具有降低的免疫原性的纖連蛋白結合域的制作方法
                            
            
                            
            文檔序號：3481543閱讀：1707來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            具有降低的免疫原性的纖連蛋白結合域的制作方法
            
【專利摘要】提供了一種III型纖連蛋白(10Fn3)結合結構域，其具有與降低免疫原性相關的新設計。本申請描述了可選擇的10Fn3結合結構域，其中某些免疫原區在產生結合子(binder)時不被修飾，以便保持被宿主生物體識別為自身抗原。本申請還描述了10Fn3結合結構域，其中HLA錨定區被破壞，從而降低了相鄰區域的免疫原性貢獻。還提供了具有被修飾區域的新型組合的10Fn3結構域，其能夠以高親和力結合期望的靶標。
            
【專利說明】具有降低的免疫原性的纖連蛋白結合域
            
[0001]序列表
            
[0002]本申請包含一個序列表，其已經通過EFS-Web以ASCII格式提交，本文援引并入其全部內容。所述ASCII拷貝于2012年10月31日生成，命名為MXI523PC.txt，大小為48，779字節。
            
[0003]引言
            
[0004]纖連蛋白是一個大蛋白，在細胞外基質的形成和細胞-細胞相互作用中發揮至關重要的作用；它由多個重復的三種類型(1、II和III型)的小結構域構成。III型纖連蛋白結構域(Fn3)是一個大的亞家族，其成員經常作為細胞粘附分子、細胞表面激素和細胞因子受體、分子伴侶和碳水化合物結合結構域的一部分被發現。綜述可見 Bork&Doolittle、Proc Natl Acad Sci USA89(19):8990-4(1992) ；Bork et al.、J MolB1l.242(4):309-20(1994) ;Campbell&Spitzfaden、Structure〗(5):333-7(1994)；Harpez&Chothia、J Mol B1l.238 (4):528-39(1994))。
            
[0005]基于纖連蛋白的支架(Fibronectin based scaffold)是一個具有免疫球蛋白樣折疊的蛋白的家族。這些蛋白一般使用衍生自III型纖連蛋白(Fn3)或Fn3樣結構域的支架，以天然或工程化抗體(即多克隆、單克隆或單鏈抗體)的特征方式發揮作用，并且具有結構上的優勢。具體地講，這些抗體模擬物的結構經常被優化以獲得最佳的折疊、穩定性和溶解性，即使是在通常會導致抗體結構和功能喪失的條件下。基于纖連蛋白的支架蛋白的一個實例是Adnectins?(Adnexus、Bristol-Myers Squibb的一個全資子公司)。已經顯不，基于纖連蛋白的支架的CDR樣環區能夠被修飾，從而進化成能夠結合任何興趣化合物的蛋白。例如美國專利N0.7，115，396描述了 Fn3結構域蛋白，其中對BC、DE和FG環的改變產生了高親和力的TNFa結合子。美國專利N0.7，858，739描述了 Fn3結構域蛋白，其中對BC、DE和FG環的改變產生了高親和力的VEGFR2結合子。
            
[0006]蛋白藥物在患者體內經常伴隨一定水平的免疫原性。這些免疫原性問題可能導致蛋白藥物效力降低，以及在患者體內產生潛在的有害免疫應答。因此，獲得免疫原性降低的、并可同時用于治療和診斷目的的改良纖連蛋白結構域支架蛋白，將是有利的。
            
[0007]概要
            
[0008]本申請的一個方面提供基于纖連蛋白的支架多肽，其包含經過修飾的環和支架區，例如與改進的靶結合關聯的β_鏈，的新組合。本申請的另一個方面提供了具有降低的免疫原性的新型基于纖連蛋白的支架多肽。
            
[0009] 在一些實施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域，其中該1QFn3結構域包含⑴相對于野生型人1QFn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環，在從BC、DE和FG環中選出的至少一個北極環(north pole loop)的氨基酸序列中含有修飾，和(?)相對于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環，在從AB、CD和EF環中選出的至少一個南極環(south pole loop)的氨基酸序列中含有修飾,其中該至少一個修飾的北極環和至少一個修飾的南極環貢獻于對相同靶標的結合。在一些實施方案中，多肽的至少一個北極環或至少一個南極環具有野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的氨基酸序列。
            
[0010]在一些實施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域，其中uiFr^結構域包含(i)AB、BC、⑶、DE、EF、或FG環中的至少一個的氨基酸序列中相對于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的修飾，和(ii)至少一個鏈的氨基酸序列中相對于野生型人’113結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應β -鏈的修飾，其中該至少一個修飾的環和至少一個修飾的鏈貢獻于對相同靶標的結合。在一些實施方案中，多肽可在至少一個鏈和至少兩個環中包含修飾的氨基酸序列。在一些實施方案中，多肽的至少一個修飾的環是從BC、DE和FG環中選出的北極環，且至少一個修飾的環是從AB、CD和EF環中選出的南極環，并且兩個環均貢獻于對靶標的結合。在一些實施方案中，至少一個環不是修飾的，即至少一個環具有對應于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的氨基酸序列。
            
[0011]在一些實施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域，其中所述wFnS結構域相對于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的序列在CD和FG環的氨基酸序列中含有修飾，并且其中CD和FG環貢獻于對相同靶標的結合。在一些實施方案中，相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的⑶環的序列，⑶環的至少3、4、5、6、7、8、9、10或11個氨基酸被修飾。在一些實施方案中，⑶環中對應于野生型人10Fn3結構域(SEQ ID NO:1或6)氨基酸殘基46或47的一個或多個氨基酸殘基與那些位置處的野生型氨基酸相同。在一些實施方案中，相對于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的FG環的序列，FG環的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個氨基酸被修飾。在一些實施方案中，FG環中對應于野生型人1QFn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸殘基75或87的一個或多個氨基酸殘基與那些位置處的野生型氨基酸相同。在一些實施方案中，相對于野生型人wFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的氨基酸序列，CD環和/或FG環的氨基酸序列的長度延長或長度縮短。還構想了它們的組合。例如，相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的氨基酸序列，CD和FG環中的至少一個的氨基酸序列的長度可以延長，且相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的氨基酸序列，CD和FG環中的至少一個的氨基酸序列的長度縮短。在一些實施方案中，相對于野生型人10Fn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應β -鏈的序列，包含修飾的CD和FG環的wFM結構域的多肽可以進一步在β -鏈C、β -鏈D、β -鏈F和/或β -鏈G的一個或多個中含有氨基酸序列修飾。在一些實施方案中，具有修飾的CD和FG環的多肽可以進一步在BC環的至少一部分中含有氨基酸序列修飾，例如BC環中對應于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸殘基30和31的一個或多個氨基酸殘基的修飾。在一些實施方案中，一個或多個修飾的鏈與經過修飾的環一起貢獻于對相同靶標的結合。在一些實施方案中，ΑΒ、DE和EF環的一個或多個沒有被修飾，即所述環具有野生型人1QFn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的氨基酸序列。
            
[0012]在一些實施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域，其中該wFM結構域相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的序列在CD和DE環的氨基酸序列中含有修飾，并且其中CD和DE環貢獻于對相同靶標的結合。多肽還可以進一步在EF環、β-鏈C、β-鏈D和/或β-鏈F中的一者或多者的氨基酸序列中包含修飾，并且這些額外的修飾可以和CD和DE環一起貢獻于對相同靶標的結合。一些實施方案中，相對于野生型序列中的相應殘基，對應于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的殘基 36-66 的氨基酸之間的至少 10、15、16、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個或全部31個殘基已經被修飾。在一些實施方案中，CD環的長度與野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的CD環相比延長或縮短。
            
[0013]在一些實施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域，其中該1QFn3結構域相對于野生型人1QFn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的序列在EF和FG環的氨基酸序列中含有修飾，并且其中EF和FG環貢獻于對相同靶標的結合。在一些實施方案中，該多肽可以進一步在AB環、@-鏈六和/或β-鏈G的一個或多個中包含氨基酸序列修飾，并且這些額外的修飾可以和EF和FG環一起貢獻于對相同靶標的結合。在一些實施方案中，多肽可以進一步在N端和/或C端含有序列修飾。特別地，相對于野生型序列中的相應殘基，最先7個氨基酸的氨基酸序列或對應于野生型人wFM結構域(SEQ IDNO:1或6)的殘基93-97的氨基酸的氨基酸序列可以被修飾。這些額外的末端修飾也可以和其它序列修飾一起貢獻于對靶標的結合。在一些實施方案中，相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)中的相應殘基，uiFr^結構域的前15個氨基酸殘基中有至少2、3、4、
            
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14個或全部15個被修飾。在一些實施方案中，相對于野生型人10Fn3結構域(SEQ ID NO:1或6)中的相應殘基，EF環的至少3、4或5個氨基酸殘基可以被修飾。在一些實施方案中，相對于野生型序列中的相應殘基，對應于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1 或 6)的殘基 80-97 的氨基酸之間的至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
            
15、16、17個或全部18個殘基可以被修飾。在一些實施方案中，相對于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的FG環，FG環的氨基酸序列的長度可以被延長或縮短。
            
[0014]在一些實施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域，其中wFM結構域相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應β -鏈和環的序列在β -鏈Α、ΑΒ環、β -鏈B、⑶環、β -鏈E、EF環和β -鏈F的氨基酸序列中含有修飾，并且其中被修飾的環和鏈貢獻于對相同靶標的結合。在一些實施方案中，相對于野生型人10Fn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的⑶環，⑶環氨基酸序列的長度被延長或縮短。在一些實施方案中，多肽可以進一步在β-鏈G和/或C端尾巴的氨基酸序列中含有修飾。
            
[0015]在一些實施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域，其中該1QFn3結構域相對于野生型人1QFn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的FG環的氨基酸殘基77-83的序列在FG環中含有序列修飾，并且其中該uiFr^以小于500nM的Kd與靶標結合。在一些實施方案中，相對于野生型FG環的氨基酸殘基77-83的序列，FG環中對應于野生型人1QFn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸殘基77-83的部分的長度被延長或縮短。在一些實施方案中，FG環單獨介導與靶的結合。在一些實施方案中，AB、BC、⑶、DE或EF環中的一個或多個具有野生型人wFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的序列。
            
[0016]在一些實施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域，其中所述wFM結構域相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環和β -鏈的序列在BC環以及β-鏈B或β-鏈C中至少一個中包含序列修飾，并且其中相對于在β-鏈B或β -鏈C中的至少一個中不含有相對于野生型的序列修飾的等價wFnS結構域，該kiFM結構域具有降低的免疫原性。在一些實施方案中，相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的BC環的氨基酸序列，BC環的氨基酸序列的長度被延長或縮短。在一些實施方案中，相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的最先7個氨基酸殘基的氨基酸序列，kiFM結構域進一步在最先7個氨基酸殘基的氨基酸序列中含有修飾。在一些實施方案中，相對于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的序列，uiFr^結構域進一步在DE環和/或FG環中含有修飾。在一些實施方案中，相對于野生型人wFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的DE環的氨基酸序列，DE環的氨基酸序列的長度被延長或縮短。在一些實施方案中，相對于野生型人1QFn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的FG環的氨基酸序列，FG環的氨基酸序列的長度被延長或縮短。在一些實施方案中，kiFM結構域在DE環中含有序列修飾，并且相對于野生型人wFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應β -鏈的序列，進一步在β-鏈F和/或β-鏈G中含有序列修飾。在一些實施方案中，kiFM結構域在FG環中含有序列修飾，并且相對于野生型人wFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應β -鏈的序列，進一步在β-鏈D和/或β-鏈E含有序列修飾。
            
[0017]在一些實施方案中，本文中提供的多肽的BC環的至少一部分具有野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的氨基酸序列。例如，BC環的前1、2、3、4、5、6、7或8個殘基可以與野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的BC環中相應的殘基相同。在另外的實施方案中，整個BC環具有野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的氨基酸序列。在一些實施方案中，相對于在BC環中具有額外修飾的等價多肽，BC環的至少一部分具有野生型序列的多肽的免疫原性降低。
            
[0018]在特定的實施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域，其中所述wFnS結構域相對于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的序列在BC環的一部分和FG環的一部分中含有序列修飾，并且其中相對于和野生型BC環相比BC環的更大一部分被修飾的kiFM結構域，該kiFM結構域具有降低的免疫原性。在一些實施方案中，BC環的被修飾的部分可對應于野生型人1QFn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的BC環的殘基28-29、27-29、26-29、25-29、或24-29。在一些實施方案中，FG環的被修飾的部分可對應于野生型人1QFn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的FG環的殘基77-79、77-80、77-81、77-82、77-83、77-84、77-85、或77-86。在一些實施方案中，FG環的被修飾的部分與野生型人1QFn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的FG環的相應部分相比具有插入或缺失。在一些實施方案中，BC和FG環貢獻于對靶標的結合。在一些實施方案中，相對于野生型人uiFr^結構域(SEQ IDNO:1或6)的DE環序列，uiFr^結構域進一步在DE環的一部分中含有序列修飾。在一些實施方案中，DE環的被修飾的部分對應于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1)的BC環的殘基52和53。在一些實施方案中，相對于進一步在氨基酸殘基23-27中的一個或多個中與野生型BC環中的相應位置相比包含修飾的等價kiFM結構域，該kiFM結構域的免疫原性降低。在一些實施方案中，kiFM結構域以小于500nM的Kd與靶結合。
            
[0019]在一些實施方案中，本文中提供的多肽的FG環不含有RGD整聯蛋白結合位點。
            
[0020]在一些實施方案中，本文中提供的多肽的疏水核心殘基相對于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)沒有被修飾。
            
[0021] 在一些實施方案中，相對于野生型人1QFn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的氨基酸序列，本文中提供的多肽的至少一個被修飾的環的氨基酸序列的長度被延長。在其它實施方案中，相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的氨基酸序列，本文中提供的多肽的至少一個被修飾的環的氨基酸序列長度被縮短。
            
[0022]在一些實施方案中，相對于野生型人1QFn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的C端尾巴的氨基酸序列，本文中提供的多肽的C端尾巴的氨基酸序列被修飾。在一些實施方案中，相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的最先7個氨基酸殘基的氨基酸序列，最先7個氨基酸殘基的氨基酸序列被修飾。在其它實施方案中，相對于野生型人kiFM結構域(SEQID NO:1或6)，多肽的N端截短了 1-7個氨基酸，和/或相對于野生型人kiFM結構域(SEQIDN0:1), C端截短了 1-9個氨基酸。
            
[0023]在一些實施方案中，本文中提供的多肽與野生型人uiFr^結構域(SEQ ID N0:l、2、60或6)的氨基酸序列具有至少50%同一性。在其它實施方案中，所述多肽與野生型人kiFM結構域(SEQ IDN0:1、2、60或6)的氨基酸序列具有至少65%同一性。在某些實施方案中，10Fn3結構域包含與由SEQ ID NO: 1,2,60或6的代表的天然存在的人uiFr^結構域至少60、
            
70、80或90%相同的氨基酸序列。
            
[0024]在一些實施方案中，本文中提供的多肽包含III型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域，其中該uiFr^結構域包含與SEQ ID NO: 2或60具有至少60%同一性的氨基酸序列，并以小于10nM的Kd與靶分子結合，其中所述kiFM結構域還包含不含有DK序列的C端尾巴。在一些實施方案中，C端尾巴包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列。在一些實施方案中，C端尾巴還包含半胱氨酸殘基。在其它實施方案中，C端尾巴包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在其它實施方案中，C端尾巴可以包含SEQ ID NOs:23-31中任一的序列。
            
[0025]在某些實施方案中，所述基于纖連蛋白的支架蛋白結合野生型kiFM結構域不結合的靶標。
            
[0026]在一些實施方案中，所述基于纖連蛋白的支架蛋白的kiFM結構域還包含具有1-10個氨基酸的N端延伸。在某些實施方案中，kiFM結構域包含位于SEQ ID NO:1或6的第一個氨基酸的N端一側的M、MG或G N。在其它實施方案中，對應于SEQ ID NO:1或6第1-8個氨基酸的氨基酸殘基被SEQ ID NOs:9-11或16-21中的任一個代替。
            
[0027]在一些實施方案中，所述基于纖連蛋白的支架蛋白進一步包含一個或多個選自下組的藥代動力學(PK)模塊:聚氧化烯模塊、人血清白蛋白結合蛋白、唾液酸、人血清白蛋白、轉鐵蛋白、IgG、IgG結合蛋白和FC片段。在一些實施方案中，PK模塊是聚氧化烯模塊，并且所述聚氧化烯模塊是聚乙二醇(PEG)。在一些實施方案中，PEG模塊通過半胱氨酸或賴氨酸與所述基于纖連蛋白的支架蛋白共價連接。在一些實施方案中，PEG為大約0.5kDa-大約 10kDa。
            
[0028]在某些實施方案中，本申請提供可藥用的組合物，其包含本文中所述的新型uiFr^結構域。在一些實施方案中，該組合物基本上沒有致熱源。在一些實施方案中，組合物基本上沒有微生物污染，使得其適合于體內施用。組合物可以被配制成用于，例如，靜脈內(IV)、腹膜內(IP)或皮下(SubQ)施用。在一些實施方案中，組合物包含生理學上可接受的載體。在一些實施方案中，組合物的pH為4.0-6.5,4.0-5.5，或者等于4.0,4.5、5.0或5.5。在一些實施方案中，組合物中基于纖連蛋白的支架蛋白的濃度為5mg/ml。
            
[0029]在某些實施方案中，本申請提供了編碼如本文中所述的新型uiFr^結構域的核酸。還包括含有這些蛋白的多核苷酸的載體。合適的載體包括，例如，表達載體。本申請的進一步的方面提供一種細胞，其包含編碼kiFM結構域的多核苷酸、載體或表達載體。序列優選地被優化，以便在所用細胞類型中獲得最大表達。在一些實施方案中，表達在細菌細胞中進行，例如大腸桿菌。在其它實施方案中，表達在哺乳動物細胞中進行。在一個實施方案中，細胞表達包含如本文中所述的uiFr^結構域的蛋白。在某些實施方案中，編碼uiFr^結構域的多肽被密碼子優化，以便在所選的細胞類型中表達。還提供了用于產生如本文中所述的10Fn3結構域的方法，包括培養包含編碼kiFM結構域的核酸、載體或表達載體的宿主細胞，和從培養物回收所表達的蛋白。
            
[0030]在某些實施方案中，本申請提供了如本文中所述的基于纖連蛋白的支架蛋白的文庫。本文中提供的文庫可以包含例如至少105、106、107、108、109、1010、1012、1013、或114或更多個成員。還提供了用于從本文中所述的文庫中的一個分離特異性結合感興趣的靶標的基于纖連蛋白的支架蛋白的方法。例如，文庫分離方法可以包括，例如，使基于纖連蛋白的支架蛋白的文庫與感興趣的靶標接觸，和分離與靶標結合(例如以特定的親和力或在合適的清洗條件下結合)的成員。分離步驟可以用任何合適的方法實施，例如噬菌體展示或HiRNA展示。類似地，靶標結合可以用任何合適的方法實施，例如將靶標固定在固體支持物(例如柱子、芯片、珠子等)上，并在適合于蛋白結合的條件下將固定的靶標與文庫混合。然后將可以已結合的文庫成員與未結合的文庫成員分離，獲得與靶標結合的、分離的基于纖連蛋白的支架蛋白。在某些實施方案中，分離方法可以涉及重復多輪靶標結合和分離步驟。
            
[0031]附圖簡要說明
            
[0032]圖1:野生型kiFM氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，其中疏水核心氨基酸殘基已被標明。β -鏈用粗體標明，環區用成對字母標示，疏水核心殘基加有粗體下劃線(underlinedin bold)。氨基酸95-101對應于尾巴，當具有SEQ ID NO:1的uiFr^結構域沒有該尾巴時，便成為具有SEQ ID NO:6的uiFr^結構域。
            
[0033]圖2 (A-F):野生型uiFr^結構域氨基酸序列(SEQ ID NO:1或6)，其中全長序列(SEQ ID NO:1)中標明的氨基酸位置可以被突變，以提供一個代表性的修飾kiFM多肽補丁(patch)文庫。可以加以修飾而產生各個代表性補丁文庫kiFM多肽的可能位置用粗體表示并加有下劃線。這些標出的位置中的任何一個或它們的組合可以被突變而產生西北結合子(Northwest Binder)(圖 2A)、東北結合子(Northeast Binder)(圖 2B)、西側結合子(WestSide Binder)(圖 2C)、南-前結合子(South-Front Binder)(圖 2D)、AG 鏈結合子(圖 2E)和西南結合子(South West Binder)(圖 2F)。
            
[0034]圖3(A_F):野生型kiFM結構域的晶體結構，其中顯示了不同的可能結合界面的視圖。可以從野生型改變的殘基用黑體顯示。不屬于6個環中其中之一的成員的被改變殘基添加有棒線(Stick)。顯示了野生型kiFM結構域的西北(Northwest)結合界面(圖3A)、東北(Northeast)結合界面(圖3B)、西側(West Side)結合界面(圖3C)、南-前(South-Front)結合界面(圖3D)、AG鏈結合界面(圖3E)和西南(South West)結合界面(圖 3F)。
            
[0035]圖4 =HLA結合數據顯示了 5種不同HLA等位蛋白與kiFM多肽的5種不同肽片段的IC5tl結合親和力(μΜ)。SEQ IDN0s:58、51和52分別是BC、DE和FG環的環區集群 (loopreg1n cluster),環區殘基用下劃線標示。SEQ ID NOs: 53和54分別是wFnS多肽野生型和經過修飾的支架區片段。如圖所示，BC環區集群(SEQIDN0:58)和兩個所測試的支架區肽片段(SEQ IDN0s:53和54)是大多數被測試的HLA等位蛋白的強結合子(〈25 μ M)。支架區肽片段(SEQ ID NOs:53和54)的預測的免疫顯性(immunodominant)區用下劃線標示。
            
[0036]圖5 =Notchl:鼠DLL4競爭測定結果，顯示通過Biacore分析確定，SEQ ID NOs: 3和4的WS-LIl結合子能夠100%抑制Notchl與鼠DLL4之間的相互作用，SEQ ID NO:5的WS-LIl結合子能夠抑制75%。
            
[0037]圖6:大小排阻色譜結果，顯示SEQ ID NO:3的WS-LIl結合子主要是單體，而SEQID N0s:4和5的WS-LIl結合子則含有單體和聚集蛋白的混合物。粗線軌跡對應于被測試的WS-LIl結合子，而非粗線軌跡對應于分子量標記，WS-LIl結合子單體的預期在第3和第5標記峰之間洗脫。
            
[0038]圖7:大小排阻色譜結果，顯示SEQ ID NOs:45-47的WS-LII結合子主要是單體。粗線軌跡對應于被測試的WS-LIl結合子，而非粗線軌跡對應于分子量標記，WS-LII結合子單體預期在第3和第5標記峰之間洗脫。
            
[0039]圖8:大小排阻色譜結果，顯示SEQ ID NOs:48-49的WS-LII結合子主要是單體。粗線軌跡對應于被測試的WS-LIl結合子，而非粗線軌跡對應于分子量標記，WS-LII結合子單體預期在第3和第5標記峰之間洗脫。
            
[0040]圖9(A_C):非傳統kiFM結合子的文庫設計。圖9A顯示的是BC環基本上或完全沒有被修飾(即BC環的全部或大部分保持野生型序列)的文庫設計。圖9A所示文庫的所有CD和FG環可以在大小上不同，特別是，SP1、WS2’、WS2’ -CD、Front3和CDl-環的CD環的長度可以改變。Back3的FG環的大小也可以改變，⑶1_環的前3個氨基酸(即VSD)可以被刪除。圖9B顯示的是BC環N端的不同部分被保持為野生型的文庫設計。圖9C顯示的是BC環和BC環兩側的β-鏈區的一個或兩個均被修飾的文庫設計。也可以通過將71位的蘇氨酸保持恒定和/或將氨基酸1-7的長度保持恒定而構建文庫ΝΡ-6。也可以通過將71位的蘇氨酸保持恒定和/或將氨基酸1-7的長度保持恒定，和/或將BC環保持恒定，來構建文庫ΝΡ4-5。在圖9A-C的每一個中，全長野生型kiFM結構域(SEQ ID NO:1)顯示在最上，氨基酸編號為1-101，并標示了環區和鏈區。野生型kiFM結構域的下面是經典的北極文庫(north pole library)設計(即BC、DE和FG環被修飾)。在經典北極文庫設計之下顯示的是非傳統的文庫設計。可以被取代修飾的位置用粗體加下劃線指示，可以被取代、插入和/或刪除修飾的區域用粗體加方框指示，非野生型氨基酸殘基加有陰影。在圖9B中，所有序列均是基于 SEQ ID NO:1。在圖 9C 中，WT10Fn3、經典 NP、NPU NEU NP4-5、NP6-1、和 NW2 序列如SEQ ID NO:1所示；所有其余序列如SEQ ID NO: 59所示。在圖9A中，WT1QFn3、經典NP、WS1、WS2、WS3、L1-3(a)、WS-LI1、WS2，和 WS2’ -CD 是基于 SEQ ID NO:1 ;所有其余序列基于SEQ ID NO: 59。所有文庫還可以基于SEQ ID NO:6或SEQ ID NO: 12，即分別缺少SEQ ID NO:1和59的氨基酸95-101。
            
[0041 ] 圖10:8個特異性結合人PXR配體結合結構域的1QFn3多肽(Adnectin-1至Adnectin-8)與親本1QFn3結構域(SEQ ID NO:1)的序列比對。β鏈的位置用序列比對下方的箭頭指示，相應氨基酸用粗體指示。Adnectin-3(SEQ ID NO:62)和-4(SEQ IDNO:63)對應于SEQ ID NOs:48和49，并具有一個額外的6xHis尾巴(SEQ ID NO:44)。Adnectin-U _2、-5、-6、-7 和 _8(分別為 SEQ ID NOs:70-72 和 13-15)分別對應于 SEQ IDNO: 64-69，并具有一個額外的 6xHi s 尾巴(SEQ ID NO: 44)。
            
[0042] 圖11:柱狀圖顯示了(從左至右)玻連蛋白、纖連蛋白、非結合性對照adnectin(RGD被變為RGE)、以及三種不同與特異靶標結合但不含有RGD序列的wFM分子(分別為kiFMAJ和C)與固定的整聯蛋白αν_β3的結合程度。
            
[0043]圖12:野生型人 10Fn3 (SEQ ID NO: 6)(頂行)和 WS4、WS5、WS6 和 WS7 文庫的 10Fn3的氨基酸序列。用下劃線粗體和方框標記的氨基酸可以通過取代、刪除和添加而改變。用下劃線標記的氨基酸可以通過取代改變。
            
[0044]詳細說明
            
[0045]定義
            
[0046]“多肽”的意思是兩個或多個氨基酸的任何序列，不考慮其長度、翻譯后修飾或功能。“多肽”、“肽”或“蛋白”在本文中可以互換使用。多肽可以包括天然氨基酸和非天然氨基酸，例如在美國專利N0.6，559，126中描述的那些，本文援引并入其內容。多肽還可以通過多種標準化學方法中的任何一種進行修飾(例如氨基酸可以被保護基團修飾；羧基端氨基酸可以被變成末端酰胺基團；氨基端殘基可以被基團修飾從而例如提高親脂性；或者多肽可以被化學糖基化或被其它修飾，從而提高穩定性或體內半衰期)。多肽修飾可以包括向多肽附接另一種結構，例如環狀化合物或其它分子，也可以包括含有一個或多個構型改變的氨基酸(即R或S ;或L或D)的多肽。
            
[0047]如本文中所使用的，kiFM的“區域”是指人kiFM結構域的環(AB、BC、⑶、DE、EF和FG)、β-鏈(八、8、(:、03、卩和6)川端(對應于SEQ ID NO:1的氨基酸殘基1-7)、或C端(對應于SEQ ID NO:1的氨基酸殘基93-101)。
            
[0048]“北極環”是指人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域的BC、DE和FG環中的任一個。 
            
[0049]“南極環”是指人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域的AB、⑶和EF環中的任一個。
            
[0050]“支架區”是指人kiFM結構域的任何非環區。支架區包括β-鏈A、B、C、D、E、F和G以及N端區(對應于SEQ ID NO:1的殘基1_7的氨基酸)、和C端(對應于SEQ ID NO:1的殘基93-101的氨基酸)。
            
[0051]本文中“百分比(％)氨基酸同一性”的定義為，在比對序列并在需要時引入缺口以實現最大百分比序列同一性之后，同時不將任何保守取代看作序列同一性的一部分，在此條件下候選序列中與所選序列氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。出于確定百分比氨基酸序列同一性的目的進行的比對，可以使用本領域技術中的各種方法實現，例如使用公眾可得的計算機軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign (DNASTAR)軟件。本領域的技術人員能夠確定用于比對的合適參數，包括在所比較的全長序列上實現最大比對所需的任何算法。然而為了本文中的目的，％氨基酸同一性數值通過使用序列比較計算機程序ALIGN-2如下文所述地獲得。ALIGN-2序列比較計算程序由GenentechInc.編寫，并在美國版權局，Washington D.C.、20559，以用戶文檔存檔(filed with userdocumentat1n),其注冊的美國版權登記號為N0.TXU510087,并可以通過Genentech Inc.(South San Francisco、Calif)公共獲得。ALIGN-2程序應當被編譯用于在UNIX操作系統，優選地在digital UNIX V4.0D上使用。所有的序列比較參數由ALIGN-2程序設定，并不做改變。
            
[0052]為了本文的目的，給定氨基酸序列A與、和、相對于給定的氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(該語句可以另行表述為，給定的氨基酸序列A與、和、或相對于給定氨基酸序列B具有或包含特定的％氨基酸序列同一性)，其計算如下:100乘以X/Y的分數，其中X是序列比對程序ALIGN-2在程序比對A和B之后打分為相同匹配的氨基酸殘基的數目，而Y是B中氨基酸殘基的總數。應當意識到，當氨基酸序列A的長度與氨基酸序列B的長度不相等時，A與B的％氨基酸序列同一性并不等同于B與A的％氨基酸序列同一性。
            
[0053]如本文中所使用的，如果滿足如下條件，則認為多肽中的氨基酸殘基“貢獻于對靶的結合”:(I)基于實驗確定的復合物三維結構，殘基的側鏈或主鏈的任何非氫原子被發現與結合靶標的任何原子的距離在5A之內，和/或(2)將殘基突變成其在野生型kiFM (例如SEQ ID NO:1或6)中的等價物，突支成丙氨酸，或突變成與所述殘基具有相似大小或更小的側鏈的殘基，導致與靶標的平衡解離常數發生可測量的增加(例如km增加)。
            
[0054]多肽的“半衰期”可以一般地定義為，由于例如多肽的降解和/或多肽通過自然機制被清除或隔離，導致多肽的血清濃度在體內降低50%所需的時間。半衰期可以通過任何本身已知的方法加以確定，例如藥代動力學分析。合適的技術是本領域技術人員顯而易見的，并且一般地涉及例如如下步驟:向靈長動物施加合適劑量的多肽；以規則的時間間隔從所述靈長動物收集血液樣品或其它樣品；確定所述血液樣品中多肽的水平或濃度；和從所得數據(的圖)計算與施用時的初始水平相比多肽的水平或濃度降低50%所需的時間。用于確定半衰期的方法可以在例如如下文獻中找到=Kenneth等、Chemical Stabilityof Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists (1986) ；Peters 等、Pharmacokineteanalysis: A Practical Approach (1996);和"Pharmacokinetics"、M Gibaldi 和 D Perron、Marcel Dekker出版、第二次修改版本(1982)。
            
[0055]半衰期可以用參數表示，例如tl/2-α、tl/2-β和曲線下面積(AUC)。在本說明書中，“半衰期增加”是指這些參數中任何一個增加，這些參數中的任何兩個增加，或這三個參數增加。在某些實施方案中，半衰期增加是指tl/2-β增加，同時伴隨或不伴隨tl/2-α和/或AUC或兩者的增加。
            
[0056]概覽
            
[0057]10Fn3結構域是抗體特別是抗體可變區的結構和功能類似物。在歷史上，10Fn3結合結構域的設計依賴于wFM結構域結構與抗體VH結構域結構的相似性。特別是，10Fn3結合結構域傳統上依賴于wFnS結構域⑶R樣環的氨基酸序列的修飾。wFnS結構域AB、BC、⑶、DE、EF和FG環中的每一個都與免疫球蛋白的互補決定區(CDR)相似，因為它們有柔性并且易于對其氨基酸序列進行修飾，而不會改變kiFM結構域的整體結構。而且已經顯示，對沿著kiFM結構域一個表面的CDR樣環組(即“北極環”)的修飾容許開發出可以結合期望靶標的 1QFn3 結構域(見例如 PCT 公開 W002/032925、W02008/097497、和 W02008/066752)。在這些傳統的wFM支架設計中，環之間的蛋白序列，即β -鏈，通常不被修飾或者僅有很少的修飾，因為它們在保持kiFM的整體結構構象中發揮作用。我們現在驚訝地發現，有可能以非傳統的方式對kiFM結構域進行修飾，從而產生可以結合期望靶標同時保持合適穩定性的蛋白質。
            
[0058]特別地，本申請提供了基于纖連蛋白的支架多肽，其包含經過修飾的環和支架區的新組合，并與改善的性質相關。本文中所述的基于纖連蛋白的支架蛋白包括一個或多個人第十III型纖連蛋白結構域，其已被修飾從而與一種或多種期望的靶標結合。本申請部分地涉及如下令人驚訝的發現，即纖連蛋白結構域環和/或支架區的修飾的新組合與特異的靶結合相關。特別地，已經發現，基于纖連蛋白的支架蛋白中的新支架區(例如非環區)修飾可以與特定的環修飾組合，以獲得特異的靶結合。這樣的新支架設計拓展了設計基于10Fn3的結合蛋白的潛力。例如，本文中所述的非傳統支架設計通過開放kiFM結構域中的新區域以供序列修飾，為創建具有更大多樣性的文庫提供了可能。此外，利用非傳統支架設計可以產生與傳統CDR樣環界面提供的界面幾何形狀相比替代性的表面界面幾何形狀。這些非傳統結合子提供的額外的多樣性和備選的表面幾何結構可能有助于開發具有期望性質的wFnS結合結構域，例如通過提供對給定靶標具有更高的親和力的kiFM結合結構域，或者通過提供結合給定靶標上的不同表位的kiFM結合結構域。
            
[0059]本申請還描述了具有降低的免疫原性的新型基于纖連蛋白的支架多肽。如本文中的實施例所述，已經發現，基于強HLA結合活性，β -鏈B/BC環/ β -鏈C區可能是免疫原性“熱點”。特別地，該區域似乎充當HLA結合的強錨定序列。實施例還顯示，β-鏈B/BC環/β -鏈C區的野生型序列被靈長動物宿主識別為自身抗原。因此，盡管具有強HLA結合，但是沒有產生對野生型序列的免疫應答。因此，我們開發了備選的kiFM支架，其中β-鏈B/BC環/β-鏈C區內的關鍵區域被保留為野生型，同時對該序列其它區域的修飾允許高親和性靶結合。這些備選的結合子將會有更大的機會產生具有高親和力，并避免在宿主生物體中發生不良免疫應答的kiFM結合結構域，因為β -鏈B/BC環/ β -鏈C區的免疫原性熱點沒有改變，故其應會被宿主生物體識別為自身抗原。本申請還提供了備選的kiFM結合結構域，其中β -鏈B/BC環/ β -鏈C區中的HLA錨定序列已被破壞，其應當會降低該區域的免疫原潛能。這些除去了錨定序列的kiFM結合結構域應當允許對全部或部分BC環多樣化，同時仍然避免發生與此區域相關的不良免疫應答。HLA錨定序列的除去或破壞可以通過修飾β -鏈B/BC環/ β -鏈C區中的關鍵殘基，結合對BC環區進行修飾來實現。具有被降低的免疫原潛力的非傳統kiFM結合結構域的實例在下面進一步描述。
            
[0060]本文中所述的新型基于纖連蛋白的支架多肽可以加以設計而結合任何感興趣的靶標。在示例實施方案中，靶標是抗原，多肽或感興趣的治療性蛋白靶標。期望的治療性靶標實例包括，例如，腫瘤壞死因子α (TNF-α)、δ樣蛋白4 (DLL4)、白細胞介素17 (IL-17)和孕烷X受體(PXP)。 
            
[0061]基于纖連蛋白的支架
            
[0062]A.一般結構
            
[0063]Fn3是指纖連蛋白的3型結構域。Fn3結構域小、單體、可溶并且穩定。它缺少二硫鍵，因此在還原條件下穩定。Fn3的整體結構類似于免疫球蛋白折疊。Fn3結構域包括，按照從N端到C端順序，β或β樣鏈A ;AB環；β或β樣鏈B ;BC環；β或β樣鏈C ；CD環；β或β樣鏈D ;DE環；β或β樣鏈E ;EF環；β或β樣鏈F ；FG環；和β或β樣鏈G。7個反平行β_鏈排列成2個β折疊片，它們形成一個穩定核心，同時產生兩個由連接β或β樣鏈的環構成的“面”。ΑΒ、⑶和EF環位于一個面上(“南極”)，BC、DE和FG環位于相對面上(“北極”)。AB、BC、⑶、DE、EF和FG環的任一個或全部可參與配體結合。在人纖連蛋白中有至少15種不同的Fn3模組(module)，雖然模組之間的序列相似度較低，但是它們在四級結構上均具有高度相似性。
            
[0064]在示例實施方案中，本文中所述的配體結合支架蛋白是基于第十3型纖連蛋白結構域，即Fn3的第十模組(1QFn3)。天然存在的人1QFn3的氨基酸序列在SEQ ID NO:1中給出:
            
[0065]VSDVPRDLEVVAATPTSLLISffDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:1) (AB、CD和EF環用下劃線標出；BC、FG和DE環用粗體強調；β -鏈位于每兩個環區之間；Ν端和C端區域用斜體顯示)。SEQ ID NO:1是包含尾巴，即氨基酸95-101，的1QFn3分子的序列。SEQ ID NO:6是不包含尾巴、并且由SEQID NO:1的氨基酸1-94構成的野生型人kiFM分子的氨基酸序列。
            
[0066]SEQ ID NO:1中參與形成疏水核心的殘基(“核心氨基酸殘基”)包括對應于SEQID N0:1 或 6 的如下氨基酸的氨基酸:L8、V10, A13、L18、120、W22、Y32、134、Y36、F48、V50、A57、I59、L62、Y68、I70、V72、A74、188、190和Y92，其中核心氨基酸殘基用單字母氨基酸符號和其后的其在SEQ ID NO:1中的位置來表示。見例如Dickinson et al.、J.Mol.B1l.236:1079-1092(1994)。在一些實施方案中，使用參與形成疏水核心的殘基來界定多肽環區的邊界。例如，AB環可以定義為β -鏈A疏水核心殘基Α13與β -鏈B疏水核心殘基L18之間的一段氨基酸。見圖1。在一些實施方案中，疏水核心氨基酸與野生型序列相比沒有被修飾。在其它實施方案中，如下的疏水氨基酸可以突變:Α13，其是β-凸起(bulge)的一部分，并可以轉變成表面殘基；Y32和Α74，它們中的一個或兩個能夠改變，從而與相鄰環發生不同的相互作用；188，其是部分暴露于溶劑的，并且相應位置并不總是天然III型纖連蛋白結構域的疏水殘基；和Υ92，其與C端尾巴相連，并且在C端區發生多樣化時可以被多樣化。
            
[0067]在一些實施方案中，AB環對應于SEQ ID NO:1的殘基14_17，BC環對應于殘基23-31，CD環對應于殘基37-47，DE環對應于殘基51-56，EF環對應于殘基63-67，FG環對應于殘基75-87。BC、DE和FG環沿著分子的一個面排列，即“北極”，ΑΒ、CD和EF環沿著分子的相對面排列，即“南極”。在SEQ ID NO:1中，β-鏈A對應于殘基8-13，β -鏈B對應于殘基17-22，β-鏈C對應于殘基32-36，β -鏈D對應于殘基48-50，β -鏈E對應于殘基57-62，β -鏈F對應于殘基68-74，β -鏈G對應于殘基88-92。各β -鏈通過相應的環彼此相連，例如鏈A和B通過AB環相連，構成β -鏈Α、ΑΒ環和β -鏈B的隊形，諸如此類。N端和/或C端區(上面斜體標示)可以被除去或者改變，從而產生保留生物活性并包含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的分子。在某些實施方案中，SEQ ID NO:1的最先8個氨基酸殘基和/或SEQ ID NO:1的最后7個氨基酸殘基(即SEQ ID NO:1的氨基酸殘基95-101)可以被除去或改變，從而產生包含SEQ ID NO: 60或SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的多肽(相當于SEQ ID NO:1沒有7個N端氨基酸，由SEQ ID NO:1的氨基酸1_94構成)。本文中所述的文庫可以包含SEQ IDNOil中提出的N或C端區。在某些實施方案中，文庫包含N端區域，但不包含C端區域(即它們是基于SEQ ID NO:6)。
            
[0068]如上所述，對應于SEQ ID NO:1 的殘基 14-17、23-31、37-47、51-56、63_67 和 75-87的氨基酸殘基分別界定了 AB、BC、⑶、DE、EF和FG環。然而應當理解，為了獲得對期望靶標具有強親和力的kiFM結合結構域，并非環區內的每一個殘基均需要被修飾。例如，在一些實施方案中，只有對應于CD環的氨基酸39-45和FG環的氨基酸77-87的殘基被修飾，從而產生高親和力wFM結合子(見例如具有SEQ ID N0:3、4或5的氨基酸序列的鼠DLL4結合核心，和具有SEQ ID N0:45、46或47的氨基酸序列的鼠IL-17結合核心)。
            
[0069] 此外，還可以在環區中進行插入和缺失，同時仍然產生高親和力kiFM結合結構域。例如，具有SEQ ID N0:3的鼠DLL4結合子的⑶環具有與野生型uiFr^結構域⑶環相同的長度，即SEQ ID NO:1的7個氨基酸39-45被SEQ ID NO: 3的7個殘基41-47代替。與之相對，具有SEQ ID NO: 3的鼠DLL4結合子的FG環的長度比野生型1QFn3結構域的FG環更長，即SEQ ID NO:1的9個氨基酸77-85被SEQ ID NO: 3的19個殘基79-98代替。
            
[0070]因此，在一些實施方案中，與野生型人1QFn3的相應環相比，選自AB、BC、⑶、DE、EF和FG中的一個或多個環的長度可以被延長或縮短。在任何給定的多肽中，一個或多個環的長度可以被延長，一個或多個環的長度可以被縮短，或它們的組合。在一些實施方案中，給定環的長度可以被延長 2-25、2-20、2-15、2-10、2-5、5-25、5-20、5-15、5-10、10-25、10-20、或10-15個氨基酸。在一些實施方案中，給定環的長度可以被縮短1-15、1-11、1-10、1-5、1-3、1-2、2-10、或2-5個氨基酸。特別地，kiFM的FG環長度為13個殘基，而抗體重鏈的相應環長度為4-28個殘基不等。因此，為了優化依賴FG進行靶結合的多肽的抗原結合，可以改變wFM的FG環的長度和序列，以便獲得靶結合中最大的可能靈活性和親和性。
            
[0071]在一些實施方案中，整聯蛋白結合基序“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”(RGD) (SEQID NO:1或6的氨基酸78-80)中的一個或多個殘基可以被取代，以破壞整聯蛋白的結合。在一些實施方案中，本文中提供的多肽的FG環不含有RGD整聯蛋白結合位點。在一個實施方案中，RGD序列被極性氨基酸-中心氨基酸-酸性氨基酸序列(從N端到C端方向)取代。在另一個實施方案中，RGD序列被SGE取代。在另外一個實施方案中，RGD序列被RGE取代。
            
[0072]在一些實施方案中，基于纖連蛋白的支架蛋白包含與具有SEQ ID N0:l、2、60或6的氨基酸序列的人1QFn3結構域具有至少40%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%、或90%同一性的uiFr^結構域。在某些實施方案中，本文中提供的多肽與野生型人1QFn3結構域(SEQ ID N0:l、2、60或6)的氨基酸序列具有至少50%同一性。在其它實施方案中，多肽與野生型人1QFn3結構域(SEQ ID N0:l、2、60或6)的氨基酸序列具有至少65%同一性。在某些實施方案中，一個或多個環相對于野生型序列相應環的序列不會被修飾，和/或一個或多個β-鏈相對于野生型序列相應鏈的序列不會被修飾。在某些實施方案中，基于纖連蛋白的支架蛋白中的kiFM結構域的每一個β或β樣鏈可以包含、基本上組成為、或組成為與SEQ IDN0:1或6的相應β或β樣鏈序列具有至少80%、85%、90%、95%或100%同一性的氨基酸序列。優選地，β鏈區中的變化不會干擾多肽在生理條件下的穩定性。在示例實施方案中，1QFn3域結合期望靶標的Kd值小于500nM、100nM、50nM、lnM、500pM、100pM或更小。在一些實施方案中，纖連蛋白基蛋白支架的kiFM結構域結合期望靶標的Kd值為1ρΜ-1μΜ、100ρΜ-500ηΜ、1ηΜ-500ηΜ、或ΙηΜ-ΙΟΟηΜ。在示例實施方案中，基于纖連蛋白的支架蛋白特異性結合不與野生型kiFM結構域，特別是野生型人kiFM結構域結合的靶標。
            
[0073]在一些實施方案中，本公開提供了包含wFnS結構域的多肽，其中該kiFM結構域包含AB環、BC環、CD環、DE環、EF環和FG環，并且相對于SEQ ID NO:1的人1QFn3結構域的相應環的序列，從AB、BC、⑶、DE、EF和FG環中選出的至少一個環具有改變的氨基酸序列。在一些實施方案中，BC、DE和FG環被改變。在其它實施方案中，CD和FG環被改變。在其它實施方案中，CD、DE和EF環被改變。在其它實施方案中，EF和FG環被改變。在其它實施方案中，AB、CD和EF環被改變。在其它實施方案中，FG環是唯一一個被改變的環。在其它實施方案中，CD和FG環均被改變。在其它實施方案中，CD和EF環被改變。在一些實施方案中，一個或多個特定的支架變化與一個或多個環變化相組合。“(被)改變”的意思是，與模板序列(即相應的野生型人纖連蛋白結構域)相比，一個或多個氨基酸序列發生變化，并且包括氨基酸添加、缺失和取代。
            
[0074]在一些實施方案中，基于纖連蛋白的支架蛋白包含具有與SEQ ID NO:1或6的非環區有至少80、85、90、95、98或100%同一性的氨基酸序列的1QFn3結構域，其中選自AB、BC、⑶、DE、EF和FG的至少一個環被改變。例如，在某些實施方案中，AB環可以具有最多4個氨基酸取代，最多10個氨基酸插入，最多3個氨基酸缺失，或其組合；BC環可以具有最多10個氨基酸取代，最多4個氨基酸缺失，最多10個氨基酸插入，或其組合；CD環可以具有最多6個氨基酸取代，最多10個氨基酸插入，最多4個氨基酸缺失，或其組合；DE環可以具有最多6個氨基酸取代，最多4個氨基酸缺失，最多13個氨基酸插入，或其組合；EF環可以具有最多5個氨基酸取代，最多10個氨基酸插入，最多3個氨基酸缺失，或其組合；和/或FG環可以具有最多12個氨基酸取代，最多11個氨基酸缺失，最多25個氨基酸插入，或其組合。
            
[0075]在某些實施方案中，基于纖連蛋白的支架蛋白包含由如下序列一般性地限定的10Fn3結構域:
            
[0076]VSDVPRDLEVVAA (X)..LLISff(X)..YRITY(X)...FTV(X)..ATISGL(X) yYTITVYA(X)JSINYRT(SEQ ID NO:22)
            
[0077]在SEQ ID NO:22中，AB環用(X)u代表，BC環用(X)v代表，CD環用(X)w代表，DE環用(X)x代表，EF環用(X)y代表，FG環用(X)z代表。X代表任何氨基酸，X后面的腳標代表氨基酸數目的整數。特別地，u、v、w、x、y和z每一個可以獨立地是2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8 、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7、或 6-7 個氨基酸。相對于 SEQ ID NO:22 中的相應氨基酸，β鏈(加有下劃線)的序列在全部7個支架區中可以具有0-10、0-8、0-6、0-6、0-4、0-3、或0-1個取代、缺失或添加。在一些實施方案中，相對于SEQ ID NO: 22中的相應氨基酸，β鏈的序列在全部7個支架區中可以具有0-10、0-8、0-6、0-6、0-4、0-3、或0-1個保守取代。在某些實施方案中，疏水核心氨基酸殘基(上面SEQ ID NO: 22中的粗體殘基)是固定的，而任何取代、保守取代、缺失或添加發生在疏水核心氨基酸殘基之外的殘基。在一些實施方案中，本文中提供的多肽的疏水核心殘基相對于野生型人uiFr^結構域(SEQ IDNO:1)沒有被修飾。
            
[0078]B.支架區修飾
            
[0079]10Fn3的非環序列，即“支架區”，可以被改變，只要kiFM結構域仍保持靶標結合功能和/或結構穩定性即可。在一些實施方案中，Asp7、Glu9、和Asp23中的一個或多個被其它氨基酸，例如非負電荷氨基酸殘基(例如AsruLys等)代替。這些突變已經被報道具有相對于野生型提高突變體kiFM在中性pH下的穩定性的作用(見PCT公開N0.W002/04523)。許多其他有利的或中性的1QFn3支架改變已經被公開。見例如Batori et al.、ProteinEng.200215 (12): 1015-20 ；Koide et al.、B1chemistry200140 (34): 10326-33。
            
[0080]10Fn3的支架區，例如β -鏈和/或N端和C端，可以被修飾以提高多肽與期望靶標的結合或降低免疫原性。在一些實施萬案中，參與形成疏水核心的殘基，即對應于SEQ IDN0:1 或 6 的 L8、V10、A13、L18、I20、W22、Y32、134、Y36、F48、V50、A57、159、L62、Y68、170、V72、A74、188、190和Y92殘基的殘基，不被突變。在一些實施方案中，相對于SEQ ID NO:1或6所示的氨基酸序列中存在的相應氨基酸，對應于kiFM多肽支架區殘基1-7、9-15、19、21、33、35、36、49、58、60、61、69、7173、88、89和91-101的殘基的任何一個殘基或任何殘基的組合被突變成不同的氨基酸。
            
[0081]在一些實施方案中，可以對多肽的支架區進行突變，但要排除下列特定突變中的一個或多個:V1A ；S2P ；S2T ；D3G ；D3S ；P5S ；R6G ；R6S ；D7G ；D7K ；L8P ；L8Q ；E9D ；E9K ；E9R ；E9V ；V10A ；V10I ；A12D ；A12E ；A12V ；L18E ；L18I ；L18P；L18Q；L18R ；L19Q ；S21C ；S21G ；S21N ；R29G ；R29S ；R29Y ；Y31H ；Y32F ；R33G ；I34T ；I34V ；T35A ；T35F ；T35I ；Y36H ；F48L ；F48S ；T49A ；T49I ；V50A ；V50E ；V50M ;A57 缺失；T58A ；T58I ;T58 缺失；I59V 159 缺失；S60G ；S60N ；S60R ；G61C ；G61R ；L62R ；D67G ；D67K ；D67N ；Y68A ；Y68D ；T69I ；I70N ；I70S ；I70V ；T71A ；V72A ；V72G ；Y73C ；Y73H ；A74G ；A74T ；I88S ；I88T ；I88V ；S89P ；I90F ；I90T ；I90V ；N91D ；N91S ；N91T ；Y92C ；Y92H ；Y92L ；Y92R ；Y92 缺失；R93Q ；R93T 和 T94A。在某些實施方案中，在BC、DE和FG環被修飾的kiFM結構域的語境下，這些特定的支架突變被排除。
            
[0082]在一些實施方案中，可以對多肽的支架區進行突變，但是排除以下突變組合:
            
[0083].L18R、S21C 和 S60G ;
            
[0084].E9D、L18R、V50E 和 T56I ；
            
[0085].L18R、T49I 和 N91D ;
            
[0086].F48S 和 T71A;
            
[0087].P5S、V10A、S60G 和 S89P ；
            
[0088].L18R 和 Y92C ； 
            
[0089].L18R 和 F48S ；
            
[0090].L18R 和 V72A ；
            
[0091].L18Q、R33G 和 F48S ;
            
[0092].Y68D 和 Y92H ；
            
[0093].R6S、L62R 和 N91S ;
            
[0094].L8P、E9V、I34V、T71A 和 Y92 缺失；
            
[0095].E9K、L18R 和 F48L ；
            
[0096].E9R、L18R、S60G 和 I70V ；
            
[0097].L18R、I88V 和 I90T ；
            
[0098].L18R、N91D 和 Y92C ;
            
[0099].L18R 和 I34T;
            
[0100].L18R 和 G61C;
            
[0101].Y32F、T71A 和 T94A ;
            
[0102].L18R、T58A、Y92L 和 R93T ；
            
[0103].V50M、T58A、S89P、I90F 和 Y92R ；
            
[0104].S2T、D7G、E9K、V101、T58A、S60N 和 S89P ；
            
[0105].I59V、S60N 和 T94A ;
            
[0106].R6G、S21G、T35A、T58I 和 S60G ；
            
[0107].L18P、S21C、T58A、Y73H 和 Y92C ；
            
[0108].Y31H、R33G 和 G61R ;
            
[0109].A74G、R93Q 和 T94A
            
[0110].S2P 和 T58I;
            
[0111].T58I 和 I88T ;
            
[0112].T58I 和 I90T ;
            
[0113]*G61R 和 A74T
            
[0114].A57缺失、T58缺失和159缺失
            
[0115].R33G、T35I 和 V50M
            
[0116].VIA、R33G 和 V50M
            
[0117].R33G 和 V50M
            
[0118].R33G、I34V 和 V50M
            
[0119].D3G、L181、R33G、V50M、Y73!^PN91T
            
[0120].R6G、T35F 和 V72A
            
[0121].A12V、S21N 和 T35A
            
[0122].S21G 和 T49A
            
[0123].D3S 和 D7K
            
[0124].Α12ν 和 L19Q
            
[0125].A12D、L18I 和 L19Q
            
[0126].A12E、L18I 和 L19Q
            
[0127]在某些實施方案中，在BC、DE和FG環被修飾的wFnS結構域的語境下，這些特定的支架突變組合被排除。
            
[0128]在一些實施方案中，在對應于SEQ ID NO:1或6的位置21的位置處具有突變的多肽被排除，除非該位置的突變與對應于SEQ ID NO:1或6的位置1_7、19、31、49、58、60、73、75和89中的任何一個氨基酸位置的突變組合。在一些實施方案中，在對應于SEQ ID NO:1的位置60的位置處具有突變的多肽被排除，除非該位置的突變與對應于SEQ ID NO:1或6的位置 1-7、9-17、19、21、23-31、33、35、49、51-56、65-67、75-87 和 89 中的任何一個氨基酸位置的突變組合。在一些實施方案中，在對應于SEQ ID NO:1或6的位置61的位置處具有突變的多肽被排除，除非該位置的突變與對應于SEQ ID NO:1或6的位置11、12、19、46、66-67、69和91的任何一個氨基酸位置的突變組合。在一些實施方案中，在對應于SEQ ID NO:1或6的位置93或94的位置處具有突變的多肽被排除，除非這些位置中任一處的突變與對應于SEQ ID NO:1或6的位置1-7、9_14、65_67、89和91的任何一個氨基酸位置的突變組合。在某些實施方案中，這些排除適用于其中BC、DE和FG環被修飾的kiFM結構域。
            
[0129]在某些實施方案中，呷113結構域的非環區可以被一個或多個保守取代所修飾。10Fn3結構域中多達5%、10%、20%或甚至30%或更多的氨基酸可以通過保守取代被改變，而不會顯著改變kiFM對配體的親和力。在某些實施方案中，支架可以包含0-15、0-10、
            
0-8、0-6、0-5、0-4、0-3、1-15、1-10、1-8、1-6、1-5、1-4、1-3、2-15、2-10、2-8、2-6、2-5、2-4、5-15、或5-10個保守氨基酸取代。在示例實施方案中，支架修飾優選地使kiFM結合子與配體的結合親和力降低少于100倍、50倍、25倍、10倍、5倍或2倍。這樣的變化有可能在體內改變kiFM的免疫原性，且當免疫原性被降低時，這樣的改變是期望的。如本文中所使用的，“保守取代”是用物理上或功能上相似的殘基代替相應的參考殘基。也就是說，保守取代和其參考殘基具有相似的大小、性質、電荷、化學性質，包括形成共價鍵或氫鍵的能力，等。優選的保守取代滿足在Dayhoff et al.、Atlas of Protein Sequence andStructure5:345-352 (1978&Supp.)中定義的可接受的點突變的標準。保守取代的實例包括如下組內的取代:(a)纈氨酸、甘氨酸；(b)甘氨酸、丙氨酸；(c)纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；(d)天冬氨酸、谷氨酸；(e)天冬酰胺、谷氨酰胺；(f)絲氨酸、蘇氨酸；(g)賴氨酸、精氨酸、甲硫氨酸；和(h)苯丙氨酸、酪氨酸。
            
[0130]在一些實施方案中，kiFM結構域包含具有本文中記載的任何文庫設計，例如在圖
            
2、9和12(或其氨基酸1-94 ；SEQIDN0:6)中提出的任何文庫設計的氨基酸序列，并且在環和/或鏈中包含最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個額外取代、添加或缺失。在某些實施方案中，uiFr^結構域包含具有本文中記載的、例如在圖2、9和12 (或其氨基酸1_94 ；SEQ IDNO:6)中記載的任何文庫設計的氨基酸序列，并且沒有其它氨基酸修飾。包含具有本文中記載的、例如在圖2、9和12 (或其氨基酸1-94 ；SEQ ID NO: 6)中記載的任何文庫設計的氨基酸序列的kiFM分子在被改變的位置處可以包含任何氨基酸，在某些情況下甚至包含野生型kiFM分子的氨基酸。在某些實施方案中，包含具有本文中記載的、例如在圖2、9和12 (或其氨基酸1-94 ；SEQ ID NO:6)中記載的任何文庫設計的氨基酸序列的kiFM分子在每一個標示為“被改變”的位置(加有下劃線或方框，并用粗體標記的那些)上僅包含非野生型氨基酸。
            
[0131]C.N 和 C 端區
            
[0132]在一些實施方案中，本文中提供的多肽的N端和/或C端區氨基酸序列相對于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應區域的氨基酸序列可以通過缺失、取代或插入被修飾。kiFM結構域一般以SEQ ID NO:1的氨基酸編號I開始。然而，具有氨基酸缺失的結構域也包含在本發明之內。在一些實施方案中，SEQ ID NO:1的最先8個氨基酸(即殘基1-8)和最后7個氨基酸( 即殘基95-101)缺失，生成具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的10Fn3結構域。在某些實施方案中，SEQ ID NO:1的最后7個氨基酸(即殘基95-101)缺失，生成具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的1QFn3結構域。在具有SEQ ID NO: 1、2、6、或60氨基酸序列的kiFM結構域的N或C端也可以添加有額外的序列。例如，在一些實施方案中，N端延伸由選自下組的氨基酸序列構成:M、MG和G。
            
[0133]在某些實施方案中，在本文中提供的多肽中，SEQ IDN0:1或6的前1、2、3、4、5、6、
            
7、8或9個氨基酸的氨基酸序列相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應氨基酸序列可以被修飾或缺失。在示例的實施方案中，對應于SEQ ID NO:1或6的氨基酸1_8的氨基酸被長度為1-20個、1-15個、1-10個、1-8個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個、或I個氨基酸的備選N端區所代替。備選N端區的實例包括(用單字母氨基酸編碼表示)M、MG、G、MGVSDVPRDL(SEQ ID NO:9)和 GVSDVPRDL (SEQ ID NO: 11)、或 SEQ ID NO: 9 和 11 中任一個的N-端截短物。其它合適的備選N端區包括，例如，XnSDVPRDL(SEQ ID NO: 16)、XnDVPRDL(SEQID NO: 17)、XnVPRDL(SEQ ID NO: 18)、XnPRDL(SEQ ID NO: 19)、XnRDL(SEQ ID NO: 20)、XnDL(SEQID NO: 21)、或XnL,其中η = 0、1或2個氨基酸,其中當η = I時，X是Met或Gly,當η = 2時，X是Met-Gly。當Met-Gly序列被添加在uiFr^結構域的N端時，M通常會被切掉，在N端留下一個G。在其它實施方案中，備選的N端區包括MASTSG (SEQ ID NO: 50)的氨基酸序列。
            
[0134]在某些實施方案中，相對于野生型人wFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應氨基酸序列，本文提供的多肽中對應于SEQ ID NO:1的氨基酸93-101、94-101、95-101、96-101、97-101、98-101、99-101、100-101、或101的氨基酸序列缺失或被修飾。在示例實施方案中，對應于SEQ ID NO:1氨基酸95-101的氨基酸被長度為1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、
            
1-3、1-2、或I個氨基酸的備選C端區代替。備選C端區序列的具體實例包括，例如，包含、基本上組成為、或組成為 EIEK(SEQ ID NO:7), EGSGC(SEQ ID NO:23), EIEKPCQ(SEQ IDNO:24)、EIEKPSQ(SEQ ID NO:25)、EIEKP(SEQ ID NO:26)、EIEKPS(SEQ ID NO:27)、EIEKPC(SEQID NO:8)、或SEQ ID NO:44構成的多肽。在一些實施方案中，備選C端區包含EIDK(SEQ IDNO:29)，在特定的實施方案中，備選C端區是EIDKPCQ(SEQ ID NO:31)或EIDKPSQ(SEQ IDNO:30)。
            
[0135]在某些實施方案中，基于纖連蛋白的支架蛋白包含具有備選N端區序列和備選C端區序列二者的uiFr^結構域。
            
[0136]當本文中提到包含特定文庫設計的分子，且該文庫設計包含氨基酸1-101 (SEQ IDNO:1)時，應當理解的是，包含氨基酸1-94 (SEQ ID NO:6)、但不包含7個N端氨基酸和/或不包含C端氨基酸的該分子也涵蓋在本文之內。
            
[0137]D.具有新的環與支架組合的蛋白質
            
[0138]如本文中所述，“補丁文庫”是指這樣的文庫，其中支架蛋白表面上的某個區域被多樣化。要進行多樣化的殘基可以通過這樣的方式確定:挑取(picking)蛋白表面上的一個點(spot)，然后鑒定據其一定距離(例如8A)內的所有表面和環殘基，并調節形狀、序列連通性、保守性等。例如，為了產生以支架“西南(西南)”部分為中心的補丁文庫，選擇EF環中的最后一個氨基酸一Asp67,它大約位于SW側面的中心。然后鑒定距離Asp67在gA范圍內的所有殘基，并從要多樣化殘基的列表中除去疏水核心殘基，從而提供了總共14個供隨機化的氨基酸，包括G37-G41、K63-D67、T69，和自N91開始的C端序列(殘基位置根據具有SEQ ID NO:1或6的野生型人kiFM結構域的序列進行編號)。然后可以在支架設計中引入其它多樣化手段，例如，改變CD環的長度(以允許更大的形狀變化)、或修飾或延伸N端區的序列。圖2A-F和9A-C提供了可以加以突變從而產生代表性補丁文庫的氨基酸殘基的實例。圖3A-F顯示了 kiFM結構域肽的三維結構，例示了數個不同的界面，這些界面可以被靶定而產生代表性補丁文庫。在一些實施方案中，kiFM結構域多肽的氨基酸的多樣化不是就環的定義而言，而是就它們在kiFM結構表面上的物理定位而言。在一些實施方案中，一個有10-30個或更多個氨基酸的“補丁”被多樣化，并被選用來形成一個大體上連續的表面，該表面可以是跨環和鏈的，或者可以是僅位于鏈殘基上的。
            
[0139]1.北極環和南極環被修飾的結合子
            
[0140]在一些實施方案中，本文中提供的多肽包含uiFr^結構域，所述kiFM結構域具有:⑴相對于野生型人1QFn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環，在從BC、DE和FG環選出的至少一個北極環的氨基酸序列中含有修飾，和(ii)相對于野生型人kiFM結構域(SEQ IDNO:1或6)的相應環，在從AB、CD和EF環選出的至少一個南極環的氨基酸序列中含有修飾。所述經修飾的北極環和南極環貢獻于對相同靶標的結合。構想了經修飾的北極環與南極環的各種組合。例如，kiFM可以包含一個經過修飾的北極環和一個經過修飾的南極環，一個經過修飾的北極環和兩個經過修飾的南極環，兩個經過修飾的北極環和一個經過修飾的南極環，兩個經過修飾的北極環和兩個經過修飾的南極環，三個經過修飾的北極環和一個經過修飾的南極環，等，其中每一個經過修飾的環均貢獻于對相同靶標的結合。可以被修飾的北極環和南極環的組合的實例包括，例如，CD環(南極環)和FG環(北極環)，CD環(南極環)和DE環(北極環)，EF環(南極環)和FG環(北極環)，AB環(南極環)和FG環(北極環)，或DE環(北極環)和EF環(南極環)。另一個環組合實例是CD環(南極環)、DE環(北極環)和EF環(南極環)。再另外的環組合實例是DE環(北極環)和AB、CD和EF環(南極環)中的一個或多個。經過修飾的環可以在整個環中都有序列修飾，或者僅在環的一部分中有序列修飾。此外，一個或多個經過修飾的環可以具有插入或缺失，從而使環的長度與野生型序列的相應環的長度相比發生改變。在某些實施方案中，uiFr^結構域的其它區域(即除了北極環和南極環之外)，例如β -鏈、N端和/或C端區的序列，與野生型10Fn3結構域相比也可以被修飾，并且這些額外修飾也可以貢獻于與靶標的結合。
            
[0141]有至少一個北極環和至少一個南極環被修飾的kiFM設計實例包括，例如，圖9A所示的胃51、152、153、152’、前1、前、后1、后2、WS-LI1、南前、和AG鏈設計，和圖2C-2E所示的西側、南前和AG鏈設計。
            
[0142]2.具有環和支架區修飾的結合子
            
[0143]本文中還提供了具有新型環和支架修飾組合的kiFM結構域。特別地，本申請提供的多肽包含這樣的uiFr^結構域，其包括⑴在環AB、BCXD、DE、EF、或FG的至少一個中的氨基酸序列修飾，和(ii)在至少一個支架區中的氨基酸序列的修飾(即在至少一個鏈、N端區和/或C端區中的修飾)，其中經過修飾的環和經過修飾的支架區均貢獻于對相同靶標的結合。在示例實施方案中，支架區修飾與環區中的修飾相鄰，例如，如果AB環被修飾，則支架突變多位于在kiFM結構域的線性序列中與AB環相鄰的β-鏈A和/或β-鏈B中。在其它實施方案中，在kiFM結構域的線性序列中彼此相鄰的環和支架區內可發現成簇的修飾。例如，例如 ，同時具有環和支架修飾的kiFM結合子，可以在kiFM結構域的線性序列中彼此相鄰的環和支架區的如下組合中具有氨基酸修飾簇:β -鏈/環/ β -鏈、環/ β -鏈/環、環/β-鏈/環/β-鏈、末端區/β-鏈/環、或環/β-鏈/末端區，等。例如，具有新型環和支架修飾組合的kiFM結構域可以具有成簇的修飾，從而與野生型相比，在由20個連續氨基酸構成的區段(stretch)中有至少15個氨基酸被修飾。在其它實施方案中，與野生型kiFM結構域在相應氨基酸區段上的序列相比，在一段連續區段中，20個殘基中的至少17個，20個中的至少18個，25個中的至少17個，25個中的至少20個，或30個殘基中的至少25個被修飾。在某些實施方案中，給定的uiFr^結構域可以具有兩個或三個成簇的修飾，它們被未經修飾的(即野生型)序列隔開。對于任何給定的被修飾區域(即環、鏈或末端區)，區域的全部或僅有一部分與野生型序列相比被修飾。當鏈區被修飾時，優選地疏水核心殘基保持不被修飾(即野生型)，而β_鏈中的一個或多個非核心殘基被修飾。環、β -鏈或末端區中的合適修飾包括氨基酸取代、缺失和/或插入，及其組合。
            
[0144]在至少一個環區和至少一個支架區具有修飾的wFM設計實例包括，例如，圖9Α所示的WS1、前1、前2、后1、后2、SPU SP2、SP3、南前、AG鏈和西南設計，圖9Β所示的NW3設計，圖9C所示的ΝΡ1、ΝΕ1、ΝΡ4-5、ΝΡ6-1和NW2設計，和圖2A-2F所示的設計。
            
[0145]3.“西側”結合子
            
[0146]在一些實施方案中，本申請提供的kiFM結構域具有沿著分子“西側”的結合面(見圖3C)，并被稱作“西側結合子”或“WS結合子”。與SEQ ID NO:1或6中記載的相應CD和FG環序列相比，本文中所述的WS結合子包含的wFnS結構域具有經過修飾的⑶環和經過修飾的FG環。CD環和FG環均貢獻于對相同靶標的結合。在某些實施方案中，WS結合子可在10Fn3結構域的一個或多個區域中包含額外的修飾。例如，WS結合子可以在與CD和/或FG環相鄰的一個或多個鏈區中含有支架修飾。特別地，WS結合子可以在@-鏈(:、0-鏈D、β -鏈F和/或β -鏈G的一個或多個中含有序列修飾。支架修飾的實例包括在對應于SEQ ID NO:1或6的氨基酸位置:33、35、49、69、71、73、89和/或91的一個或多個支架區位置處的修飾。WS結合子還可以在BC環，特別是在BC環的C端部分含有修飾。在一個實施方案中，BC環的最后兩個殘基(即對應于野生型kiFM結構域中的氨基酸30和31)與野生型序列相比被修飾。額外的環和支架修飾的全部或部分可以和被修飾的CD和FG環一起貢獻于對靶的結合。優選地，疏水核心殘基與野生型序列相比不被修飾。
            
[0147]在某些實施方案中，WS結合子具有長為大約3-11個殘基、4-9或5個殘基的⑶環；長為大約1-10個殘基，例如6或5個殘基的FG環；長為大約6-14、8-11或9個殘基的C鏈；和/或長為大約9-11或10個殘基的F鏈。β鏈C的位置31、33、35和37-39可以和野生型序列相比被改變。β鏈C的位置32、34和36可以是疏水殘基。β鏈F的位置67、69,71和73可以和野生型序列相比被改變。β鏈F的位置68、70和72可以是疏水殘基。WS結合子可以在SEQ ID NO:1或6的位置30、31、32、33、34、35、36、37、38和/或39，例如位置31、33、35、37、38和/或39，如位置31和/或33含有氨基酸取代。WS結合子可以在SEQID NO:1或6的位置44、45、46、47、48、49、50和/或51，例如位置44、45、47和/或49含有氨基酸取代。WS結合子可以在SEQ ID NO:1或6的位置40、41、42、43、44和/或45含有氨基酸取代。WS結合子可以在SEQ ID NO:1或6的位置67、68、69、70、71、72、73、74、75和/或76，例如位置67、69、71、73和/或76或位置71、73、75和/或76含有氨基酸取代。WS結合子可以在SEQ IDN0:1或6的位置76、77、78、79、81、82、83、84、85和/或86，例如位置84和/或85含有氨基酸取代。WS結合子可以在SEQ ID NO:1或6的位置85、86、87、88、89、90、91、92、93和/或94含有氨基酸取代。WS結合子可以在SEQ ID NO:1或6的位置31、33、47、49,73和/或75含有氨基酸取代。WS結合子可以包含含有4_9個被改變的氨基酸，例如非野生型氨基酸的C環；含有5-6個被改變的氨基酸，例如非野生型氨基酸的FG環；并且其中氨基酸31、33、35、37-39、67、69、71、73和76不是野生型。“不是野生型”的氨基酸是指與野生型人kiFM分子(具有例如SEQ ID NO:1或6)的相同位置處出現的氨基酸不同的氨基酸。
            
[0148]10Fn3WS結合子設計的實例包括，例如，圖9A所示的WS1、WS2、WS3、WS2’、和WS-LI1設計，和圖2C所示的設計(或其氨基酸1-94)。當提到具有基于包含氨基酸1-101的kiFM序列的特定設計的wFM分子時，該表述意圖包括那些在末端不含有“DK”和/或不包含N端7個氨基酸，并且對應于所示序列氨基酸1-94的分子。或者，當所示設計包含氨基酸1-94時，該表述意圖包括具有N端7個氨基酸的相同設計，其可以沒有“DK”序列。本文中描述了其它可以進行的修飾。
            
[0149]圖12提供了 WS結合子設計的實例。WS3，例如，對應于WS1，其中⑶和FG環的長度可以被修飾，D67也可以被修飾。具有WS3設計的分子的一個實例是具有SEQ ID NO:49的 PXR 結合子。WS1、WS2、WS3、WS2’、WS-LIUPWS4 的變異體包括在位置 30、31、33、35、37、38、46、47、49、50、67、69、71、73、75、76、84、85、86、87、89 或 91 具有野生型或突變氨基酸的那些。例如，WS結合子設計可以在⑶環的氨基酸39-45中包含一個或多個氨基酸修飾，并在FG環的氨基酸77-83中包含一個或多個氨基酸修飾(WS-LI1設計)，并且其中具有該設計的kiFM分子特異性結合一個靶分子(并且任選地不包含RGD序列)。WS結合子設計可以包含WS-LIl的設計并在環或鏈中具有最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20或25個額外氨基酸修飾。例如，WS結合子設計可以包含WS-LII的設計，并在氨基酸位置37、38、46、47、75、76、和 85-88 等氨基酸位置具有最多 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20 或 25個額外的氨基酸修飾。可以包含的其它氨基酸修飾是在位置30、31、33、35、49、50、67、69、71、73、89和91的修飾。WS設計的一個實例可以包含WS7的氨基酸序列(圖12)，其中環的長度可以和野生型kiFM分子中環的長度不同，并且其中每個被改變的位置9 (粗體且下劃線)可以被修飾成任何其它氨基酸，或者在某些情況下，可以保持不修飾，只要具有這種設計的kiFM分子可以特異性結合靶分子(并且任選地不包含R⑶位點)即可。在某些實施方案中，kiFM分子包含WS7的氨基酸序列，其中CD和FG環的長度可以被改變，其中沒有其它的氨基酸可以被改變，并且其中被標示為“可變”(下劃線且粗體標示)的氨基酸殘基中正好有或者最多有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20或25個實際上沒有改變，而是野生型人wFM分子相同位置處的氨基酸，即野生型氨基酸(SEQ ID NO:1或6)。例如，WS7中的氨基酸30、31、33、35、36、37、47、49、50、67、69、71、73、75和87中有一個或多個可以是野生型氨基酸，只要該WS結合子特異性結合其靶標即可。在某些實施方案中，具有WS7設計的WS結合子在除了所標明的氨基酸修飾之外不包含任何氨基酸修飾。在某些實施方案中，具有WS7設計的WS結合子除了所標明的氨基酸修飾之外，還包含最多1、2、3、4、5、6、7、
            
8、9、10、12、15、17、20或25個氨基酸修飾。
            
[0150]還提供了包含本文中所述任何一種WS結合子設計的文庫。一個示例文庫是如下的文庫，其包含具有被改變的⑶和FG環并進一步在位置30、31、33、47和49包含非野生型氨基酸的WS結合子。一個示例文庫是如下的文庫，其具有被改變的FG環并還在位置30、31、33、47和49包含非野生型氨基酸。
            
[0151]在某些實施方案中，設計序列的氨基酸至少或至多有10、20、30、40、50、或60個不被改變，例如不被取代改變。例如，一個或多個如下的氨基酸保持為野生型人wFnS分子的氨基酸:位置 1-29、32、34、36、48、51-66、68、70、72、88、90 和 92-101 的氨基酸。
            
[0152]可特異性結合治療性靶標的WS結合子的實例在實施例中有描述，并且包括例如具有SEQ ID NO:3-5、45-49、62-63、66、和72中任何一個的氨基酸序列的多肽。
            
[0153]在一些實施方案中，WS結合子包括吧1、吧2、吧3、吧2’、吧-1^1、吧4、吧5、吧6或WS7(或其氨基酸1-94)的氨基酸序列，并且在環和/或鏈中包含最多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個額外的取代、添加或缺失。在某些實施方案中，WS結合子包含WS1、WS2、WS3、WS2’、WS-LI1、WS4、WS5、WS6或WS7(或其氨基酸1_94)的氨基酸序列，并且沒有其它的氨基酸修飾。包含 WS1、WS2、WS3、WS2’、WS-LI1、WS4、WS5、WS6 或 WS7(或其氨基酸 1-94)的氨基酸序列的WS結合子在被改變的位置處可以包含任何氨基酸，并且在一些情況下甚至包含野生型uiFr^分子的氨基酸。在某些實施方案中，包含151、152、153、152’、15-1^1、154、吧5、WS6或WS7 (或其氨基酸1-94)的氨基酸序列的WS結合子在每一個標示為“被改變”的位置(下劃線和粗體)均包含非野生型氨基酸。
            
[0154]4.“前(Front) ” 結合子
            
[0155]在一些實施方案中，本文中提供的多肽包含kiFM結構域，所述kiFM結構域在⑶環、DE環，以及在某些情況下EF環中具有修飾，其中環修飾均貢獻于對靶的結合。這些多肽在本文中被稱作“前結合子”。前結合子可以額外地在一個或多個支架區包含修飾，特別是在位于被修飾環區的兩側或臨近的支架區中。例如，與野生型人呷113結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應β_鏈的序列相比，前結合子可以在0-鏈(:、0-鏈0和/或β-鏈E的一個或多個中含有支架修飾。優選地，疏水核心殘基與野生型序列相比不被修飾。可存在于前結合子中的支架修飾的實例包括在對應于SEQ ID NO:1或6的氨基酸位置36、49、58和/或60的一個或多個位置處的修飾。這些支架修飾可以和被修飾的環一起貢獻于對靶的結合。在某些實施方案中，前結合子可以包含跨越kiFM結構域的數個環和鏈區的成簇的修飾。特別地，前結合子可以在對應于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)殘基36-66的氨基酸之間的31個殘基中的至少15、20、24、25、或27個中含有修飾。環和/或鏈修飾可以包含氨基酸取代、缺失和/或插入，或其組合。在示例實施方案中，與野生型人kiFM結構域(SEQID NO:1或6)的⑶環相比，⑶環的長度被延長或縮短。uiFr^前結合子設計的實例包括，例如，圖9Α所示的前I和前2設計。
            
[0156]5.“后(Back)” 結合子
            
[0157]在一些實施方案中，本文中提供的多肽包含kiFM結構域，所述kiFM結構域在EF和FG環中具有修飾，其中環修飾貢獻于對相同靶標的結合。這些多肽在本文中被稱作“后結合子”。后結合子可以在其它環和/或支架區含有額外的修飾。例如，后結合子可以在AB環的至少一部分，優選地AB環的N端部分中含有修飾。在示例實施方案中，AB環的最先2個氨基酸(即對應于野生型kiFM結構域的氨基酸殘基14和15)相對于野生型序列被修飾。在某些實施方案中，后結合子還可以包含一個或多個支架修飾，特別是在與被修飾的環區相鄰的一個或多個支架區中含有修飾。例如，后結合子可以在鏈Α、β-鏈G、N端區和/或C端區的一個或多個中含有一個或多個修飾。優選地，疏水核心殘基與野生型序列相比不被修飾。支架修飾的實例包括在對應于SEQ ID NO:1或6氨基酸位置1_7、9_13、89、91、93和/或94的一個或多個位置處含有修飾。所述額外的環和/或支架修飾中的一個或多個可以與被修飾的EF和FG環一起貢獻于對靶的結合。合適的環和/或支架區修飾包括氨基酸取代、缺失和/或插入，或其組合。在某些實施方案中，與野生型人kiFM結構域(SEQID NO:1或6)的FG環相比，FG環的氨基酸序列的長度延長或長度縮短。
            
[0158]在某些實施方案中，后結合子可以在跨越kiFM結構域的數個區域的連續區段中包含成簇的被修飾的氨基酸殘基。例如，與野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應殘基相比，kiFM結構域的最先15個氨基酸殘基中的至少14個被修飾，和/或相對于野生型序列中的相應殘基，對應于野生型人1QFn3結構域(SEQ ID NO:1或6)殘基80-97 (或94)的氨基酸之間的18個殘基中有至少15個已被修飾。
            
[0159]10Fn3后結合子設計的實例包括，例如，圖9A所示的后I和后2設計。
            
[0160]6.“南極”結合子
            
[0161] 在某些實施方案中，本申請提供包括uiFr^結構域的多肽，其中與野生型序列的相應殘基的序列相比，kiFM結構域在β -鏈Α、ΑΒ環、β -鏈B、CD環、β -鏈E、EF環和β -鏈F的氨基酸序列中含有修飾。這些多肽在本文中被稱作“南極結合子”或“SP結合子”。這些經過修飾的環和鏈貢獻于對相同靶的結合。與野生型人wFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的CD環相比，CD環的氨基酸序列的長度可以延長或縮短。與野生型序列的相應區域的序列相比，南極結合子可以在鏈G和/或C端區含有額外的修飾。在示例實施方案中，南極環可以在對應于野生型序列位置11、12、19、60、61、69、91、93和95-97的氨基酸處包含一個或多個修飾。kiFM南極結合子設計的實例包括，例如，圖9A所示的SP1、SP2和SP3設計。
            
[0162]7.“西北(Northwest)，，結合子
            
[0163]在一些實施方案中，本申請提供包含kiFM結構域的多肽，所述kiFM結構域與SEQID NO:1或6中記載的相應BC、DE和FG環序列相比，在BC、DE和FG環中具有修飾，并且在一個或多個β -鏈C、β -鏈D、β -鏈F和β -鏈G鏈殘基中含有額外的修飾。這些β -鏈修飾和環區修飾一起貢獻于對靶的結合。這些蛋白在本文中被稱作“西北結合子”或“NW結合子”。在示例實施方案中，NW結合子在對應于SEQ ID NO:1或6支架區位置R33、T49、Y73和S89的任何一個氨基酸位置或其組合處含有一個或多個支架修飾。環和支架區中的合適修飾包括氨基酸取代、缺失和/或插入，或其組合。在某些實施方案中，與野生型序列相比，BC、DE和FG環中的一個或多個的長度延長或長度縮短，或其組合。在一個實施方案中，與野生型序列(例如SEQ ID NO:1或6)相比，BC、DE和FG環的每一個的長度被延長或縮短，或其組合。在某些實施方案中，與野生型序列相比，只有BC環的一部分，特別是C端部分被修飾。例如，BC環中可以只有對應于野生型BC環氨基酸27-31的氨基酸殘基被修飾，而BC環的其余部分(即對應于野生型環的殘基23-26)保留不被修飾。
            
[0164]10Fn3NW結合子設計的實例包括，例如，圖9B所示的NW3設計，圖9C所示的NW2設計，和圖2A所示的設計。圖3描述了 NW結合子的一個模型。
            
[0165]8.“東北(Northeast)，，結合子
            
[0166]在一些實施方案中，本申請提供包含wFnS結構域的多肽，所述kiFM結構域具有經過修飾的BC、DE和FG環，并且在N端區、β -鏈Α、β -鏈B和/或β -鏈E的任何一個或其組合中含有一個或多個額外的修飾。這些蛋白在本文中被稱作“東北結合子”或“NE結合子”。在示例實施方案中，NE結合子在對應于野生型序列(SEQ ID NO:1或6)的支架區位置1-7、E9、L19、S21和/或T58的任何一個氨基酸或其組合處被修飾。經過修飾的環和支架區的組合貢獻于對靶的結合。kiFMNE結合子設計的實例包括，例如，圖9C所示的NEl設計，和圖2B所示的設計。圖3B描述了 NE結合子的一個模型。
            
[0167]9.“南前(South Front) ” 結合子
            
[0168]在一些實施方案中，本申請提供包含kiFM結構域的多肽，所述kiFM結構域在AB、⑶、DE和EF環的一個或多個中具有修飾，并且在β -鏈B、β -鏈D和/或β -鏈E的一個或多個中具有額外的修飾。這些蛋白在本文中被稱作“南前結合子”。經過修飾的環和支架區的組合貢獻于對靶的結合。在示例實施方案中，南前結合子可以在對應于SEQ ID NO:1或6的支架區位置1^19、了49、了58、360、和/或661的一個或多個氨基酸位置處被修飾，和/或在對應于 SEQ ID NO:1 或 6 的環區位置 T14_S17、P51、T56、G40_E47、和 / 或 K63-G65 的一個或多個氨基酸位置處被修飾。在示例實施方案中，南前結合子的AB環、對應于野生型序列殘基18和20的氨基酸之間，和/或CD環的長度可以被延長或縮短。kiFM南前結合子設計的實例包括，例如，圖9A所示的南前設計，和圖2D所示的設計。圖3D描述了南前結合子的一個模型。
            
[0169]10.“AG” 結合子
            
[0170]在一些實施方案中，本申請提供包含kiFM結構域的多肽，所述kiFM結構域與SEQID NO:1或6的相應鏈相比，具有經過修飾的β -鏈A和β -鏈G。這些蛋白在本文中被稱作“AG結合子”或“AG鏈”結合子。在某些實施方案中，AB鏈結合子在kiFM結構域的N端和C端部分包含成簇的修飾，而kiFM的中間部分保持不被修飾。例如，AG鏈結合子可以在10Fn3結構域的最先19個氨基酸(即對應于SEQ ID NO:1或6的氨基酸位置1_19)中的16個處包含修飾，在wFM結構域的最后18個氨基酸(即對應于SEQ ID NO:1或6的氨基酸位置84-101)中的13-17個處包含修飾，或者在kiFM結構域的最后22個氨基酸(即對應于SEQ ID NO:1或6的氨基酸位置80-101)中的14-18個處包含修飾。在示例實施方案中，AG結合子可以在對應于SEQ ID NO:1的位置1-7、9、11-17、19、84-89和91-97的一個或多個位置處包含修飾。優選地，AB結合子中被修飾的區域貢獻于對相同靶的結合。kiFmag結合子設計的實例包括，例如，圖9A所示的AG鏈設計，和圖2E所示的設計。圖3E描述了 AG結合子的一個模型。
            
[0171]11.“西南(西南)”結合子
            
[0172]在一些實施方案中，本申請提供包含wFnS結構域的多肽，所述kiFM結構域具有經過修飾的⑶和EF環，并在對應于SEQ ID NO:1位置69或91-97中的任何一個殘基或殘基組合中具有額外的修飾。這些蛋白在本文中被稱作“西南結合子”或“SW結合子”。經過修飾的環和支架區貢獻于對靶的結合。kiFi^SW結合子設計的實例包括，例如，圖9A所示的西南設計，和圖2F所示的設計。圖3F描述了 SW結合子的一個模型。
            
[0173]E.具有降低的免疫原性的蛋白
            
[0174]在一些實施方案中，本文中提供的多肽有降低的免疫原性。如實施例中所述，uiFr^結構域BC環周圍的區域似乎是免疫原性熱點。因此，本申請提供了兩個類型的具有降低的免疫原性的kiFM設計。在第一個類型的設計中，BC環保持完全未被修飾或至少部分未被修飾，從而宿主(例如人類)免疫應答更可能將kiFM結構域的BC區識別為自身，借此避免免疫應答。在第二個類型的設計中，kiFM結構域BC環中的強HLA結合錨被除去或破壞，從而使BC區不會那么緊密地結合宿主HLA受體，藉此降低kiFM結構域BC環區的免疫原潛力。下面對這些wFM設計進行進一步的描述。
            
[0175]在某些實施方案中，本申請提供了具有降低的免疫原性的多肽，其包含kiFM結構域，其中整個BC環保留為野生型。優選地，這些多肽與在BC環具有修飾的等價多肽相比，具有更低的免疫原性。具有野生型BC環的多肽在kiFM結構域的其它參與靶結合的區域中具有修飾。優選地，BC環之外的修飾不會導致在宿主體內產生針對kiFM結構域的強免疫應答。整個BC環保留為野生型的kiFM結合子的實例包括，例如，本文中所述的WS結合子、前結合子、后結合子、南極結合子、南前結合子、AG結合子和西南結合子。具有與野生型序列相比未被修飾的BC環的kiFM設計的特定實例包括，例如，圖9A所示的WS2、WS3、前1、前 2、后 1、后 2、SP1、SP2、SP3、L1-3 (a)、WS-LI1、LU-S9、南前、AG 鏈和西南設計，和圖 2D-2F所示的設計。在具有野生型BC環的kiFM結合子設計中，可能理想的是使β-鏈B和/或β -鏈C的全部或一部分，特別是與BC環相鄰的β -鏈B和/或β -鏈C部分(即β -鏈B的C端部分和/或β-鏈C的N端部分)，與野生型序列相比保持不被修飾。在示例實施方案中，具有野生型BC環和降低的免疫原性的wFM結構域，在wFM的處于CD環的N端一側的部分中可以不含任何修飾，即，N端區、β-鏈Α、ΑΒ環、β-鏈B、BC環和β-鏈C相對于野生型序列全被保留不被修飾。
            
[0176]在某些實施方案中，本申請提供了具有降低的免疫原性的多肽，其包含kiFM結構域，其中BC環的一部分被保留為野生型。優選地，這些多肽與在BC環的更大部分中具有修飾的等價多肽相比，具有更低的免疫原性。在示例實施方案中，BC環的N端部分被保留為野生型。例如，BC環的最先1、2、3、4、5、或6個殘基可以被保留為野生型，而BC環的其余C端殘基可以被修飾。在BC環N端區的至少一部分被保留為野生型的kiFM設計中，可能理想的是使β -鏈B和/或β -鏈C的全部或部分，特別是β -鏈B和/或β -鏈C的與BC環相鄰的部分(即β -鏈B的C端部分和/或β-鏈C的N端部分)，與野生型序列相比保持不被修飾。在示例實施方案中，在BC環的N端部分具有野生型序列和降低的免疫原性的uiFr^結構域在N端區、β -鏈Α、ΑΒ環和β -鏈B中可以不具有任何修飾。在BC環的一部分為野生型的kiFM設計中，BC環被修飾的部分可以和kiFM結構域其它區域內的修飾一起貢獻于對靶的結合。BC環N端部分保留為野生型的kiFM結合子的實例包括，例如，圖9Β所示的kiFM設計，圖9Α所示的WSl設計，和圖2C所示的kiFM設計。
            
[0177]在某些實施方案中，本申請提供了具有降低的免疫原性的多肽，其包含kiFM結構域，其中β -鏈B/BC環/ β -鏈C ( “BC錨”)區中的強HLA錨已被除去或破壞(例如以相對于野生型序列降低對一種或多種HLA受體的結合親和力的方式被修飾)。例如，可以通過在對應于SEQ ID NO:1或6的位置L19、S21、R33和/或T35的一個或多個位置處對1QFn3結構域進行修飾，而除去或破壞BC錨。當BC錨已被除去或破壞時，有可能修飾BC環的序列而不會顯著增加BC區的免疫原潛力。因此，許多這樣的kiFM設計除了 0-鏈8和/或β -鏈C中的修飾之外，在BC環中也有修飾。BC環可以貢獻于對靶的結合，任選地與uiFr^結構域其它區域中的修飾一起貢獻于對靶的結合。β-鏈B和/或β-鏈C中的修飾可以或者可以不貢獻于對靶的結合。BC錨被除去或破壞的kiFM結合子的實例包括，例如，圖9C所示的wFM設計和圖2Β所示的kiFM設計。
            
[0178]在某些實施方案中，本文中所述的多肽與具有SEQ ID NO:61的多肽相比具有降低的免疫原性，例如多肽的免疫原性比具有SEQ ID Ν0:61的多肽的免疫原性低。 
            
[0179]本文中所述的多肽的免疫原性可以通過例如如下的一種或多種方法進行評估:人白細胞抗原(“HLA”)結合、HLA結合的計算機預測(in silico predict1n)(例如使用Epimatrix程序)、人T細胞的體外活化、體內動物免疫應答，或其它用于評估免疫原性潛力的方法。
            
[0180]在某些實施方案中，免疫原性可以通過HLA結合實驗進行評估。優選地，本文中提供的多肽與一種或多種HLA受體結合的IC5tl小于或等于等價的HLA受體與野生型wFnS結構域之間結合的IC5Q。例如，本文中提供的多肽可以以大于10μΜ、15μΜ、20μΜ、25μΜ、50 μ Μ、100 μ Μ、150 μ M或200 μ M的IC5tl與HLA受體結合。在一些實施方案中，多肽與HLA受體結合的 IC5tl 為 10μΜ-1πιΜ、100μΜ-1πιΜ*500μΜ-1πιΜ。用于評估多肽/HLA IC5tl 結合的HLA 等位體可以是 DRB*0101、DRB*0301、DRB*0401、DRB*0701 和 / 或 DRB*1501 中的一種或多種。
            
[0181]在一些實施方案中，免疫原性可以通過計算機分析，例如EpiMatrix,進行評估。在特定的實施方案中，本文中提供的多肽的EpiMatrix “Z”評分表得分(“Z” scalescore)小于或等于野生型uiFr^結構域的得分。在某些實施方案中，本文中提供的多肽的EpiMatrix “Z”評分表得分不大于野生型kiFi^結構域得分的200%。在一些實施方案中，多妝的 EpiMatrix 得分在 EpiMatrix “Z” 評分表上小于 1.64 (An Z ；2009 ；TherapeuticMonoclonal Antibodies:From Bench to Clinic ；John Wiley and Sons ；New Jersey ；428~429頁)。
            
[0182]在一些實施方案中，免疫原性可以通過體內動物免疫應答實驗進行評估。例如，可以用本文中提供的多肽注射動物，例如小鼠或猴，并測量IgG和/或IgM免疫應答。優選地，本文中所述的多肽顯示的IgG和/或IgM免疫應答不會超過在用野生型wFM結構域注射的小鼠或猴中觀察到的免疫應答的200%、100%、50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、2% 或 1%。
            
[0183]本申請還提供了本文中所提供的多肽的文庫和從文庫中篩選可結合期望靶標的結合子的方法。與沒有進行設計以避免與BC區相關的免疫原潛力的文庫相比，從本文中提供的文庫中有更高的可能性分離到具有可接受的免疫原性特征的靶結合分子。這些文庫有助于減少對多肽候選物脫免疫(deimmunize)所需的勞動，并提高鑒定出非免疫原性的多肽分子的概率。
            
[0184]F.多價蛋白
            
[0185]在某些實施方案中，基于纖連蛋白的支架蛋白是包含兩個或更多個kiFM結構域的多價蛋白。例如，多價的基于纖連蛋白的支架蛋白可以包含2、3、或更多個共價締合的10Fn3結構域。在示例實施方案中，基于纖連蛋白的支架蛋白是包含兩個kiFM結構域的雙特異性或二聚體蛋白。在某些實施方案中，多價的基于纖連蛋白的支架蛋白包含與第一靶分子結合的第一 kiFM結構域，和與第二靶分子結合的第二 kiFM結構域。所述第一和第二靶分子可以是相同或不同的靶分子。當第一和第二靶分子相同時，第一和第二 kiFM結構域可以結合相同的靶標，但結合于不同的表位。此外，當第一和第二靶分子相同時，10Fn3結構域中與靶結合相關的修飾區域可以是相同或不同的。而且，第一和第二 kiFM結構域可以基于相同或不同的支架設計。例如，多價的基于纖連蛋白的蛋白支架可以包含兩個kiFM結構域，其中兩個kiFM均是基于本文中所述的相同的非傳統支架設計，其中一個kiFM結構域基于第一類型的非傳統支架設計而第二個kiFM結構域基于第二種類型的非傳統支架設計，或者一個wFM結構域基于一種非傳統支架設計，而第二個基于傳統的支架設計(即BC、DE和FG環被修飾)。
            
[0186]在示例實施方案中，多價的基于纖連蛋白的蛋白支架的每個kiFM結構域與期望靶標的結合Kd小于500nM、100nM、50nM、lnM、500pM、100pM，或更低。在一些實施方案中，多價的基于纖連蛋白的蛋白支架的每個kiFM結構域與期望靶標的結合Kd為IpM-1 μ M、100pM-500nM、lnM-500nM、或1ηΜ-100ηΜ。在示例實施方案中，多價的基于纖連蛋白的蛋白支架的每個wFM結構域特異性結合不與野生型wFM結構域，特別是野生型人kiFM結構域結合的靶標。
            
[0187]多價的基于纖連蛋白的支架蛋白的kiFM結構域可以通過多肽接頭連接。示例多肽接頭包括具有1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、或1_2個氨基酸的多肽。用于連接kiFM結構域的合適接頭是那些允許不同的結構域彼此獨立折疊，從而形成允許與靶分子高親和力結合的三維結構的接頭。合適接頭的特定實例包括基于甘氨酸-絲氨酸的接頭，基于甘氨酸-脯氨酸的接頭，基于脯氨酸-丙氨酸的接頭，以及具有SEQ ID NO: 32的氨基酸序列的接頭。在一些實施方案中，接頭是基于甘氨酸-絲氨酸的接頭。這些接頭包含甘氨酸和絲氨酸殘基，并且長度可以為8-50、10-30、和10-20個氨基酸。這些接頭的實例包括SEQ ID NOs:39-43.在一些實施方案中，接頭是基于甘氨酸-脯氨酸的接頭。這些接頭包含甘氨酸和脯氨酸，并且長度為3-30、10-30、和3-20個氨基酸。這些接頭的實例包括SEQ IDNOs:33-35。在一些實施方案中，接頭是基于脯氨酸-丙氨酸的接頭。這些接頭包含脯氨酸和丙氨酸，并且長度可以為3-30、10-30、3-20和6_18個氨基酸。這些接頭的實例包括SEQID NO: 36-38。在示例實施方案中，接頭不含有任何Asp-Lys (DK)對。
            
[0188]藥代動力學模塊
            
[0189]在一個方面中，本申請提供的基于纖連蛋白的支架蛋白進一步包括藥代動力學(PK)模塊。藥代動力學包括化合物被對象例如吸收、分布、代謝和排泄等的性質。藥代動力學的改良可以根據預期的治療需要進行評估。往往期望增加生物利用度和/或延長給藥之間的時間，這可能可以通過延長蛋白在施用后在血清中保持可用的時間來實現。在一些情況下，期望提高蛋白的血清濃度隨時間推移的連續性(例如降低在剛施用后和在下一次施用即將開始前的蛋白的血清濃度的差異)。基于纖連蛋白的支架蛋白可以附接于這樣的模塊，其可以將多肽在哺乳動物(例如小鼠、大鼠或人)體內的清除速率與未經修飾的多肽相比降低超過3倍。改良的藥代動力學的其它度量包括血清半衰期，其通常被分成α相和β相。這兩個相的一個或兩個可以通過添加合適的模塊而被顯著改良。PK模塊是指在與生物活性分子融合時會影響生物活性分子藥代動力學性質的任何蛋白、肽、或模塊。
            
[0190]趨向于減慢蛋白從血液中清除的PK模塊包括聚氧化烯模塊，例如聚乙二醇、糖(例如唾液酸)和耐受良好的蛋白模塊(例如Fc、Fc片段、轉鐵蛋白或血清白蛋白)。基于纖連蛋白的支架蛋白可以和如美國公開N0.20070048282中所述的白蛋白或白蛋白的片段(部分)或變異體融合。在一些實施方案中，PK模塊是血清白蛋白結合蛋白，例如美國公開Nos.2007/0178082和2007/0269422中描述的那些。在一些實施方案中，PK模塊是血清免疫球蛋白結合蛋白，例如美國公開N0.2007/0178082中描述的那些。
            
[0191]在一些實施方案中，基于纖連蛋白的支架蛋白可以附接包含非蛋白質聚合物的PK模塊。在一些實施方案中，聚合物是聚乙二醇(“PEG”)、聚丙二醇或聚氧化烯，如美國專利Nos.4，640，835 ;4，496，689 ;4，301，144 ;4，670，417 ;4，791，192 或 4，179，337 所述。在示例實施方案中，聚合物是PEG模塊。
            
[0192] PEG是一種眾所周知的水溶聚合物，其可以商購或者根據本領域眾所周知的方法(Sandler and Karo、Polymer Synthesis、Academic Press、New York、第 3 卷、138-161 頁)通過乙二醇的開環聚合加以制備。術語“PEG”被廣義地使用，包括任何聚乙二醇分子，而不考慮大小或PEG末端的修飾，并且可以用如下公式表示:X-0 (CH2CH2O)^1CH2CH2OH(I)，其中η是20-2300，X是H或末端修飾，例如CV4烷基。在一個實施方案中，本發明PEG的一端用羥基或甲氧基封端，即X是H或CH3 (“甲氧基PEG”)。PEG可以進一步含有結合反應必需的化學基團，這是該分子的化學合成的結果；或者其是用于在分子各部分間獲得最佳距離的間隔子(spacer)。此外，這種PEG可以由一個或多個連接在一起的PEG側鏈構成。具有超過一個PEG鏈的PEG被稱作多臂或分支PEG。分支PEG可以通過例如向各種多元醇，包括甘油、季戊四醇和山梨醇，添加聚氧乙烯加以制備。例如，四臂的分支PEG可以用季戊四醇和氧化乙烯制備。分支PEG在例如歐洲公開申請N0.473084A和美國專利N0.5，932，462中有描述。一種形式的PEG包含藉由賴氨酸的伯氨基連接的兩個PEG側鏈(PEG2) (Monfardin1、C.、et al.、B1conjugate Chem.6 (1995) 62-69)。
            
[0193]PEG與肽或蛋白的綴合一般包括PEG的活化和將活化的PEG中間產物直接與靶蛋白/肽偶聯，或與接頭偶聯，而接頭隨后被活化并與靶蛋白/肽偶聯(見Abuchowsk1、A.etal、J.B1l.Chem.,252,3571 (1977)和 J.B1l.Chem.、252、3582(1977)、Zalipsky、et al.、和 Harris et.al.、in:Poly(ethylene glycol)Chemistry:B1technical and B1medicalApplicat1ns ； (J.M.Harris ed.)Plenum Press:New York> 1992 ;第 21 和 22 章)。應當注意，含有PEG分子的基于纖連蛋白的支架蛋白也被稱作綴合蛋白，而缺少附接的PEG分子的蛋白可以稱作是非綴合的。
            
[0194]所用PEG的大小將會取決于多種因素，包括基于纖連蛋白的支架蛋白的預期用途。優選較大的PEG以增加在體內、血液、非血液細胞外液體或組織內的半衰期。對于體內細胞活性，大約10-60kDa范圍內PEG是優選的，小于大約10kDa的PEG，更優選地小于大約60kDa也是優選的，盡管也大于約10kDa的大小也可以使用。對于體內成像應用，可以使用較小的PEG，一般小于約20kDa，其不會像較大的PEG那樣增加半衰期，從而允許更快的分布和較小的半衰期。可以選擇多種分子量形式的PEG，例如從大約1，000道爾頓(Da)到100, OOODa(η為20-2300)，用于綴合到基于纖連蛋白的支架蛋白上。PEG中重復單位“η”的數目是用道爾頓表述的近似分子量。優選地，活化的接頭上PEG的總分子量適合于藥用。因此，在一個實施方案中，PEG分子的分子量不超過100，000Da。例如，如果三個PEG分子與一個接頭連接，其中每一個PEG分子具有12，OOODa的相同分子量(每一個η為大約270)，那么接頭上PEG的總分子量為大約36，OOODa (總η為大約820)。附接在接頭上的PEG的分子量也可以不同，例如接頭上的三個分子中，2個PEG分子可以各為5，OOODa (每一個的η為大約110)，而一個PEG分子可以是12，OOODa (η為大約270)。在一些實施方案中，一個PEG模塊與基于纖連蛋白的支架蛋白綴合。在一些實施方案中，PEG模塊為大約20、30、40、50、60、70、80、或90KDa。在一些實施方案中，PEG模塊為大約40KDa。
            
[0195]在一些實施方案中，PEG化的基于纖連蛋白的支架蛋白含有1、2或更多個PEG模塊。在一個實施方案中 ，PEG模塊與位于蛋白表面上和/或背離與靶配體接觸的表面的氨基酸殘基結合。在一個實施方案中，PEG化的基于纖連蛋白的支架蛋白中PEG的總或全分子量為大約3，000Da-60, OOODa、或大約10，000Da-36, OOODa0在一個實施方案中，PEG化的基于纖連蛋白的支架蛋白中的PEG是基本上線性的直鏈PEG。
            
[0196]本領域的技術人員可以根據PEG化的基于纖連蛋白的支架蛋白如何應用于治療、期望的劑量、循環時間、對蛋白水解的耐受、免疫原性和其它考慮，為PEG選擇合適的分子量。關于PEG及其用于提高蛋白性質的應用的討論,見N.V.Katre、Advanced Drug DeliveryReviewsl0:91-114(1993)。
            
[0197]在一些實施方案中，基于纖連蛋白的支架蛋白與具有如下公式的聚(乙二醇)模塊共價連接:-C0-CH2)x-(OCH2CH2)m-OR,其中聚(乙二醇)基團的-CO(即羰基)與結合多肽的一個氨基形成酰胺鍵；R是低級烷基；x為2或3 ;m為大約450-大約950 ；n和m的選擇令綴合物減去結合多肽的分子量為大約10-40kDa。在一個實施方案中，基于纖連蛋白的支架蛋白一個賴氨酸的ε-氨基是可及的(游離的)氨基。
            
[0198]在一個具體實施方案中，用PEG的碳酸酯形成PEG-基于纖連蛋白的支架蛋白偶聯物。N，N’-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC)可在與PEG的反應中使用，從而形成活化的混合PEG-琥珀酰亞胺基碳酸酯，其隨后可以和接頭的親核基團或基于纖連蛋白的支架蛋白的氨基反應(見美國專利N0.5，281，698和美國專利N0.5，932，462)。在一個相似類型的反應中，可以用1，I’-(苯并三唑基)碳酸酯(1，I’ -(dibenzotriazolyl) carbonate)和二-(2-吡唳基)碳酸酯(d1-(2-pyridyl) carbonate)和PEG反應,分別形成PEG-苯并三唑基和PEG-吡啶基混合碳酸酯(美國專利N0.5，382，657)。
            
[0199]基于纖連蛋白的支架蛋白的PEG化能夠根據代表本領域當前技術水平的方法實施，例如通過使基于纖連蛋白的支架蛋白與親電子活性的PEG(供應商:Shearwater Corp.、USA,萬維網shearwatercorp.com)反應。本發明優選的PEG試劑是,例如，N-羥基琥拍酰亞胺基丙酸酯(PEG-SPA)、丁酸酯(PEG-SBA)、PEG-琥珀酰亞胺基丙酸酯或有分支的N-羥基玻拍酸亞胺如 mPEG2_NHS (Monfardin1、C.、et al.、B1con jugate Chem.6 (1995) 62-69)。這些方法可以用于在基于纖連蛋白的支架蛋白的賴氨酸ε -氨基處PEG化，或在基于纖連蛋白的脂蛋白的末端氨基處PEG化。
            
[0200]在另一個實施方案中，PEG分子可以和基于纖連蛋白的支架蛋白上的巰基偶聯(Sartore、L.、et al.> Appl.B1chem.B1technol.、27、45(1991) ；Morpurgo et al.、B1con.Chem.、7、363_368 (1996) ；Goodson et al.、B1/Technology (1990) 8、343 ;美國專利N0.5，766，897)。美國專利Nos.6，610，281和5，766，897描述了可以和巰基偶聯的反應活性PEG種類的實例。
            
[0201]在一些實施方案中，PEG化的基于纖連蛋白的支架蛋白通過定點PEG化產生，特別地是通過將PEG綴合于半胱氨酸模塊而產生。在某些實施方案中，Cys殘基可以位于基于纖連蛋白的支架蛋白的N端,N端與最靠N端的β或β樣鏈之間，C端,或C端與最靠C端的β或β樣鏈之間。Cys殘基也可以位于其他位置，特別是任何不參與靶結合的環或者位于多價的基于纖連蛋白的支架蛋白的兩個結合結構域之間。PEG化基團還可以通過其它化學附接，包括通過與胺綴合。 
            
[0202]在一些實施方案中，當PEG分子與基于纖連蛋白的支架蛋白上的半胱氨酸殘基綴合時，半胱氨酸是基于纖連蛋白的支架蛋白自帶的，而在其它實施方案中，一個或多個半胱氨酸殘基被工程化到基于纖連蛋白的支架蛋白中。可以在基于纖連蛋白的支架蛋白編碼序列中引入突變，從而產生半胱氨酸殘基。這可以通過，例如，將一個或多個氨基酸殘基突變成半胱氨酸來實現。用于突變成半胱氨酸氨基的優選氨基酸包括絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和其它親水氨基酸。優選地，要突變成半胱氨酸的殘基是表面暴露的殘基。用于根據一級序列或蛋白預測殘基的表面可及性的算法是本領域眾所周知的。或者，考慮到設計基于纖連蛋白的支架蛋白所依據的第十fn3結構域的框架已經被解析(見Dickinson、et al.> J.Mol.B1l.236 (4): 1079-92 (1994))，則可以通過比較基于纖連蛋白的支架蛋白的氨基酸序列預測表面殘基，從而鑒定出表面暴露的殘基。在一個實施方案中，半胱氨酸殘基被引入到基于纖連蛋白的支架蛋白的N和/或C端或其附近，或者被弓丨入到環區內。半胱氨酸殘基的PEG化可以使用，例如，PEG-馬來酰亞胺、PEG-乙烯砜、PEG-碘乙酰胺或PEG-鄰二硫吡啶實施。
            
[0203]在一些實施方案中，PEG化的基于纖連蛋白的支架蛋白包含與N端氨基酸的α氨基共價連接的PEG分子。位點特異性N端還原胺化反應在P印insky et al.、(2001) JPET,297，1059、和美國專利N0.5，824，784中有描述。在美國專利N0.4，002，531，在Wieder etal.、(1979) J.B1l.Chem.254, 12579,和在 Chamow et al.、(1994)B1conjugate Chem.5、133中描述了使用PEG-醛利用其它可得的親核氨基對蛋白進行還原胺化反應。
            
[0204]在另一個實施方案中，PEG化的基于纖連蛋白的支架蛋白包含一個或多個附接于接頭的PEG分子，而接頭則附接在基于纖連蛋白的支架蛋白的N端氨基酸殘基的α氨基上。這種方法在美國公開N0.2002/0044921和PCT公開N0.W094/01451中有公開。
            
[0205]在一個實施方案中，基于纖連蛋白的支架蛋白在C端被PEG化。在一個具體的實施方案中，通過引入C端疊氮基-甲硫氨酸并隨后通過Staudinger反應進行甲基-PEG-三芳基膦化合物綴合，而使蛋白在C端被PEG化。該C端綴合方法在Cazalis et al.、C-TerminalSite-Specific PEGylat1n of a Truncated Thrombomodulin Mutant with Retent1n of FullB1activity、B1conjug Chem.2004 ；15 (5): 1005-1009 中有描述。
            
[0206]在示例實施方案中，如在下文進一步詳述地那樣對基于纖連蛋白的支架蛋白進行了 C端尾巴區中的PGE化。在示例實施方案中，C端含有半胱氨酸殘基，其被用作附接PEG基團的位點。示例C端尾巴包括，例如，具有SEQ IDN0:23、24或31中任一個的多肽。
            
[0207]PEG化的基于纖連蛋白的支架蛋白可以使用本領域已知的常規分離和純化技術，例如大小排阻(例如凝膠過濾)和離子交換色譜，來進行純化。還可以使用SDS-PAGE對產物進行分離。可以分離的產物包括單、二、三、多聚和非-PEG化的基于纖連蛋白的支架蛋白，以及游離的PEG。單-PEG偶聯物的百分比可以通過匯集(pooling)洗脫峰周圍更廣泛的級分以增加單-PEG在組合物中的百分比來進行控制。大約90%的單-PEG偶聯物代表一個產率和活性的良好平衡。例如其中至少92%或至少96%的偶聯物是單-PEG物質的組合物是理想的。在本發明的一個實施方案中，單-PEG偶聯物的百分比范圍是90% -96%。
            
[0208]在本發明的一個實施方案中，PEG化的基于纖連蛋白的支架蛋白中的PEG在使用羥胺測定，例如450mM羥胺(pH6.5)在室溫下8_16小時的條件時，不會從PEG化氨基酸殘基上水解下來，因此是穩定的。在一個實施方案中，超過80 %的組合物是穩定的單-PEG-基于纖連蛋白的支架蛋白，更優選地至少90 %，最優選地至少95 %。
            
[0209]在另一個實施方案中，PEG化的基于纖連蛋白的支架蛋白將會優選地保持未經修飾蛋白的至少大約25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%的生物活性。在一個實施方案中，生物活性是指其結合一種或多種靶分子的能力，用1、1^或1^。?評價。在一個具體的實施方案中，PEG化的基于纖連蛋白的支架蛋白與未PEG化的基于纖連蛋白的支架蛋白相比，與一種或多種靶分子的結合增強。
            
[0210]PEG修飾的基于纖連蛋白的支架蛋白的血清清除速率與未經修飾的基于纖連蛋白的支架蛋白的清除速率相比，可以降低大約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或者甚至90 %。與未經修飾的基于纖連蛋白的支架蛋白的半衰期相比，PEG修飾的基于纖連蛋白的支架蛋白的半衰期(t1/2)提高。與未經修飾的基于纖連蛋白的支架蛋白的半衰期相比，PEG修飾的基于纖連蛋白的支架蛋白的半衰期可以提高至少10%、20%、30%、40%,50%,60%,70%,80%,90% ,100% ,125% ,150% ,175%,200%,250%,300%,400%or500%、或者甚至1000%。在一些實施方案中，蛋白半衰期在體外測定，例如在緩沖生理鹽水溶液或血清中。在其它實施方案中，蛋白半衰期是體內半衰期，例如基于纖連蛋白的支架蛋白在動物的血清或其它體液中的半衰期。
            
[0211]核酸-蛋白融合技術
            
[0212]在一個方面中，本申請提供基于纖連蛋白的支架蛋白，該蛋白包含III型纖連蛋白結構域，其結合人類靶標，例如TNF- a、DLL4、IL-17、PXR或其它蛋白。一種快速制作和測試具有特定結合性質的Fn3結構域的方法是Adnexus,百時美施貴寶公司(Bristol-MyersSquibb Company),的核酸-蛋白融合技術。這種體外表達和標簽化技術稱作PROfus1n?,其利用核酸-蛋白融合(RNA-和DNA-蛋白融合)，可用于鑒定對與蛋白的結合重要的新型多肽和氨基酸基序。核酸-蛋白融合技術是一種使蛋白與其編碼遺傳信息共價偶聯的技術。關于RNA-蛋白融合技術和基于纖連蛋白的支架蛋白文庫篩選方法的詳細描述見 Szostak et al.、美國專利 Nos.: 6，258，558 ;6，261，804 ;6，214，553 ;6，281，344 ；6，207，446 ;6，518，018 ；PCT 公開 Nos.W000/34784 ；W001/64942 ；W002/032925 ；和 Robertsand Szostak、Proc Natl.Acad.Sc1.94:12297-12302、1997，本文援引并入這些文獻的內容。
            
[0213]載體和多核苷酸實施方案
            
[0214]編碼本文中所公開的各種基于纖連蛋白的支架蛋白中任何一種的核酸可以化學、酶學或重組合成。可以選擇密碼子用法，以提高在細胞內的表達。這些密碼子用法會依賴于所選的細胞類型。已經為大腸桿菌(E.coli)和其它細菌以及哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞和昆蟲細胞開發出了專用的密碼子使用模式。見例如:Mayfield et al.、Proc NatlAcad Sci USA.2003Jan21 ； 100 (2): 438-42 ；Sinclair et al.Protein Expr Pur if.20020ct ；26(1):96-105 ；Connell ND.Curr Opin B1technol.20010ct ；12(5):446-9 ；Makrides etal.Microb1l Rev.1996Sep ；60 (3): 512-38 ;和 Sharp et al.Yeast.19910ct ；7 (7): 657-78。
            
[0215]用于核酸操作的一般技術在例如下列文獻中有描述:Sambrook et al., MolecularCloning:A Laboratory Manual,第 1-3 卷,Cold Spring Harbor Laboratory Press,第二版,1989,或 F.Ausubel et al., Current Protocols in Molecular B1logy (GreenPublishing and ffiley-1nterscience:New York, 1987)及其定期更新，本文援引并入其內容。編碼多肽的DNA與來自哺乳動物，病毒或昆蟲基因的合適轉錄或翻譯調節元件操作連接。這些調節元件包括轉錄啟動子、控制翻譯的任選操作子序列、編碼合適mRNA核糖體結合位點的序列，和控制轉錄和翻譯終止的序列。此外還引入在宿主體內復制的能力(通常由復制原點提供)和便于轉化子識別的篩選基因。
            
[0216]本文中所述的基于纖連蛋白的支架蛋白不僅可以直接重組產生，而且可以與異源多肽一起作為融合多肽產生，異源多肽優選地是信號序列或其它在成熟蛋白或多肽N端具有特異切割位點的多肽。所選擇的異源信號序列優選地可被宿主細胞識別和加工(即被信號肽酶切割)。對于不識別和加工天然信號序列的原核生物宿主細胞，信號序列可以用原核生物信號序列例如從堿性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或熱穩定的腸毒素II前導序列(leader)中選出的原核生物信號序列代替。為了進行酵母分泌，可以將天然信號序列替換為例如酵母轉換酶前導序列、因子前導序列(factor leader)(包括酵母和克魯維酵母α -因子前導序列)或酸性磷酸酶前導序列、人白色念珠菌糖化酶前導序列或在PCT公開N0.W090/13646中描述的信號。在哺乳動物細胞表達中，可以獲得哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導序列，如單純皰疹病毒gD信號。這類前體區的DNA可以和編碼蛋白的DNA合閱讀框連接。
            
[0217]表達和克隆載體均含有能夠使載體在一種或多種所選宿主細胞內復制的核酸序列。一般地，在克隆載體中，該序列是能夠使載體獨立于宿主染色體DNA復制、并包含復制原點或自主復制序列的序列。許多細菌、酵母和病毒的這些序列是眾所周知的。來自質粒PBR322的復制原點適合于大多數革蘭氏陰性菌，2μ質粒原點適合于酵母，各種病毒原點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)適合于在哺乳動物體內克隆載體。一般地，哺乳動物表達載體不需要復制原點組分(通常可僅使用SV40原點，因為它含有早期啟動子)。
            
[0218]表達和克隆載體可以含有篩選基因，也稱作可篩選標簽。典型的篩選基因編碼如下蛋白，其(a)賦予對抗生素或其它毒素，例如氨芐青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四環素的抗性，(b)補償營養缺陷型的缺陷，或(C)提供不能從復合培養基獲得的關鍵營養素，例如為芽孢桿菌編碼D-丙氨酸消旋酶的基因。
            
[0219]用于酵母的一種合適的篩選基因是酵母質粒YRp7中存在的trpl基因(Stinchcomb et al.、Nature、282:39 (1979))。trpl基因為不能在無色氨酸條件下生長的酵母突變菌株，例如 ATCC N0.44076 或PEP4-1.Jones, Genetics, 85:12(1977)提供了篩選標記。酵母宿主細胞基因組中存在的trpl缺陷提供了一個有效的環境，可通過在無色氨酸條件下生長對轉化子進行篩選。類似地，Leu2-缺陷酵母菌株(ATCC20，622或38，626)可以被已知的攜帶Leu2基因的質粒補償。
            
[0220]表達和克隆載體通常含有啟動子，啟動子可以被宿主生物體識別，并與編碼基于纖連蛋白的支架蛋白的核酸可操作連接。適合于原核生物宿主使用的啟動子包括PhoA啟動子、內酰胺酶和乳糖啟動子系統、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統和雜合啟動子,例如tac啟動子。然而,其它已知的細菌啟動子也是合適的。用于細菌系統的啟動子還可含有與編碼基于纖連蛋白的支架蛋白的DNA可操作連接的Shine-Dalgarno (S.D.)序列。
            
[0221]真核生物的啟動子序列是已知的。實際上，所有真核生物基因在轉錄起始位點上游大約25-30個堿基處具有一個富含AT的區域。另一個在許多基因轉錄起始上游70-80個堿基處發現的序列是CNCAAT區，其中N可以是任何核苷酸。大多數真核生物基因的3’端是AATAAA序列，其可能是用于向編碼序列3’端添加多聚A尾巴的信號。所有這些基因都被合適地插入在真核生物表達載體中。
            
[0222]用于和酵母宿主使用的合適啟動子的實例包括用于3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶的啟動子，例如烯醇化酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡萄糖異構酶，和葡萄糖激酶的啟動子。
            
[0223]其它酵母啟動子，其是具有可通過生長條件控制轉錄的額外優點的可誘導啟動子，是如下酶的啟動子區:乙醇脫氫酶2,異細胞色素C(isocytochrome C),酸性磷酸酶,氮代謝相關降解酶，金屬硫蛋白，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶。用于在酵母中表達的合適載體和啟動子在EP專利公開N0.73，657中有進一步的描述。酵母增強子也可有利地與酵母啟動子一起使用。
            
[0224]在哺乳動物宿主細胞中從載體進行的轉錄可以用例如如下啟動子進行控制，從病毒基因組，例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、乙型肝炎B病毒，最優選猿猴病毒40 (SV40)獲得的啟動子；來自異源哺乳動物啟動子，例如，肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子；來自熱休克啟動，只要這些啟動子與宿主細胞系統兼容即可。
            
[0225]S V40病毒的早期和晚期啟動子被方便地用作SV40限制片段，其也含有SV40病毒復制原點。人巨細胞病毒的中早期啟動子被方便地用作HindIII E限制片段。在美國專利N0.4, 419, 446中公開了一種使用牛乳頭瘤病毒作為載體的，用于在哺乳動物宿主體內表達DNA的系統。關于在小鼠細胞中在來自單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶啟動子控制下表達人β 干擾素，另見 Reyes et al.，Nature297:598-601 (1982)。
            
[0226]經常通過在載體中插入增強子序列提高高等真核生物對編碼基于纖連蛋白的支架蛋白的DNA的轉錄。現在已知許多來自哺乳動物基因(珠蛋白，彈性蛋白酶，白蛋白，α-甲胎蛋白和胰島素)的增強子序列。然而，通常會使用來自真核細胞病毒的增強子。實例包括復制原點晚期側(late side) (bp100-270)的SV40增強子，巨細胞病毒早期啟動子增強子，復制原點晚期側的多瘤病毒增強子，和腺病毒增強子。關于激活真核細胞啟動子，另見Yaniv, Nature297:17-18 (1982)。增強子可以剪接(spliced into)到載體多肽編碼序列的5’或3’側的位置，但是優選地位于啟動子5’位。
            
[0227]真核生物宿主細胞(例如酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細胞生物體的有核細胞)中使用的表達載體還含有用于終止轉錄或用于穩定mRNA所需的序列。這些序列通常可以從真核生物或病毒DNA或cDNA的5’非翻譯區獲得，偶爾還可從3’非翻譯區獲得。這些區域在編碼多肽的mRNA的非翻譯區含有被轉錄為多聚腺苷酸片段的核苷酸片段。一個有用的轉錄終止組分是牛生長激素多聚腺苷酸區域。見W094/11026及其中公開的表達載體。
            
[0228]重組DNA還可以包含任何類型的對基于纖連蛋白的支架蛋白蛋白的純化有用的標簽序列。蛋白標簽的實例包括，但不僅限于，組氨酸標簽、FLAG標簽、myc標簽、HA標簽或GST標簽。用于細菌、真菌、酵母和哺乳動物細胞宿主的合適克隆和表達載體可以在CloningVectors:A Laboratory Manual、(Elsevier、New York、1985)中找到，本文援引并入其相關公開內容。
            
[0229]使用適合于宿主細胞的方法將表達構建體引入到宿主細胞中，這是本領域技術人員容易想到的。本領域已知有許多用于將核酸引入到宿主細胞內的方法，包括但不僅限于，電穿孔；采用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其它物質的轉染；微粒轟擊；脂質體轉染；和感染(其中載體是感染劑)。
            
[0230]合適的宿主細胞包括原核細胞、酵母、哺乳動物細胞或細菌細胞。合適的細菌包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如大腸桿菌或芽孢桿菌。酵母，優選地來自釀酒酵母物種如釀酒酵母的酵母，也可用于生產多肽。各種哺乳動物或昆蟲細胞培養系統也能夠用于表達重組蛋白。Luckow和Summers, (B1/Technology,6:47,1988)綜述了用于在昆蟲細胞中生產異源蛋白的桿狀病毒系統。合適的哺乳動物宿主細胞實例包括內皮細胞、C0S-7猴腎細胞、CV-1、L細胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢(CHO)、人胚胎腎細胞、HeLa、293、293T和BHK細胞系。通過培養合適的宿主/載體系統表達重組蛋白，制備純化的基于纖連蛋白的支架蛋白。對于許多應用，在大腸桿菌中表達小尺寸的基于纖連蛋白的支架蛋白是優選的表達方法。基于纖連蛋白的支架蛋白隨后從培養基或細胞提取物中被純化。
            
[0231]蛋白生產
            
[0232]用本文中所述的用于蛋白生產的表達或克隆載體轉化宿主細胞，并在常規營養培養基中進行培養，常規營養培養基可視需要進行改變以適合于誘導啟動子、篩選轉化體或擴增編碼期望序列的基因。
            
[0233]用于生產基于纖連蛋白的支架蛋白的宿主細胞可以在各種培養基中培養。商品化的培養基，例如 Ham’s FlO (Sigma)、Minimal Essential Medium ((MEM)、(Sigma))、RPM1-1640 (Sigma)、和 Dulbecco's Modified Eagle’s Medium ((DMEM) (Sigma))適合于培養宿主細胞。此外，在 Ham et al.、Meth.Enz.58:44(1979)、Barnes et al.、Anal.B1chem.102:255 (1980)、美國專利 Nos.4，767，704 ;4，657，866 ;4，927，762 ;4，560，655 ；或5，122，469 ；W090/03430 ；W087/00195 ;或美國專利N0.Re.30，985中描述的任何培養基均可用作宿主細胞的培養基。任何這些培養基可以根據需要添加激素和/或其它生長因子(例如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(例如氯化鈉、鈣、鎂和磷)、緩沖液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷酸和胸腺嘧啶)、抗生素(例如GENTAMYCIN?藥物)、微量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無機化合物)，和葡萄糖或相當的能量源。任何其它必需添加物也可以合適的濃度存在，其是本領域技術人員已知的。培養條件，例如溫度、PH等，與先前用于篩選表達宿主細胞時所用的相同，并且是普通技術人員顯而易見的。
            
[0234]本文中公開的基于纖連蛋白的支架蛋白還可以用無細胞翻譯系統產生。為此目的，可以修飾編碼基于纖連蛋白的支架蛋白的核酸，使其能夠在體外被轉錄產生mRNA，并允許在所用的特定無細胞系統(無真核生物如哺乳動物或酵母細胞的翻譯系統或無原核生物如細菌細胞的翻譯系統)中進行mRNA的無細胞翻譯。
            
[0235]基于纖連蛋白的支架蛋白還可以通過化學合成來產生(例如通過Solid PhasePeptide Synthesis、第二版、1984、The Pierce Chemical 公司、Rockford、IL 中描述的方法)。基于纖連蛋白的支架蛋白的修飾也可以通過化學合成產生。
            
[0236]本文中公開的基于纖連蛋白的支架蛋白可以通過蛋白質化學領域公知的蛋白分離/純化方法進行純化。非限制性實例包括提取、重結晶、鹽析(例如用硫酸銨或硫酸鈉)、離心、透析、超過濾、吸附色譜、離子交換色譜、疏水色譜、正相色譜、反相色譜、凝膠過濾、凝膠滲透色譜、親和色譜、電泳、逆流分布或這些的任意組合。純化后，基于纖連蛋白的支架蛋白可以與不同的緩沖交換，和/或通過本領域已知的多種方法中的任何方法(包括但不僅限于，過濾和透析)進行濃縮。
            
[0237]純化的基于纖連蛋白的支架蛋白優選為至少85%純，更優選地至少95%純，最優選地至少98%純。無論純度的精確數值為何，基于纖連蛋白的支架蛋白的純度足夠用作藥物產品。
            
[0238]示例用途
            
[0239]在一個方面中，本申請提供標記有可檢測模塊的基于纖連蛋白的支架蛋白。基于纖連蛋白的支架蛋白可以用于各種診斷應用。可檢測模塊可以是任何能夠直接或間接產生可檢測信號的模塊。例如，可檢測模塊可以是放射性同位素，例如H3、C14、C13、P32、S35、或1131 ;熒光或化學發光化合物，例如異硫氰酸熒光素、羅丹明或熒光素；或者酶，例如堿性磷酸酶、半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶。
            
[0240]可以采用任何本領域已知的用于將蛋白與可檢測模塊綴合的方法，包括在下列文獻中描述的方法:Hunter、et al.、Naturel44:945 (1962) ;David、et al.、B1chemistry13:1014(1974) ;Pain、et al.、J.Tmmunol.Meth.40:219(1981)；和 Nygren>J.Histochem.and Cytochem.30:407 (1982)。體外方法,包括本領域眾所周知的綴合化學,包括與蛋白質相容的化學，例如用于特定氨基酸如Cys和Lys的化學。為了將可檢測標簽與基于纖連蛋白的支架蛋白連接，使用連接基團或反應性基團。合適的連接基團是本領域眾所周知的，包括二硫基、硫酯基、酸不穩定基團、光不穩定基團、肽酶不穩定基團和酯酶不穩定基團。優選的連接基團是二硫基和硫酯基，視應用而定。對于沒有Cys氨基酸的多肽，可以在特定位置處引入Cys，以便使在蛋白具有活性的同時生成用于綴合的位點。
            
[0241 ] 與可檢測模塊連接的基于纖連蛋白的支架蛋白可用于體外或體內成像。多肽可以和不透射線劑(rad1-opaque agent)或放射性同位素連接,施用給受試者,優選地施用到血流中，并可以測定受試者體內被標記蛋白的存在和定位。例如，當基于纖連蛋白的支架蛋白與癌相關靶標結合時，該成像技術可以用于惡性腫瘤的分期和治療。基于纖連蛋白的支架蛋白可以用任何可以在受試者內檢測到(無論是通過核磁共振、放射學還是本領域已知的其它檢測方法)的模塊標記。
            
[0242]基于纖連蛋白的支架蛋白還可用作親和純化劑。在該過程中，使用本領域眾所周知的方法將基于纖連蛋白的支架蛋白固定在合適的支持物上，例如Sephadex樹脂或濾紙上。
            
[0243]基于纖連蛋白的支架蛋白可以在任何已知的測定方法中使用，例如競爭結合測定、直接和間接夾心式測定、和免疫沉淀測定(Zola、Monoclonal Antibodies:A Manual ofTechniques、pp.147-158 (CRC Press、Inc.、1987))。
            
[0244]在某些方面中，本公開提供了用于檢測樣品中靶分子的方法。該方法可以包括使樣品與本文中所述的基于纖連蛋白的支架蛋白接觸，其中所述接觸在允許基于纖連蛋白的支架蛋白-靶復合物形成的條件下進行；和檢測所述復合物，藉此檢測所述樣品中的所述靶標。檢測可以使用本領域已知的任何技術，例如放射照相、免疫測定、熒光檢測、質譜或表面等離子體共振來實施。樣品經常是生物樣品，例如組織活檢，特別是腫瘤或疑似腫瘤的組織活檢，在基于纖連蛋白的支架蛋白與癌癥相關的靶標結合的情況下。樣品可以來自人或其它哺乳動物。基于纖連蛋白的支架蛋白可以用標記模塊，例如放射性模塊、熒光模塊、發色模塊、化學發光模塊或半抗原模塊標記。基于纖連蛋白的支架蛋白可以被固定在固體支持物上。
            
[0245]在一個方面中，本申請提供可用于疾病的治療的基于纖連蛋白的支架蛋白。可以治療的疾病或病癥將由基于纖連蛋白的支架蛋白的結合特異性決定。如本文中所述，基于纖連蛋白的支架蛋白可以被設計成與任何感興趣的靶標結合。靶標實例包括，例如，TNF-α、DLL4、IL_17和PXR。僅僅作為舉例，與TNF-a結合的基于纖連蛋白的支架蛋白可用于治療自身免疫疾病，例如類風濕性關節炎、炎性腸病、銀屑病和哮喘；與IL-17結合的基于纖連蛋白的支架蛋白可用于治療哮喘；和與DLL4結合的基于纖連蛋白的支架蛋白可用于治療與不期望的血管新生有關的過度增殖疾病或病癥，例如癌癥或腫瘤。
            
[0246]本申請還提供了用于將基于纖連蛋白的支架蛋白施用給受試者的方法。在一些實施方案中，受試者是人。在一些實施方案中，基于纖連蛋白的支架蛋白對哺乳動物，特別是人而言是可藥用的。“可藥用的”組合物是指這樣的組合物，其施用給動物不會產生明顯的不良醫學結果。可藥用的組合物的實例包括包含缺少整聯蛋白結合結構域(RGD)的kiFM結構域的組合物，和基本上沒有內毒素或致熱源或具有極低內毒素或致熱源水平的組合物。
            
[0247]制劑和施用
            
[0248]本申請進一步提供了可藥用的組合物，其包含本文中所述的基于纖連蛋白的支架蛋白，其中該組合物基本上沒有內毒素和/或致熱源。
            
[0249]包含基于纖連蛋白的支架蛋白的治療性制劑通過將具有期望純度水平的所述蛋白與任選的生理學上可接受載體、賦形劑或穩定劑(Remington’s PharmaceuticalSciencesl6版、Osol、A.編輯(1980))混合制備，以水性溶液、凍干或其它干燥制劑的形式儲存。可接受的載體、賦形劑和穩定劑在所用劑量和濃度下對受體是無毒的，并且包括緩沖劑例如磷酸鹽、醋酸鹽、和其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如十八烷基二甲基苯基(octadecyidimethylbenzyl)氯化銨；氯化六甲雙銨；苯扎氯銨；節索氯銨；苯酚，丁基或芐醇；對羥基苯甲酸烷基酯類如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲基苯酚)；低分子量(小于約10個殘基)的多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸、或賴氨酸；單糖，雙糖，和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或葡聚糖；螯合劑如EDTA ;糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽的反離子，如鈉；金屬絡合物(例如，鋅蛋白復合物)；和/或非離子表面活性劑如TWEEN?、PLURONICS? 或聚乙二醇(PEG)。
            
[0250]本文中的制劑還可以視需要含有超過一種活性化合物，用于治療的特定適應證，優選地具有互補活性并且彼此沒有不良影響的活性化合物。這些分子以可有效實現所預期目的的量適當地組合存在。
            
[0251]基于纖連蛋白的支架蛋白還可以包埋在通過例如凝聚(coacervat1n)技術或通過界面聚合制備的微膠囊中，例如分別為羥甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚(甲基異丁烯酸)微膠囊，包含在膠狀藥物輸送系統(例如脂質體、白蛋白微球、微乳、納米顆粒和納米膠囊)中，或包含在大乳狀液中(macroemuls1n)。這些技術在Remington’s PharmaceuticalSciences 第 16 版、Osol、Α.編輯(1980)中有公開。
            
[0252]用于體內施用的制劑必須無菌。這可以通過過濾通過無菌濾膜容易地實現。
            
[0253]可以制備緩釋制備物。緩釋制備物的合適實例包括含有本文中所述基于纖連蛋白的支架蛋白的固體疏水聚合物半滲透性基質，該基質呈成形制品(shaped article)的形式，例如薄膜、或微膠囊。緩釋基質的實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-丙烯酸甲酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美國專利N0.3，773，919)、L-谷氨酸和Y -乙基-L-谷氨酸酯共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、可降解的乳酸-甘醇酸共聚物如LUPRONDEPOT?(由乳酸-甘醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構成的可注射微球)，和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。盡管聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯共聚物和乳酸-甘醇酸共聚物能夠釋放分子100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白的時間較短。當被包埋的蛋白質長時間保持在體內時，它們可能由于暴露于37°C的濕氣而變性或聚集，導致生物活性喪失以及可能的免疫原性改變。可以根據所涉及的機理設計出用于穩定化的合理策略。例如，如果發現聚集機理是由于巰基-二硫化物交換導致的分子內S-S鍵形成，則可以通過修飾巰基殘基、從酸性溶液凍干、控制水分含量、使用合適的添加劑和開發特定的聚合物機制組合物，來實現穩定化。
            
[0254]盡管技術人員會理解，每種基于纖連蛋白的支架蛋白的劑量取決于蛋白的同一性，但是優選的劑量范圍是大約10mg/m2-大約2000mg/m2,更優選地，大約50mg/m2-大約1000mg/m2。
            
[0255]對于治療性應用，基于纖連蛋白的支架蛋白以可藥用的劑量形式施用給受試者。它們可以通過單次或在一段時間內連續輸注靜脈施用，通過肌肉內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內，口服，外用，或吸入途徑。蛋白還可以通過腫瘤內、腫瘤周圍、病灶內或病灶周圍途徑施用，發揮局部以及系統治療效果。合適的可藥用的載體、稀釋劑、賦形劑是眾所周知的，可以由本領域技術人員根據臨床狀況要求加以確定。合適的載體、稀釋劑和/或賦形劑的實例包括:⑴杜氏磷酸鹽緩沖液，pH大約7.4,含有大約lmg/ml-25mg/ml人血清白蛋白，
            
(2)0.9%生理鹽水(0.9% w/v NaCl),和(3) 5% (w/v)葡萄糖(dextrose)。本發明的方法可以在體外、體內或離體實施。
            
[0256]可以實施基于纖連蛋白的支架蛋白和一種或多種額外治療劑的施用，無論是共同施用還是序貫施用，如上文關于治療性應用所述。技術人員會理解，用于共同施用的合適的可藥用的載體、稀釋劑和賦形劑取決于所共同施用的特定治療劑的同一性。
            
[0257]當以水性劑型而非凍干狀態存在時，基于纖連蛋白的支架蛋白通常以大約0.1mg/ml-10mg/ml的濃度配制，盡管這些范圍之外的寬泛變化也是允許的。對于疾病的治療，基于纖連蛋白的支架蛋白的合適劑量取決于所治療的疾病類型，疾病的嚴重程度和進程，基于纖連蛋白的支架蛋白的施用是出于預防還是治療目的，先前治療的過程，患者的病史和對基于纖連蛋白的支架蛋白的應答，和主治醫生的決定。基于纖連蛋白的支架蛋白可以一次性或通過一系列治療適當地施用給患者。
            
[0258]基于纖連蛋白的支架蛋白還可以用作結晶伴侶(crystallizat1n chaperone),形成蛋白與感興趣化合物的結構。例如，特異性結合人孕烷X受體(PXR)的基于纖連蛋白的支架蛋白可以用作結晶伴侶，以方便化合物與PXR，例如PXR的配體結合結構域(LBD) —起結晶。本文中描述了數種可結合人PXR的uiFr^分子。
            
[0259]PXR活化會上調多種藥物代謝酶，例如細胞色素P450酶和MDRl的細胞水平。CYP酶表達的提高會改變藥物的藥代動力學，并導致危險的藥物-藥物相互作用，包括治療效力喪失和毒性增加。為了避免晚期臨床失敗和伴隨新藥上市的高昂成本，許多藥物公司采用了篩選測定，用于早期檢測可激活PXR的化合物。此外，使用PXR的已知晶體結構進行的計算篩選也越來越多地被用于預測潛在的PXR活性。PXR具有大而柔性的配體結合口袋，而且這些化合物有可能在PXR配體結合空穴內以多個取向結合不同位置，這些都使得對PXR活性的可靠預測變得復雜。特別是對于對預期的治療靶標具有期望的效力、選擇性和生物利用度的更高級的化合物/化學型(chemotype)而言，更是如此。考慮到這些限制，經常需要共結晶結構，以界定精確的結合相互作用，和提示能夠干擾與PXR結合有關的關鍵相互作用同時保持針對主要靶標的活性的特定修飾。例如，在某些實施方案中，用于分析測試劑與PXR相互作用的方法包括，將(i)PXR或其配體結合結構域；(ii)測試劑和(iii)與PXR，例如PXR LBD，特異性結合的kiFM蛋白，在適合于結晶的條件下共同溫育。特異性結合PXRLBD的1QFn3蛋白的實例包含與SEQ ID NOs:48,49和62-69和72的其中一個具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在某些實施方案中，特異性結合PXR LBD的1QFn3蛋白包含與SEQ ID NO:48、49和62-69和72中的任一個相差最多1、2、3、5、
            
10、15、 20或25個氨基酸變化，例如取代(例如保守取代)、添加或缺失的氨基酸序列。該方法可進一步包括誘導結晶，并確定測試劑的哪些部分(或原子)與PXR(—般是PXR的配體結合結構域)相互作用，和任選地對測試劑進行修飾，使其不再與PXR相互作用或以更低的親和力與PXR相互作用。
            
[0260]序列
            
[0261]野牛型MFn3序列:
            
[0262]WT10Fn3 結構域
            
[0263]VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:1)
            
[0264]WT10Fn3結構域核心序列版本I
            
[0265]LEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINY(SEQ ID NO:2)
            
[0266]具有D80E取代的WT1QFn3結構域
            
[0267]VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGESPASSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:59)
            
[0268]WT10Fn3結構域核心序列版本2
            
[0269]EWAATPTSLLISTOAPA VTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO:60)
            
[0270]WT10Fn3結構域核心序列版本3
            
[0271]VSDVPRDLEVVAA (X)..LLISff(X)..YRITY(X)...FTV (X)..ATISGL(X).,YTITVYA(X)JSINYRT (SEQ ID NO:22) 
            
[0272]WT10Fn3結構域核心序列版本4
            
[0273]VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO:6)
            
[0274]DLL4結合件WS-LIl結合子:
            
[0275]MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGEQHSKYPHQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTIQPQDPEQDYQYHYYETSSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:3)
            
[0276]MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGEHVADHFDHNQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTYQFQDPEEHYYYHFYDSSSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:4)
            
[0277]MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGEYHEHYHSPGFSQKYHYEQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGHKHYHYYYYYHHHSSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:5)
            
[0278]N-端延長序列實例:
            
[0279]MGVSDVPRDL(SEQ ID NO:9)
            
[0280]VSDVPRDL(SEQ ID NO:10)
            
[0281 ] GVSDVPRDL(SEQ ID NO: 11)
            
[0282]XnSDVPRDL,其中n = 0、I或2個氨基酸，其中當n = I時，X是Met或Gly，當η =2 時，X 是 Met-Gly (SEQ ID NO: 16)
            
[0283]XnDVPRDL,其中η = 0、1或2個氨基酸,其中當η = I時，X是Met或Gly,當η =2 時，X 是 Met-Gly (SEQ ID NO: 17)
            
[0284]XnVPRDL,其中η = O、I或2個氨基酸,其中當η = I時，X是Met或Gly,當η = 2時，X 是 Met-Gly (SEQ ID NO: 18)
            
[0285]XnPRDL,其中η = 0、1或2個氨基酸,其中當η = I時，X是Met或Gly,當η = 2時，X 是 Met-Gly (SEQ ID NO: 19)
            
[0286]XnRDL,其中η = 0、1或2個氨基酸,其中當η = I時,X是Met或Gly,當η = 2時，X 是 Met-Gly (SEQ ID NO: 20)
            
[0287]XnDL,其中η = 0、1或2個氨基酸,其中當η = I時,X是Met或Gly,當η = 2時，X 是 Met-Gly (SEQ ID NO: 21)
            
[0288]MASTSG (SEQ ID NO: 50)
            
[0289]C-端尾巴序列實例:
            
[0290]EIEK (SEQ ID NO:7)
            
[0291]EIEKPC (SEQ ID NO:8)
            
[0292]EGSGC (SEQ ID NO:23)
            
[0293]EIEKPCQ (SEQ ID NO: 24)
            
[0294]EIEKPSQ (SEQ ID NO: 25)
            
[0295]EIEKP (SEQ ID NO:26)
            
[0296]EIEKPS (SEQ ID NO: 27)
            
[0297]EGSGS (SEQ ID NO:28)
            
[0298]EIDK (SEQ ID NO:29)
            
[0299]EIDKPSQ (SEQ ID NO: 30) 
            
[0300]EIDKPCQ(SEQ ID NO:31)
            
[0301]接頭序列實例:
            
[0302]PSTSTST (SEQ ID NO: 32)
            
[0303]GPG (SEQ ID NO:33)
            
[0304]GPGPGPG (SEQ ID NO: 34)
            
[0305]GPGPGPGPGPG (SEQ ID NO: 35)
            
[0306]PAPAPA (SEQ ID NO: 36)
            
[0307]PAPAPAPAPAPA (SEQ ID NO: 37)
            
[0308]PAPAPAPAPAPAPAPAPA (SEQ ID NO: 38)
            
[0309]GSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 39)
            
[0310]GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 40)
            
[0311]GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:41)
            
[0312]GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:42)
            
[0313]GGGGSGGGGSGGGSG(SEQ ID NO:43)
            
[0314]6Xhis 標簽:
            
[0315]HHHHHH (SEQ ID NO: 44)
            
[0316]IL-17 結合 WS-LII 結合子:
            
[0317]MGYSDYPRDLEVVAATPTSLLISffDAPAVTYRYYRITYGEYHAFFASNGKYYFYIQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTDDTVHHGDSNYHSSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:45)
            
[0318]MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISffDAPAVTVRYYRITYGEYSSFFQHQGQYYHYIQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTQHEHSQDSSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:46)
            
[0319]MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISffDAPAVTVRYYRITYGEFSQFVHSDGEYYQEYQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGQYDQDDEPSSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:47)
            
[0320]PXR結合WSl結合子:
            
[0321]MASTSGYSDYPRDLEYVAATPTSLLISffDAPAVPVSKYYIYYffPGALISSMQAFKVPGSKSTATISGLKPGVLYSIVVDALTGDGQGSYVffDPITITYRTEGSGS(SEQ ID NO:48)
            
[0322]MASTSGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISffDAPAVTVHSYYITYQELQHHSVPQGFQVPGSKSTATISGLKPGVAYQIAVYAFTGPGLPPSDAPPIVIYYRTEGSGS(SEQ ID NO:49)
            
[0323]圖4的1^!^環和支架區狀:
            
[0324]PTSLLISffDAPAVTVRYYRITYG(SEQ ID NO:58)
            
[0325]PVQEFTVPGSKSTATISGLK(SEQ ID NO:51)
            
[0326]TITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO:52)
            
[0327]MGEVVAATPTSLLIS(SEQ ID NO:53)
            
[0328]PHFPTRYYRITYGETGGNS(SEQ ID NO:54)
            
[0329]實施例2的BC環序列:
            
[0330]PTSLLISffDAPAVTVRYYRITYG(SEQ ID NO:55)
            
[0331]PTSLLISffSARLKVARYYRITYG(SEQ ID NO:56)
            
[0332]PTSLLISffRHPHFPTRYYRITYG(SEQ ID NO:57)
            
[0333]IGF-1R結合具有經討修飾的BC、DE和FG環的MFn3結構域:
            
[0334]GVSDVPRDLEVVAA TPTSLLISffSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:61)
            
[0335]PXR結合性1QFn3分子:
            
[0336]圖10 的 Adnectinl-8 的氨基酸序列分別對應于 SEQ ID N0s:70、71、62、63、72、13、14和15。圖10的無6xHis尾巴的Adnectinl-8的氨基酸序列分別對應于SEQ ID NOs:64、65、48、49、66、67、68 和 69。
            
實施例
            
[0337]下面通過參考下面的實施例對本發明進行說明，它們只是舉例，并不意圖對本發明構成限制。盡管已經通過參照本發明的特定實施方案對本發明進行了詳細說明，但是本領域技術人員在不背離本發明精神和范圍的前提下顯然能夠想到各種變化和修改。
            
[0338]實施例1.基于纖連蛋白的支架蛋白的表達和純化
            
[0339]將選定的結合子克隆到PET9d載體中，并轉化大腸桿菌BL21DE3plysS細胞。將被轉化的細胞以24孔形式接種在含有50 μ g/mL卡那霉素和34 μ g/ml氯霉素的5ml LB培養基中，并37°C過夜培養(接種培養)。通過將200 μ I接種培養物吸取到含有50 μ g/mL卡那霉素和34 μ g/ml氯霉素的5ml(以24-孔形式)TB-過夜表達培養基(自誘導)中，建立生產培養。培養物在37°C培育4小時，此時將溫度降低到18°C，并培育20小時。通過40C 2750g離心10分鐘收集培養物。
            
[0340]通過將細胞離心沉淀(24-孔形式)混懸在450 μ I裂解緩沖液(50mM NaH2P04、0.5MNaCl、Ix Complete? 蛋白酶抑制劑雞尾酒-無 EDTA(Roche)、ImM PMSF, 1mM CHAPS,40mM 咪唑、lmg/ml溶菌酶、30 μ g/ml DNA酶、2 μ g/ml抑肽酶、ρΗ8.0)中，并在室溫振蕩1-3小時，裂解細胞。將裂解物澄清并通過轉移到安裝有96孔、1.2ml收集板(catch plate)的96孔Whatman GF/D過濾器中并在正壓下過濾,將其重新分配(re-racked)成96孔格式。將經過澄清的裂解物轉移到先前已經用平衡緩沖液(50mM NaH2P04、0.5M NaCl、40mM咪唑、pH8.0)平衡的96孔HisPur Cobalt板上,并溫育5min。通過正壓力除去未結合的材料。樹脂用清洗緩沖液 #1 (50mM NaH2PO4^0.5M NaCl、5mM CHAPS,40mM 咪唑、ρΗ8.0)以 2x0.3ml/ 孔進行清洗，每次通過正壓力除去清洗液。在洗脫之前，用50 μ I洗脫緩沖液(PBS+20mM EDTA)清洗每個孔，溫育5min，通過正壓力棄去該清洗液。通過向每孔添加額外的100μ I洗脫緩沖液洗脫蛋白。在室溫下溫育30分鐘之后，將板以200g離心5分鐘，將被洗脫的蛋白收集在96孔收集板中，在洗脫前向洗脫收集板的底部添加5μ 10.5Μ MgCl2。用總蛋白測定法對被洗脫的蛋白進行定量，以SGE作為蛋白標準。SGE是一種野生型kiFM結構域，其中FG環的RGD序列被改變為SGE。
            
[0341]實施例2.10Fn3結構域多肽免疫原性的表征
            
[0342]過繼性免疫應答是抗原呈遞細胞(APC)，如樹突細胞，對內化的蛋白進行加工和消化而觸發的。APC將被內化的蛋白切割成短肽，然后將多肽展示在其表面MHC II類分子上。MHC II類分子的肽結合位點長而窄，類似熱狗面包(hot-dog bun)，并以使其肽保持延伸的形態，在主結合位點里有可容納9個氨基酸的空間(一般可允許肽的任一側有短尾巴)IHC結合位點中的某些口袋是確定肽結合的決定子。這些口袋對應于9聚體肽的被錨定部分中的氨基酸位置1、4、6和9。在這四個位置中的每一個處具有有利側鏈的肽一般可以良好地與HLA(—種MHC II類分子)結合。
            
[0343]位置I被認為是參與肽與HLA分子間結合的最重要的“錨殘基”。位置I 一般喜好疏水側鏈——因此通常結合HLA的9聚體以V、1、L、M、F、Y、或W起始。其它位置的可變性則高得多，不同的HLA等位片段在每個位點有利于不同系列的氨基酸。本文中所述多肽的免疫原性同時用體外和計算機方法進行評估。
            
[0344]A-人白細胞抗原(“HLA”)結合的體外測定
            
[0345]在本實驗中，在HLA結合測定中評估合成肽，這些合成肽對應于野生型wFM結構域序列或工程化wFnS結構域序列中的不同區域。類似的HLA結合測定在Reijonen H,Kwokffff, Use of HLA class II tetramers in tracking antigen-specific T cells and mappingT-cell epitopes,Methods29 (3):282-8(2003)中有描述。該HLA結合測定中所測試的每一個實驗肽或是野生型kiFM結構域北極環(BC、DE或FG環)肽片段，其在每個環的N和C端兩側具有額外的氨基酸(SEQ IDN0s:58、51和52);或是來自野生型1QFn3結構域的位于BC環的N端一側的支架區肽片段(SEQ ID NO:53);或是來自工程化uiFr^結構域的位于BC環的C端一側的支架區肽片段(SEQ ID NO: 54)。將各實驗肽以測定期望濃度的50倍溶解于100% DMSO中。然后將每個肽在反應緩沖液中稀釋，并從128 μ M到2 μ M順序滴定。
            
[0346]在HLA結合測定中，將5種不同HLA等位體分子(DRB*0101 ；DRB*0301 ；DRB*0401 ；DRB*0701或DRB*1501等位片段)分別與未標記的實驗肽及銪標記的對照(競爭)肽一起分施到96孔板的孔中。將該結合混合物在孔中溫育24小時以達到穩定平衡。然后，將HLA分子復合物捕獲在包被有抗-人HLA-DR抗體的ELISA平板上。通過時間解析熒光來測量結合的HLA-標記的對照肽,并通過Wallac Victor3?單元(Perkin-Elmer)在615nm進行評估。實驗肽的結合用被標記的對照肽的百分比抑制(實驗熒光/對照熒光乘以100)表示。從每個濃度下的被標記對照肽的百分比抑制，為每個實驗肽求出針對測試的5種等位體的IC5tl曲線。這些實驗的結果如圖4所示。
            
[0347]如圖4所示，發現BC環肽發現與5種測試等位體中的4種高親和力結合，提示它是蛋白內的免疫顯性序列。相比之下，對應于DE和FG環的合成肽一般結合更少的HLA等位體，并且親和力更低。因此，預測DE和FG環不是野生型wFM結構域中的免疫顯性序列。
            
[0348]如圖4所示，SEQ ID NO: 53的支架區肽被發現以高親和力結合5種HLA等位體，而SEQ ID NO: 54的支架區肽被發現以高親和力結合其中4種HLA等位體。這些結果提示，kiFM結構域的BC環兩側的支架區是免疫顯性區。圖4所示的SEQ ID NO: 53和54序列的下劃線部分被預測是這些序列的免疫顯性部分。
            
[0349]對于被發現是免疫顯性環的BC環，用相同的HLA結合測定進行了進一步評估。具體地說，使用該測定對三種BC環序列變體肽(SEQ ID NO:55-57)進行檢驗，并發現它們顯示幾乎相同的對所測試的HLA等位體的強結合模式。SEQ ID NO:55的肽序列是人野生型序列，SEQ ID NO: 56和57是來自經工程化而結合兩種不同靶的wFM結構域的BC環區。在假定相似的結合模式反映共同的基序的條件下，對序列進行比對以幫助鑒定潛在的錨定殘基。所測試的不同BC環序列的潛在位置I殘基用下劃線標示:
            
[0350]15 23 30 (基于 SEQ ID NO:1 的位置序列)
            
[0351]I I
            
[0352]PTSLLISff DAPAVTV RYYRITYG (SEQ ID NO: 55)
            
[0353]PTSLLISff SARLKVA RYYRITYG (SEQ ID NO: 56)
            
[0354]PTSLLISff RHPHFPT RYYRITYG (SEQ ID NO: 57)
            
[0355]這三種肽的共有序列部分是可變BC環前面的鏈B、以及BC環后面的β-鏈C。這些部分的每一個均具有數個疏水殘基(潛在的位置I錨定子)，但是β-鏈C中的那些疏水殘基的后面沒有跟隨至少8個額外殘基，因此不可能是MHC結合的錨定殘基。可變BC環中的疏水殘基在這三種肽中的位置不同，可見具有共同的β -鏈C殘基的單一 9聚體位置不大可能被錨定在BC環內。因此，這些結果提示，β_鏈B對于設計肽錨定子應該是有用的。
            
[0356]錨定殘基最可能的位置似乎是“LLI” (SEQ ID NO:1的位置18-20)，因為它們包含一段位于BC環殘基之前的固定的β-鏈B殘基。如果，例如，是由起始于第一個L的9聚體來錨定肽，則第四個位置總是S，這有利于結合許多HLA等位體。
            
[0357]應當注意，盡管許多完整人序列被MHC展示，但是免疫系統將它們識別為“自身”，不會啟動免疫應答。此外，在具有相同的kiFM序列的食蟹猴中施用各種不同kiFM多肽時會產生免疫應答，但是在施用野生型kiFM時卻不會產生免疫應答。這表明，食蟹猴將人野生型kiFM序列識別為“自身”蛋白，因此不會啟動對它們的免疫應答。
            
[0358]B - HLA結合的計算機預測
            
[0359]HLA結合可以在計算機上進行預測，例如使用EpiMatrix進行預測。EpiMatrix是由EpiVax開發的一種有權利保護的計算算法，其用于篩選蛋白序列中是否存在假定的HLA結合基序。輸入序列被解析(parse)成多個重疊的9聚體框,每一個框與前一個框有8個氨基酸重疊。然后對每一個所得的框對一組8種共有II類HLA等位體(DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101、DRB1*1301、和 DRB1*1501)的預測結合親和力進行打分。將原始分數相對于隨機生成肽的大樣本的得分進行標準化。報告所得的“Z”得分。任何EpiMatrix Z-得分超過1.64的9聚體肽被認為是推定的HLA結合基序。
            
[0360] 用EpiMatrix算法對來自具有SEQ ID N0:61記載的氨基酸序列的1QFn3多肽的肽表位進行預測。結果顯示，10Fn3多肽的BC、DE和FG環的Z-得分分別為21.3,0.9和1.1。
            
[0361]上面的體外和計算機HLA結合結果提示，β -鏈B/BC環片段可能是對HLA結合而言的“熱點”。β -鏈B/BC環片段可能通過β -鏈B中的氨基酸強烈地錨定于MHC分子，以致于BC環序列中的至少某些變異體對與HLA的結合幾乎沒有影響。強錨定可能使得該片段難以被脫免疫。然而，如果整個序列段都是野生型序列，則應當會被免疫系統識別為自身，從而不會引發免疫應答。因此，通過將BC環保留為野生型，或至少將SEQ ID NO:1或6的D23-T28的殘基保留為野生型，以使得被錨定在L18、L19、或120處的任何9聚體肽保持為野生型，可以設計出具有降低的免疫原性的kiFM結構域多肽文庫。圖9A顯示了其中全部或大部分BC環被保留為野生型的文庫的實例。圖9B顯示了 BC環N端區的不同部分被保留為野生型的文庫的實例。實施例3中提供了對應于SEQ ID NO:1的D23-T28的殘基被保留為野生型的kiFM結合子的具體實例。或者，如果BC環被修飾，則可以通過在BC環中的修飾的基礎上進一步破壞該區域中的強錨定子，即在β -鏈B中進行修飾，來實現免疫原性的降低。錨定子被除去的文庫的實例包括如下文庫，其中位置L19和/或S21已經被多樣化，藉此增加文庫成員缺失錨定子殘基的可能性。圖9C顯示了其中錨定殘基被除去的文庫的實例。
            
[0362]實施例3.西側(West Side)結合子的產生
            
[0363]使用mRNA展示法(Xu et al ChemB1l.2002Aug ；9(8): 933-42)篩選含有經過修飾的kiFM結構域的西側(West Side) ( “WS”)結合子多肽的文庫，檢驗是否與作為靶標的鼠IL-17、鼠DLL4或人PXR結合。WS結合子設計成保留BC環序列為野生型。使用WSl文庫設計(見圖9A)鑒定與靶標人PXR的結合子，使用WS-LIl文庫設計(見圖9A)鑒定與靶標鼠IL-17或鼠DLL4的結合子。靶標結合通過qPCR進行監測，當觀察到特異性結合信號時，對群體進行克隆并在大腸桿菌中進行表達。
            
[0364]實施例4.能夠結合鼠DLL4的WS-LI1結合子破壞DLL4與Notchl的相互作用
            
[0365]DLL4是Notchl蛋白的配體。采用競爭性Biacore實驗，評估了具有WS-LI1設計的1QFn3多肽破壞Notchl與鼠DLL4之間相互作用的能力。將大約4500RU的Notchl-Fc固定在CM5Biacore芯片上。在HBSP緩沖液和5mM CaCl2中，將2 μ M WS-LIl結合子用20ηΜ鼠DLL4平衡，同時對照中不添加WS-LIl多肽。使每一個樣品流過芯片，并將鼠DLL4的結合與沒有添加WS-LIl多肽的對照進行比較，信號的減少對應于Notchl:鼠DLL4相互作用的抑制。在每兩次樣品運行之間，通過用HBSP ρΗ7.4和50mM EDTA進行2次30秒清洗對芯片進行再生。該實驗的結果如圖5所示。發現具有SEQ ID N0:3和4序列的多肽分別導致對Notchl與鼠DLL4之間相互作用的100%競爭。具有SEQ ID NO: 5序列的多肽能夠誘發對Notchl與鼠DLL4之間相互作用的75%競爭。
            
[0366]實施例5.能夠結合鼠DLL4的WS-LIl結合子的大小排阻色譜分析
            
[0367]利用大小排阻色譜來展示實施例4中觀察到的競爭結果是由于所測試的WS-LIl結合子的單體形式所致。具有SEQ ID N0:3或4氨基酸序列的WS-LIl結合子主要是單體，而具有SEQ ID NO: 5氨基酸序列的WS-LIl結合子含有單體蛋白和聚集體蛋白的混合物。該實驗結果如圖6所示，其表明實施例4中測試的WS-LIl結合子作為單體種類發揮作用，這提示這些結合子作為穩定的、良好折疊的多肽存在。
            
[0368]實施例6.能夠結合鼠DLL4的WS-LIl結合子的穩定性
            
[0369]通過基于熒光的熱遷移測定(TSF)評估實施例4所述多肽的穩定性。具有SEQ IDNO: 3氨基酸序列的多肽在59°C有躍遷。具有SEQ ID NO:4氨基酸序列的多肽在49°C有躍遷。具有SEQ ID NO:5氨基酸序列的多肽沒有觀察到躍遷。
            
[0370]實施例7.通過能夠結合鼠IL-17的WS-LI1結合子破壞鼠IL-17與鼠IL-17RA之間的相互作用
            
[0371]IL-17是IL-17受體A蛋白IL-17RA的配體。通過采用競爭性Alphascreen實驗對具有WS-LIl設計的uiFr^結構域破壞鼠IL-17和鼠IL-17RA之間相互作用的能力進行評估。根據制造商的使用說明書混合鏈霉親和素供體珠子、抗-人IgG受體珠子、1.5nM鼠IL-17RA-FC和2.5nM生物素化的鼠IL-17，以便給出強烈的Alphascreen信號。考察了具有SEQ ID N0:45、46或47的序列的多肽當以I μ M濃度加入到該混合物中時抑制該信號的能力。具有SEQ ID NO:45的序列的多肽導致83%的Alphascreen信號抑制，具有SEQ IDNO: 46的序列的多肽導致94 %的Alphascreen信號抑制，具有SEQ ID NO: 47的序列的多肽導致81%的Alphascreen信號抑制。這些結果證明，WS-LIl文庫設計產生了能夠結合IL-17并可有效抑制IL-17與其受體之間相互作用的kiFM結構域。
            
[0372]實施例8.能夠結合鼠IL-17的WS-LIl結合子的大小排阻色譜分析
            
[0373]使用大小排阻色譜展示實施例7中觀察到的競爭結果是由于所測試的WS-LIl結合子的單體形式所致的。具有SEQ ID Ν0:45、46或47氨基酸序列的WS-LIl結合子主要是單體。該實驗結果如圖7所示，其表明，實施例7中測試的WS-LIl結合子以單體種類發揮作用，提示這些結合子以穩定的、良好折疊的多肽的形式存在。
            
[0374]實施例9. 能夠結合鼠IL-17的WS-LIl結合子的穩定性
            
[0375]通過TSF評估實施例7所述多肽的穩定性。具有SEQ ID NO:45氨基酸序列的多肽在51 °C有躍遷。具有SEQ ID NO:46氨基酸序列的多肽在60°C有躍遷。具有SEQ ID NO:47氨基酸序列的多肽沒有觀察到躍遷。
            
[0376]實施例10.能夠結合人PXR的WSl結合子的結合性質表征
            
[0377]用Biacore結合測定和帶GST標簽的PXR對能夠結合PXR的WSl結合子進行表征。將14000RU的抗-GST抗體固定在Biacore芯片上，通過使50nM溶液以5 μ L/min的速度流過芯片3分鐘來捕獲GST-PXR。使WSl結合子以0.5-2 μ M濃度流過芯片，觀察相對于缺少PXR的對照的結合。每兩次運行之間，用1mM甘氨酸、ρΗ2.0進行2次30秒清洗，對芯片進行剝離(stripped)，并捕獲新鮮的GST-PXR。在這些條件下，146RU的具有SEQ ID NO:48氨基酸序列的WSl結合子結合了 GST-PXR，而81RU的具有SEQ ID NO:49氨基酸序列的WSl結合子結合了 GST-PXR。這些結果證明，具有SEQ ID NO:48或49氨基酸序列的WSl結合子能夠結合GST-PXR。
            
[0378]實施例11.能夠結合人PXR的WSl結合子的大小排阻色譜分析
            
[0379]使用大小排阻色譜來展示實施例10中觀察到的競爭結果是由于所測試的WSl結合子的單體形式導致的。具有SEQ ID N0:48或49氨基酸序列的WSl結合子主要是單體。該實驗結果如圖8所示，其表明，實施例10中測試的WSl結合子以單體種類發揮作用，提示這些結合子作為穩定的、良好折疊的多肽存在。
            
[0380]實施例12.結合人PXR的wFM多肽的序列和結合特征
            
[0381]本實施例描述6種其他的可結合人PXR配體結合結構域(LBD)的uiFr^多肽。還提供了這6種多肽以及兩種在實施例10中描述的多肽(具有SEQ ID NO:48和49)的結合特征。
            
[0382]通過篩選各種文庫鑒定了具有圖10中記載的氨基酸序列的kiFM多肽。例如，從NPl文庫分離的Adnectin-1 (見圖9C)。kiFM多肽的合成如下。將編碼kiFM多肽的核酸克隆在pET9D載體中，然后在20°C下在大腸桿菌中表達。裂解物用N1-瓊脂糖親和色譜進行一步純化。
            
[0383]如下所述在Biacore TlOO裝置(GEHealthcare)上進行表面等離子體共振(SPR)來確定1QFn3多肽的Kd值:在固定有抗-GST抗體(GE Healthcare)的芯片上捕獲人PXR-GST(Invitrogen)，在人PXR-GST上注射系列濃度的kiFM多肽，各動力學循環之間用1mM甘氨酸、pH2再生芯片表面。二者的動力學參數用Biacore TlOO軟件計算。結果如表I所示。
            
[0384]表1:Adnectin_l—Adnectin-8 與人 PXR 的結合特征
            
[0385]
            
【權利要求】
            
1.一種包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域的多肽，其中所述kiFM結構域包含(i)相對于野生型人1QFn3結構域(SEQ ID NO:1)的相應環，在從BC、DE和FG環中選出的至少一個北極環的氨基酸序列中的修飾，和Qi)相對于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環，在從AB、CD和EF環中選出的至少一個南極環的氨基酸序列中的修飾，其中該至少一個被修飾的北極環和至少一個被修飾的南極環貢獻于對相同靶標的結合。
            
2.權利要求1的多肽，其中至少一個北極環或至少一個南極環具有野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的氨基酸序列。
            
3.權利要求1的多肽，其中所述BC環的至少一部分具有野生型人uiFr^結構域(SEQIDNO:1或6)的相應環的氨基酸序列。
            
4.權利要求3的多肽，其中所述BC環的最先3個殘基與野生型人uiFr^結構域(SEQIDNO:1或6)的BC環中的相應殘基相同。
            
5.權利要求3的多肽，其中所述BC環的最先4個殘基與野生型人uiFr^結構域(SEQIDNO:1或6)的BC環中的相應殘基相同。
            
6.權利要求3的多肽，其中所述BC環的最先5個殘基與野生型人uiFr^結構域(SEQIDNO:1或6)的BC環中的相應殘基相同。
            
7.權利要求3的多肽，其中所述BC環具有野生型人1QFn3結構域(SEQID NO:1或6)的相應環的氨基酸序列。
            
8.權利要求3-7中任一項的多肽，其中相對于在BC環中具有額外修飾的等價多肽，該多肽具有降低的免疫原性。
            
9.權利要求1-8中任一項的多肽，其中所述FG環不含有RGD整聯蛋白結合位點。
            
10.權利要求1-9中任一項的多肽，其中至少一個β-鏈的氨基酸序列相對于野生型人10Fn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應β -鏈的氨基酸序列被修飾。
            
11.權利要求10的多肽，其中在所述kiFM結構域的線性序列中所述被修飾的β-鏈位于所述被修飾的環之一的鄰近。
            
12.權利要求10的多肽，其中在所述kiFM結構域的線性序列中所述被修飾的β-鏈位于所述被修飾的北極環和所述被修飾的南極環之間。
            
13.權利要求10-12中任一項的多肽，其中在所述uiFr^結構域的線性序列中所述被修飾的北極環、所述被修飾的β-鏈和所述被修飾的南極環彼此鄰近。
            
14.權利要求10-13中任一項的多肽，其中所述被修飾的β-鏈貢獻于對靶標的結合。
            
15.權利要求1-13中任一項的多肽，其中疏水核心殘基相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)沒有被修飾。
            
16.權利要求1-15中任一項的多肽，其中至少一個被修飾的環的氨基酸序列相對于野生型人wFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的氨基酸序列長度已延長。
            
17.權利要求1-16中任一項的多肽，其中至少一個被修飾的環的氨基酸序列相對于野生型人wFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的氨基酸序列長度已縮短。
            
18.權利要求1-17中任一項的多肽，其中C端尾巴的氨基酸序列相對于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的C端尾巴的氨基酸序列被修飾。
            
19.權利要求1-18中任一項的多肽，其中最先7個氨基酸殘基的氨基酸序列相對于野生型人wFnS結構域(SEQ ID NO:1或6)的最先7個氨基酸殘基的氨基酸序列被修飾。
            
20.權利要求1-17中任一項的多肽，其中該多肽相對于野生型人uiFr^結構域(SEQIDNO:1)從N端截短了 1-7個氨基酸，或相對于野生型人wFM結構域(SEQ ID NO:1或6)從C端截短了 1-9個氨基酸，或二者均有。
            
21.權利要求1-20中任一項的多肽，其中該多肽與野生型人uiFr^結構域(SEQID NO:1或6)的氨基酸序列具有至少50%同一性。
            
22.權利要求1-21中任一項的多肽，其中該多肽與野生型人uiFr^結構域(SEQID NO:1或6)的氨基酸序列具有至少65%同一'丨生。
            
23.一種文庫，其含有多個包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域的多肽，其中所述kiFM結構域包含⑴相對于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1)的相應環，在從BC、DE和FG環中選出的至少一個北極環的氨基酸序列的修飾，和(ii)相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環，在從AB、⑶和EF環中選出的至少一個南極環的氨基酸序列中的修飾。
            
24.權利要求23的文庫，其中該文庫包含至少15個多肽，每一個多肽含有不同的kiFM結構域序列。
            
25.一種用于鑒定結合靶標的多肽的方法，包括篩選權利要求23或24的文庫以鑒定結合該靶標的多肽。
            
26.分離的多肽，其是通過權利要求25的方法鑒定的。
            
27.權利要求26的分離的多肽，其中該多肽以小于500nM的Kd與靶標結合。
            
28.一種包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域的多肽，其中所述kiFM結構域包含:(i)相對于野生型人1QFn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環，在AB、BC、CD、DE、EF、或FG環中至少一個的氨基酸序列中的修飾，和(ii)相對于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應β-鏈，在至少一個鏈的氨基酸序列中的修飾，其中所述至少一個被修飾的環和所述至少一個被修飾的β-鏈貢獻于對相同靶標的結合。
            
29.權利要求28的多肽，其中在所述kiFM結構域的線性序列中所述被修飾的β-鏈與所述被修飾的環鄰近。
            
30.權利要求28或29的多肽，其中至少兩個β-鏈具有相對于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應β -鏈被修飾的氨基酸序列。
            
31.權利要求30的多肽，其中在所述kiFM結構域線性序列中所述被修飾的β-鏈與所述被修飾的環的每一側鄰近。
            
32.權利要求30或31的多肽，其中所述被修飾的β-鏈均貢獻于對靶標的結合。
            
33.權利要求28-32中任一項的多肽，其中至少兩個環具有相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環被修飾的氨基酸序列。
            
34.權利要求33的多肽，其中至少一個被修飾的環是從BC、DE和FG環中選出的北極環，且至少一個被修飾的環是從ΑΒ、⑶和EF環中選出的南極環。
            
35.權利要求33或34的多肽，其中所述被修飾的環均貢獻于對靶標的結合。
            
36.權利要求28-35中任一項的多肽，其中至少一個北極環或至少一個南極環具有野生型人wFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的氨基酸序列。
            
37.權利要求28-35中任一項的多肽，其中所述BC環的至少一部分具有野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的氨基酸序列。
            
38.權利要求37的多肽，其中所述BC環的最先3個殘基與野生型人kiFM結構域(SEQID NO:1或6)的BC環中的相應殘基相同。
            
39.權利要求37的多肽，其中所述BC環的最先4個殘基與野生型人kiFM結構域(SEQID NO:1或6)的BC環中的相應殘基相同。
            
40.權利要求37的多肽，其中所述BC環的最先5個殘基與野生型人kiFM結構域(SEQID NO:1或6)的BC環中的相應殘基相同。
            
41.權利要求37的多肽，其中所述BC環具有野生型人1QFn3結構域(SEQID NO:1或6)的相應環的氨基酸序列。
            
42.權利要求37-41中任一項的多肽，其中該多肽相對于在BC環中具有額外修飾的等價多肽具有降低的免疫原性。
            
43.權利要求28-42中任一項的多肽，其中所述FG環不含有RGD整聯蛋白結合位點。
            
44.權利要求28-43中任一項的多肽，其中疏水核心殘基相對于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)沒有被修飾。
            
45.權利要求28-44中任一項的多肽，其中至少一個被修飾的環的氨基酸序列相對于野生型人wFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的氨基酸序列長度延長。
            
46.權利要求28-45中任一項的多肽，其中至少一個被修飾的環的氨基酸序列相對于野生型人wFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的氨基酸序列長度縮短。
            
47.權利要求28-46中任一項的多肽，其中C端尾巴的氨基酸序列相對于野生型人10Fn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的C端尾巴的氨基酸序列被修飾。
            
48.權利要求28-47中任一項的多肽，其中最先7個氨基酸殘基的氨基酸序列相對于野生型人wFnS結構域(SEQ ID NO:1或6)的最先7個氨基酸殘基的氨基酸序列被修飾。
            
49.權利要求28-46中任一項的多肽，其中該多肽相對于野生型人kiFM結構域(SEQIDNO:1或6)從N端截短了 1-7個氨基酸，或相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1)從C端截短了 1-9個氨基酸，或者兩者均有。
            
50.權利要求28-49中任一項的多肽，其中該多肽與野生型人uiFr^結構域(SEQIDNO:1或6)的氨基酸序列具有至少50%同一性。
            
51.權利要求28-50中任一項的多肽，其中該多肽與野生型人uiFr^結構域(SEQIDNO:1或6)的氨基酸序列具有至少65%同一性。
            
52.一種文庫，其含有多個包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域的多肽，其中所述10Fn3結構域包含⑴相對于野生型人wFM結構域(SEQ ID NO:1)的相應環，在AB、BCXD、DE、EF、或FG環中至少一個的氨基酸序列中的修飾，和(ii)相對于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應β -鏈，在至少一個β -鏈的氨基酸序列中的修飾。
            
53.權利要求52的文庫，其中所述文庫包含至少15個多肽，每一個多肽含有不同的10Fn3結構域序列。
            
54.一種用于鑒定結合靶標的多肽的方法，包括篩選權利要求52或53的文庫以鑒定結合該靶標的多肽。
            
55.一種分離的多肽，其是通過權利要求54的方法鑒定的。
            
56.權利要求55的分離的多肽，其中該多肽以小于500nM的Kd與靶標結合。
            
57.一種包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域的多肽，其中所述kiFM結構域相對于野生型人wFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的序列在CD和FG環的氨基酸序列中含有修飾，并且其中所述CD和FG環貢獻于對相同靶標的結合。
            
58.權利要求57的多肽，其中相對于野生型人1QFn3結構域(SEQID NO:1或6)的⑶環的序列，⑶環的11個氨基酸中有至少4個被修飾。
            
59.權利要求57或58的多肽，其中⑶環中對應于野生型人1QFn3結構域(SEQID NO:1或6)的氨基酸殘基46或47的一個或多個氨基酸殘基與這些位置處的野生型氨基酸相同。
            
60.權利要求57-59中任一項的多肽，其中相對于野生型人1QFn3結構域(SEQID NO:1或6)的FG環的序列，FG環的13個氨基酸中有至少11個被修飾。
            
61.權利要求60的多肽，其中FG環中對應于野生型人1QFn3結構域(SEQID NO:1或6)的氨基酸殘基75或87的一個或多個氨基酸殘基與這些位置處的野生型氨基酸相同。
            
62.權利要求57-61中任一項的多肽，其中相對于野生型人1QFn3結構域(SEQID NO:1或6)的相應環的氨基酸序列，CD環、FG環或兩者的氨基酸序列的長度延長。
            
63.權利要求57-61中任一項的多肽，其中相對于野生型人1QFn3結構域(SEQID NO:1或6)的相應環的氨基酸序列，CD環、FG環或兩者的氨基酸序列的長度縮短。
            
64.權利要求57-61中任一項的多肽，其中相對于野生型人1QFn3結構域(SEQID NO:1或6)的相應環，CD環和FG環的至少一個的氨基酸序列的長度延長，并且相對于野生型人10Fn3結構域(SEQ ID NO: 1或6)的相應環，⑶環和FG環的至少一個的氨基酸序列的長度縮短。
            
65.權利要求57-64中任一項的多肽，其中β-鏈C和β -鏈D的氨基酸序列相對于野生型人wFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應β -鏈的序列被修飾。
            
66.權利要求57-65中任一項的多肽，其中所述BC環的至少一部分相對于野生型人10Fn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的BC環的序列被修飾。
            
67.權利要求66的多肽，其中所述BC環中對應于野生型人1QFn3結構域(SEQID NO:1或6)的氨基酸殘基30和31的一個或多個氨基酸殘基相對于這些位置處的野生型氨基酸被修飾。
            
68.權利要求57-67中任一項的多肽，其中β-鏈F和β -鏈G的氨基酸序列相對于野生型人wFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應β -鏈的序列被修飾。
            
69.權利要求57-68中任一項的多肽，其中一個或多個所述被修飾的β-鏈貢獻于對靶標的結合。
            
70.權利要求69的多肽，其中所有所述被修飾的β-鏈均貢獻于對靶標的結合。
            
71.權利要求57-70中任一項的多肽，其中AB、DE和EF環中的一個或多個具有野生型人1QFn3結構域(SEQ ID NO:1或6)相應環的氨基酸序列。
            
72.權利要求57-71中任一項的多肽，其中疏水核心殘基相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)沒有被修飾。
            
73.權利要求57-72中任一項的多肽，其中所述BC環的至少一部分具有野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的氨基酸序列。
            
74.權利要求73的多肽，其中所述BC環的最先3個殘基與野生型人kiFM結構域(SEQID NO:1或6)的BC環中的相應殘基相同。
            
75.權利要求73的多肽，其中所述BC環的最先4個殘基與野生型人kiFM結構域(SEQID NO:1或6)的BC環中的相應殘基相同。
            
76.權利要求73的多肽，其中所述BC環的最先5個殘基與野生型人kiFM結構域(SEQID NO:1或6)的BC環中的相應殘基相同。
            
77.權利要求73的多肽，其中所述BC環的最先6個殘基與野生型人kiFM結構域(SEQID NO:1或6)的BC環中的相應殘基相同。
            
78.權利要求73的多肽，其中所述BC環具有野生型人1QFn3結構域(SEQID NO:1或6)的相應環的氨基酸序列。
            
79.權利要求73-78中任一項的多肽，其中該多肽相對于在BC環中具有額外修飾的等價多肽具有降低的免疫原性。
            
80.一種文庫，其含有多個包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域的多肽，其中所述10Fn3結構域相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的序列在⑶和FG環的氨基酸序列中含有修飾。
            
81.權利要求80的文庫，其中該文庫包含至少15個多肽，每一個多肽包含不同的kiFM結構域序列。
            
82.一種用于鑒定結合靶標的多肽的方法，包括篩選權利要求80或81的文庫以鑒定結合該靶標的多肽。
            
83.一種分離的多肽，其是通過權利要求80的方法鑒定的。
            
84.權利要求83的分離的多肽，其中該多肽以小于500nM的Kd與靶標結合。
            
85.一種包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域的多肽，其中相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的序列，所述wFnS結構域在CD和DE環的氨基酸序列中含有修飾，并且其中CD和DE環貢獻于對相同靶標的結合。
            
86.權利要求85的多肽，其中EF環的氨基酸序列相對于野生型人kiFM結構域(SEQIDNO:1或6)的EF環的序列被修飾，并且其中EF環貢獻于對靶標的結合。
            
87.權利要求85或86的多肽，其中β-鏈C、β-鏈D和β-鏈F中一個或多個的氨基酸序列相對于野生型人wFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應β -鏈的序列被修飾。
            
88.權利要求87的多肽，其中一個或多個所述被修飾的β-鏈貢獻于對靶標的結合。
            
89.權利要求85-88中任一項的多肽，其中相對于野生型序列中的相應殘基，在對應于野生型人1QFn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的殘基36至66的氨基酸之間的31個殘基中有至少24個已被修飾。
            
90.權利要求85-89中任一項的多肽，其中相對于野生型人1QFn3結構域(SEQID NO:1或6)的CD環，所述CD環的長度延長或長度縮短。
            
91.權利要求85-90中任一項的多肽，其中疏水核心殘基相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)沒有被修飾。
            
92.權利要求85-91中任一項的多肽，其中所述FG環不含有RGD整聯蛋白結合位點。
            
93.一種文庫，其含有多個包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域的多肽，其中所述10Fn3結構域相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的序列在⑶和DE環的氨基酸序列中含有修飾。
            
94.權利要求93的文庫，其中該文庫包含至少15個多肽，每一個多肽包含不同的kiFM結構域序列。
            
95.一種用于鑒定結合靶標的多肽的方法，包括篩選權利要求93或94的文庫以鑒定結合該靶標的多肽。
            
96.一種分離的多肽，其是通過權利要求95的方法鑒定的。
            
97.權利要求96的分離的多肽，其中該多肽以小于500nM的Kd與靶標結合。
            
98.一種包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域的多肽，其中相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1)的相應環的氨基酸序列，所述1QFn3結構域在EF和FG環的氨基酸序列中包含修飾，并且其中所述EF和FG環貢獻于對相同靶標的結合。
            
99.權利要求98的多肽，其中AB環的氨基酸序列相對于野生型人uiFr^結構域(SEQIDNO:1或6)的AB環的序列被修飾，并且其中AB環貢獻于對靶標的結合。
            
100.權利要求98或99的多肽，其中相對于野生型人$113結構域(SEQID NO:1)的相應β -鏈的序列，β -鏈A和β -鏈G中一個或多個的氨基酸序列被修飾。
            
101.權利要求100的多肽，其中一個或多個所述被修飾的β-鏈貢獻于對靶標的結合。
            
102.權利要求98-101中任一項的多肽，其中最先7個氨基酸的氨基酸序列或對應于野生型人1QFn3結構域(SEQ ID NO:1)殘基93至97的氨基酸的氨基酸序列相對于野生型序列中的相應殘基已被修飾。
            
103.權利要求102的多肽，其中額外的被修飾的氨基酸貢獻于對靶標的結合。
            
104.權利要求98-103中任一項的多肽，其中相對于野生型人uiFr^結構域(SEQIDNO:1或6)中的相應殘基,所述kiFi^結構域的最先15個氨基酸殘基中有至少14個已被修飾。
            
105.權利要求98-104中任一項的多肽，其中相對于野生型人1QFn3結構域(SEQIDNO:1或6)中的相應殘基，所述EF環的5個氨基酸殘基中有至少4個已被修飾。
            
106.權利要求98-105中任一項的多肽，其中相對于野生型序列中的相應殘基，在對應于野生型人wFM結構域(SEQ ID NO:1)殘基80-97的氨基酸之間的18個殘基中有至少15個已被修飾。
            
107.權利要求98-106中任一項的多肽，其中相對于野生型人1QFn3結構域(SEQIDNO:1或6)的FG環，所述FG環的氨基酸序列長度延長或長度縮短。
            
108.權利要求98-107中任一項的多肽，其中疏水核心殘基相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)沒有被修飾。
            
109.權利要求98-108中任一項的多肽，其中所述FG環不含有RGD整聯蛋白結合位點。
            
110.一種文庫，其含有多個包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域的多肽，其中所述10Fn3結構域相對于野生型人1QFn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的序列在EF和FG環的氨基酸序列中含有修飾。
            
111.權利要求110的文庫，其中該文庫包含至少15個多肽，每一個多肽包含不同的10Fn3結構域序列。
            
112.一種用于鑒定結合靶標的多肽的方法，包括篩選權利要求110或111的文庫以鑒定結合該靶標的多肽。
            
113.—種分離的多肽，其是通過權利要求112的方法鑒定的。
            
114.權利要求113的分離的多肽，其中該多肽以小于500nM的Kd與靶標結合。
            
115.一種包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域的多肽，其中相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的氨基酸序列，1QFn3結構域在AB和FG環的氨基酸序列中含有修飾，并且其中AB和FG環貢獻于對相同靶標的結合。
            
116.權利要求115的多肽，其中相對于野生型人uiFr^結構域(SEQID NO:1或6)的相應β -鏈和環的序列，β -鏈Α、環ΑΒ、β -鏈B、環FG和β -鏈G的氨基酸序列含有修飾，并且其中被修飾的環和鏈貢獻于對相同靶標的結合。
            
117.權利要求115或116的多肽，其中相對于野生型序列中的相應殘基，最先7個氨基酸的氨基酸序列或對應于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1)的殘基93-97的氨基酸的氨基酸序列已被修飾。
            
118.權利要求117的多肽，其中額外的被修飾的氨基酸貢獻于對靶標的結合。
            
119.權利要求115-118中任一項的多肽，其中相對于野生型人uiFr^結構域(SEQIDNO:1或6)的AB環，AB環的氨基酸序列的長度延長或長度縮短。
            
120.權利要求115-119中任一項的多肽，其中AB環在對應于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸殘基15和18的氨基酸殘基之間含有插入或缺失。
            
121.權利要求115-120中任一項的多肽，其中相對于野生型人uiFr^結構域(SEQIDNO:1或6)的FG環，FG環的氨基酸序列的長度延長或長度縮短。
            
122.權利要求115 -121中任一項的多肽，其中所述FG環的對應于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)FG環的氨基酸殘基84-87的部分相對于野生型CD環的相同部分具有修飾的氨基酸序列。
            
123.權利要求115-122中任一項的多肽，其中所述FG環在對應于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸殘基83和88的氨基酸殘基之間含有插入或缺失。
            
124.權利要求115-123中任一項的多肽，其中β-鏈B在對應于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸殘基18和20的氨基酸殘基之間含有插入或缺失。
            
125.權利要求115-124中任一項的多肽，其中對應于野生型人uiFr^結構域(SEQIDNO:1或6)的殘基1-19的氨基酸之間的19個殘基中有至少16個相對于野生型序列中的相應殘基已被修飾。
            
126.權利要求115-125中任一項的多肽，其中對應于野生型人uiFr^結構域(SEQIDNO:1或6)殘基84-97的氨基酸之間的14個殘基中有至少13個相對于野生型序列中的相應殘基已被修飾。
            
127.權利要求115-126中任一項的多肽，其中BCXD、DE或EF環中的一個或多個具有野生型人wFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的序列。
            
128.權利要求115-127中任一項的多肽，其中疏水核心殘基相對于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)沒有被修飾。
            
129.權利要求115-128中任一項的多肽，其中所述FG環不含有RGD整聯蛋白結合位點。
            
130.一種文庫，其含有多個包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域的多肽，其中所述10Fn3結構域相對于野生型人1QFn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的序列在AB和FG環的氨基酸序列中含有修飾。
            
131.權利要求130的文庫，其中該文庫包含至少15個多肽，每一個多肽包含不同的10Fn3結構域序列。
            
132.—種用于鑒定結合靶標的多肽的方法，包括篩選權利要求130或131的文庫以鑒定結合該靶標的多肽。
            
133.—種分離的多肽，其是通過權利要求132的方法鑒定的。
            
134.權利要求133的分離的多肽，其中該多肽以小于500nM的Kd與靶標結合。
            
135.—種包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域的多肽，其中所述kiFM結構域相對于野生型人wFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的氨基酸序列在⑶環、EF環、β -鏈F和β -鏈G的氨基酸序列中包含修飾，并且其中被修飾的環和鏈貢獻于對相同靶標的結入口 ο
            
136.權利要求135的多肽，其中相對于野生型序列中的相應殘基，對應于野生型人10Fn3結構域(SEQ ID NO:1)殘基93-97的氨基酸的氨基酸序列已被修飾。
            
137.權利要求136的多肽，其中額外的被修飾的氨基酸貢獻于對靶標的結合。
            
138.權利要求135-137中任一項的多肽，其中⑶環的對應于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的⑶環的氨基酸氨基37-45的部分具有相對于野生型⑶環的相同部分被修飾的氨基酸序列。
            
139.權利要求135-138中任一項的多肽，其中⑶環的對應于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的⑶環的氨基酸殘基37-45的部分相對于野生型⑶環的相同部分含有插入或缺失。
            
140.權利要求135-139中任一項的多肽，其中相對于野生型人uiFr^結構域(SEQIDNO:1或6)的EF環，EF環的氨基酸序列的長度延長或長度縮短。
            
141.權利要求135-140中任一項的多肽，其中β-鏈F在對應于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸殘基68和70的氨基酸殘基之間含有插入或缺失。
            
142.權利要求135-141中任一項的多肽，其中對應于野生型人uiFr^結構域(SEQIDNO:1)的氨基酸殘基91-97的序列的氨基酸序列具有相對于野生型序列的相同部分被修飾的氨基酸序列。
            
143.權利要求135-142中任一項的多肽，其中該多肽在對應于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸殘基90和98的氨基酸殘基之間含有插入或缺失。
            
144.權利要求135-143中任一項的多肽，其中AB、BC或DE環中的一個或多個具有野生型人wFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的序列。
            
145.權利要求135-144中任一項的多肽，其中疏水核心殘基相對于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)沒有被修飾。
            
146.權利要求135-145中任一項的多肽，其中所述FG環不含有RGD整聯蛋白結合位點。
            
147.一種文庫，其含有多個包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域的多肽，其中所述10Fn 3結構域相對于野生型人wFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應β -鏈和環的序列，在⑶環、EF環、β -鏈F和β -鏈G的氨基酸序列中含有修飾。
            
148.權利要求147的文庫，其中該文庫包含至少15個多肽，每一個多肽包含不同的10Fn3結構域序列。
            
149.一種用于鑒定結合靶標的多肽的方法，包括篩選權利要求147或148的文庫以鑒定結合該靶標的多肽。
            
150.一種分離的多肽，其是通過權利要求149的方法鑒定的。
            
151.權利要求150的分離的多肽，其中該多肽以小于500nM的Kd與靶標結合。
            
152.一種包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域的多肽，其中相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應β -鏈和環的序列，所述uiFr^結構域在β -鏈A、AB環、β -鏈B、⑶環、β -鏈E、EF環、和β -鏈F的氨基酸序列中含有修飾，并且其中經過修飾的環和鏈貢獻于對相同靶標的結合。
            
153.權利要求152的多肽，其中相對于野生型人uiFr^結構域(SEQIDNO:l或6)的CD環，所述CD環的氨基酸序列的長度延長或長度縮短。
            
154.權利要求152或153的多肽，其中相對于野生型人uiFr^結構域(SEQID NO:1或6)的β -鏈G的序列，所述β -鏈G的氨基酸序列被修飾。
            
155.權利要求152-154中任一項的多肽，其中相對于野生型人uiFr^結構域(SEQIDNO:1)的C端尾巴的氨基酸序列，C端尾巴的氨基酸序列被修飾。
            
156.權利要求152-155中任一項的多肽，其中疏水核心殘基相對于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)沒有被修飾。
            
157.權利要求152-156中任一項的多肽，其中所述FG環不含有RGD整聯蛋白結合位點。
            
158.一種文庫，其含有多個包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域的多肽，其中相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應β -鏈和環的序列，所述wFM結構域在β -鏈A、AB環、β -鏈B、CD環、β -鏈E、EF環和β -鏈F的氨基酸序列中含有修飾。
            
159.權利要求158的文庫，其中該文庫包含至少15個多肽，每一個多肽包含不同的10Fn3結構域序列。
            
160.一種用于鑒定結合靶標的多肽的方法，包括篩選權利要求158或159的文庫以鑒定結合該靶標的多肽。
            
161.一種分離的多肽，其是通過權利要求160的方法鑒定的。
            
162.權利要求161的分離的多肽，其中該多肽以小于500nM的Kd與靶標結合。
            
163.—種包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域的多肽，其中相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應β -鏈和環的序列，所述wFM結構域在AB環、β -鏈B、⑶環、β -鏈D、DE環、β -鏈E和EF環的氨基酸序列中含有修飾，并且其中經過修飾的環和鏈貢獻于對相同靶標的結合。
            
164.權利要求163的多肽，其中相對于野生型人1QFn3結構域(SEQIDNO:l或6)的AB環，所述AB環的氨基酸序列的長度延長或長度縮短。
            
165.權利要求163或164的多肽，其中⑶環的對應于野生型人kiFM結構域(SEQIDNO:1或6)的CD環的氨基酸殘基40-47的部分相對于野生型CD環的相同部分具有被修飾的氨基酸序列。
            
166.權利要求163-165中任一項的多肽，其中⑶環的對應于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的⑶環的氨基酸殘基40-47的部分相對于野生型⑶環的相同部分含有插入或缺失。
            
167.權利要求163-166中任一項的多肽，其中β-鏈B在對應于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)殘基18和20的氨基酸殘基之間含有插入或缺失。
            
168.權利要求163-167中任一項的多肽，其中相對于野生型序列中的相應殘基，對應于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)殘基14-19的氨基酸之間的6個殘基中有至少5個已被修飾。
            
169.權利要求163-168中任一項的多肽，其中相對于野生型序列中的相應殘基，對應于野生型人1QFn3結構域(SEQ ID NO:1或6)殘基40-66的氨基酸之間的27個殘基中有至少18個已被修飾。
            
170.權利要求163-169中任一項的多肽，其中所述BC環具有野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的序列。
            
171.權利要求163-170中任一項的多肽，其中疏水核心殘基相對于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)沒有被修飾。
            
172.權利要求163-171中任一項的多肽，其中所述FG環不含有RGD整聯蛋白結合位點。
            
173.—種文庫，其含有多個包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域的多肽，其中相對于野生型人wFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應β -鏈和環的序列，kiFM結構域在AB環、β -鏈B、⑶環、β -鏈D、DE環、β -鏈E和EF環的氨基酸序列中含有修飾。
            
174.權利要求173的文庫，其中該文庫包含至少15個多肽，每一個多肽包含不同的10Fn3結構域序列。
            
175.一種用于鑒定結合靶標的多肽的方法，包括篩選權利要求173或174的文庫以鑒定結合該靶標的多肽。
            
176.—種分離的多肽，其是通過權利要求175的方法鑒定的。
            
177.權利要求176的分離的多肽，其中該多肽以小于500nM的Kd與靶標結合。
            
178.一種包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域的多肽，其中相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的FG環的氨基酸殘基序列77-83，所述1QFn3結構域在FG環中含有序列修飾，并且其中所述wFM以小于500nM的Kd與靶標結合。
            
179.權利要求178的多肽，其中所述FG環的對應于野生型人1QFn3結構域(SEQID NO:1或6)的氨基酸殘基77-83的部分相對于野生型FG環的氨基酸殘基序列77-83長度延長或長度縮短。
            
180.權利要求178或179的多肽，其中所述FG環單獨介導與靶標的結合。
            
181.權利要求178-180中任一項的多肽，其中所述AB、BC、CD、DE或EF環中的一個或多個具有野生型人呷113結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的序列。
            
182.—種文庫，其含有多個包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域的多肽，其中相對于野生型人wFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的FG環的氨基酸殘基序列77-83，所述1QFn3結構域在FG環中含有序列修飾。
            
183.權利要求182的文庫，其中該文庫包含至少15個多肽，每一個多肽包含不同的10Fn3結構域序列。
            
184.一種用于鑒定結合靶標的多肽的方法，包括篩選權利要求182或183的文庫以鑒定結合該靶標的多肽。
            
185.—種分離的多肽，其是通過權利要求184的方法鑒定的。
            
186.權利要求200的分離的多肽，其中該多肽以小于500nM的Kd與靶標結合。
            
187.一種包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域的多肽，其中相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的序列，所述wFM結構域在BC環的一部分和FG環的一部分中含有序列修飾，并且其中與相對于野生型BC環在BC環的更大部分中具有修飾的等價wFM結構域相比，該kiFM結構域具有降低的免疫原性。
            
188.權利要求187的多肽，其中所述BC環中被修飾的部分對應于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的BC環的殘基28和29。
            
189.權利要求187的多肽，其中所述BC環中被修飾的部分對應于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的BC環的殘基27-29。
            
190.權利要求187的多肽，其中所述BC環中被修飾的部分對應于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的BC環的殘基24-29。
            
191.權利要求187-190中任一項的多肽，其中所述FG環中被修飾的部分對應于野生型人1QFn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的FG環的殘基77-83。
            
192.權利要求187-190中任一項的多肽，其中所述FG環中被修飾的部分對應于野生型人10Fn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的FG環的殘基72-82。
            
193.權利要求187-190中任一項的多肽，其中所述FG環中被修飾的部分對應于野生型人1QFn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的FG環的殘基77-86。
            
194.權利要求187- 190中任一項的多肽，其中所述FG環中被修飾的部分對應于野生型人10Fn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的FG環殘基77-79。
            
195.權利要求191-194中任一項的多肽，其中相對于野生型人uiFr^結構域(SEQIDNO:1或6)的FG環的相應部分，所述FG環中的被修飾部分具有插入或缺失。
            
196.權利要求187-195中任一項的多肽，其中所述BC和FG環貢獻于對靶標的結合。
            
197.權利要求187-196中任一項的多肽，其中相對于野生型人uiFr^結構域(SEQIDNO:1或6)的DE環的序列，所述kiFM結構域在DE環的一部分中進一步含有序列修飾。
            
198.權利要求197的多肽，其中DE環中被修飾的部分對應于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的DE環的殘基52和53.
            
199.權利要求187-198中任一項的多肽，其中與在氨基酸殘基23-27的一個或多個中相對于野生型BC環中的相應位置進一步包含修飾的等價kiFM結構域相比，該wFM結構域具有降低的免疫原性。
            
200.權利要求187-199中任一項的多肽，其中所述uiFr^結構域以小于500nM的Kd與靶標結合。
            
201.一種文庫，其含有多個包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域的多肽，其中相對于野生型人wFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環的序列，所述wFM結構域在BC環的一部分和FG環的一部分中含有序列修飾。
            
202.權利要求201的文庫，其中該文庫包含至少15個多肽，每一個多肽包含不同的10Fn3結構域序列。
            
203.一種用于鑒定結合靶標的多肽的方法，包括篩選權利要求201或202的文庫以鑒定結合該靶標的多肽。
            
204.一種用于增加鑒定出結合靶標并具有降低的免疫原性的多肽的可能性的方法，包括篩選權利要求201或202的文庫以鑒定出結合所述靶標的多肽。
            
205.一種分離的多肽，其是通過權利要求203或204的方法鑒定的。
            
206.權利要求205的分離的多肽，其中所述多肽以小于500nM的Kd與靶標結合。
            
207.—種包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域的多肽，其中所述’113結構域在BC環和鏈B或β-鏈C中的至少一個中相對于野生型人1QFn3結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環和β -鏈的序列含有序列修飾，并且其中與在β-鏈B或β-鏈C中的至少一個中相對于野生型不具有序列修飾的等價kiFM結構域相比，該kiFM結構域具有降低的免疫原性。
            
208.權利要求207的多肽，其中相對于野生型人1QFn3結構域(SEQIDNO:l或6)的BC環的氨基酸序列，所述BC環的氨基酸序列長度延長或長度縮短。
            
209.權利要求207或208的多肽，其中相對于野生型人uiFr^結構域(SEQID NO:1或6)的最先7個氨基酸殘基的氨基酸序列，所述kiFM結構域進一步在最先7個氨基酸殘基的氨基酸序列中含有修飾。
            
210.權利要求207-209中任一項的多肽，其中相對于野生型人uiFr^結構域(SEQIDNO:1或6)的相應環的序列，uiFr^結構域進一步在DE環、FG環或兩者中含有修飾。
            
211.權利要求210的多肽，其中相對于野生型人uiFr^結構域(SEQIDNO:l或6)的DE環的氨基酸序列，所述DE環的氨基酸序列長度延長或長度縮短。
            
212.權利要求210或211的多肽，其中相對于野生型人’113結構域(SEQID NO:1或6)的FG環的氨基酸序列，FG環的氨基酸序列長度延長或長度縮短。
            
213.權利要求210-212中任一項的多肽，其中相對于野生型人uiFr^結構域(SEQIDNO:1或6)的相應β-鏈的序列，所述kiFM結構域在DE環中含有序列修飾，并進一步在β -鏈D、β -鏈E或兩者中含有序列修飾。
            
214.權利要求210-212中任一項的多肽，其中相對于野生型人uiFr^結構域(SEQIDNO:1或6)的相應β-鏈的序列，所述kiFM結構域在FG環中含有序列修飾，并進一步在β -鏈F、β -鏈G或兩者中含有序列修飾。
            
215.權利要求207-214中任一項的多肽，其中所述BC環的對應于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的BC環的氨基酸殘基27-31的部分相對于野生型BC環的相同部分具有被修飾的氨基酸序列。
            
216.權利要求207-215中任一項的多肽，其中所述BC環在對應于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸殘基26和32的氨基酸殘基之間含有插入或缺失。
            
217.權利要求207-216中任一項的多肽，其中β-鏈D在對應于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸殘基48和50的氨基酸殘基之間含有插入或缺失。
            
218.權利要求207-217中任一項的多肽，其中β-鏈F在對應于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸殘基72和74的氨基酸殘基之間含有插入或缺失。
            
219.權利要求207-218中任一項的多肽，其中β-鏈G在對應于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸殘基88和90的氨基酸殘基之間含有插入或缺失。
            
220.權利要求207-219中任一項的多肽，其中疏水核心殘基相對于野生型人uiFr^結構域(SEQ ID NO:1或6)沒有被修飾。
            
221.—種文庫，其含有多個包含人3型纖連蛋白第十C°Fn3)結構域的多肽，其中相對于野生型人kiFM結構域(SEQ ID NO:1或6)的相應環和β -鏈的序列，所述wFM結構域在BC環以及β -鏈B或β -鏈C的至少一個中包含序列修飾。
            
222.權利要求221的文庫，其中該文庫包含至少15個多肽，每一個多肽包含不同的.10Fn3結構域序列。
            
223.—種用于鑒定結合靶標的多肽的方法，包括篩選權利要求221或222的文庫以鑒定結合該靶標的多肽。
            
224.—種用于增加鑒定出結合靶標并具有降低的免疫原性的多肽的可能性的方法，包括篩選權利要求221或222的文庫以鑒定出結合所述靶標的多肽。 .223.—種分離的多肽，其是通過權利要求223或224的方法鑒定的。.224.權利要求223的分離的多肽，其中該多肽以小于500nM的Kd與靶標結合。
            
【文檔編號】C07K14/78GK104053670SQ201280065574 
            
【公開日】2014年9月17日   申請日期:2012年10月31日   優先權日:2011年10月31日
            
【發明者】J.戴維斯, D.利波夫塞克, R.坎福森   申請人:百時美施貴寶公司
            
                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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