Q5V、P7S、E10G、 M20L、M20I、T28S、Y32S、A68F、A68V、T69I、L70I、A72V、K74N、K74T、M81L、S84N、A92G、N109D、 A113Q、V263L、V277I、F279L 和 V312I ;以及 c. 所述經分離穩定的抗⑶20抗體輕鏈氨基酸序列包含（a)中所列舉的SEQ ID NO: 1中的所述氨基酸序列變化中的至少一者或所述穩定的抗CD20抗體重鏈氨基酸序列包含 (b)中所列舉的SEQ ID NO :2中的所述氨基酸序列變化中的至少一者。
35. 根據權利要求34所述的方法，其中所述穩定的抗CD20抗體輕鏈氨基酸序列包含具 有W46L氨基酸序列變化的SEQ ID N0:1。
36. 根據權利要求34所述的方法，其中所述穩定的抗CD20抗體輕鏈氨基酸序列包含具 有W46I氨基酸序列變化的SEQ ID NO :1。
37. 根據權利要求34所述的方法，其中所述穩定的抗CD20抗體重鏈氨基酸序列包含具 有以下氨基酸序列變化中的一者的SEQ ID NO :2 :M20L、M20I、M81L、A92G、N109D或V263L。
38. 根據權利要求37所述的方法，其中所述穩定的抗CD20抗體重鏈氨基酸序列包含具 有M20L氨基酸序列變化的SEQ ID NO :2。
39. 根據權利要求37所述的方法，其中所述穩定的抗CD20抗體重鏈氨基酸序列包含具 有M20I氨基酸序列變化的SEQ ID NO :2。
40. 根據權利要求37所述的方法，其中所述穩定的抗CD20抗體重鏈氨基酸序列包含具 有M81L氨基酸序列變化的SEQ ID N0:2。
41. 根據權利要求37所述的方法，其中所述穩定的抗CD20抗體重鏈氨基酸序列包含具 有A92G氨基酸序列變化的SEQ ID NO :2。
42. 根據權利要求37所述的方法，其中所述穩定的抗CD20抗體重鏈氨基酸序列包含具 有N109D氨基酸序列變化的SEQ ID NO :2。
43. 根據權利要求37所述的方法，其中所述穩定的抗CD20抗體重鏈氨基酸序列包含具 有V263L氨基酸序列變化的SEQ ID NO :2。
44. 根據權利要求34所述的方法，其中： a. 所述穩定的抗CD20抗體輕鏈氨基酸序列包含具有W46L氨基酸序列變化的SEQ ID NO :1 ;并且 b. 所述穩定的抗CD20抗體重鏈氨基酸序列包含具有M20I、M81L、A92G、N109D和V263L 氨基酸序列變化的SEQ ID N0:2。
45. 根據權利要求34所述的方法，其中： a. 所述穩定的抗⑶20抗體輕鏈氨基酸序列包含SEQ ID NO :1 ;并且 b. 所述穩定的抗CD20抗體重鏈氨基酸序列包含具有M20I、M81L、A92G、N109D和V263L 氨基酸序列變化的SEQ ID N0:2。
46. 根據權利要求34所述的方法，其中： a. 所述穩定的抗CD20抗體輕鏈氨基酸序列包含具有W46L氨基酸序列變化的SEQ ID NO :1 ;并且 b. 所述穩定的抗CD20抗體重鏈氨基酸序列包含具有M20L、M81L、A92G和N109D氨基 酸序列變化的SEQ ID N0:2。
46.根據權利要求34所述的方法，其中： a. 所述穩定的抗⑶20抗體輕鏈氨基酸序列包含SEQ ID NO :1 ;并且 b. 所述穩定的抗CD20抗體重鏈氨基酸序列包含具有M20L、M81L、A92G和N109D氨基 酸序列變化的SEQ ID N0:2。
48. 根據權利要求34所述的方法，其中： a. 所述穩定的抗⑶20抗體輕鏈氨基酸序列包含SEQ ID NO :1 ;并且 b. 所述穩定的抗⑶20抗體重鏈氨基酸序列包含具有M20L、M81L和A92G氨基酸序列 變化的 SEQ ID NO :2。
49. 根據權利要求34所述的方法，其中當如通過以下所測量，所述抗CD20抗體的重鏈 或輕鏈具有優于野生型抗CD20抗體的相應重鏈或輕鏈的熱穩定性時，其視為穩定的：差示 掃描熱量測定DSC、圓二色性CD光譜法、熒光發射光譜法、核磁共振NMR光譜法、尺寸排阻色 譜法或熱挑戰分析。
50. 根據權利要求34所述的方法，其中當與相同數量的野生型抗CD20抗體相比時，所 述穩定的抗CD20抗體具有增強的抗原結合活性、存放期、血清半衰期、AUC或C max。
51. 根據權利要求34所述的方法，其中所述抗CD20抗體輕鏈或重鏈氨基酸序列具有其 它氨基酸變化，所述氨基酸變化增強所述抗體結合到所述CD20分子、錨定補體、調理CD-20 表達細胞、活化抗體依賴性細胞毒性ADCC、活化抗體依賴性程序性細胞死亡、活化巨噬細胞 依賴性抗CD20免疫反應、攜帶CD20的細胞對化學療法的敏感性的能力，或者降低所述抗 ⑶20抗體錨定補體的能力以及其組合。
52. 根據權利要求34所述的方法，其中所述抗CD20抗體偶聯到效應物。
53. 根據權利要求52所述的方法，其中所述效應物是放射性同位素、化學治療劑、毒 素、生物反應調節劑或第二抗體。
54. 根據權利要求34所述的方法，其中所述抗CD20抗體偶聯到PEG、白蛋白或多唾液 酸。
55. 根據權利要求34所述的方法，其中所述疾病是非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴細胞 性白血病、類風濕性關節炎、韋格納氏肉芽腫病或顯微鏡下多血管炎。
56. 根據權利要求34所述的方法，其中所述抗CD20抗體呈完全抗體、單鏈可變區ScFv 抗體、單克隆抗體、Fab抗體片段、Fab'抗體片段或Fab' 2抗體片段形式。
57. -種定量檢測患者中的⑶20多肽的方法，其包含向所述患者投與在藥學上可接受 的載劑中的診斷有效量的穩定的抗CD20抗體，其中 a. 所述經分離穩定的抗CD20抗體輕鏈氨基酸序列或所述輕鏈氨基酸序列的等效物 包含SEQ ID NO :1或具有以下氨基酸序列變化中的一或多者的SEQ ID NO :1 :S41Q、S42P、 W46L、W46I、S55P、V59A、V59D、S69D、S69N、Y70F 和 A79P ; b. 所述經分離穩定的抗CD20抗體重鏈氨基酸序列或所述重鏈氨基酸序列的等效物包 含SEQ ID NO :2或具有以下氨基酸序列變化中的一或多者的SEQ ID NO :2 :V37L和M20L、 M20L 和 A92G、Q5V、P7S、E10G、M20L、M20I、T28S、Y32S、A68F、A68V、T69I、L70I、A72V、K74N、 K74T、M81L、S84N、A92G、N109D、A113Q、V263L、V277I、F279L 和 V312I ; c. 所述經分離穩定的抗CD20抗體輕鏈氨基酸序列或所述輕鏈氨基酸序列的所述等效 物包含（a)中所列舉的SEQ ID NO :1中的所述氨基酸序列變化中的至少一者，或者所述穩 定的抗CD20抗體重鏈氨基酸序列或所述重鏈氨基酸序列的所述等效物包含（b)中所列舉 的SEQ ID NO :2中的所述氨基酸序列變化中的至少一者；以及 d. 所述經分離穩定的抗⑶20抗體呈完全抗體、Fv片段、單鏈可變區ScFv抗體、單克隆 抗體、Fab抗體片段、Fat/抗體片段或Fat/ 2 Fab抗體片段形式。
58. -種定量檢測生物樣本中的CD20多肽的方法，其包含使診斷量的穩定的抗CD20抗 體與所述生物樣本接觸，其中 a. 所述經分離穩定的抗CD20抗體輕鏈氨基酸序列或所述輕鏈氨基酸序列的等效物 包含SEQ ID NO :1或具有以下氨基酸序列變化中的一或多者的SEQ ID NO :1 :S41Q、S42P、 W46L、W46I、S55P、V59A、V59D、S69D、S69N、Y70F 和 A79P ; b. 所述經分離穩定的抗CD20抗體重鏈氨基酸序列或所述重鏈氨基酸序列的等效物包 含SEQ ID NO :2或具有以下氨基酸序列變化中的一或多者的SEQ ID NO :2 :V37L和M20L、 M20L 和 A92G、Q5V、P7S、E10G、M20L、M20I、T28S、Y32S、A68F、A68V、T69I、L70I、A72V、K74N、 K74T、M81L、S84N、A92G、N109D、A113Q、V263L、V277I、F279L 和 V312I ; c. 所述經分離穩定的抗CD20抗體輕鏈氨基酸序列或所述輕鏈氨基酸序列的所述等效 物包含（a)中所列舉的SEQ ID NO :1中的所述氨基酸序列變化中的至少一者，或者所述穩 定的抗CD20抗體重鏈氨基酸序列或所述重鏈氨基酸序列的所述等效物包含（b)中所列舉 的SEQ ID NO :2中的所述氨基酸序列變化中的至少一者；以及 d.所述經分離穩定的抗⑶20抗體呈完全抗體、Fv片段、單鏈可變區ScFv抗體、單克隆 抗體、Fab抗體片段、Fat/抗體片段或Fat/ 2 Fab抗體片段形式。
59. 根據權利要求57所述的方法，其中所述抗CD20抗體用于ELISA分析、蛋白質印跡、 狹縫印跡、抗原捕捉分析或微陣列分析中。
60. -種經分離抗⑶20抗體，其中 a. 所述抗⑶20抗體輕鏈氨基酸序列包含SEQ ID NO: 1或具有以下氨基酸序列變化中 的一或多者的 SEQ ID NO :1 :Q1D、S5T、A9S、A9L、I10L、I10F、I10S、I10T、A13V、P15A、P15L、 P15V、K18Q、K18R、K18E、M21I、M21L、S27Q、S27K、I32L、H33N、F35Y、P39S、S41A、S41T、S41Q、 S42A、S42P、P45L、P45R、W46L、W46I、A49D、S55P、V59A、V59D、F61T、S69D、S69N、S69T、Y70F、 S71T、A79P、A82L、A82V、A82F、Q88L 和 G99Q ; b. 所述抗⑶20抗體重鏈氨基酸序列包含SEQ ID NO :2或具有以下氨基酸序列變化中 的一或多者的SEQ ID NO :2 : i. V37L、M20L 和以下一或多者：Q5V、P7S、A9G、A9L、E10G、K13Q、T28S、T30S、K67R、K67R、 A68F、A68F、A68V、T69I、L70I、A72V、K74N、K74T、Y80F、M81L、S84N、A92G、W106S、F108A、 N109D 和 A113Q ; ^?]\1201^^926和以下一或多者：￥181^、1(191?、1(195、1(191\]\1201、]\12(^、5251\￥27卩、￥32卩、 Y32S、P41H、G44E、L45R ;以及 iii. V244L、L246I、V263L、V267A、V267I、V267L、V270L、V270S、V270F、V270I、V277I、 F279I、F279L、V306T、V312I、V312L、V327A、V327L、I340A、I340L、T254E、M256L、M256Y、 T260E、T260F 和 T260K ;以及 c. 其中所述抗⑶20抗體輕鏈氨基酸序列包含（a)中所列舉的SEQ ID NO :1中的至少 一種氨基酸變化，或者所述抗CD20抗體重鏈氨基酸序列包含（b)中所列舉的SEQ ID NO :2 中的所述氨基酸變化中的至少一者。
【文檔編號】C07K16/00GK104204217SQ201280071350
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2012年1月19日 優先權日:2012年1月19日
【發明者】羅斯瑪麗·威爾頓 申請人:醫用蛋白國際有限責任公司