流感病毒疫苗及其用途

流感病毒疫苗及其用途
【專利摘要】本發明提供流感血球凝集素主干域多肽，其包含(a)流感血球凝集素HA1域，該流感血球凝集素HA1域包含利用具有0至50個氨基酸殘基的連接序列共價鍵聯至HA1?C端主干區段的HA1?N端主干區段；及(b)流感血球凝集素HA2域，其中HA2域中的一或多個氨基酸已突變。亦提供編碼這些多肽的核酸，包含這些多肽和/或核酸分子的組合物，以及其使用方法，尤其在檢測、預防和/或治療流感方面。
【專利說明】流感病毒疫苗及其用途
[0001] Μ?
[0002] 本發明是關于醫藥領域。本文提供流感血球凝集素主干域多肽，提供血球凝集素 主干域多肽的方法，包含其的組合物，包含其的疫苗，及其使用方法，尤其在檢測、預防和/ 或治療流感方面。
[0003] 置量
[0004] 流感病毒為主要的人類病原體，其引起呼吸道疾病（通常稱為"流感"或"流行性 感冒")，嚴重度可在無癥狀性感染（sub-clinical infection)至可引起死亡的原發性病毒 性肺炎范圍內。感染的臨床作用隨流感病毒株的毒性及宿主的暴露量、病史、年齡及免疫狀 態而變化。據估計在世界范圍內每年約有10億人經歷流感病毒的感染，在3至5百萬個病 例中引起嚴重疾病，及引起估計300, 000至500, 000起流感相關死亡。大部分此等感染可 歸因于攜帶H1或H3血球凝集素亞型的A型流感病毒，小部分歸因于B型流感病毒，且因此 所有三者的代表株均包括于季節性疫苗中。當前免疫實踐依賴于早期鑒別傳播性流感病毒 以允許及時制造有效的季節性流感疫苗。除在預測將在下一個季節期間占主導地位的病毒 株方面存在固有的困難以外，抗病毒耐藥性及免疫逃避亦在當前疫苗無法預防發病及死亡 中起一定作用。除此以外，大流行病的可能性對全球健康造成重大及現實的威脅，該大流行 病由來源于動物儲存宿主的高毒性病毒株引起且經過再分類以增強人與人之間傳播。
[0005] A型流感病毒在自然界中分布廣泛且可感染多種禽類及哺乳動物。流感病毒為包 膜RNA病毒，其屬于正黏液病毒科（Orthomyxoviridae)家族。其基因組由8個單鏈RNA區 段組成，這些單鏈RNA區段編碼以下11種不同的蛋白質：一種核蛋白（NP)、三種聚合酶蛋 白（PA、PB1及PB2)、兩種基質蛋白（Ml及M2)、三種非結構蛋白（NS1、NS2及PB1-F2)及兩 種外部糖蛋白：血球凝集素（HA)及神經胺酸酶（NA)。基于HA及NA蛋白的抗原結構的差 異對病毒進行分類，且其不同組合表示獨特的病毒亞型，這些病毒亞型進一步分類為特定 流感病毒株。盡管所有已知亞型均可見于禽類中，但目前傳播的人類A型流感亞型為H1N1 及H3N2。系統發生分析已展示血球凝集素再分成兩個主要類群：尤其系統發生第1類群中 的HI、H2、H5及H9亞型，及尤其系統發生第2類群中的H3、H4及H7亞型。
[0006] B型流感病毒株嚴格針對人類。B型流感病毒株內HA的抗原變異少于在A型病毒 株內觀察到的抗原變異。B型流感病毒的兩種遺傳上及抗原上不同的譜系在人類中傳播， 如由 B/Yamagata/16/88(亦稱為 B/Yamagata)及 B/Victoria/2/87(B/Victoria)譜系所表 示（Ferguson等人，2003)。盡管由B型流感病毒引起的疾病譜與由A型流感病毒引起的疾 病譜相比一般較溫和，但在B型流感感染的情況下仍頻繁地觀察到需要住院治療的嚴重疾 病。
[0007] 已知中和流感病毒的抗體主要是針對血球凝集素（HA)。血球凝集素或HA為三聚 糖蛋白，其錨定至病毒外殼且具有雙重功能：其負責結合至細胞表面受體唾液酸，及在吸收 之后，其介導病毒與內體膜的融合，引起病毒RNA在細胞的胞溶質中的釋放。HA包含較大頭 部域及較小主干域。對病毒膜的附著是由與主干域連接的C端錨定序列所介導。蛋白以指 定環形式翻譯后裂解，得到兩種多肽HA1及HA2 (完整序列稱為ΗΑ0)。膜遠程頭部區主要來 源于HA1，且膜近端干區主要來自HA2 (圖1)。
[0008] 季節性流感疫苗必須每年更新的原因在于病毒的變異性較大。在血球凝集素分子 中，此變異尤其表現于頭部域中，其中抗原漂移（drift)及轉移（shift)已產生大量不同的 變異體。由于此頭部域亦為免疫顯性區，故大多數中和抗體是針對此域且藉由干擾受體結 合來起作用。頭部域的免疫顯性與較大變異的組合亦解釋經特定病毒株感染不引起對其他 病毒株的免疫性的原因：由首次感染誘生的抗體僅識別與初次感染的病毒密切相關的有限 數目的病毒株。
[0009] 近來，已經描述了缺乏全部或實質上全部流感血球凝集素球狀頭部域的流感血球 凝集素主干域多肽，且其用于對主干域多肽的一或多個保守抗原決定基產生免疫反應。相 信主干域多肽的抗原決定基與球狀頭部域的高度免疫原性區相比免疫原性較低，因此，主 干域多肽中不存在球狀頭部域可能允許針對主干域多肽的一或多個抗原決定基產生免疫 反應（Steel等人，2010)。因此，Steel等人已藉由以下方式建立一種新的分子：使A/波多 黎各（Puerto Rico)/8/1934 (H1N1)及 A/香港（Hong Kong)/1968 (H3N2)病毒株的 HA1 的 氨基酸殘基53至276自HA -級序列中缺失，且用較短柔性連接序列GGGG置換此缺失。用 H3HK68構建體對小鼠進行疫苗接種不會誘生可與第1類群HA交叉反應的抗血清。此外，如 以下實例中所示，這些主干域多肽高度不穩定且未采取正確構象，如由展示結合至干區中 的保守抗原決定基的抗體不發生結合所證實。
[0010] 此外，Bommakanti等人（2010)描述一種基于HA2的多肽，其包含HA2的氨基酸殘 基1至172、7氨基酸連接子（GSAGSAG)、HA1的氨基酸殘基7至46、6氨基酸連接子GSAGSA， 后接撤1的殘基290至321，其中在撤1中有突變￥2971\130(^、￥3021'及03051'。該設計是 基于H3HA的序列（A/香港（Hong Kong)/1968)。該多肽僅針對H3亞型內另一流感病毒株 (A/Phil/2/82)而非針對H1亞型（A/PR/8/34)提供交叉保護。
[0011] 因此，仍存在對安全及有效的通用疫苗的需求，該通用疫苗刺激產生穩固的廣泛 中和抗體反應，且針對一組廣泛的當前及未來流感病毒株（季節性及大流行性）提供保護， 尤其針對系統發生第1類群和/或第2類群內的一或多種A型流感病毒亞型提供保護，以 用于有效預防及治療流感。
[0012] 概述
[0013] 本文提供流感血球凝集素主干域多肽，提供主干域多肽的方法，包含其的組合物， 包含其的疫苗及其使用方法。
[0014] 在第一方面中，本發明提供新穎免疫原性多肽，其包含流感血球凝集素主干域且 缺乏球狀頭部，稱為流感血球凝集素（HA)主干域多肽。多肽能夠在投與個體（尤其為人類 個體）時誘導免疫反應。本發明的多肽在膜遠程頭部域中存在的顯性抗原決定基不存在的 情況下，向免疫系統呈現膜近端主干域HA分子的保守抗原決定基。為此，移除構成頭部域 的ΗΑ0蛋白的一級序列的一部分，且將剩余氨基酸序列直接再連接或在一些實施例中藉由 引入較短柔性連接序列（'連接子'）而再連接，以恢復氨基酸鏈的連續性。所得序列藉由 引入特定突變來進一步修飾，這些特定突變使ΗΑ0分子的剩余部分的天然3維結構穩定。免 疫原性多肽不包含流感病毒的全長HA1和/或HA2。
[0015] 流感血球凝集素主干域多肽是基于一般用于人類流感疫苗制造的流感病毒株的 HA。具體而言，多肽是基于HI、H5和/或H3亞型的A型流感病毒的HA。
[0016] 在某些實施例中，本發明提供流感血球凝集素主干域多肽，其包含（a)流感血球 凝集素 HA1域，該流感血球凝集素 HA1域包含利用具有0至50個氨基酸殘基的連接序列共 價鍵聯至HA1C端主干區段的HA1N端主干區段；及（b)流感血球凝集素 HA2域，其中該血 球凝集素主干域多肽在HA1與HA2之間的接合點處可抵抗蛋白酶裂解，且其中連接HA2的 A螺旋與螺旋CD的氨基酸序列中的一或多個氨基酸與野生型流感HA2域相比已突變。HA1 及HA2域優選地來源于選自由HI、H5及H3亞型組成的組的A型流感病毒。
[0017] 如圖1中所指示，本發明的多肽在使螺旋A的C端殘基連接至螺旋CD的N端殘基 的HA2氨基酸序列中包含一或多個突變。在某些實施例中，該HA2氨基酸序列中的一或多 個疏水性氨基酸已由親水性氨基酸（諸如極性和/或帶電荷的氨基酸）或柔性氨基酸甘氨 酸（G)取代。
[0018] 在某些實施例中，HA1N端主干區段包含HA1的氨基酸1至X，且HA1C端主干區段 包含HA1的氨基酸y至末端（亦即HA1的C端氨基酸）。因此，在某些實施例中，HA1區段 中的缺失包含位置χ+1處的氨基酸至并且包括位置y-Ι處的氨基酸的氨基酸序列。在某些 實施例中，多肽不包含信號序列。因此，在某些實施例中，HA1N端區段包含HA1的氨基酸p 至X，其中P為成熟HA分子的第一個氨基酸（例如在SEQ ID NO: 1的情況下，p = 18)。普 通技術人員將能在無信號肽（例如SEQ ID NO: 1的氨基酸1至17)的情況下制備本文中所 述的多肽。在某些實施例中，本發明的多肽含有HA的細胞內序列及跨膜域。在其他實施例 中，本發明的多肽不包含HA的細胞內序列及跨膜域。在某些實施例中，已移除細胞內及跨 膜序列，例如HA2域的位置523、524、525、526、527、526、528、529或530(或等效位置）至 HA2域的C端的氨基酸序列。
[0019] 本發明的多肽不包含全長HA1。
[0020] 在某些實施例中，多肽經糖基化。
[0021] 在某些實施例中，免疫原性多肽實質上小于ΗΑ0,優選地缺乏HA的全部或實質上 全部球狀頭部。免疫原性多肽長度優選地不大于360個、優選地不大于350、340、330、320、 310、305、300、295、290、285、280、275或270個氨基酸。在某些實施例中，免疫原性多肽長度 為約250至約350個、優選地約260至約340個、優選地約270至約330個、優選地約270 至約330個氨基酸。
[0022] 在某些實施例中，與HA1及HA2域所基于的HA的氨基酸序列相比，多肽在HA1和 /或HA2域中另外包含一或多個其他突變。
[0023] 本發明亦提供用于提供流感血球凝集素干多肽的方法，該方法包含以下一般步 驟：
[0024] (a)提供流感ΗΑ0氨基酸序列；
[0025] (b)移除HA1與HA2之間的裂解位點；
[0026] (c)自ΗΑ0序列中移除球狀頭部域的氨基酸序列，尤其自位置χ+1開始至y-Ι的氨 基酸序列；
[0027] (d)在使螺旋A的C端殘基連接至螺旋⑶的N端殘基的氨基酸序列中引入一或多 個突變；及
[0028] (e)在HA主干域多肽中引入一或多個二硫橋鍵。
[0029] 可藉由這些方法獲得的多肽亦為本發明的一部分。
[0030] 在某些實施例中，多肽包含第1類群交叉中和抗體CR6261 (如WO 2008/028946中 所揭示）和/或抗體CR9114(如下文及共同待決申請EP11173953.8中所述；一種能夠結合 及中和第1類群及第2類群A型流感病毒以及B型流感病毒的抗體）的保守主干域抗原決 定基。因此，本發明的另一方面提供HA主干域多肽，其中這些多肽結合至抗體CR6261和/ 或抗體CR9114。在一實施例中，多肽不結合至CR8057(描述于W0 2010/130636中；一種僅 結合至H3流感病毒的單克隆抗體）。在某些實施例中，多肽結合至抗體CR8020、CR8043和 /或CR9114。本文提供的流感血球凝集素主干域多肽適用于免疫原性組合物（例如疫苗）， 該免疫原性組合物能夠針對復數種A型和/或B型流感病毒株產生免疫反應。在一實施例 中，流感血球凝集素主干域多肽能夠針對系統發生第1類群和/或第2類群的A型流感病 毒株、尤其針對系統發生第1類群及第2類群兩者的流感病毒株產生免疫反應。在一實施 例中，多肽能夠針對同源流感病毒株產生免疫反應。在一實施例中，多肽能夠針對屬于相同 和/或不同亞型的異源流感病毒株產生免疫反應。在另一實施例中，多肽能夠對系統發生 第1類群及第2類群兩者的流感病毒株及B型流感病毒株產生免疫反應。
[0031] 本發明的多肽可用于例如獨立治療和/或預防和/或診斷由流感病毒、尤其系統 發生第1類群或第2類群A型流感病毒和/或B型流感病毒引起的疾病或病狀，或與其他 預防性和/或治療性治療（諸如（現有或未來的）疫苗、抗病毒劑和/或單克隆抗體）組 合。
[0032] 在另一方面中，本發明提供編碼流感HA主干域多肽的核酸分子。在另一方面中， 本發明提供包含編碼免疫原性多肽的核酸的載體。
[0033] 在另一方面中，本發明提供在個體中誘導免疫反應的方法，該方法包含向個體投 與本發明的多肽和/或核酸分子。
[0034] 在另一方面中，本發明提供免疫原性組合物，其包含本發明的多肽和/或核酸分 子。本文提供的免疫原性組合物可呈允許組合物投與個體（例如小鼠、雪貂或人類）的任 何形式。在一特定實施例中，免疫原性組合物適于人類投與。多肽、核酸分子及組合物可用 于預防和/或治療流感病毒疾病的方法和/或用于診斷目的。組合物可另外包含醫藥學上 可接受的載劑或賦形劑。在某些實施例中，本文中所述的組合物包含佐劑或與佐劑組合投 與。
[0035] 在另一方面中，本發明提供多肽、核酸和/或免疫原性組合物，其用作疫苗。本發 明尤其是關于免疫原性多肽、核酸和/或免疫原性組合物，其在預防和/或治療由系統發生 第1類群和/或第2類群的A型流感病毒亞型和/或B型流感病毒引起的疾病或病狀中用 作疫苗。
[0036] 由以下本發明的詳細描述，將清楚本發明的多肽的各種實施例及用途。
[0037] 附圖簡要說明
[0038] Ml展示如存在于天然三聚體中的呈融合前狀態的HA單體的模型。HA1以淺灰色 展示，HA2以深灰色展示。如同連接此等二級結構組件的環一般，指示螺旋A(CR6261的抗 原決定基的重要部分）及螺旋CD (三聚體界面的一部分）。
[0039] 圖2 :如由FACS分析的單克隆抗體對全長HA及本發明的HA主干域多肽的結合。 A:染色后陽性的細胞百分比。B:平均熒光強度。H1-全長（SEQIDN0:1)、微型HA-cll(SEQ ID NO: 3)、微型 HA-cl 1+2 (SEQ ID NO: 4)、微型 HA-c 11+3 (SEQ ID NO: 5)、微型 HA-c 11+4 (SEQ ID N0:6)、微型 HA-cll+2+3(SEQ ID N0:7)、微型 HA-cll+2+3+4(SEQ ID N0:8)。
[0040] 圖3 :如由FACS分析的單克隆抗體對全長HA及HA主干域多肽的結合。A :染色后 陽性的細胞百分比。B :平均熒光強度。H1-全長（SEQ ID N0:1)、微型HA(SEQ ID N0:2)、微 型 HA-cll(SEQ IDN0:3)。
[0041] 圖4 :血清抗體對HEK293F表達的全長HA及本發明的多肽的結合。A :平均熒光強 度。B :染色后陽性的細胞百分比。H1-FL(SEQ ID N0:1)、CL1(SEQ ID N0:3)、CL1+2(SEQ ID N0:4)及 CL1+4(SEQ ID N0:6)。cM2 為陰性對照。
[0042] 圖5 :如由FACS分析的單克隆抗體對全長HA及HA主干域多肽的結合。上圖染色 后陽性的細胞百分比。下圖：平均熒光強度。H1-全長（SEQIDN0:1)、微型HA-cll(SEQID N0:3)、H1-微型 1-clll (SEQ ID N0:9)、H1-微型2-clll (SEQ ID NO: 10)、H1-微型3-clll (SEQ ID N0:11)、HI-微型 4-clll(SEQ ID N0:12)、HI-微型 l-clll+5(SEQ ID N0:13)、HI-微型 2-clll+5(SEQ ID N0:14)、HI 微型 3-clll+5(SEQ ID N0:15)及 HI-微型 4-clll+5(SEQ ID N0:16)。
[0043] 圖 6 :在經編碼 HA A/ 布里斯班（Brisbane)/59/2007 (SEQ ID NO: 1)、微型 HA-聚 簇 1 (SEQ ID NO: 3)、微型 2-聚簇 11 (SEQ ID NO: 10)、微型 1-聚簇 11+5 (SEQ ID NO: 13)、微型 2_聚簇11+5 (SEQ ID NO: 14)及cM2 (共同M2序列）的DNA肌肉內免疫或編碼HA A/布里斯 班（Brisbane)/59/2007 (SEQ ID NO: 1)、微型 2-聚簇 11+5(SEQ ID NO: 14)及 cM2(共同 M2 序列）的DNA的基因槍免疫之后，血清抗體對來自A/布里斯班（Brisbane) 59/2007的全長 HA的胞外域的結合。圖A :首次免疫后28天。圖B:免疫49天后。
[0044] 圖7 :如由FACS分析的單克降抗體對全長HA及HA主干域多肽的結合。上圖 染色后陽性的細胞百分比。下圖：平均熒光強度。H1-全長（SEQIDN0:1)、微型HA(SEQ ID N0:2)、HI-微型 2-clll+5(SEQ ID N0:14)、HI-微型 2-cll+5(SEQ ID N0:48)、HI-微型 2-cll+5+6(SEQ ID N0:46)、H1-微型 2-clll+5+6(SEQ ID N0:47)、H1-微型 2-cll+5+6-三聚 體（SEQ ID N0:44)、H1-微型 2-cll+5+6-GCN4(SEQ ID N0:45)。
[0045] 圖8 :如由FACS分析的單克隆抗體對全長HA及HA主干域多肽的結合。A :染色后 陽性的細胞百分比。B:平均熒光強度。
[0046] 圖9 :如由FACS分析的單克隆抗體對全長HA及HA主干域多肽的結合。A :染色后 陽性的細胞百分比。B:平均熒光強度。
[0047] 圖10 :某于呑俄(Hong Kong) /1/1968的構建體在細胞表面上的表達。
[0048] 圖11 :本發明的若干多肽的純化的SDS-PAGE (A至D)及蛋白質印跡（E至F)分析。 在蛋白質印跡中，將針對his標記的抗體用于檢測。
[0049] 圖12 :如由Elisa檢測的單克降抗體CR9114(A)、CR8020(B)及多克隆抗HI HA血 清（C)對本發明的若干多肽的結合。
[0050] 圖13 :本發明的多肽的糖基化的SDS-PAGE(A)及蛋白質印跡（B)分析。在去糖基 化之后，擴散條帶集中在預期分子量下。在蛋白質印跡中，將針對H1HA的多克隆血清用于 檢測。
[0051] 圖14 :本發明的多狀的SEC-MALS分析。跡線以SEQ ID N0標記。
[0052] 圖15 :A :表達SEQ ID NO: 145的細胞的上清液的蛋白質印跡分析。在蛋白質印跡 中，將針對his標記的抗體用于檢測。B :如由Elisa檢測的單克隆抗體CR9114 (正方形）、 CR6261(圓圈）、CR8020(向上三角形）及FI6v3(向下三角形）對SEQ IDN0:145的結合。
[0053] 圖16 :來自培養物上清液的SEQ ID N0:145在His截留管柱上的純化的洗脫概況。 本發明的多肽分別在l〇〇mM(A峰）及200mM(B峰）咪唑下洗脫。
[0054] 圖17 :A至B :SEQ ID NO: 145藉由尺寸排阻層析（Superdex200)純化的洗脫概況。 A峰及B峰均含有本發明的多肽。C:來自尺寸排阻層析的部分的非變性PAGE分析。大部 分經純化的蛋白在與該蛋白的單體形式一致的分子量下運作。D:來自尺寸排阻層析的部分 的SDS PAGE分析。
[0055] 圖18 :作為本申請中所述的DNA免疫方案結果的對同源全長蛋白胞外域的IgG反 應的時程。
[0056] 圖19 :針對來自同源病毒株H1N1 A/布里斯班（Brisbane) /59/2007 (A)及異源病 毒株H1N1 A/加利福尼亞（California)/07/2009 (B)的全長血球凝集素的胞外域，對個別小 鼠進行首次免疫后第7周時的IgG反應。空心符號對應于在分析檢測限以下的值。
[0057] 圖20 :針對來自同源病毒株H1N1 A/布里斯班（Brisbane)/59/2007 (A)、異源 病毒株H1N1 A/加利福尼亞（California)/07/2009 (B)、異源亞型病毒株H5N1 A/越南 (Vietnam)/1203/2004(0 及異源亞型病毒株 H3N2A/香港（Hong Kong)/1/1968 (D)的全長 血球凝集素的胞外域，對個別小鼠進行首次免疫后第7周時的IgG反應。空心符號對應于 在分析檢測限以下的值。
[0058] 圖21:基于H3 HA的主干域多肽的FACS分析。展示平均熒光強度㈧及陽性細 胞％⑶。
[0059] 圖22 :針對來自同源病毒株H1N1 A/布里斯班（Brisbane) /59/2007 (圖A)、異源 病毒株H1N1 A/加利福尼亞（California)/07/2009 (圖B)及異源亞型病毒株H5N1 A/越南 (Vietnam)/1203/2004(圖C)的全長血球凝集素，對個別小鼠進行首次免疫后第7周時的 IgG反應。空心符號對應于在分析檢測限以下的值。
[0060] 圖23 :單抗CR6261、CR9114、CR8020及CR9020以及多克隆抗H1血清對全長HA及 本發明的相應多肽的FACS分析。上圖平均熒光強度。實心條表示全長蛋白，條紋條表示本 發明的多肽。全長HA及來源于該序列的本發明的相應多肽具有相同的背景色。
[0061] 圖24 :實例21中所述的流感攻擊實驗的卡本-麥爾（Kaplan-Meier)存活曲線 (A)、體重變化⑶及臨床分數中值（C)。
[0062] 圖25 :根據實例22選擇的H1N1序列的比對。
[0063] 圖26 :根據實例22選擇的基于HI HA的主干域多肽的FACS分析。展示平均熒光 強度。
[0064] 圖27 :如由牛物層干渉術測定，旱三聚體及單體形式的全長HI HA(SEQ ID NO 149) 及s-Hl-微型2-聚簇l+5+6-GCN4(SEQ ID N0:145)對經固定的單克隆抗體CR6261(A)、 CR9114(B)及CR8020(C)的結合的動力學。
[0065] 圖28 :穩態滴定s-Hl-微型2-聚簇1+5+6-GCN4 (SEQ ID N0:145)對經固定的 CR6261(A)及CR9114(B)的結合，繼而進行生物層干涉術。
[0066] 圖29 :如由ELISA測定，在第49天時針對來自A/香港（Hong Kong)/1/1968的HA 的胞外域的IgG反應。實驗詳情描述于實例24中。空心符號對應于在分析檢測限以下的 值。
[0067] 圖30 :實例24中描述的流感攻擊實驗的卡本-麥爾存活曲線（A)、體重變化（B) 及臨床分數中值（C)。
[0068] 圖31 :根據實例25選擇的基于HI HA的主干域多肽的FACS分析。展示平均熒光 強度。
[0069] 圖 32 :如由來自 A/ 威斯康辛州（Wisconsin)/67/2005 (A)、A/ 香港（Hong Kong) /1/1968 (B)及A/Perth/16/2009 (C)的HA測定，49天后針對HA的胞外域的IgG反應。 實驗詳情描述于實例26中。空心符號對應于在分析檢測限以下的值。
[0070] 圖33 :如由ELISA測定，在49天后針對來自A/呑俄(Hong Kong)/1/1968的HA的 胞外域的IgG反應。實驗詳情描述于實例27中。空心符號對應于在分析檢測限以下的值。
[0071] 圖34 :根據實例28選擇的基于HI HA的主干域多肽的FACS分析。展示平均熒光 強度。
[0072] 定義
[0073] 下文給出如本發明中所用的術語的定義。
[0074] 本發明的氨基酸可為20種天然產生的氨基酸（或'標準'氨基酸）中的任一者或 其變異體（諸如D-脯氨酸（脯氨酸的D-對映異構體））、或并非天然可見于蛋白質中的任 何變異體（諸如正亮氨酸）。標準氨基酸可基于其性質劃分為數個組。重要因素為電荷、親 水性或疏水性、尺寸及官能基。此等性質對于蛋白質結構及蛋白質間相互作用很重要。一 些氨基酸具有特殊性質，諸如半胱氨酸，其可對其他半胱氨酸殘基形成共價二硫鍵（或二 硫橋鍵）；脯氨酸，其對多肽主鏈形成環；及甘氨酸，其與其他氨基酸相比柔性較大。表5展 示標準氨基酸的縮寫及性質。
[0075] 術語"氨基酸序列一致性"是指一對經比對的氨基酸序列之間的一致性或相似性 程度，通常以百分比形式表示。一致性百分比為在比對序列及引入空隙（如有必要）以獲得 最大序列同源性百分比之后，候選序列中與肽中相應氨基酸殘基一致（亦即，在比對中在 給定位置處的氨基酸殘基為相同殘基）或相似（亦即，如下文論述，在比對中在給定位置處 的氨基酸取代為保守性取代）的氨基酸殘基的百分比。序列同源性（包括序列一致性及相 似性百分比）使用此項技術中熟知的序列比對技術（諸如藉由目視檢查及數學計算）來測 定，或更優選地，比較藉由使用計算機程序比較序列信息來進行。一種例示性優選的計算機 程序為 Genetics Computer Group (GCG ;Madison, Wis.)威斯康辛州（Wisconsin)套裝 10. 0 版程序 'GAP'（Devereux 等人（1984))。
[0076] "保守性取代"是指一個類別的氨基酸經相同類別的另一氨基酸置換。在特定實施 例中，保守性取代不改變多肽的結構或功能或結構及功能兩者。出于保守性取代的目的，氨 基酸的類別包括疏水性（例如Met、Ala、Val、Leu)、中性親水性（例如Cys、Ser、Thr)、酸性 (例如Asp、Glu)、堿性（例如Asn、Gin、His、Lys、Arg)、構象破壞者（例如Gly、Pro)及芳 族（例如 Trp、Tyr、Phe)。
[0077] 如本文所用，術語"疾病"及"病癥"可互換使用以指代個體中的病狀。在一些實 施例中，病狀為病毒性感染，尤其為流感病毒感染。在特定實施例中，術語"疾病"是指由細 胞或個體中存在病毒引起、或藉由病毒對細胞或個體的侵襲引起的病理狀態。在某些實施 例中，病狀為個體中的疾病，其嚴重度藉由經由投與免疫原性組合物在個體中誘導免疫反 應來降低。
[0078] 如本文所用，術語"有效量"在向個體投與療法的情形下是指具有預防性和/或治 療性作用的療法的量。在某些實施例中，"有效量"在向個體投與療法的情形下是指足以獲 得以下效果的療法的量：降低或改善流感病毒感染、與其相關的疾病或癥狀的嚴重度，諸如 (但不限于）減少流感病毒感染、與其相關的疾病或癥狀的持續時間；預防流感病毒感染、 與其相關的疾病或癥狀的發展；預防流感病毒感染、與其相關的疾病或癥狀的發生或發作 或復發；預防或減少流感病毒由一個個體傳播至另一個體；減少個體的住院治療和/或住 院治療持續時間；提高患有流感病毒感染或與其相關的疾病的個體的存活率；消除流感病 毒感染或與其相關的疾病；抑制或減少流感病毒復制；降低流感病毒效價；和/或增強和/ 或改良另一療法的預防性或治療性作用。在某些實施例中，有效量不引起全面保護免于流 感病毒疾病，但與未經治療的個體相比引起流感病毒效價降低或數目減少。流感病毒的效 價、數目或總負載降低的益處包括（但不限于）感染的癥狀嚴重度較低、感染的癥狀較少及 與感染有關的疾病的持續時間減少。
[0079] 如本文所用的術語"宿主"意欲指代已引入載體（諸如克隆載體或表達載體）的 生物體或細胞。生物體或細胞可為原核或真核的。宿主優選地包含經分離的宿主細胞，例 如培養中的宿主細胞。術語"宿主細胞"僅意味經修飾以用于本發明的多肽的（過度）表 達的細胞。應理解術語宿主意欲不僅指代特定個體生物體或細胞，而且指代該生物體或細 胞的子代。由于某些修飾可能因突變或環境影響而發生于繼代中，故該子代可能實際上并 非與親本生物體或細胞一致，但仍包括于如本文中所用的術語"宿主"的范圍內。
[0080] 如本文所用的術語"包括（included或including) "視為后接措詞"（但不限 于）"。
[0081] 如本文所用，術語"感染"意謂藉由病毒在細胞或個體中倍增和/或存在而侵襲。 在一個實施例中，感染為"活性"感染，亦即，病毒在細胞或個體中復制的感染。該感染特征 在于病毒自經病毒最初感染的細胞、組織和/或器官傳播至其他細胞、組織和/或器官中。 感染亦可為潛伏性感染，亦即，病毒不復制的感染。在某些實施例中，感染是指由細胞或個 體中存在病毒引起、或藉由病毒對細胞或個體的侵襲引起的病理狀態。
[0082] 流感病毒分類成流感病毒類型：A屬、B屬及C屬。如本文所用的術語"流感病毒 亞型"是指A型流感病毒變異體，其特征在于血球凝集素（H)及神經胺酸酶（N)病毒表面蛋 白質的組合。根據本發明，流感病毒亞型可利用其Η號數稱為諸如"包含H3亞型的HA的 流感病毒"、"Η3亞型的流感病毒"或"Η3流感"，或利用Η號數與Ν號數的組合稱為諸如"流 感病毒亞型Η3Ν2"或"Η3Ν2"。術語"亞型"特定言之包括各亞型內的所有個別"病毒株"， 這些病毒株通常由突變產生且展示不同病原性概況，包括天然分離株以及人造突變株或重 配株及其類似物。這些病毒株亦可稱為病毒亞型的各種"分離株"。因此，如本文所用，術語 "病毒株"及"分離株"可互換使用。人類流感病毒株或分離株的現行命名法包括病毒類型 (屬）（亦即Α、Β或C)、首次分離的地理位置、病毒株號數及分離年份，通常在括號中給出ΗΑ 及ΝΑ的抗原描述，例如A/Moscow/10/00 (Η3Ν2)。非人類病毒株亦在命名中包括起源宿主。 A型流感病毒亞型可另外藉由參考其系統發生類群分類。系統發生分析已展示血球凝集素 再分成兩個主要類群：尤其系統發生第1類群（"第1類群"流感病毒）中的H1、H2、H5、H9 亞型，及尤其系統發生第2類群（"第2類群"流感病毒）中的H3、H4、H7及H10亞型。
[0083] 如本文所用，術語"流感病毒疾病"是指由細胞或個體中存在流感病毒（例如A型 或B型流感病毒）或者流感病毒侵襲細胞或個體而產生的病理狀態。在特定實施例中，術 語是指由流感病毒引起的呼吸道疾病。
[0084] 如本文所用，術語"核酸"意欲包括DNA分子（例如cDNA或基因組DNA)及RNA分 子（例如mRNA)及使用核苷酸類似物產生的DNA或RNA的類似物。核酸可為單鏈或雙鏈 的。如普通技術人員將輕易地了解，核酸分子可以化學方式或以生物化學方式修飾，或可含 有非天然或經衍生的核苷酸堿基。這些修飾包括例如：標記；甲基化；用類似物取代一或多 個天然產生的核苷酸；核苷酸間修飾，諸如不帶電荷的鍵聯（例如膦酸甲酯、磷酸三酯、氨 基磷酸酯、氨基甲酸酯等）、帶電荷的鍵聯（例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）；側接部分 (例如多肽）；嵌入劑（例如吖啶、補骨脂素等）；螯合劑；烷基化劑；及經修飾的鍵聯（例如 α變旋異構核酸等）。除非另有說明，否則提及核酸序列涵蓋其互補序列。因此，提及具有 特定序列的核酸分子應理解為涵蓋其互補鏈以及其互補序列。互補鏈亦適用于例如反義療 法、雜交探針及PCR引子。
[0085] 如本文所用，在某些實施例中，ΗΑ中氨基酸的編號是基于野生型流感病毒的ΗΑ0 中氨基酸的編號，例如Η1Ν1流感病毒株Α/布里斯班（Brisbane)/59/2007 (SEQ ID NO: 1)的 氨基酸的編號。因此，如本發明中所用，措詞"HA中位置"x"處的氨基酸"意謂對應于特定 野生型流感病毒（例如A/布里斯班（Brisbane)/59/2007 (SEQ ID NO: 1 ;其中HA2域的氨基 酸已以斜體形式指示））的ΗΑ0中位置X處的氨基酸的氨基酸。普通技術人員將理解在其他 流感病毒株和/或亞型中的等效氨基酸可藉由多重序列比對來測定（參見例如表8)。應注 意，在貫穿本申請所用的編號系統中，1是指不成熟ΗΑ0蛋白（SEQ ID NO: 1)的N端氨基酸。 成熟序列起始于例如SEQ ID NO: 1的位置18。在某些實施例中，等效氨基酸的編號是基于H3 ΗΑ0中氨基酸的編號，尤其基于H3N2流感病毒株A/威斯康辛州（Wisconsin)/67/2005 (SEQ ID N0:89)的氨基酸的編號。其他H3 HA序列中的等效氨基酸可藉由比對來測定。普通技 術人員將理解在制造期間引導蛋白質轉運的前導序列（或信號序列；例如對應于SEQ ID NO:89的氨基酸1至17) -般不存在于例如用于疫苗的最終多肽中。因此，在某些實施例中， 本發明的多肽包含不具有前導序列的氨基酸序列，亦即氨基酸序列是基于不具有信號序列 的ΗΑ0的氨基酸序列。
[0086] 如普通技術人員已知，"多肽"是指利用酰胺鍵鍵聯的氨基酸的聚合物。如本文所 用，該術語可指代利用共價酰胺鍵鍵聯的單條多肽鏈。該術語亦可指代利用非共價相互作 用（諸如離子接觸、氫鍵、凡得瓦爾力（Van derWaals)接觸及疏水性接觸）締合的多條多 肽鏈。普通技術人員將認識到該術語包括例如藉由翻譯后處理而經修飾的多肽，該翻譯后 處理諸如為信號肽裂解、二硫鍵形成、糖基化（例如N連接型糖基化）、蛋白酶裂解及脂質修 飾（例如S-棕櫚酰化）。
[0087] "主干域多肽"是指多肽，其包含構成天然產生的（或野生型）血球凝集素（HA)的 主干域的一或多條多肽鏈。主干域多肽通常為單條多肽鏈（亦即對應于血球凝集素 ΗΑ0多 肽的主干域）或兩條多肽鏈（亦即對應于與血球凝集素 HA2多肽締合的血球凝集素 HA1多 肽的主干域）。根據本發明，與野生型HA分子相比，主干域多肽包含一或多個突變，特定言 之野生型HA的一或多個氨基酸殘基可能經其他氨基酸取代，這些其他氨基酸并非天然產 生于特定野生型HA中的相應位置上。如下文所述，本發明的主干域多肽可另外包含一或多 個連接序列。
[0088] 術語"載體"表示核酸分子，其中可插入第二核酸分子以用于引入其將復制且在 一些情況下表達的宿主中。換言之，載體能夠轉運其已連接的核酸分子。如本文所用，術 語"載體"涵蓋克隆載體以及表達載體。載體包括（但不限于）質體、黏質體、細菌人工染 色體（BAC)及酵母人工染色體（YAC)及來源于噬菌體或植物或動物（包括人類）病毒的載 體。載體包含由所提出的宿主識別的復制起點，且在表達載體的情況下，包含由宿主識別的 啟動子及其他調節區。某些載體能夠在引入其的宿主中自主復制（例如具有細菌復制起點 的載體可在細菌中復制）。其他載體一旦引入宿主中后即可整合于宿主的基因組中，且藉此 與宿主基因組一起復制。
[0089] 如本文所用，術語"野生型"在病毒的情形下是指流行、自然傳播且產生典型疾病 爆發的流感病毒。
[0090] 詳細描沭
[0091] 流感病毒對全球公眾健康具有重大影響，每年引起數百萬例嚴重疾病、數以千計 的死亡及可觀的經濟損失。當前三價流感疫苗對疫苗病毒株及密切相關的分離株誘發強力 中和抗體反應，但極少擴展至亞型內分歧較大的病毒株或其他亞型。此外，選擇適當疫苗病 毒株存在許多挑戰且經常引起欠佳的保護。另外，預測下一次大流行病毒的亞型（包括其 將出現的時間及地點）在當前是不可能的。
[0092] 血球凝集素（HA)為來自A型流感病毒的主要包膜糖蛋白，其為中和抗體的主要標 靶。血球凝集素在進入過程期間具有兩個主要功能。第一，血球凝集素經由與唾液酸受體 相互作用來介導病毒對靶細胞表面的附著。第二，在病毒內吞之后，血球凝集素隨后觸發病 毒與內體膜的融合以將其基因組釋放至靶細胞的細胞質中。HA包含具有約500個氨基酸的 較大胞外域，該胞外域由宿主來源的酶裂解，產生仍然利用二硫鍵鍵聯的2條多肽。大部分 N端片段（HA1，320至330個氨基酸）形成膜遠程球狀域，該膜遠程球狀域含有由病毒中和 抗體識別的受體結合位點及大多數決定基。較小C端部分（HA2,約180個氨基酸）形成干 樣結構，該干樣結構使球狀域錨定至細胞或病毒膜。HA1多肽中亞型之間的序列同源性程 度（亞型之間34%至59%同源性）與HA2多肽中（51%至80%同源性）相比較小。最保 守的區域為裂解位點周圍的序列，尤其為HA2 N端23個氨基酸，其在所有A型流感病毒亞型 中均為保守的（Lorieau等人，2010)。此區域的一部分以HA前驅體分子（ΗΑ0)中的表面環 形式暴露，但在ΗΑ0裂解成HA1及HA2時變得不可及。
[0093] 大多數中和抗體結合至圍繞受體結合位點的環且干擾受體結合及附著。由于此等 環高度易變，故大多數靶向此等區的抗體為病毒株特異性的，解釋當前疫苗誘發如此有限 的病毒株特異性免疫的原因。然而，近來產生具有廣泛交叉中和效能的針對流感病毒血球 凝集素的完全人類單克隆抗體。功能及結構分析已揭示此等抗體干擾膜融合過程且針對流 感HA蛋白的主干域中的高度保守抗原決定基（Throsby等人，2008 ;Ekiert等人2009 ;W0 2008/028946 ;W0 2010/130636)。
[0094] 根據本發明，已設計含有此等抗原決定基的新穎HA主干域多肽，以便建立基于 通用抗原決定基的疫苗，該疫苗針對廣泛范圍流感病毒株誘發保護。基本上，首先自全長 HA分子中移除高度易變且免疫顯性的部分（亦即頭部域），產生主干域多肽（亦稱為微型 HA)。以此方式，免疫反應將對定位有針對廣泛中和抗體的抗原決定基的主干域重定向。上 述廣泛中和抗體用于探查新建分子的正確折疊，并用于證實存在中和抗原決定基。
[0095] 本發明的主干域多肽能夠在膜遠程頭部域中存在的顯性抗原決定基不存在的情 況下，向免疫系統呈現膜近端主干域HA分子的保守抗原決定基。為此，移除構成頭部域的 ΗΑ0蛋白的一級序列的一部分，且直接再連接或在一些實施例中藉由引入較短柔性連接序 列（'連接子'）來再連接，以恢復多肽鏈的連續性。所得多肽序列藉由引入特定突變來進 一步修飾，這些突變使ΗΑ0分子的剩余部分的天然3維結構穩定。
[0096] 因此，本發明提供多肽，其包含（a)流感血球凝集素 HA1域，該流感血球凝集素 HA1 域包含利用具有〇至50個氨基酸殘基的連接序列共價鍵聯至HA1C端主干區段的HA1N端 主干區段；及（b)流感血球凝集素 HA2域，其中HA2域中的一或多個氨基酸已突變。因此， 在本發明的多肽中，HA2域與HA主干域多肽所基于的野生型流感血球凝集素的HA2域相比 包含一或多個突變。
[0097] 流感血球凝集素主干域多肽是基于一般用于人類流感病毒疫苗的A型流感病毒 亞型的HA。在優選地實施例中，主干域多肽是基于包含H1、H5和/或H3亞型的HA的流感 病毒的HA。
[0098] 本發明特定言之提供流感血球凝集素主干域多肽，其包含（a)流感血球凝集素 HA1域，該流感血球凝集素 HA1域包含利用具有0至50個氨基酸殘基的連接序列共價鍵聯 至HA1 C端主干區段的HA1 N端主干區段；及（b)流感血球凝集素 HA2域，其中血球凝集素 主干域多肽在HA1與HA2之間的接合點處可抵抗蛋白酶裂解，且其中連接HA2的A螺旋與 螺旋CD的氨基酸序列中的一或多個氨基酸與野生型流感HA2域相比已突變。HA1及HA2域 優選地來源于選自由HI、H5及H3組成的組的A型流感病毒亞型。
[0099] 因此，如圖1中所指示，本發明的多肽在使螺旋A的C端殘基連接至螺旋⑶的N 端殘基的HA2氨基酸序列中包含一或多個突變。在某些實施例中，該HA2氨基酸序列中的 一或多個疏水性氨基酸已由親水性氨基酸（諸如極性和/或帶電荷的氨基酸）或柔性氨基 酸甘氨酸（G)取代。
[0100] 本發明的多肽不包含全長HA1。
[0101] 在某些實施例中，免疫原性多肽實質上小于ΗΑ0,優選地缺乏HA的全部或實質上 全部球狀頭部。免疫原性多肽長度優選地不大于360個、優選地不大于350、340、330、320、 310、305、300、295、290、285、280、275或270個氨基酸。在某些實施例中，免疫原性多肽長度 為約250至約350個、優選地約260至約340個、優選地約270至約330個、優選地約270 至約330個氨基酸。
[0102] 在某些實施例中，與獲得HA1及HA2域的HA的氨基酸序列相比，多肽在HA1和/ 或HA2域中另外包含一或多個其他突變。由此，進一步增強干多肽的穩定性。
[0103] 根據本發明，"HA1 N端區段"是指對應于流感血球凝集素（HA)分子的HA1域的氨 基端部分的多肽區段。在某些實施例中，HA1 N端多肽區段包含HA1域的位置1至位置X的 氨基酸，其中位置X上的氨基酸為HA1內的氨基酸殘基。術語"HA1 C端區段"是指對應于 流感血球凝集素 HA1域的羧基端部分的多肽區段。在某些實施例中，HA1 C端多肽區段包含 HA1域的位置y至且包括C端氨基酸的氨基酸，其中位置y上的氨基酸為HA1內的氨基酸殘 基。根據本發明，y大于X，因此，HA1 N端區段與HA1 C端區段之間（亦即HA1的位置X上 的氨基酸與位置y上的氨基酸之間）的HA1域的區段已缺失，且在一些實施例中，經連接序 列置換。
[0104] 在某些實施例中，HA1 N端主干區段包含HA1的氨基酸1至x，且HA1 C端主干區段 包含HA1的氨基酸y至末端。因此，在某些實施例中，HA1區段中的缺失包含位置x+1處的 氨基酸至且包括位置y-Ι處的氨基酸的氨基酸序列。
[0105] 在某些實施例中，多肽不包含信號序列。因此，在某些實施例中，HA1N端區段包含 HA1的氨基酸p至X，其中p為成熟HA分子的第一個氨基酸（例如在SEQ IDN0:1的情況下， P = 18)。普通技術人員將能在無信號肽（例如SEQ ID NO: 1的氨基酸1至17)的情況下制 備本文中所述的多肽。在某些實施例中，本發明的多肽含有HA的細胞內序列及跨膜域。在 其他實施例中，本發明的多肽不包含HA的細胞內序列及跨膜域。在某些實施例中，已移除 細胞內及跨膜序列，例如HA2域的位置523、524、525、526、527、526、528、529或530 (或等效 位置）至HA2域的C端的氨基酸序列。
[0106] 根據本發明，血球凝集素主干域多肽在HA1與HA2之間的接合點處可抵抗蛋白酶 裂解。普通技術人員已知跨越HA1及HA2的Arg(R)-Gly(G)序列為胰蛋白酶及胰蛋白酶樣 蛋白酶的識別位點且通常裂解以達成血球凝集素活化。由于本文中所述的HA主干域多肽 不應活化，故本發明的流感血球凝集素主干域多肽耐蛋白酶裂解。因此，根據本發明，移除 蛋白酶裂解位點，或使跨越HA1及HA2的蛋白酶位點突變成耐蛋白酶裂解的序列。
[0107] 在某些實施例中，HA1 C端主干區段的C端氨基酸殘基為除精氨酸（R)或賴氨酸 (K)以外的任何氨基酸。在某些實施例中，HA1 C端氨基酸為谷氨酰胺（Q)、絲氨酸（S)、蘇 氨酸（T)、天冬酰胺（N)、天冬氨酸（D)或谷氨酸（E)。在某些實施例中，HA1 C端主干區段 的C端氨基酸殘基為谷氨酰胺（Q)。
[0108] 在某些實施例中，多肽經糖基化。
[0109] 流感血球凝集素主干域多肽可基于任何天然產生的A型流感血球凝集素病毒的 HA，該A型流感血球凝集素病毒屬于用于人類流感疫苗的亞型。一般用于流感疫苗的A型流 感病毒亞型為H1、H3或H5亞型的A型流感病毒。"基于"意謂HA1域和/或HA2域的N端 區段和/或C端區段與HI、H3和/或H5亞型的任何天然產生的流感血球凝集素的HA1和 /或HA2域的相應N端和/或C端區段具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、 97 %、98 %或99 %氨基酸序列一致性，該H1、H3和/或H5亞型為普通技術人員已知或后來 發現的。在某些實施例中，流感血球凝集素主干域多肽是基于第1類群A型流感病毒的流 感血球凝集素。在某些實施例中，流感血球凝集素主干域多肽是基于第2類群A型流感病 毒的流感血球凝集素。在一些實施例中，流感血球凝集素主干域多肽為雜交或嵌合多肽，其 包含以下或由以下組成：來自復數種流感病毒株或亞型的區段和/或域。舉例而言，流感血 球凝集素主干域多肽可包含來自不同A型流感病毒HA亞型的HA1 N端及HA1 C端主干區段 和/或HA2域。
[0110] 在某些實施例中，多肽是基于H1HA。如下文所述，在一特定實施例中，多肽包含來 自以下或基于以下的血球凝集素主干域：包含H1亞型的HA的A型流感病毒的HA，諸如來 自流感病毒A/布里斯班（Brisbane)/59/2007 (H1N1) (SEQ ID NO: 1)。普通技術人員將理解， 亦可根據本發明使用包含H1亞型的HA的其他A型流感病毒。在某些實施例中，多肽包含 基于選自表7的A型H1流感病毒的HA的血球凝集素主干域。
[0111] 在某些實施例中，多肽包含HA1 N端多肽區段，該HA1 N端多肽區段包含HI HA1域 的位置1至位置X的氨基酸，其中X為位置46上的氨基酸與位置60上的氨基酸之間的任 何氨基酸，諸如為位置47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59上的氨基酸，優選地 其中X為52、53、55或59。多肽優選地包含不具有信號序列的HA1 N端區段，亦即包含HA1 域的位置18(例如對于HI HA而言，諸如SEQ IDN0:1 ;或其他H1流感病毒株中的等效位置） 至位置X的氨基酸的HA1 N端區段。因此，在某些實施例中，HA1 N端區段包含HA1域的位 置P (其中對于H1HA而言，在SEQ IDN0:1中，p = 18 ;或其他HI HA上的等效位置）至位置 X的氨基酸。
[0112] 在某些實施例中，HA1 C端多肽區段包含HI HA1域的位置y至且包括C端氨基酸 的氨基酸，其中y為HI HA1的位置290上的氨基酸與位置325上的氨基酸之間的任何氨基 酸，優選地其中y為291、303、318或321。根據本發明，HA2域在使螺旋A的C端殘基連接 至螺旋⑶的N端殘基的HA2氨基酸序列中包含一或多個突變（圖1)。在某些實施例中，該 HA2氨基酸序列中的一或多個疏水性氨基酸已由親水性氨基酸（諸如極性和/或帶電荷的 氨基酸）取代。在某些實施例中（例如對于HI HA而言，諸如SEQ ID NO: 1)，連接螺旋A的 C端殘基與螺旋CD的N端殘基的HA2氨基酸序列包含流感HA2的殘基402至418之間的氨 基酸序列。在某些實施例中，連接螺旋A的C端殘基與螺旋CD的N端殘基的HA2氨基酸序 列包含氨基酸序列 MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R) (SEQ ID N0:17)。
[0113] 在某些實施例中，x為59且y為291。
[0114] 在某些實施例中，X為52且y為321。
[0115] 在某些實施例中，X為53且y為303。
[0116] 在某些實施例中，X為55且y為318。
[0117] 在一實施例中，使螺旋A的C端殘基連接至螺旋CD的N端殘基的氨基酸序列對應 于：SEQ ID NO: 1的HA2的位置402上的氨基酸與位置418上的氨基酸之間的氨基酸序列， 其中多肽在跨越SEQ ID NO: 1的氨基酸402至418的氨基酸序列中包含一或多個突變。血 清型H1的流感HA的殘基402至418之間的氨基酸序列包含氨基酸序列MNTQFTAVGKEFN (H/ K)LE(K/R) (SEQ ID N0:17)。在某些實施例中，血清型H1的流感HA的殘基402至418之間 的氨基酸序列包含氨基酸序列MNTQXJAX 2GKEX3N(H/K)X4E(K/R)。
[0118] 因此，在某些實施例中，如表6中所指示，多肽在HI HA2域中包含一或多個突變。 在某些實施例中，位置406、409、413及416上的氨基酸中的一或多者（亦即氨基酸Xi、X 2、 X3&X4中的一或多者）已突變（編號參考SEQ ID NO: 1)。在某些實施例中，位置406上的 氨基酸（亦即XD已轉變成選自由以下組成的組的氨基酸：S、T、N、Q、R、H、K、D、E&Gdt 選地為S。在某些實施例中，位置409上的氨基酸（亦即X2)已轉變成選自由以下組成的組 的氨基酸：S、T、N、Q、R、Η、K、D、E及G，優選地為T、Q或G。在某些實施例中，位置413上的 氨基酸（亦即X 3)已轉變成選自由以下組成的組的氨基酸：S、T、N、Q、R、Η、K、D、E、G，優選 地為S。在某些實施例中，位置416上的氨基酸（亦即X 4)已轉變成選自由以下組成的組的 氨基酸：3、1\隊〇、1?、!1、1(、03、6，優選地為3。亦可能為此等突變的組合。
[0119] 在某些實施例中，HA1 N端主干區段包含HA1的氨基酸殘基1至59,且HA1 C端主 干區段包含HA1的氨基酸殘基291至343,其中位置343上的氨基酸（亦即R343)已突變 且為除R以外的氨基酸，優選地為谷氨酰胺（Q)。在某些實施例中，HA1 N端區段由HA1的 氨基酸殘基1至59組成，且HA1 C端區段由HA1的氨基酸殘基291至343組成。應注意氨 基酸的編號是基于HI ΗΑ0中氨基酸的編號，特定言之是基于H1N1流感病毒株A/布里斯班 (Brisbane)/59/2007 (SEQ ID NO: 1)的氨基酸的編號。應注意由于不同流感亞型/病毒株的 HA序列與彼此相比可能在頭部區中具有插入或缺失，故編號未必總是相同。普通技術人員 將能藉由序列比對來測定不同流感病毒株和/或亞型的HA序列中的等效氨基酸位置。
[0120] 在某些實施例中，HA1 N端多肽區段不包含信號序列。在優選地實施例中，HA1 N端 區段包含HA1域的位置18至位置59的氨基酸。在某些實施例中，HA1 N端區段由HA1域的 氨基酸18至59組成。
[0121] 在一些實施例中，本發明的多肽在HA1域和/或HA2域中包含一或多個其他突變 (亦即氨基酸取代）。因此，在某些實施例中，HA1域另外包含以下突變中的一或多者：L58T、 V314T及I316T。再次應注意氨基酸的編號是基于H1HA0中氨基酸的編號，特定言之是基于 H1N1流感病毒株A/布里斯班（Brisbane)/59/2007 (SEQ ID N0:1)的氨基酸的編號。普通 技術人員將能測定其他H1流感病毒的HA中的等效氨基酸，且因此將能測定等效突變。
[0122] 在一特定實施例中，HA1域包含突變L58T、V314T及I316T，且HA2域包含以下突變 中的一或多者：F406S、V409T 及 L416S。
[0123] 在某些實施例中，HA1域另外包含突變K321C且/或HA2域另外包含以下突變中 的一或多者：Q405C、F413C、E421C 及 Y502S。
[0124] 在一特定實施例中，HA1域包含突變L58T、V314T、I316T及K321C，且HA2域包含 突變：Q405C、F406S、V409T 及 L416S。
[0125] 在一特定實施例中，HA1域包含突變L58T、V314T及I316T，且HA2域包含突變： F406S、V409T、F413C、L416S 及 E421C。
[0126] 在一特定實施例中，HA1域包含突變L58T、V314T及I316T，且HA2域包含突變： F406S、V409T、L416S 及 Y502S。
[0127] 在一特定實施例中，HA1域包含突變L58T、V314T、I316T及K321C，且HA2域包含 突變：Q405C、F406S、V409T、F413C、L416S 及 E421C。
[0128] 在一特定實施例中，HA1域包含突變L58T、V314T、I316T及K321C，且HA2域包含 突變：Q405C、F406S、V409T、F413C、L416S、E421C 及 Y502S。
[0129] 在其他實施例中，HA2域另外包含突變M420I及V421I中的一或多者或等效突變。
[0130] 在一特定實施例中，HA1域包含突變L58T、V314T及I316T，且HA2域包含以下突變 中的一或多者：F406S、V409T、L416S、M420I 及 V421I。
[0131] 在某些實施例中，HA1N端主干區段包含HA1的氨基酸殘基1至52,優選地為HA1 的氨基酸殘基18至52,且HA1 C端主干區段包含HA1的氨基酸殘基321至343,其中位置 343上的氨基酸（亦即R343)已突變且為除R以外的氨基酸，優選地為谷氨酰胺（Q)，其中 HA2域包含突變F406S、V409T、L416S、M420I及V421I。在某些實施例中，HA1 N端主干區段 由HA1的氨基酸殘基1至52、優選地HA1的氨基酸殘基18至52組成，且HA1 C端主干區段 由HA1的氨基酸殘基321至343組成。
[0132] 在某些實施例中，HA1 N端主干區段包含HA1的氨基酸殘基1至53,優選地為HA1 的氨基酸殘基18至53,且HA1 C端主干區段包含HA1的氨基酸殘基303至343,其中位置 343上的氨基酸（亦即R343)已突變且為除R以外的氨基酸，優選地為谷氨酰胺（Q)。在某 些實施例中，HA1 N端主干區段由HA1的氨基酸殘基1至53、優選地HA1的氨基酸殘基18至 53組成，且HA1 C端主干區段由HA1的氨基酸殘基303至343組成。在一特定實施例中，HA1 域包含突變V314T及I316T，且HA2域包含以下突變中的一或多者：F406S、V409T、L416S、 M420I及V421I。在一優選的實施例中，多肽包含SEQIDN0:11的氨基酸序列。
[0133] 在某些實施例中，HA1 N端主干區段包含HA1的氨基酸殘基1至55,優選地為HA1 的氨基酸殘基18至55,且HA1 C端主干區段包含HA1的氨基酸殘基318至343,其中位置 343上的氨基酸（亦即R343)已突變且為除R以外的氨基酸，優選地為谷氨酰胺（Q)。在某 些實施例中，HA1 N端主干區段由HA1的氨基酸殘基1至55、優選地HA1的氨基酸殘基18至 55組成，且HA1 C端主干區段由HA1的氨基酸殘基318至343組成。在一實施例中，HA2域 包含突變 F406S、V409T、L416S、M420I 及 V421I。
[0134] 在某些實施例中，多肽另外包含以下突變：HA1域中的R324C及HA2域中的T436C。
[0135] 在一特定實施例中，HA1域包含突變L58T、V314T、I316T及R324C，且HA2域包含 以下突變中的一或多者： 1?4065、￥4091'、14165、財2〇1、料211及了436(：。
[0136] 在一實施例中，HA1域包含突變R324C，且HA2域包含突變F406S、V409T、L416S、 M420I、V421I 及 T436C。
[0137] 在另一實施例中，HA1域包含突變V314T、I316T及R324C，且HA2域包含以下突變 中的一或多者：F406S、V409T、L416S、M420I、V421I 及 T436C。
[0138] 在一實施例中，HA1域包含突變R324C，且HA2域包含突變F406S、V409T、L416S、 M420I、V421I 及 T436C。
[0139] 在某些實施例中，本發明的多肽含有HA的細胞內序列及跨膜域。在其他實施例 中，已移除細胞內及跨膜序列，例如HA2域的位置523、524、525、526、527、526、528、529或 530 (或等效位置）至HA2域的C端（編號根據SEQ ID NO: 1)的氨基酸序列。在某些實施 例中，藉由引入已知形成三聚體結構的序列，亦即AYVRKDGEWVLL(SEQ IDN0:143)('折疊子' 序列），任選地經由連接子連接，使多肽進一步穩定。連接子任選地可含有裂解位點以用于 之后根據普通技術人員所熟知的方案處理。為了促進可溶性形式的純化，可添加標記序列， 例如經由較短連接子（例如EGR)連接的his標記（HHHHHHH)。在一些實施例中，在不存在 折疊子序列的情況下添加連接子及his標記序列。
[0140] 在某些實施例中，已移除HA2域的位置530 (或等效位置）至HA2域的C端（編 號根據SEQ ID NO: 1)的氨基酸序列。在某些實施例中，細胞內及跨膜序列已由氨基酸序列 AGRHHHHHHH(SEQ ID N0:81)或 SGRSLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHH(SE Q ID NO :82)置換。
[0141] 在某些實施例中，多肽選擇性結合至抗體CR6261和/或CR9114。在一實施例中， 多肽不結合至抗體CR8057。在一實施例中，CR6261包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 SEQ ID N0:20的氨基酸序列；及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID N0:21的氨基酸序 列；CR9114包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID N0:18的氨基酸序列；及輕鏈可變 區，該輕鏈可變區包含SEQ ID N0:19的氨基酸序列。在一實施例中，CR8057包含：重鏈可變 區，該重鏈可變區包含SEQ ID N0:22的氨基酸序列；及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID N0:23的氨基酸序列。
[0142] 如上所述，多肽包含流感血球凝集素 HA1域，該流感血球凝集素 HA1域包含利用具 有0至50個氨基酸殘基的連接序列共價鍵聯至HA1 C端主干區段的HA1 N端主干區段。連 接序列不以天然產生的（或野生型）HA形式出現。在某些實施例中，連接子為包含以下的 肽：1個氨基酸殘基、2個或2個以下氨基酸殘基、3個或3個以下氨基酸殘基、4個或4個以 下氨基酸殘基、5個或5個以下氨基酸殘基、10個或10個以下氨基酸殘基、15個或15個以 下氨基酸殘基、或20個或20個以下氨基酸殘基、或30個或30個以下氨基酸殘基、或40個 或40個以下氨基酸殘基、或50個或50個以下氨基酸殘基。在一特定實施例中，連接序列為 選自由以下組成的組的序列：G、GS、GGG、GSG、GSA、GSGS、GSAG、GGGG、GSAGS、GSGSG、GSAGSA、 GSAGSAG 及 GSGSGSG。
[0143] 本發明亦提供用于提供本發明的多肽、特定言之提供本發明的HI HA主干域多肽 的方法，以及利用此等方法可獲得或獲得的多肽。在某些實施例中，該方法包含以下步驟：
[0144] (a)提供流感ΗΑ0氨基酸序列，特定言之血清型H1的流感ΗΑ0氨基酸序列；
[0145] (b)移除HA1與HA2之間的裂解位點，優選地藉由使HA1的C端氨基酸突變成除精 氨酸（R)或賴氨酸⑷以外的氨基酸；
[0146] (c)自ΗΑ0序列中移除球狀頭部域的氨基酸序列；此舉藉由以下方式進行：使位置 X上的氨基酸與位置y上的氨基酸之間的HA1域的區段缺失，且任選地經由具有0至50個 氨基酸的連接序列將由此獲得的HA1的N端區段（跨越HA1的位置1上的氨基酸至并且包 括位置X上的氨基酸）與C端區段（跨越HA1的氨基酸y至C端氨基酸）再連接。在某些 實施例中，X為位置46與60之間的任何位置上的氨基酸，優選地為HA1的位置52、53、55或 59上的氨基酸，且其中y為位置290與325之間的任何位置上的氨基酸，優選地為HA1的位 置291、303、318或321上的氨基酸。再次，所用編號參考SEQIDN0:1。普通技術人員將理 解在制造期間引導蛋白質轉運的前導序列（或信號序列；例如對應于SEQ ID NO: 1的氨基酸 1至17) -般將不存在于例如用于疫苗的最終多肽中。因此，在某些實施例中，本發明的多 肽包含不具有前導序列的HA1 N端區段。
[0147] (d)使經修飾的HA的融合前構象的穩定性增強且使融合后構象不穩定，優選 地藉由在以下中引入一或多個突變：使螺旋A的C端殘基連接至螺旋⑶的N端殘基的 氨基酸序列、優選地為跨越SEQ ID NO: 1的氨基酸402至418的氨基酸序列（尤其包含 MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R) (SEQ ID N0:17)的氨基酸序列）。突變優選地包含將疏水性氨 基酸殘基取代成親水性氨基酸殘基。
[0148] (e)在HA主干域多肽中引入一或多個二硫橋鍵。
[0149] 根據本發明，移除HA1與HA2之間的裂解位點可藉由在P1位置處使R(在少數情 況下為K)突變成Q來達成（參見例如Sun等人，2010對于裂解位點（SEQ ID NO: 1中的位 置343)的命名的解釋）。優選地突變成Q，但S、T、N、D或E為替代方案。
[0150] 移除頭部域可例如藉由使來自SEQ ID NO: 1的氨基酸53至320、或來自其他流感病 毒的HA中的等效位置處的氨基酸缺失來達成。等效位置可由普通技術人員藉由使用適合 的算法（諸如Clustal或Muscle)比對序列來輕易地測定。序列的剩余部分可直接連接， 或者可引入柔性連接子。連接子序列長度可為1至50個氨基酸。優選地為有限長度的柔 性連接子（小于或等于10個氨基酸），例如GGG、GGGG、GSA、GSAG、GSAGSA、GSAGSAG或類似 物。缺失長度亦可變化，例如藉由在位置（x)(等效位置）處、例如在位置54、55、56、57或 58處開始缺失；或藉由在位置47、48、49、50、51或52處切割以增加缺失長度。類似地，最 后一個欲缺失的氨基酸可在位置（y)、諸如315、316、317、318或319(等效位置）處，或在位 置321、322、323、324或325(等效位置）處以增加缺失長度。重要的是認識到，缺失長度的 變化可藉由匹配連接子序列的長度來部分補償，亦即較大缺失可與較長連接子匹配且反之 亦然。本發明亦涵蓋此等多肽。
[0151] 根據本發明，增強A螺旋與⑶螺旋之間的環的溶解度。此環由HI A/布里斯班 (Brisbane)/59/2007 (SEQ ID NO: 1)中的殘基402至418 (等效殘基）形成。因此，使經修 飾的HA的融合前構象的穩定性增強且使融合后構象不穩定。如可在以下表6中看出，此環 在H1序列中高度保守。此舉可例如藉由用親水性對應物置換該環中的氨基酸I、L、F或V 來達成。等效位置可由普通技術人員藉由使用適合的算法（諸如Clustal或Muscle)比對 序列來輕易地測定。突變成甘氨酸使融合后構象不穩定，因為此氨基酸的高度柔性引起欲 利用HA序列的此部分形成的融合后螺旋的穩定性降低。描述血清型H1的流感HA的殘基 402至418之間的環的共同序列為（SEQ ID NO: 17)MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)。在本發明 的多肽中，位置406、409、413和/或416(或其等效位置，如由序列比對測定）處的氨基酸 為極性（S、T、N、Q)、帶電荷的（R、H、K、D、E)或柔性（G)氨基酸。亦可能為此等位點處的突 變的組合，例如F406S、V409T、L416S。在一些情況下，優選地為恢復共同氨基酸的突變，例 如其中V或Μ在位置404處（突變成T)，V在408(突變成A)或410(突變成G)處，或I在 414處（突變成N);具有此等特定氨基酸的序列的發生率極低。表征本發明的多肽的上述 突變的概述在表6中給出。
[0152] 根據本發明，將一或多個二硫橋鍵引入主干域多肽中，優選地在H1A/布里斯班 (Brisbane)/59/2007中的位置324與436 (或等效位置）的氨基酸之間。等效位置可由普 通技術人員藉由使用適合的算法（諸如ClustaUMuscle等）比對序列來輕易地測定。藉由 以下方式產生經工程化的二硫橋鍵：使空間上接近的至少一個（若另一者已為半胱氨酸）、 但通常兩個殘基突變成半胱氨酸，其將自發地或藉由活性氧化在此等殘基的硫原子之間形 成共價鍵。
[0153] 天然HA以三聚體的形式存在于細胞表面上。使三聚體保持在一起的個別單體之 間的大部分相互作用位于頭部域。移除頭部之后，三級結構由此去穩定，且因此增強截斷的 分子中的單體之間的相互作用將增強穩定性。在主干域中，三聚藉由形成三聚卷曲螺旋基 元來介導。藉由強化此基元，可產生較穩定三聚體。根據本發明，可在位置418至433(等效 位置）處將用于形成三聚卷曲螺旋的共同序列（例如IEAIEKKIEAIEKKIE(SEQ IDN0:83))引 入本發明的多肽中。在某些實施例中，在位置419至433(等效位置）處引入來源于GCN4且 亦已知三聚的序列MKQIEDKIEEIESKQ (SEQ ID N0:84)。在某些實施例中，藉由將M420、L423、 V427、G430修飾成異亮氨酸來使三聚體界面穩定。
[0154] 在某些實施例中，本發明的多肽含有HI HA的細胞內序列及跨膜域。在其他實施 例中，已移除細胞內及跨膜序列，例如HA2域的位置523、524、525、526、527、526、528、529或 530 (或等效位置）至HA2域的C端（編號根據SEQ ID NO: 1)的氨基酸序列，以在表達于細 胞中之后產生可溶性多肽。在某些實施例中，藉由引入已知形成三聚體結構的序列，亦即 AYVRKDGEWVLL(SEQ IDN0:80)，任選地經由連接子連接，使多肽進一步穩定。連接子可任選 地含有裂解位點以用于之后根據普通技術人員所熟知的方案處理。為了促進可溶性形式的 純化，可添加標記序列，例如經由較短連接子（例如EGR)連接的his標記（HHHHHHH)。在一 些實施例中，在不存在折疊子序列的情況下添加連接子及his標記序列。在某些實施例中， 細胞內及跨膜序列已由氨基酸序列AGRHHHHHHH(SEQ ID N0:97)或SGRSLVPRGSPGSGYIPEAPR DGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHH(SEQ IDN0:82)置換。
[0155] 申請人:先前已鑒別由來自經接種疫苗的個體的原代人類B細胞分離的廣泛中和 抗體，其中一些對第1類群具有特異性（例如CR6261，如W0 2008/028946中所述），且其中 一些對第2類群流感病毒具有特異性（例如CR8020,如W0 2010/130636中所述）。此等單克 隆抗體的抗原決定基的詳細分析已揭露此等特異性抗體缺乏交叉反應性的原因。在兩種情 況下，聚糖存在于第1類群或第2類群HA分子中的不同位置上至少部分解釋抗體具有類群 特異性的事實。如下文所述，在鑒別與許多第1類群及第2類群HA分子交叉反應的CR9114 樣抗體的情況下，已清楚人類免疫系統有可能針對流感病毒誘生極廣泛中和抗體。然而，鑒 于對每年疫苗接種流程的需求，在經（季節性）H1和/或H3亞型的流感病毒感染或疫苗接 種之后顯然不誘生或僅在極低程度上誘生此等抗體。因此，在某些實施例中，本發明提供以 構象正確方式呈現HA的干區的多肽，以便在不存在免疫顯性可變區的情況下向免疫系統 呈現誘生廣泛中和抗體的抗原決定基。由于已知聚糖模式在H1與H3HA之間不同，且此差 異可引起較多類群限制性抗體反應，故在不同實施例中，本發明的多肽是基于第2類群HA 分子（例如H3的HA)。如以下實例3中所示，與H3亞型相比，CR9114對H1亞型的活體外 中和能力較高。因此，猜測與H3HA分子（其可歸因于HA1中N38上為許多第2類群HA亞型 所共有的聚糖）相比，CR9114的抗原決定基對H1較可及。在不希望受此理論束縛下，可推 斷若本發明的多肽是基于H1，則所得抗體很可能受第2類群HA分子上N38上的聚糖阻礙， 且因此對第2類群流感病毒的活性稍低。因此，為了能夠誘生以良好活性對第1類群及第 2類群兩者流感病毒起作用的廣泛中和抗體，在某些實施例中，本發明的主干域多肽是基于 H3 HA亞型。
[0156] 人類經常受包含H1或H3亞型的HA的季節性流感病毒感染。顯然盡管暴露于此 等流感病毒，但在自然情況下通常不產生廣泛中和抗體。除HA中存在易變頭部區以外，此 現象的原因之一可能為暴露于與先前所見亞型密切相關的新亞型不知何故使反應較不廣 泛。因此，優選地可使個體暴露于較無關的亞型序列。因此，在另一實施例中，本發明的主 干域多肽是基于第2類群亞型的HA，該第2類群亞型在HA1中的位置38上含有天冬酰胺 (N) (N38)且不為H3亞型。
[0157] 在某些實施例中，多肽是基于A型流感病毒亞型。在某些實施例中，多肽不基于H7 HA。
[0158] 如上所述，本發明的多肽不僅經設計基于來自第1類群的流感疫苗病毒亞型（諸 如H1及H5)的親本HA序列，而且亦可基于來自第2類群的流感亞型的HA序列，尤其用于 流感疫苗的第2類群的流感病毒亞型（諸如H3)。根據本發明，多肽經構建保守CR8020 及CR8043的抗原決定基，因為此等抗體能夠中和多種第2類群病毒株（W0 2010/130636)。 在此等多肽中，干區底部處的β片及其周圍應盡可能的保守，因為此β片為CR8020及 CR8043結合至Η3 ΗΑ的區域。
[0159] 在某些實施例中，ΗΑ域屬于Η3亞型，優選地屬于Α/威斯康辛州 (Wisconsin)/67/2005 (SEQ ID Ν0:89)或 Α/香港（Hong Kong)/1/1968 (SEQ ID Ν0:121)。普 通技術人員將理解，亦可根據本發明使用包含H3亞型的HA的其他A型流感病毒。
[0160] 在某些實施例中，多肽包含HA1 N端多肽區段或由HA1 N端多肽區段組成，該HA1 N 端多肽區段包含H3 HA1域的位置1至位置X的氨基酸，優選地包含HA1域的位置p至位置 X的氨基酸，其中X為H3 HA1的位置56與69之間的任何氨基酸，諸如為57、58、59、60、61、 62、63、64、65、66、67或68，優選地其中1為61、62、63或68。在某些實施例中，擬1(：端多肽 區段包含H3HA1域的位置y至且包括C端氨基酸的氨基酸，其中y為H3 HA1的位置292與 325之間（且包括位置292及325)的任何氨基酸，優選地其中y為293、306、318或323。
[0161] 在某些實施例中，HA域屬于H3亞型，優選地屬于A/威斯康辛州 (Wisconsin)/67/2005 (SEQ ID N0:89)或 A/香港（Hong Kong)/1/1968 (SEQ ID N0:121)。
[0162] 根據本發明，頭部域已藉由以下方式移除：使HA1序列的較大部分缺失，且經由較 短連接子使N端及C端序列再連接。缺失長度可變化，但優選地HA1的N端序列的最后一 個殘基與C端序列的第一個殘基在空間上緊靠在一起以避免經由連接序列引入病毒株。在 H3序列中，可在S62至P322、S63至P305及T64至T317(等效位置）處引入缺失。等效位 置可由普通技術人員藉由使用適合的算法（諸如Clustal或Muscle)比對序列來輕易地 測定。序列的剩余部分可直接連接，或者可引入柔性連接子。連接子序列長度可為1至50 個氨基酸。優選地為有限長度的柔性連接子（小于或等于10個氨基酸），例如GGG、GGGG、 GSA、GSAG、GSAGSA、GSAGSAG或類似物。缺失長度亦可變化，例如藉由在位置63、64、65、66、 67 (等效位置）處開始來減少缺失中的殘基數目，或藉由在位置57、58、59、60或61處切割 來增加缺失長度。類似地，最后一個欲缺失的氨基酸可在位置317、318、319、320或321 (等 效位置）處，或在位置323、324、325、326或327(等效位置）處以增加缺失長度。重要的是 認識到，缺失長度的變化可藉由匹配連接子序列的長度來部分補償，亦即較大缺失可與較 長連接子匹配且反之亦然。此等多肽亦包括于本發明中。
[0163] 在某些實施例中，X為61且y為323。
[0164] 在某些實施例中，X為62且y為306。
[0165] 在某些實施例中，X為63且y為318。
[0166] 在某些實施例中，X為位置62、63、64、65、66或位置56、57、58、59或60(等效位 置）。
[0167] 在某些實施例中，y為位置306、318、319、320、321或322 (等效位置），或位置324、 325、326、327 或 328 (等效位置）。
[0168] 在一實施例中，使螺旋A的C端殘基連接至螺旋CD的N端殘基的氨基酸序列對應 于：SEQ ID N0:89的HA2的位置400上的氨基酸與位置420上的氨基酸之間的氨基酸序列， 或其他H3病毒株中等效位置上的氨基酸殘基，其中多肽在以下中包含一或多個突變：使螺 旋A的C端殘基連接至螺旋CD的N端殘基的氨基酸序列，亦即跨越SEQ ID N0:89的氨基酸 400至420的氨基酸序列，或其他H3流感病毒株中的等效氨基酸殘基。
[0169] 在某些實施例中，使血清型H3的流感HA的螺旋A的C端殘基連接至螺旋⑶的N 端殘基的氨基酸序列包含SEQ ID N0:104的氨基酸序列。
[0170] 根據本發明，多肽在使螺旋A的C端殘基連接至螺旋CD的N端殘基的氨基酸序列 中包含一或多個突變。在某些實施例中，多肽包含表8的一或多個突變、或H3亞型的其他 流感病毒株中的等效突變。
[0171] 根據本發明，已移除HA1與HA2之間的裂解位點。在某些實施例中，位置345 (編號 參考SEQ ID N0:89)處的裂解位點移除已突變（R345Q)，以防止自ΗΑ0形成HA1及HA2。任 選地可再缺失殘基347至351 (IFGAI，融合肽的一部分），以使疏水性殘基對水性溶劑的暴 露降至最低。裂解處的正電荷在H3中100%保守，且此突變可因此應用于所有序列中。
[0172] 頭部域的缺失留下現暴露于水性溶劑的殘基400至420之間的B環。在H3HA中，此 環高度保守（參見表9)。共同序列為：4011 (E/G)KTNEKFHQIEKEFSEVEGR 421 (SEQ ID N0:104 ; 編號參考SEQ ID N0:89)。為了增加此環的溶解度以用于呈融合前構象的本發明的多肽且 使融合后構象不穩定，一些疏水性殘基必需修飾成極性（S、T、N、Q)、帶電荷的氨基酸（R、H、 1(、03)，或必需藉由突變成6來增加柔性。特定言之，在位置401、408、411、415、418(編號 參考SEQ ID N0:89)處的突變將有助于本發明的多肽的穩定性。
[0173] 為了使本發明的多肽的融合前構象穩定，在于一級序列中遠離但在折疊的融合前 構象中接近的兩個部分之間引入共價鍵。為此，二硫橋鍵可在本發明的多肽中經工程化，優 選地在H3A/威斯康辛州（Wisconsin)/67/2005 (SEQ ID N0:89)中的位置326與438 (等效 位置）之間。等效位置可由普通技術人員藉由使用適合的算法（諸如ClustaUMuscle等） 比對序列來輕易地測定。藉由以下方式產生經工程化的二硫橋鍵：使空間上接近的至少一 個（若另一者已為半胱氨酸）、但通常兩個殘基突變成半胱氨酸，其將自發地或藉由活性氧 化在此等殘基的硫原子之間形成共價鍵。藉由使此等殘基突變成半胱氨酸，可在H3 A/威斯 康辛州（Wisconsin)/67/2005 (SEQ ID N0:89)中的位置334與393 (等效位置）之間建立替 代性半胱氨酸橋連基。在一些情況下，將位置321 (等效位置）處的半胱氨酸修飾成甘氨酸 以避免形成不當二硫橋鍵。
[0174] 在某些實施例中，多肽包含以下突變中的一或多者：F408S、I411T、F415S、V418G、 I401R、K326C、S438C、T334C、I393C、C321G。
[0175] 天然HA以三聚體的形式存在于細胞表面上。使三聚體保持在一起的個別單體之 間的大部分相互作用位于頭部域。移除頭部之后，三級結構由此去穩定，且因此增強截斷 的分子中的單體之間的相互作用將增強穩定性。在主干域中，三聚藉由形成三聚卷曲螺旋 基元來介導。藉由強化此基元，可產生較穩定三聚體。在位置421至441(等效位置）處 引入用于形成三聚卷曲螺旋的共同序列IEAIEKKIEAIEKKIEAIEKK。為了避免妨礙在位置 326與438之間形成二硫橋鍵，亦使用在位置421至435 (等效位置）處的替代性較短序列 IEAIEKKIEAIEKKI。一種替代方案為在位置421至441處引入來源于GCN4且已知三聚的序 列 RMKQIEDKIEEIESKQKKIEN 或在位置 421 至 435 處引入較短序列 RMKQIEDKIEEIESK。
[0176] 本發明的多肽可含有HA的細胞內序列及跨膜域，以便所得多肽在表達于細胞中 時呈現于細胞表面上。在其他實施例中，移除位置522至C端（等效位置）的細胞質序列 及跨膜序列，以便在表達于細胞中之后產生分泌型（可溶性）多肽。一些其他殘基任選地 可藉由自523、524、525、526、527、528或529(等效位置）缺失序列而包括于可溶性蛋白質 中。藉由引入已知形成三聚體結構的序列，亦即AYVRKDGEWVLL(SEQIDN0:143)( '折疊子' 序列），任選地經由連接子連接，可使可溶性多肽進一步穩定。連接子可任選地含有裂解位 點以用于之后根據普通技術人員所熟知的方案處理。為了促進可溶性形式的純化，可添加 標記序列，例如經由較短連接子（例如EGR)連接的his標記（HHHHHHH)。在一些實施例中， 在不存在折疊子序列的情況下添加連接子及his標記序列。
[0177] 根據本發明，HA2域的位置530 (編號根據SEQ ID NO: 1)至C端氨基酸的氨基酸序 列可經移除并置換為以下序列：EGRHHHHHHH(SEQ IDN0:81)或 SGRSLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQ AYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHH(SEQ ID NO :82)〇
[0178] 在某些實施例中，HA1 N端主干區段不包含信號序列。普通技術人員將理解在制 造期間引導蛋白質轉運的前導序列（或信號序列；例如對應于SEQ ID N0:89的氨基酸1至 17) -般將不存在于例如用于疫苗的最終多肽中。因此，在某些實施例中，本發明的多肽包 含不具有前導序列的氨基酸序列。
[0179] 根據本發明，多肽不基于B型流感的HA分子。B型流感病毒株嚴格地針對人類。 B型流感病毒株內HA的抗原變異少于在A型病毒株內觀察到的抗原變異。B型流感病 毒的兩種遺傳上及抗原上不同的譜系在人類中傳播，如由B/Yamagata/16/88(亦稱為B/ Yamagata)及 B/Victoria/2/87(B/Victoria)譜系所表不（Ferguson 等人，2003)。盡管由 B型流感病毒引起的疾病譜與由A型流感病毒引起的疾病譜相比一般較溫和，但在B型流感 感染的情況下仍頻繁地觀察到需要住院治療的嚴重疾病。
[0180] 根據本發明，提供模擬CR6261及CR9114的特異性抗原決定基的多肽，且其可用作 免疫原性多肽以例如在單獨或與其他預防性和/或治療性治療組合活體內投與時誘生交 叉中和抗體。在"交叉中和抗體"的情況下，抗體意謂能夠中和：系統發生第1類群的A型 流感病毒的至少兩種、優選地至少三種、四種或五種不同亞型；和/或系統發生第2類群的 A型流感病毒的至少兩種、優選地至少三種、四種或五種不同亞型；和/或B型流感病毒的 至少兩種不同亞型，尤其由CR6261及CR9114中和的至少所有病毒株。
[0181] 本發明的多肽不包含全長HA1。在某些實施例中，免疫原性多肽實質上小于ΗΑ0， 優選地缺乏HA的全部或實質上全部球狀頭部。免疫原性多肽長度優選地不大于360個、優 選地不大于 350、340、330、320、310、305、300、295、290、285、280、275 或 270 個氨基酸。在一 實施例中，免疫原性多肽長度為約250至約350個、優選地約260至約340個、優選地約270 至約330個、優選地約270至約330個氨基酸。
[0182] 在某些實施例中，多肽選擇性結合至抗體CR6261和/或CR9114。在一實施例中， 多肽不結合至抗體CR8057。在一實施例中，CR6261包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 SEQ ID N0:20的氨基酸序列；及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID N0:21的氨基酸序 列；CR9114包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID N0:18的氨基酸序列；及輕鏈可變 區，該輕鏈可變區包含SEQ ID N0:19的氨基酸序列。在一實施例中，CR8057包含：重鏈可變 區，該重鏈可變區包含SEQ ID N0:22的氨基酸序列；及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID N0:23的氨基酸序列。
[0183] 如上所述，多肽包含流感血球凝集素 HA1域，該流感血球凝集素 HA1域包含利用具 有0至50個氨基酸殘基的連接序列共價鍵聯至HA1 C端主干區段的HA1 N端主干區段。連 接序列不以天然產生的（或野生型）HA形式出現。在某些實施例中，連接子為包含以下的 肽：1個氨基酸殘基、2個或2個以下氨基酸殘基、3個或3個以下氨基酸殘基、4個或4個以 下氨基酸殘基、5個或5個以下氨基酸殘基、10個或10個以下氨基酸殘基、15個或15個以 下氨基酸殘基、或20個或20個以下氨基酸殘基、或30個或30個以下氨基酸殘基、或40個 或40個以下氨基酸殘基、或50個或50個以下氨基酸殘基。在一特定實施例中，連接序列為 選自由以下組成的組的序列：G、GS、GGG、GSG、GSA、GSGS、GSAG、GGGG、GSAGS、GSGSG、GSAGSA、 GSAGSAG 及 GSGSGSG。
[0184] 本發明亦提供用于提供本發明的多肽、特定言之提供本發明的HA主干域多肽的 氨基酸序列的方法，以及利用此等方法可獲得或獲得的多肽。在某些實施例中，該方法包含 以下步驟：
[0185] -提供流感ΗΑ0氨基酸序列，例如血清型HI、H5或H3的流感ΗΑ0序列；
[0186] -移除HA1與HA2之間的裂解位點，優選地藉由使HA1的C端氨基酸突變成除精氨 酸（R)或賴氨酸⑷以外的氨基酸；
[0187] -自ΗΑ0序列中移除球狀頭部域的氨基酸序列；此舉藉由以下方式進行：使位置X 上的氨基酸與位置y上的氨基酸之間的HA1域的區段缺失，且任選地經由具有0至50個氨 基酸的連接序列將由此獲得的HA1的N端區段（跨越HA1的位置1上的氨基酸至并且包括 位置X上的氨基酸）與C端區段（跨越HA1的氨基酸y至C端氨基酸）再連接。
[0188] -使經修飾的HA的融合前構象的穩定性增強且使融合后構象不穩定，優選地藉由 在以下中引入一或多個突變；使螺旋A的C端殘基連接至螺旋CD的N端殘基的氨基酸序 列、優選地為跨越HI HA的氨基酸402至418的氨基酸序列（尤其包含MNTQFTAVGKEFN (H/K) LE(K/R) (SEQ ID N0:17)或對于 H3 HA 的 I (E/G)KTNEKFHQIEKEFSEVEGR 421 (SEQ ID N0:104) 的氨基酸序列）。突變優選地包含將疏水性氨基酸殘基取代成親水性氨基酸殘基。
[0189] -在HA主干域多肽中引入一或多個二硫橋鍵。
[0190] 根據本發明，移除HA1與HA2之間的裂解位點可藉由在P1位置處使R(在少數情 況下為K)突變成Q來達成（參見例如Sun等人，2010對于裂解位點（SEQ ID NO: 1中的位 置343)的命名的解釋）。優選地突變成Q，但S、T、N、D或E為替代方案。
[0191] 移除頭部域可例如藉由使來自SEQ ID NO: 1的氨基酸53至320缺失來達成。等效 位置可由普通技術人員藉由使用適合的算法（諸如Clustal或Muscle)比對序列來輕易地 測定。序列的剩余部分可直接連接，或者可引入柔性連接子。連接子序列長度可為1至50 個氨基酸。優選地為有限長度的柔性連接子（小于或等于10個氨基酸），例如GGG、GGGG、 GSA、GSAG、GSAGSA、GSAGSAG或類似物。缺失長度亦可變化，例如藉由在位置（X)(等效位 置）處、例如在位置54、55、56、57或58處開始缺失；或藉由在位置47、48、49、50、51或52處 切割以增加缺失長度。類似地，最后一個欲缺失的氨基酸可在位置（y)、諸如315、316、317、 318或319 (等效位置）處，或在位置321、322、323、324或325 (等效位置）處以增加缺失長 度。重要的是認識到，缺失長度的變化可藉由匹配連接子序列的長度來部分補償，亦即較大 缺失可與較長連接子匹配且反之亦然。本發明亦涵蓋此等多肽。
[0192] 根據本發明，增強A螺旋與⑶螺旋之間的環的溶解度。此環由HI A/布里斯班 (Brisbane)/59/2007 (SEQ ID N0:1)中的殘基402至418(等效位置）形成。因此，使經修飾 的HA的融合前構象的穩定性增強且使融合后構象不穩定。如可在以下表6中看出，此環在 H1序列中高度保守。此舉可例如藉由用親水性對應物置換該環中的氨基酸I、L、F或V來 達成。等效位置可由普通技術人員藉由使用適合的算法（諸如Clustal或Muscle)比對序 列來輕易地測定。突變成甘氨酸使融合后構象不穩定，因為此氨基酸的高度柔性引起欲利 用HA序列的此部分形成的融合后螺旋的穩定性降低。描述血清型H1的流感HA的殘基402 至418之間的環的共同序列為（SEQ IDN0:17)MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)。在本發明的 某些多肽中，位置406、409、413和/或416(或其等效位置，如由序列比對測定）處的氨基 酸為極性（S、T、N、Q)、帶電荷的（R、H、K、D、E)或柔性（G)氨基酸。亦可能為此等位點處的 突變的組合，例如SEQ ID N0:10及SEQ ID N0:14中的F406S、V409T、L416S。在一些情況下， 優選地為恢復共同氨基酸的突變，例如其中V或Μ在位置404處（突變成T)，V在408 (突 變成A)或410 (突變成G)處，或I在414處（突變成N);具有此等特定氨基酸的序列的發 生率極低。表征本發明的多肽的上述突變的概述在表6中給出。
[0193] 根據本發明，將一或多個二硫橋鍵引入主干域多肽中，優選地在H1A/布里斯班 (Brisbane)/59/2007中的位置324與436 (或等效位置）的氨基酸之間：SEQ ID N0:13至 SEQ ID NO: 16。等效位置可由普通技術人員藉由使用適合的算法（諸如Clustal、Muscle 等）比對序列來輕易地測定。藉由以下方式產生經工程化的二硫橋鍵：使空間上接近的至 少一個（若另一者已為半胱氨酸）、但通常兩個殘基突變成半胱氨酸，其將自發地或藉由活 性氧化在此等殘基的硫原子之間形成共價鍵。
[0194] 利用該方法可獲得的多肽亦為本發明的一部分。
[0195] 天然HA以三聚體的形式存在于細胞表面上。使三聚體保持在一起的個別單體之 間的大部分相互作用位于頭部域。移除頭部之后，三級結構由此去穩定，且因此增強截斷的 分子中的單體之間的相互作用將增強穩定性。在主干域中，三聚藉由形成三聚卷曲螺旋基 元來介導。藉由強化此基元，可產生較穩定三聚體。根據本發明，可在位置418至433(等 效位置）處將用于形成三聚卷曲螺旋的共同序列IEAIEKKIEAIEKKIE(SEQ IDN0:83)弓丨入本 發明的多肽中。在某些實施例中，在位置419至433(等效位置）處引入來源于GCN4且亦 已知三聚的序列MKQIEDKIEEIESKQ(SEQ ID N0:84)。在某些實施例中，藉由將M420、L423、 V427、G430修飾成異亮氨酸來使三聚體界面穩定。
[0196] 在某些實施例中，多肽包含選自由以下組成的組的氨基酸序列：SEQ ID N0:3至 SEQIDN0:16、SEQIDN0:44至SEQIDN0:53、SEQIDN0:111至SEQIDN0:114、SEQIDN0:119 至 SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 144 至 SEQ ID NO: 175 及 SEQ ID NO: 177 至 SEQ ID NO: 187。
[0197] 在某些實施例中，多肽是選自由以下組成的組：SEQ IDN0:45、SEQ IDN0:113及SEQ ID NO: 130。
[0198] 普通技術人員將理解在制造期間引導蛋白質轉運的前導序列（或信號序列；例如 對應于SEQ ID NO: 1的氨基酸1至17)不存在于例如用于疫苗的最終多肽中。因此，在某些 實施例中，本發明的多肽包含不具有前導序列的氨基酸序列。
[0199] 可根據視為適于熟習技術者的任何技術（包括下文描述的技術）制備流感血球凝 集素主干域多肽。
[0200] 因此，本發明的免疫原性多肽可藉由此項技術中已知的標準方法以DNA序列形式 合成并克隆，且隨后使用此項技術中已知的適合的限制酶及方法活體外或活體內表達。因 此，本發明亦關于編碼上述多肽的核酸分子。本發明另外關于包含編碼本發明的多肽的核 酸的載體。在某些實施例中，本發明的核酸分子為載體（例如質體）的一部分。這些載體 可利用普通技術人員所熟知的方法來輕易地操作，且可例如經設計以能夠在原核和/或真 核細胞中復制。此外，許多載體可直接或以來自其的經分離的所需片段形式用于真核細胞 轉型，且將全部或部分整合至這些細胞的基因組中，產生在基因組中包含所需核酸的穩定 宿主細胞。所用載體可為適于克隆DNA且可用于相關核酸轉錄的任何載體。當使用宿主細 胞時，載體優選地為整合載體。或者，載體可為游離型復制載體。
[0201] 普通技術人員能夠選擇適合的表達載體，且以功能方式插入本發明的核酸序 列。為了獲得編碼多肽的核酸序列的表達，普通技術人員熟知能夠驅動表達的序列可功 能性連接至編碼多肽的核酸序列，產生編碼呈可表達形式的蛋白質或多肽的重組核酸分 子。通常，將啟動子序列置放于應表達的序列的上游。此項技術中可利用許多表達載體， 例如Invitrogen的pcDNA及pEF載體系列、來自BD Sciences的pMSCV及pTK-Hyg、來自 Stratagene的pCMV-Script等，這些表達載體可用于獲得適合的啟動子和/或轉錄終止子 序列、polyA序列及其類似序列。當參考控制所編碼的多肽的轉錄及翻譯的序列適當插入編 碼相關多肽的序列時，所得表達卡匣適用于制造相關多肽，稱為表達。驅動表達的序列可包 括啟動子、強化子及其類似物及其組合。此等序列應能夠在宿主細胞中起作用，藉此驅動與 其功能性連接的核酸序列的表達。普通技術人員意識到各種啟動子可用于獲得基因在宿主 細胞中的表達。啟動子可為組成性的或經調節的，且可自各種來源（包括病毒、原核或真核 來源）獲得或經人工設計。相關核酸可自天然啟動子或其衍生物或自完全異源的啟動子表 達（Kaufman，2000)。一些用于在真核細胞中表達的熟知且較常用的啟動子包含：來源于病 毒（諸如腺病毒）的啟動子，例如E1A啟動子；來源于細胞巨大病毒（CMV)的啟動子，諸如 CMV實時早期（IE)啟動子（本文中稱為CMV啟動子）（可例如自pcDNA，Invitrogen獲得）； 來源于猴病毒40 (SV40)的啟動子（Das等人，1985);及其類似啟動子。適合的啟動子亦可 來源于真核細胞，諸如金屬硫蛋白（MT)啟動子、延長因子1 a (EF-1 α )啟動子（Gill等人， 2001)、泛素 C或UB6啟動子（Gill等人，2001)、肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、熱休 克啟動子及其類似啟動子。測試啟動子功能及啟動子強度為普通技術人員的常規事項，且 通常可例如涵蓋克隆在啟動子序列后面的測試基因（諸如lacZ、熒光素酶、GFP等），及針 對測試基因的表達測試。當然，啟動子可藉由其中序列的缺失、添加、突變來改變且針對功 能性測試，以發現新型減弱或改良的啟動子序列。根據本發明，優選地為在所選真核細胞中 產生較高轉錄水平的較強啟動子。
[0202] 構建體可使用普通技術人員所熟知的方法轉染至真核細胞（例如植物、真菌、酵 母或動物細胞）或適合的原核表達系統（如大腸桿菌（E.coli))中。在一些情況下，可將 適合的'標記'序列（諸如（但不限于）his標記、myc標記、strep標記或flag標記）或完 全蛋白質（諸如（但不限于）麥芽糖結合蛋白或谷胱甘肽S轉移酶）添加至本發明的序列 中，以允許自細胞或上清液中純化和/或鑒別多肽。任選地可包括含有特異性蛋白水解位 點的序列以在之后藉由蛋白水解消化移除標記。
[0203] 可藉由此項技術中已知的光譜學方法（例如圓二色性光譜學、傅里葉變換紅外光 譜學（Fourier Transform Infrared spectroscopy)及NMR光譜學或X射線晶體學）分析經 純化的多肽，以研究所需結構（如螺旋及β片）的存在。ELISA、Octet及FACS及其類似 方法可用于研究本發明的多肽對前述廣泛中和抗體（CR6261、CR9114、CR8057)的結合。因 此，可選擇具有正確構象的本發明的多肽。
[0204] 本發明另外關于免疫原性組合物，其包含治療有效量的本發明的多肽和/或核酸 中的至少一者。在某些實施例中，組合物包含多肽，該多肽包含血球凝集素主干域，該血球 凝集素主干域來自（或基于）一種流感亞型的HA，例如基于包含例如H1或H7亞型的HA的 流感病毒的HA。在某些實施例中，組合物包含多肽，該多肽包含血球凝集素主干域，該血球 凝集素主干域基于兩種或兩種以上不同流感亞型的HA，例如包含以下的組合物：包含基于 H1亞型的HA的血球凝集素主干域的多肽、及包含基于H7亞型的HA的血球凝集素主干域的 多肽兩者。
[0205] 免疫原性組合物優選地另外包含醫藥學上可接受的載劑。在本發明情形中，術語 "醫藥學上可接受"意謂載劑在所用劑量及濃度下將不在其所投與的個體中引起不當或有 害作用。這些醫藥學上可接受的載劑及賦形劑為此項技術中所熟知（參見Remington's Pharmaceutical Sciences,第 18 版，A. R. Gennaro 編，Mack Publishing Company [1990]； Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer 及 L. Hovgaard 編，Taylor 及 Francis [2000];及 Handbook of Pharmaceutical Excipients, 第3版，A. Kibbe編，Pharmaceutical Press [2000])。術語"載劑"是指與組合物一起投與 的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。可例如采用鹽水溶液及水性右旋糖及甘油溶液作為液體載 齊U，尤其用于可注射溶液。確切配方應適應投藥模式。多肽和/或核酸分子優選地以無菌 溶液形式調配并投與。無菌溶液藉由無菌過濾或藉由此項技術中本身已知的其他方法來制 備。溶液可隨后凍干或填充至藥物劑量容器中。溶液的pH值一般在pH3.0至pH9. 5 (例如 pH5. 0至pH7. 5)的范圍內。
[0206] 本發明亦關于在個體中誘導免疫反應的方法，該方法包含投與個體如上所述的多 肽、核酸分子和/或免疫原性組合物。本發明的個體優選地為哺乳動物，其能夠受感染性致 病因子（特定言之為流感病毒）感染或可得益于免疫反應的誘導，該個體例如為嚙齒動物 (例如小鼠、雪貂或家畜或農畜）、或非人類靈長類動物或人類。個體優選地為人類個體。因 此，本發明提供在利用本文中所述的多肽、核酸和/或免疫原性組合物的個體中誘導對流 感病毒血球凝集素（HA)的免疫反應的方法，該流感病毒血球凝集素（HA)尤其屬于第1類 群和/或第2類群A型流感病毒（諸如包含H1、H2、H3、H4、H5、H7和/或H10亞型的HA的 流感病毒）和/或B型流感病毒。在一些實施例中，所誘導的免疫反應有效預防和/或治 療第1類群和/或第2類群A型流感病毒亞型和/或B型流感病毒引起的流感病毒感染。 在一些實施例中，由本文中所述的多肽、核酸和/或免疫原性組合物誘導的免疫反應有效 預防和/或治療由A型流感病毒的兩種、三種、四種、五種或六種亞型和/或B型流感病毒 引起的A型和/或B型流感病毒感染。
[0207] 由于已熟知較小蛋白質和/或核酸分子并不總是有效誘導強力免疫反應，故可能 有必要藉由添加佐劑來增加多肽和/或核酸分子的免疫原性。在某些實施例中，本文中所 述的免疫原性組合物包含佐劑或與佐劑組合投與。用于與本文中所述的組合物組合投與的 佐劑可在該組合物投與之前、同時或之后投與。適合的佐劑的實例包括：鋁鹽，諸如氫氧化 鋁和/或磷酸鋁；油-乳液組合物（或水包油組合物），包括角鯊烯-水乳液，諸如MF59 (參 見例如W0 90/14837);皂素調配物，諸如QS21及免疫刺激復合物（ISC0MS)(參見例如US 5, 057, 540 ;TO 90/03184 ;TO 96/11711 ;TO 2004/004762 ;TO 2005/002620);細菌或微生物 衍生物，其實例為單磷酰基脂質A (MPL)、3-0-脫酰MPL (3dMPL)、含有CpG基元的寡核苷酸、 ADP核糖基化細菌毒素或其突變體（諸如大腸桿菌不耐熱腸毒素 LT、霍亂菌毒素 CT、百日 咳毒素 PT或破傷風類毒素 TT)、基質M(ISC〇n〇va)。此外，可使用已知免疫增強技術，諸如 將本發明的多肽融合至此項技術中已知的蛋白質以增強免疫反應（例如破傷風類毒素、 CRM197、rCTB、細菌鞭毛蛋白或其他）、或在病毒體中包括多肽或其組合。可使用的其他非 限制性實例例如由Coffman等人（2010)揭示。
[0208] 在一實施例中，將本發明的流感血球凝集素主干域多肽并入病毒樣粒子（VLP)載 體中。VLP-般包含通常來源于病毒的結構蛋白質的病毒多肽。VLP優選地不能夠復制。在 某些實施例中，VLP可能缺乏病毒的完整基因組或包含病毒的基因組的一部分。在一些實 施例中，VLP不能夠感染細胞。在一些實施例中，VLP在其表面上表達普通技術人員已知的 病毒（例如病毒表面糖蛋白）或非病毒（例如抗體或蛋白質）靶向部分中的一或多者。
[0209] 在一特定實施例中，本發明的多肽并入病毒體中。含有本發明的多肽的病毒體可 使用普通技術人員已知的技術制造。舉例而言，病毒體可藉由以下方式制造：破壞經純化的 病毒，提取基因組，及將粒子與病毒蛋白質（例如流感血球凝集素主干域多肽）及脂質一起 重新裝配以形成含有病毒蛋白質的脂質粒子。
[0210] 本發明亦關于上述多肽、核酸和/或免疫原性組合物，其用于在個體中針對流感 HA誘導免疫反應，尤其用作疫苗。因此，本文中所述的流感血球凝集素主干域多肽、編碼這 些多肽的核酸或包含這些核酸或多肽的載體可用于針對流感病毒、例如針對流感病毒血球 凝集素的干區誘生中和抗體。本發明尤其關于如上所述的多肽、核酸和/或免疫原性組合 物，其在預防和/或治療由系統發生第1類群和/或第2類群的A型流感病毒和/或B型 流感病毒引起的疾病或病狀中用作疫苗。在一實施例中，疫苗可用于預防和/或治療由系 統發生第1類群和/或第2類群的兩種、三種、四種、五種、六種或六種以上不同亞型和/或 B型流感病毒引起的疾病。本發明的多肽可在活體外或在適合的細胞表達系統（包括細菌 及真核細胞）中合成之后使用，或者可藉由表達針對免疫原性多肽編碼的核酸而在有需要 的個體中活體內表達。這些核酸疫苗可采用任何形式，包括裸DNA、質體或病毒載體（包括 腺病毒載體）。
[0211] 可使用標準投藥途徑進行本發明的多肽、核酸分子和/或免疫原性組合物的投 與。非限制性實例包括非經腸投與，諸如靜脈內、皮內、經皮、肌肉內、皮下等；或經黏膜 投與，例如鼻內、經口及其類似方式。普通技術人員應能夠確定投與本發明的多肽、核酸 分子和/或免疫原性組合物的各種可能性，以便誘導免疫反應。在某些實施例中，多肽、 核酸分子和/或免疫原性組合物（或疫苗）投與一次以上，亦即呈所謂同源初免-加強 (prime-boost)方案形式。在某些實施例中，當不止一次投與多肽、核酸分子和/或免疫原 性組合物時，第二劑量的投與可在以下時間間隔之后進行：例如第一劑量投與之后1周或1 周以上、第一劑量投與之后2周或2周以上、第一劑量投與之后3周或3周以上、第一劑量 投與之后1個月或1個月以上、第一劑量投與之后6周或6周以上、第一劑量投與之后2個 月或2個月以上、第一劑量投與之后3個月或3個月以上、第一劑量投與之后4個月或4個 月以上等，直至多肽、核酸分子和/或免疫原性組合物的第一劑量投與之后數年。亦可能投 與疫苗大于兩次，例如三次、四次等，以便第一次初免投與繼之以一次以上加強投與。在其 他實施例中，僅投與一次本發明的多肽、核酸分子和/或免疫原性組合物。
[0212] 多肽、核酸分子和/或免疫原性組合物亦可在異源初免-加強方案中以初免或加 強形式投與。
[0213] 本發明另外提供在利用本文中所述的多肽、核酸和/或組合物的個體中預防和/ 或治療流感病毒疾病的方法。如上所述，在一特定實施例中，一種在個體中預防和/或治療 流感病毒疾病的方法包含投與有需要的個體有效量的多肽、核酸和/或免疫原性組合物。 治療有效量是指如本文所定義的多肽、核酸和/或組合物的量，該量有效預防、改善和/或 治療由第1類群或第2類群A型流感病毒和/或B型流感病毒感染引起的疾病或病狀。預 防涵蓋抑制或減少流感病毒的傳播、或抑制或減少與流感病毒感染有關的一或多種癥狀的 發作、發生或發展。如本文中所用的改善可指代減少可見或可察覺的疾病癥狀、病毒血癥或 任何其他可量測的流感感染表達。
[0214] 需要治療者包括已遭受由經第1類群或第2類群A型流感病毒或B型流感病毒感 染引起的病狀者、以及欲預防流感病毒感染者。因此，本發明的多肽、核酸和/或組合物可 投與未處理個體（亦即不患有由流感病毒感染引起的疾病或尚未及當前未經流感病毒感 染感染的個體）或投與早已和/或已經受流感病毒感染的個體。
[0215] 在一實施例中，預防和/或治療可以容易受到流感病毒感染的患者群體為目標。 這些患者群體包括（但不限于）例如老年人（例如>50歲、>60歲且優選地>65歲）、年 輕人（例如<5歲、< 1歲）、住院治療的患者及已用抗病毒化合物治療但顯示抗病毒反應 不夠的患者。
[0216] 在另一實施例中，多肽、核酸和/或免疫原性組合物可與一或多種其他活性藥劑 組合投與個體，這些其他活性藥劑諸如為現有或未來的流感疫苗、單克隆抗體和/或抗病 毒劑、和/或抗細菌劑和/或免疫調節劑。一或多種其他活性藥劑可有益于治療和/或預 防流感病毒疾病，或可改善與流感病毒疾病有關的癥狀或病狀。在一些實施例中，一或多種 其他活性藥劑為疼痛舒解劑、抗發熱藥物、或緩和或輔助呼吸的療法。
[0217] 本發明的多肽和/或核酸分子的給藥方案可經調整以提供最佳所需反應（例如治 療反應）。適合的劑量范圍可例如為0. 1毫克/公斤體重至100毫克/公斤體重，優選地 為1毫克/公斤體重至50毫克/公斤體重，優選地為0. 5毫克/公斤體重至15毫克/公 斤體重。欲使用的多肽和/或核酸分子的精確劑量將例如視投藥途徑及由其引起的感染或 疾病的嚴重度而定，且應根據醫師的判斷及各個體的情況來決定。舉例而言，有效劑量視以 下而改變：靶部位、患者的生理狀態（包括年齡、體重、健康狀態）以及治療為預防性的抑或 治療性的。患者通常為人類，但亦可治療非人類哺乳動物，包括轉基因哺乳動物。治療劑量 經最佳滴定以使安全性及功效優化。
[0218] 本發明的多肽亦可用于驗證鑒別為潛在治療候選物的單克隆抗體的結合。此外， 本發明的多肽可用作診斷工具，例如藉由在個體的血清中確定是否存在能夠結合至本發明 的多肽的抗體來測試該個體的免疫狀態。因此，本發明亦關于用于檢測患者中存在流感感 染的活體外診斷方法，該方法包含以下步驟：a)使自該患者獲得的生物樣本與本發明的多 肽接觸；及b)檢測抗體-抗原復合物的存在。
[0219] 本發明的多肽亦可用于鑒別新的結合分子或改良現有結合分子，諸如單克隆抗體 及抗病毒劑。
[0220] 本發明另外說明于以下實例及圖中。實例不意欲以任何方式限制本發明的范圍。
[0221] 實例
[0222] 實例1 :鑒別新穎第1類群及第2類群交叉中和抗體：CR9114
[0223] 藉由靜脈穿刺在EDTA抗凝血試樣管中收集來自正常健康供體的周邊血液。 scFv噬菌體呈現文庫基本上如W0 2008/028946中所述獲得，該專利以引用的方式并 入本文中。針對以下A型流感亞型的重組血球凝集素（HA)進行選擇：H1(A/新喀里 多尼亞（New Caledonia)/20/99)、H3(A/ 威斯康辛州（Wisconsin)/67/2005)、H4(A/ 鴨 / 香港（Hong Kong)/24/1976)、H5 (A/ 雞 / 越南（Vietnam)/28/2003)、H7 (A/ 荷蘭 (Netherlands)/219/2003)及 H9(A/HongKong/1073/99)。進行連續兩輪選擇，隨后分離個 別單鏈噬菌體抗體。在第二輪選擇之后，使用個別大腸桿菌群落來制備單克隆噬菌體抗體。 在ELISA中驗證在上述篩檢中獲得的含有單鏈噬菌體抗體的所選上清液的特異性，亦即對 不同HA抗原的結合。為此目的，將以下涂布至Maxisorp? ELISA盤：桿狀病毒表達的重組 H1(A/新卩客里多尼亞（NewCaledonia)/20/99)、H3(A/威斯康辛州（Wisconsin)/67/2005)、 H5 (A/ 越南（Vietnam)/1203/04)、H7 (A/ 荷蘭（Netherlands)/219/2003)及 B(B/ 0hio/01/2005) HA (Protein Sciences, CT，USA)。在所獲得的單鏈噬菌體抗體中，單鏈噬 菌體抗體SC09-114展示特異性結合重組A型流感HI、H3、H5、H7及B型流感HA。藉由 FACS分析驗證SC09-114的結合及特異性。為此目的，使全長重組A型流感亞型HI (A/ 新喀里多尼亞（New Caledonia)/20/1999)、H3(A/Wisonsin/67/2005)及 H7(A/ 荷蘭 (Netherlands) /219/2003) HA表達于PER. C6細胞的表面上。SC09-114展示特異性結合至A 型流感亞型HI、H3及H7 HA。如先前所述克隆scFv的重鏈及輕鏈可變區（W0 2008/028946)。 編碼人類IgGl重鏈及輕鏈的所得表達構建體短暫組合表達于293T細胞中，且使用標準純 化程序獲得及制造含有人類IgGl抗體CR9114的上清液。CR9114的重鏈及輕鏈的⑶R的氨 基酸序列在表1中給出。以下給出重鏈及輕鏈可變區的核苷酸及氨基酸序列。
[0224] 實例2 :CR9114的交叉結合反應性
[0225] 在ELISA中驗證CR9114的結合特異性，亦即對不同HA抗原的結合。為此 目的，將以下涂布至Maxisorp? ELISA盤：桿狀病毒表達的重組H1(A/新喀里多尼亞 (New Caledonia)/20/1999)、H3(A/ 威斯康辛州（Wisconsin)/67/2005)、H5(A/ 越南 (Vietnam) /1203/04)、H7 (A/ 荷蘭（Netherlands) /219/2003)及 H9 (A/HongKong/1073/99) HA (Protein Sciences, CT，USA)。使用無關IgG CR4098作為對照。CR9114展示對所測試的 所有重組HA均具有異源亞型交叉結合活性。參見表2。
[0226] 另外，藉由FACS分析來測試抗體的異源亞型結合。為此目的，使全長重組A型流感 亞型 HI (A/ 新喀里多尼亞（New Caledonia) /20/1999)、H3 (A/Wisonsin/67/2005)及 H7 (A/ 荷蘭（Netherlands)/219/2003)HA表達于PER. C6細胞的表面上。將細胞與CR9114-起 培育1小時，隨后用PBS+0. 1 % BSA進行三個洗滌步驟。使用PE結合的抗人抗體檢測所結 合的抗體。使用未經轉染的PER.C6細胞作為對照。CR9114展示對A型流感亞型H1、H3及 H7HA而非野生型PER. C6細胞的交叉結合活性。參見表2。
[0227] 實例3 :CR9114的交叉中和活性
[0228] 為了測定CR9114是否能夠阻斷多種A型流感病毒株，進行另外的活體外病毒中和 分析（VNA)。在MDCK細胞（ATCC CCL-34)上進行VNA。將MDCK細胞培養于MDCK細胞培養基 (補充以抗生素、20mM Η印es及0· 15% (w/v)碳酸氫鈉的MEM培養基（完全MEM培養基）， 補充以10% (v/v)胎牛血清）中。將以下用于分析的病毒株均稀釋至5.7X103TCID50/ ml (每毫升50%組織培養感染劑量）的效價，其中效價根據Spearman及Karber的方法計 算：Hl(A/WSN/33、A/ 新喀里多尼亞（New Caledonia)/20/1999、A/ 所羅門群島（Solomon Islands)/IVR-145 (A/所羅門群島（Solomon Islands)/3/2006 的高生長性重配株）、A/布 里斯班（Brisbane)/59/2007、A/NYMC/X-181(A/加利福尼亞（California)/07/2009 的高 生長性重配株））、H2 (A/Env/MPU3156/05)、H3 (A/ 香港（Hong Kong) /1/68、A/ 約翰尼斯堡 (Johannesburg)/33/94、A/ 巴拿馬（Panama)/2000/1999、A/廣島（Hiroshima)/52/2005、 A/ 威斯康辛州（Wisconsin)/67/2005 及 A/ 布里斯班（Brisbane)/10/2007)、H4(A/WF/ HK/MPA892/06)、H5(PR8-H5N1-HK97(A/ 香港（Hong Kong)/156/97 及 A/PR/8/34 的 6:2 重配株）及 A/ 赤頸鴨 /MPF461/07)、H6 (A/ 赤頸鴨 /MPD411/07)、H7 (NIBRG-60 (A/ 綠 頭鴨 / 荷蘭（Netherlands)/12/2000 的 6:2 重配株）及 PR8-H7N7-NY(A/ 紐約（New York) /107/2003 (H7N7)及 A/PR/8/34 的 7:1 重配株））、H8 (A/ 赤頸鴨 /MPH571/08)、H9 (A/ 香港（Hong Kong) /1073/99 及 A/ 雞 /HK/SSP176/09)、H10 (A/ 雞 / 德國（Germany) /N/49)及 H14(PR8-H14N5 (A/ 綠頭鴨 / 阿斯特拉罕（Astrakhan)/263/1982 (H14N5)及 A/PR/8/34 的 6:2重配株））。在一式四份孔中在完全MEM培養基中連續2倍稀釋（1:2至1:512) IgG制備 物（200 μ g/ml)。將25 μ 1各別IgG稀釋液與25 μ 1病毒懸浮液（100TCID50/25 μ 1)混合， 且在37°C下培育1小時。隨后將懸浮液一式四份地轉移至含有匯合MDCK培養物于50 μ 1 完全MEM培養基中的96孔盤上。使用前，MDCK細胞以3Χ 104個細胞/孔接種于MDCK細胞 培養基中，生長直至細胞已達至匯合為止，用300μ 1至350μ 1 PBS(pH7.4)洗滌，且最后向 各孔中添加50 μ 1完全MEM培養基。在37°C下將所接種的細胞培養3至4天，且每日觀察 細胞病變作用（CPE)的發展。將CPE與陽性對照比較。
[0229] CR9114展示對所有測試的A型流感亞型HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9及H10 病毒的代表病毒株均具有異源亞型交叉中和活性。參見表3。
[0230] 實例4 :某于H1HA設計包含CR6261及CR9114的保守主干域抗原決定基的主干域 多肽
[0231] 先前已鑒別針對流感病毒血球凝集素的具有廣泛交叉中和效能的完全人類單克 隆抗體。CR6261 (如W0 2008/028946中所述）展示具有針對系統發生第1類群的A型流 感病毒的廣泛交叉中和活性。此外，上述CR9114已顯示能夠結合及中和系統發生第1類群 及第2類群兩者的A型流感病毒以及B型流感病毒。功能及結構分析已揭示此等抗體干擾 膜融合過程且針對流感HA蛋白的主干域中的高度保守抗原決定基（Throsby等人（2008); Ekiert 等人（2009) ;W0 2008/028946 ;及共同待決申請號 EP11173953. 8)。
[0232] 在引向本發明的研究中，設計了包含含有此等抗原決定基的HA的主干域的新穎 分子，以便建立基于通用抗原決定基的免疫原性多肽，這些多肽可例如用作針對廣泛范圍 流感病毒株誘發保護的疫苗。基本上，首先自全長HA分子中移除高度易變且免疫顯性的部 分（亦即頭部域），以產生HA主干域多肽（亦稱為"微型HA"）。以此方式，免疫反應將對 定位有針對廣泛中和抗體的抗原決定基的主干域重定向。抗體CR6261及CR9114用于探查 新建分子的正確折疊，并用于證實存在中和抗原決定基。
[0233] 因此，本發明的多肽在膜遠程頭部域中存在的顯性抗原決定基不存在的情況下， 向免疫系統呈現膜近端主干域HA分子的保守抗原決定基。為此，移除構成頭部域的ΗΑ0蛋 白的一級序列的一部分，且直接再連接或藉由引入較短柔性連接序列（'連接子'）來再連 接，以恢復多肽鏈的連續性。所得序列藉由引入特定突變來進一步修飾，這些突變使ΗΑ0分 子的剩余部分的天然3維結構穩定。
[0234] 病毒中HA分子的功能為結合至細胞表面受體唾液酸，及在吸收于內體中之后，介 導病毒與內體膜的融合，引起病毒RNA釋放至細胞中。融合過程中的基本步驟為HA分子的 較大構象變化，該構象變化使分子的二級結構組件重排以使融合肽暴露。因此，HA分子存在 的兩種構象（融合前及融合后）在其三級結構方面極其不同。由于病毒HA蛋白質主要以 融合前狀態暴露于免疫系統，故重要的是確保本發明的多肽采用此構象。此要求可藉由使 融合前構象穩定且同時使融合后構象不穩定來滿足。由于融合前構象為介穩態且采用融合 后構象可產生穩定構象（亦即能量最低）（Chen等人，1995)，故需要此穩定/去穩定作用。
[0235] 在此實例中，采用來自 H1N1A/ 布里斯班（Brisbane)/59/2007 的 HA(SEQ ID NO: 1) 作為一級（或野生型）序列來建立本發明的多肽。
[0236] 在第一步驟中，本發明的多肽的構建法是移除在位置59與291之間的HA1序列 (編號參考ΗΑ0序列中的位置，如SEQ ID NO: 1中所示。在某些實施例中，HA1部分包含氨基 酸18至343,且HA2部分包含氨基酸殘基344至565 ;由于SEQ ID NO: 1包含信號肽，故HA1 部分起始于位置18)。此結果為移除ΗΑ0的殘基60至290。此等殘基被GGGG連接序列置 換。接著，藉助于Brugel計算融合前及融合后構象中各殘基的可利用表面積（Delhaise等 人，1984)。如Samantha等人（2002)中所述，測定各殘基的暴露及隱藏程度，其中著重于在 融合前構象中暴露且在融合后構象中隱藏的殘基。此等殘基的進一步分析指示一些此等氨 基酸殘基可依一定方式突變，該方式使得突變不會影響融合前構象，但會使融合后構象不 穩定。此等殘基通常具有疏水性側鏈且參與形成融合后構象中的卷曲螺旋。使此等氨基酸 殘基突變成親水性氨基酸將擾亂卷曲螺旋性質（卷曲螺旋中螺旋之間的接觸通常為疏水 性），且因此使融合后構象不穩定。
[0237] 依據此推斷，在序列的HA2部分中引入一些突變：Phe 406突變成Ser(F406S)、Val 409 突變成 Thr (V409T)、Leu 416 突變成 Ser (L416S)及 Tyr502 突變成 Ser (Y502S)。此等突 變為自HA表面移除疏水性殘基的突變。應注意到L416突變成S或T時亦引入共同N-糖基 化位點（共同序列為NX(S/T))。此位置處的糖基化將進一步增強此區域的溶解度。此外， Leu58 突變成 Thr(L58T)、Val 314 突變成 Thr(V314T)且 lie 316 突變成 Thr(I316T);此等 突變均在HA1域中，亦即對應于在天然ΗΑ0鏈裂解后的HA1的序列部分。后兩個突變維持 側鏈的β分支，但自表面移除疏水性殘基。如以下將展示，將一些此等突變引入所有變異 體中，在各別多肽中測試其他此等突變，以研究這些突變是否以不合需要的方式彼此影響。
[0238] 為了增強多肽的穩定性，研究兩個二硫橋鍵以將ΗΑ鎖定為融合前構象。二硫橋鍵 形成于在空間上彼此相隔適當距離（在全長ΗΑ分子中）的殘基之間，且這些殘基使其已在 正確位置處的C-β原子形成二硫橋鍵。所提出的第一二硫橋鍵是在位置321 (ΗΑ1域）與 位置405 (ΗΑ2域）之間。在ΗΑ2域內，二硫橋鍵產生于位置413與421之間。
[0239] 由于在位置R343處裂解ΗΑ為構象變化能夠進行的基本步驟，故在本發明的多肽 中，藉由引入Arg(R)至Gln(Q)的突變來移除裂解位點。本發明的另一解決方案為將Arg 變為Gin且使殘基345至350 (HA2的融合肽的一小部分）缺失。此等（疏水性）序列的移 除將使多膚進一步穩定。
[0240] 在某些實施例中，本發明的多肽含有HA的細胞內序列及跨膜域。在其他實施例 中，移除 HA2 的位置 523、524、525、526、526、527、528、529 或 530(或其等效位置）至 HA2 的C端（編號根據SEQ ID NO: 1)的細胞質序列及跨膜序列，以便在表達于細胞中之后制 造可用于例如疫苗的分泌型（可溶性）多肽。藉由引入已知形成三聚體結構的序列，亦 即AYVRKDGEWVLL(SEQIDN0 :143)，任選地經由連接子連接，使可溶性多肽進一步穩定。連 接子可任選地含有裂解位點以用于之后根據普通技術人員所熟知的方案處理。為了促進 可溶性形式的純化，可添加標記序列，例如經由較短連接子（例如EGR)連接的his標記 (HHHHHHH)。在一些實施例中，在不存在折疊子序列的情況下添加連接子及his標記序列。 根據本發明，HA2域的位置530 (編號根據SEQ ID NO: 1)至C端氨基酸的氨基酸序列可經移 除并置換為以下序列：EGRHHHHHHH(SEQ ID N0:81)，包含較短連接子及his標記；或SGRSLV PRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHH(SEQ ID N0:82)，包含凝血酶裂解位點、三 聚域及his標記。
[0241] 將上述突變根據其功能及在HA干多肽的3維結構中的位置集合成聚簇。所有多 肽均含有HI HA序列1至59及291至565及R343Q突變，具有以下其他突變：L58T、V314T、 I316T、F406S、V409T、L416S(SEQ IDN0:3 ;命名為聚簇1)。此外，制得具有其他突變的變異 體：
[0242] 聚簇 2 :K321C、Q405C(SEQ ID N0:4)
[0243] 聚簇 3 :F41：3C、E421C(SEQ ID NO:5)
[0244] 聚簇 4 :HA2Y5〇2S (SEQ ID NO:6)
[0245] 另外，制得含有聚簇1序列且此外含有聚簇2及3(SEQ ID NO:7)或聚簇2、3及 4(SEQIDN0:8)的突變的兩種變異體。
[0246] 合成編碼上述蛋白質序列的基因，且使用普通技術人員一般已知的方法克隆至 表達載體PCDNA2004中。出于比較的原因，將全長序列（SEQIDN0:1)以及由Steel等 人（2010)描述的序列（Hl-PR8-dHl ;SEQIDN0:24，其是基于HlNlA/波多黎各（Puerto Rico)/8/1934序列）包括于實驗中。
[0247] 使用40 μ 1 293 transfectin作為轉染試劑用表達載體（1 μ g/ml)轉染 HEK293F(Invitrogen)懸浮細胞（106個細胞/毫升，30ml)，且允許再增殖2天。收集細胞， 等分試樣（〇. 3ml，約3X 105個細胞），且將等分試樣以針對HI HA產生的多克隆血清處理以 探查表達或以HA特異性單克隆抗體（5微克/毫升）及用于染色的二級抗體處理。隨后， 使用針對H1HA產生的多克隆血清，針對膜連接的本發明的HA主干域多肽的表達，藉由熒光 結合細胞分選（FACS)分析細胞以探查表達。將具有結合全長蛋白質的已知特異性的單克 隆抗體小組（例如CR6261及CR9114)用于探查保守抗原決定基的存在，且根據推理探查全 長HA及本發明的微型HA多肽的正確折疊。結果表示為陽性細胞百分比及平均熒光強度， 且展示于圖2中。
[0248] 結果展示所有構建體均表達于細胞表面上，因為與對于未經轉染的細胞的約4% 相比，與多克隆血清（抗H1多克隆）的反應引起所分析的全部細胞的75%或75%以上為 陽性。此結果由平均熒光強度（MFI)的值證實，這些值對于以多克隆血清處理之后的所有 構建體而言為類似的。不存在IgG、僅使用經標記的抗人IgG或不相關單抗的對照實驗均 為陰性的。A/布里斯班（Brisbane)/59/2007及A/波多黎各（Puerto Rico)/8/1934全長 HA蛋白質均由單克隆抗體CR6261、CR6254、CR6328(均已知結合并中和HI HA ;Throsby等 人（2008) ;TO 2008/028946)、CR9114(上述）、CR8001(結合至 H1HA，但不中和 HI;描述于 TO 2010/130636中）而非CR8057 (僅結合至某些H3病毒株，亦描述于W0 2010/130636中） 及 CR6307(Throsby 等人（2008) ;TO 2008/028946)識別。
[0249] 考慮CR6261抗原決定基的不連續性及構象特征（Ekiert等人2009)，推斷出兩 種全長蛋白質均以其天然3維構象形式存在。對于在此實驗中測試的新設計的本發明多 肽而言，觀察到由單克隆抗體小組識別的相同模式：由CR6261、CR6254、CR6328、CR9114及 CR8001而非CR6307及CR8057結合。此現象在陽性細胞百分比的數據中最明顯，但亦在平 均熒光強度數據中觀察到。就細胞陽性％以及平均熒光強度而言，均在微型HA-聚簇1的 情況下獲得最佳結果。
[0250] 添加其他修飾，諸如上述二硫橋鍵（聚簇2及3)及聚簇4的Y502S突變或此等 突變的組合，引起陽性細胞百分比降低及平均強度降低。此實驗中所用的任何抗體均未在 背景水平以上識別含有頭部域缺失但缺乏其他修飾的由Steel等人（2010)描述的構建體 (SEQ ID N0:24)。因此，推斷出在DNA轉染之后，此蛋白未以其在HA中具有的天然3維構象 形式展示。
[0251] 上述結果預示聚簇1突變的重要性，這些聚簇1突變增強環的親水性特征，該環 由HA分子的連接A螺旋及較長骨架螺旋（⑶）的殘基402至418及周圍區域形成。為了 進一步確定聚簇1突變對本發明的多肽的穩定性及折疊的有益作用，在另一實驗中比較微 型HA(SEQ ID N0:2 ;根據Steel的多肽，但基于A/布里斯班（Brisbane))及微型祖_聚簇 1(本發明的多肽；SEQIDN0:3)(圖3)。
[0252] 盡管約60%經微型撤-聚簇1轉染的細胞在結合〇?6261、〇?6254、〇?6328及 CR9114之后為陽性，但用微型HA (根據Steel的多肽，但基于A/布里斯班（Brisbane) ;SEQ ID NO:2)轉染引起極接近于背景水平的值（1 %至3% )。我們推斷出聚簇1的突變與缺乏 此等突變的未經修飾的微型HA蛋白（SEQ ID N0:2)相比，有利地促進本發明的多肽的正確 折疊及穩定性。
[0253] Steel等人藉由以下方式建立一種新的分子：使HI A/波多黎各（Puerto Rico)/8/1934及H3 HK68病毒株的HA1的氨基酸殘基53至276自一級序列中缺失，且用較 短柔性連接子置換此缺失。如此實例中所示，此舉產生高度不穩定的分子，該分子并未調整 正確構象，如由先前展示結合至干區中的保守抗原決定基的抗體不發生結合所證實。不正 確折疊由較大區域的溶劑暴露引起，該較大區域通常由全長HA分子中的球狀頭部遮蔽。由 于此區域本質為疏水性的，故分子不再穩定且因此必需改適。
[0254] 如已在本發明多肽中進行的疏水性殘基調換為親水性殘基抵消此作用且使HA主 干域多肽穩定。藉由以下方式來達成主干域的天然3維折疊的進一步穩定：在適當位置處 引入二硫橋鍵，以使在天然三級結構中空間上接近但在一級結構中分離的殘基緊密連接。
[0255] 實例5 :賣例4的HA主干域多肽的免疫原性
[0256] 為了評估主干域多肽的免疫原性，用編碼以下的表達載體對小鼠進行免疫：來自 A/ 布里斯班（Brisbane)/59/2007 的全長 HI (SEQ ID NO: 1)、微型 HA-聚簇 1 (SEQ ID N0:3)、 微型HA-聚簇1+2 (SEQ ID NO:4)及微型HA-聚簇1+4 (SEQ ID NO:6)。出于比較的原因，亦將 由Steel等人（2010)設計的微型HA (微型PR8 ;SEQ ID NO: 24)及來自A/波多黎各（Puerto Rico)/8/1934的相應全長蛋白質HA包括于實驗中。亦包括編碼cM2的表達載體作為陰性 對照。
[0257] 在第1天、第21天及第42天用50 μ g構建體+50 μ g佐劑（pUMCVl-GM-CSF)對4 只小鼠（BALB\c)的組進行肌肉內免疫。在第49天，進行最終取血且收集血清。藉由FACS 分析來分析血清。使用40微升293transfectin作為轉染試劑用表達載體（1微克/毫升） 轉染HEK293F(Invitrogen)懸浮細胞（10 6個細胞/毫升，30ml)，且允許再增殖2天。收集 細胞，等分試樣（〇. 3ml，約3X 105個細胞），且將等分試樣以構建體特異性血清處理，用二 級抗體染色且藉由熒光結合細胞分選進行分析。結果展示于圖4中。
[0258] 正如所料，如由陽性細胞％及MFI表明，cM2特異性血清（陰性對照）識別cM2， 但全長HA或主干域多肽中沒有一者識別cM2。相比之下，全長HA特異性血清染色表達相 應全長HA(SEQ ID N0:1)的細胞，而且染色表達微型HA-聚簇1(SEQ ID勵:3)、微型撤-聚 簇1+2 (SEQ ID NO: 4)及微型HA-聚簇1+4 (SEQ ID NO: 6)的細胞，但在較低水平下（約40% 陽性細胞相對于針對全長的約80%，MFI約1000相對于針對全長的約7000)。反過來亦是 正確的：對微型HA-聚簇1(SEQ IDN0:3)、微型HA-聚簇1+2(SEQ IDN0:4)及微型HA-聚簇 1+4 (SEQ ID N0:6)具有特異性的血清識別表達相應構建體以及全長HA(SEQ ID NO: 1)的細 胞。結果概述于下表4中。
[0259] 與上述針對微型擬-聚簇1彼〇10勵:3)、微型擬-聚簇1+2彼〇10勵:4)及微 型HA-聚簇1+4 (SEQ ID N0:6)的結果對比，自經全長PR8免疫的小鼠獲得的血清并未很好 地結合至經Hl-PR8-dHl (SEQ ID N0:24)轉染的細胞。與針對微型HA-聚簇1 (SEQ ID N0:3) 及微型HA-聚簇1+2(SEQ ID N0:4)的40%至50%相比，細胞陽性百分比為約20%。在所 觀察的幾乎不在背景水平以上的平均熒光強度中亦反映該結果。
[0260] 總之，數據展示本發明的多肽能夠誘導針對全長HA的免疫反應。特定言之，在殘 基402與418 (編號根據SEQ ID NO: 1)之間的區域中的修飾對建立穩定分子很重要。
[0261] 實例6 :制各第二代豐干域多狀
[0262] 實例4中所述的主干域多肽的平均熒光強度在所有情況下均低于針對相應全長 蛋白質所觀察到的平均熒光強度；實際上，最佳設計微型HA-聚簇1(SEQIDN0:3)在與單克 隆抗體結合之后具有全長構建體的約10%平均強度的強度。由此指示細胞表面上主干域多 肽的表達和/或折疊低于針對全長蛋白質所觀察到的表達和/或折疊，且可進一步改良設 計。自第一代獲得的結果展示改良第一代構建體為可能的且因此啟動第二輪設計。
[0263] 實例4中所述的多肽是基于ΗΑ0鏈的相同缺失，亦即殘基L60至K290(微型1 ;編 號參考來自Η1Ν1 Α/布里斯班（Brisbane)/59/2007的全長ΗΑ0中的位置；SEQ ID NO: 1)。此 方法產生現不再連接于頭部域的較長非結構化環。推斷此環并不有助于整體蛋白穩定性， 且可在不影響多肽的其他部分折疊的情況下大大縮短。設計三種其他缺失，且用如前所述 的GGGG連接子序列置換且與上述聚簇1的突變組合。缺失為S53至P320 (微型2)、H54至 1302 (微型3)、G56至G317 (微型4)。引入與上述聚簇1 一致的其他修飾（L58T、V314T、 I316T、F406S、V409T、L416S)。屬于此聚簇的一些殘基為所缺失的序列的一部分，且因此可 不再經修飾（參見下文）。此外，在于融合前狀態中形成三聚卷曲螺旋的較長螺旋C中建 立兩種其他突變。此項技術中熟知三聚卷曲螺旋利用在七價重復序列的位置420 a及d處 的lie穩定，該七價重復序列為此結構基元的標志（Suzuki等人，（2005) ;Woolfson等人 (2005))。藉由在位置420(M420I)及427(V427I)處引入lie來應用此知識。此兩種突變 與聚簇1的突變的組合指定為聚簇11 ;為了闡明，以下列出組合：
[0264]
【權利要求】
1. 一種流感血球凝集素主干域多肽，其包含（a)流感血球凝集素 HA1域，該流感血球凝 集素 HA1域包含利用具有0至50個氨基酸殘基的連接序列共價鍵聯至HA1C端主干區段的 HA1N端主干區段；及（b)流感血球凝集素 HA2域，其中該血球凝集素主干域多肽在HA1與 HA2之間的接合點處可抵抗蛋白酶裂解，且其中連接HA2的A螺旋與螺旋CD的氨基酸序列 中的一或多個氨基酸與野生型流感HA2域相比已突變，且其中該HA1域及該HA2域來源于 選自由以下組成的組的A型流感病毒亞型：HI、H5及H3。
2. 如權利要求1所述的多肽，其中該多肽不包含全長HA1域。
3. 如權利要求1或2所述的多肽，其中該多肽經糖基化。
4. 如權利要求1、2或3所述的多肽，其包含（a)HAlN端區段，該HA1N端區段包含HA1 的氨基酸1至X，利用具有〇至50個氨基酸殘基的連接序列共價鍵聯至HA1C端主干區段， 該HA1C端主干區段包含HA1的氨基酸y至末端，及（b)流感血球凝集素 HA2域。
5. 如權利要求1至4中任一項所述的多肽，其中該多肽包含流感血球凝集素 HA1和/ 或HA2域，該流感血球凝集素 HA1和/或HA2域是基于來自包含H1亞型的HA的A型流感 病毒的流感血球凝集素，且其中X = 46與60之間的任何氨基酸且y = 290與325之間的 任何氨基酸。
6. 如權利要求5所述的多肽，其中該多肽包含流感血球凝集素 HA1和/或HA2域，該流 感血球凝集素 HA1和/或HA2域是基于來自包含H1亞型的HA的A型流感病毒的流感血球 凝集素，該H1亞型選自由表7的A型流感病毒組成的組。
7. 如權利要求1至4中任一項所述的多肽，其中該多肽包含流感血球凝集素 HA1和/ 或HA2域，該流感血球凝集素 HA1和/或HA2域是基于來自包含H3亞型的HA的A型流感 病毒的流感血球凝集素，且其中X = 56與69之間的任何氨基酸，且其中y = 292與325之 間的任何氨基酸。
8. 如前述權利要求中任一項所述的多肽，其中該HA1C端主干區段的C端氨基酸殘基為 除精氨酸（R)或賴氨酸（K)以外的任何氨基酸，優選地為谷氨酰胺（Q)。
9. 如前述權利要求中任一項所述的多肽，其中該多肽在該HA1域和/或該HA2域中包 含一或多個其他突變。
10. 如前述權利要求中任一項所述的多肽，其中該多肽包含一或多個二硫橋鍵。
11. 如前述權利要求中任一項所述的多肽，其中該多肽不包含信號序列。
12. 如權利要求11所述的多肽，其包含HA1N端區段，該HA1N端區段包含HA1的氨基酸 P至X，利用具有0至50個氨基酸殘基的連接序列共價鍵聯至HA1C端主干區段，該HA1C端 主干區段包含HA1的氨基酸y至末端，及（b)流感血球凝集素 HA2域，其中p =成熟HA的 第一個氨基酸。
13. 如前述權利要求中任一項所述的多肽，其中該多肽不包含HA的細胞內及跨膜序 列。
14. 如權利要求13所述的多肽，其中該多肽不包含流感H1HA2域的C端部分，該C端部 分跨越 H1HA2 的氨基酸殘基 520、521、522、523、524、525、526、527、528、529 或 530 至 C 端氨 基酸。
15. 如前述權利要求中任一項所述的多肽，其中該多肽選擇性結合至抗體CR6261和/ 或CR9114,且不結合至抗體CR8057。
16. 如前述權利要求中任一項所述的多肽，其中該多肽選擇性結合至抗體CR8020、 CR843和/或CR9114,且不結合至抗體CR8057。
17. -種提供流感血球凝集素主干域多肽的方法，該方法包含以下步驟： (a) 提供流感HAO氨基酸序列； (b) 移除HA1與HA2之間的裂解位點； (c) 自該HAO序列中移除球狀頭部域的氨基酸序列； (d) 在使螺旋A的C端殘基連接至螺旋CD的N端殘基的氨基酸序列中引入一或多個突 變；及 (e) 在該HA主干域多肽中引入一或多個二硫橋鍵。
18. -種流感血球凝集素主干域多肽，其可利用如權利要求17所述的方法獲得。
19. 一種核酸，其編碼如權利要求1至16中任一項所述的多肽。
20. -種免疫原性組合物，其包含如權利要求1至16中任一項所述的多肽和/或如權 利要求19所述的核酸分子。
21. 如權利要求1至16中任一項的多肽、如權利要求19所述的核酸和/或如權利要求 20所述的免疫原性組合物，其用作藥物，尤其用作疫苗。
【文檔編號】C07K14/005GK104066446SQ201280067834
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2012年11月27日 優先權日:2011年11月28日
【發明者】J·W·梅博閣, A·因帕利亞佐, R·福格爾斯, R·H·E·弗里森, P·阿拉爾, S·洛夫里克斯, K·拉多塞維奇 申請人:克魯塞爾荷蘭公司