經修飾的白蛋白結合結構域及其用于改善藥代動力學的用途
【專利摘要】本發明涉及包含經修飾的白蛋白結合結構域以改善治療性分子的藥代動力學性質的組合物和方法。經修飾的肽顯示減小的免疫原性和/或改善的溶解度。具體地，提供了用于增強蛋白質治療劑的治療潛能的組合物和方法，包括將已被修飾來減小免疫原性和/或改善溶解度的蛋白質白蛋白結合結構域連接于治療性蛋白，包括治療性抗體、抗體片段、抗體單結構域和/或抗體單結構域的二聚體。這些連接的多肽可顯示增加的血清半衰期而無加劇的免疫原性和/或無減小的溶解度，并且大體上不影響治療性蛋白的特異性結合性質。
【專利說明】經修飾的白蛋白結合結構域及其用于改善藥代動力學的用途
[0001]與相關申請的交叉引用
[0002]本申請要連接子臨時申請系列號61/538，552 (將其內容通過引用整體并入本文)的權益。本申請還涉及也在2011年9月23日由Frederico Aires da Silva, Sofia
Volker CortC-Real 和 Sara Lourenfo 提交的標題為“Ant1-Tumor Necorsis
Factor- a Agents and Uses Thereof ”的美國臨時申請系列號61/538，548,并且也將其內容通過引用整體并入本文。
發明領域
[0003]本發明涉及包含經修飾的白蛋白結合結構域以改善治療性分子的藥代動力學性質的組合物和方法。經修飾的肽顯示減小的免疫原性和/或改善的溶解度。具體地，提供了用于增強蛋白質治療劑的治療潛能的組合物和方法，包括將蛋白質白蛋白結合結構域(其已被修飾來減小免疫原性和/或改善溶解度)連接至治療性蛋白，包括治療性抗體、抗體片段、抗體單結構域和/或抗體單結構域的二聚體。這些連接的多肽可顯示增加的血清半衰期而無加劇的免疫原性和/或無減小的溶解度，并且大體上不影響治療性蛋白的特異性結合性質。
[0004]背景
[0005]藥物的效力很大程度上取決于化合物的固有藥代動力學。這對于小分子藥物和治療性蛋白藥物都一樣。小分子藥物長久以來依賴于它們與各種血漿組分的締合來改善它們的體內藥代動力學性質；然而，盡管它們的半衰期被延長，但與血漿蛋白締合的藥物通常不能用于結合靶。由于僅所述小分子的未結合部分通常在功能上有活性，因此必須在效力所需的游離藥物的濃度與必須施用其的頻率之間維持精細平衡(Rowland, M.(ed) (1988)Clinical Pharmacokinetics:Concepts and Applications,第 2版,Lea&Febiger, Philadelphia, PA)。
[0006]治療性蛋白，包括干擾素、生長激素、抗體片段等，主要因它們的小的尺寸而通常具有短的血清半衰期。這使得所述蛋白質高度易受快速腎清除和由血清蛋白酶導致的降解的影響。因為腎通常濾出低于60kDa的分子，減少治療性蛋白的清除的努力集中在通過化學修飾例如糖基化或添加聚乙二醇聚合物(即PEG)來增加分子大小。Kurtzhals, P.，等人(1995)Biochem.J.312, 725 - 731 ；Markussen, J.,等人(1996)Diabetologia39, 281 - 288。盡管化學衍生法已增加了血清半衰期，但這些分子的添加也可減小生物活性和治療效力，以及增加構建體的免疫原性。
[0007]使用免疫球蛋白作為治療劑特別地在近年來已顯著增加，并且已擴展至醫學治療的不同領域。這樣的用途包括無丙種球蛋白血癥和低丙種球蛋白血癥的治療，作為用于治療自身免疫性疾病和移植物抗宿主(GVH)病的免疫抑制劑，治療和控制炎性疾病如類風濕關節炎，治療淋巴惡性腫瘤和用于治療各種全身性和感染性疾病的被動免疫療法。此外，免疫球蛋白還可被用作體內診斷工具，例如在診斷成像程序中。然而，這些療法中的持續問題是免疫球蛋白從循環的清除。免疫球蛋白清除的速率直接影響免疫球蛋白的劑量的量和頻率并且增加的劑量和頻率可在患者中引起不利作用，以及增加醫療費用。
[0008]使用抗體片段作為治療性蛋白也在近年來大大增加。例如，抗體片段例如sdAb、scFv、雙抗體(diabody)和Fab提供了快速腫瘤滲透并且已被開發用于這些適應癥；然而，這些片段也被快速清除并且它們被保留在腫瘤中的能力是有限的(Kashmiri，S.V.S.(2001) J.Nucl.Med.42:1528 - 1529 ；ffu, A.M.和 Yazaki, P.J.(2000) Q.J.Nuc1.Med.44:268 - 83)。
[0009]使用了數種策略來克服與短的血清半衰期相關的問題。例如，某些蛋白質融合物已被嘗試用來增加蛋白質治療劑的大小，從而用來增加其穩定性和半衰期。(Syed 等人(1997)Blood89:3243 - 3252 ；Yeh,等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.89:1904 - 1908)。這些策略包括治療性蛋白與抗體IgG的Fe部分的融合和與阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)的融合。例如，AGP與干擾素α 2的嵌合體顯示直至13倍增加的體內血清半衰期，而生物活性保持與天然干擾素α2相似。也參見，美國專利公布號2007/0050855，所述專利公布提供了改善血清半衰期和穩定性的、治療性蛋白與可溶性毒素受體片段和經修飾的轉鐵蛋白分子的某些融合蛋白。
[0010]與抗體片段的融合還已用于例如用于治療類風濕關節炎的產品，包括依那西普(Enbrel)和賽妥珠單抗(Cimzia)以及Remicade?(英夫利昔單抗)、Humira (阿達木單抗)和Simponi (戈利 木單抗)。Enbrel是與抗體的Fe部分融合的TNF- α受體的遺傳融合物，而Cimzia是PEG化的Fab片段。然而，許多患者產生針對產品的免疫原性反應，需要轉向其它治療。
[0011]還已嘗試治療性蛋白與白蛋白的融合。白蛋白(67kDa的分子質量)是血漿中最豐富的蛋白質(以50mg/ml存在)，在人中具有19天的半衰期(Peters，T.，Jr.(1985)Adv.Protein Chem.37:161 - 245 ;Peters,Τ.，Jr.(1996)All about Albumin, AcademicPress, Inc., San Diego, CA)。白蛋白通過可逆地結合和運輸許多種內源性物質以及藥物在體內起著至關重要的作用，并且已描述了白蛋白中的幾個主要小分子結合位點。(例如，參見，Frick,等人(1994)Mol Microbiol.12:143-51 ;和 Akesson 等人(1994)Biochem.J.300:877-886)。然而，與白蛋白的直接融合已證明并不成功。例如，白蛋白與抗體的融合已經失敗，因為白蛋白可因偶聯程序或因綴合而變性。這可導致高免疫原性和導致綴合物被網狀內皮系統可觀地攝取，從而這些綴合物被從循環中快速除去，并且被肝而非靶組織大量獲取。Stehle, G.,等人(1997) Anticancer Drugs8:677 ；Stehle, G.,等人(1997)Anticancer Drugs8:835 ；Kashmiri, S.V.S.(2001) J.Nucl.Med., 42, 1528 - 1529 ；ffu, A.M.等人(2000) Q.J.Nucl.Med.，44，268 - 83。也參見，例如，屬于 Human Genome Sciences的W007/146038，其提供了增加治療性蛋白的血清可用度和存架穩定性的白蛋白融合蛋白。
[0012]其它策略包括將治療劑與允許在體內與血清白蛋白締合的另一種蛋白質偶聯。該方法的實例已在例如EP0486525和US6, 267，964中被描述，EP0486525和US6, 267，964描述了通過將細菌來源的白蛋白結合肽融合至治療性蛋白而使用來源于鏈球菌蛋白G(SpG)的白蛋白結合肽或蛋白來增加其它蛋白質的半衰期。融合蛋白傾向于結合血清白蛋白，從而增加半衰期。例如，在一種情況下，來自鏈球菌蛋白G的白蛋白結合結構域與人補體受體I型的重組融合使其在大鼠中的半衰期增加3倍至5h(Makrides，S.等人(1996)J.Pharmacol.Exp.Ther.277，534 - 542);在另一種情況下，與該結構域的融合增強針對肽抗原的免疫反應(Sjolander, A 等人(1997) J.1mmunol.Methods201, 115 - 123)。另外的白蛋白結合蛋白序列被提供于例如PCT公布號W091/19741、PCT公布號W005/097202、PCT公布號W001/45746和美國專利公布號2004/0001827中。然而，融合產物易于錯折疊并且融合區域可產生高度免疫原性位點，從而導致在給受試者施用后對構建體的強免疫反應。與單獨的治療性分子相比，融合分子也可能較不可溶。
[0013]因此，在本領域依然存在對下述策略的需求:改善分子的生物可用度、穩定性和/或血清半衰期以允許產生更有效的治療劑而不加劇治療劑在受試者中的免疫原性和/或不過度降低溶解度。本發明提供了用于解決這些和其它需求的組合物和技術。
[0014]上述討論被呈現僅用來提供對本領域面對的問題的性質的更好理解，而不應當以任何方式被解釋為對于現有技術的承認并且本文中引用的任何參考資料也不應當被解釋為承認這樣的參考資料構成了本申請的“現有技術”。
[0015]發明概述
[0016]本發明提供了使用被去免疫和/或修飾來改善溶解度的經修飾的白蛋白結合結構域的化合物、組合物和方法。具體地，提供了獸疫鏈球菌(Streptococcuszooepidemicus)的去免疫白蛋白結合結構域以及其白蛋白結合片段或衍生物，其中減少或消除了白蛋白結合結構域的一個或多個Th表位以降低肽的免疫原性。當連接至治療性分子時，經修飾的白蛋白結合結構域可通過增加半衰期但不加劇免疫原性和/或不過度降低溶解度，同時維持分子的治療性質來增強分子的藥物潛能。
[0017]因此，本發明的一個方面涉及包含連接至至少一個白蛋白結合結構域或其白蛋白結合片段或衍生物的治療性分子的試劑，其中白蛋白結合結構域包含對應于SEQ IDNOil(PEP)的氨基酸序列，并且其中所述結構域通過至少一個選自E12D、T29H-K3?和A4?的氨基酸置換而被修飾，置換參照SEQ ID NO:1中的氨基酸位置；從而相較于所述治療性分子，所述試劑具有增加的血清半衰期。
[0018]在一些具體的實施方案中，白蛋白結合結構域包含氨基酸置換E12D，置換參照SEQID N0:1中的氨基酸位置。在一些具體的實施方案中，白蛋白結合結構域包含氨基酸置換T29H-K35D，置換參照SEQ ID N0:1中的氨基酸位置。在一些具體的實施方案中，白蛋白結合結構域包含氨基酸置換A4?，置換參照SEQ ID NO:1中的氨基酸位置。在一些具體的實施方案中，白蛋白結合結構域包含對應于SEQ ID N0:31的氨基酸序列。
[0019]在一些優選實施方案中，相較于無白蛋白結合結構域的治療性分子，試劑的血清半衰期以至少約5倍增加。在一些優選實施方案中，血清半衰期以至少約8倍或至少約10倍增加。在一些優選實施方案中，試劑的血清半衰期為至少約30小時，或至少約40小時。
[0020]在一些優選實施方案中，相較于治療性分子，試劑也具有增加的溶解度。例如，在一些優選實施方案中，溶解度以至少約2倍，至少約5倍，至少約10倍，或至少約15倍增加。
[0021]在一些具體的實施方案中，治療性分子與白蛋白結合結構域之間的連接是通過連接子。在一些優選實施方案中，連接子是肽連接子，例如包含對應于SEQ ID N0:30的氨基酸序列的肽連接子。
[0022]在一些特別優選實施方案中，治療性分子是治療性多肽或肽,在一些其它實施方案中，治療性多肽或肽連接至白蛋白結合結構域作為融合物。治療性分子可選自魚精蛋白，gp60、gp30、gpl8、蛋白A、G蛋白、蛋白質轉導結構域、毒素、細胞毒素、放射性核素和大環螯合劑。在一些特別優選的實施方案中，治療性分子是抗體或抗體片段，例如選自單克隆抗體、多特異性抗體、人源化抗體、合成抗體、嵌合抗體、多克隆抗體、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、抗獨特型(抗-1d)抗體、雙抗體、微型抗體、納米抗體、單結構域抗體、Fab片段、F(ab’)片段、二硫化物連接的雙特異性Fv(sdFv)和胞內抗體的抗體或抗體片段。
[0023]在一些具體的實施方案中，治療性分子包含兩個抗體單結構域或其抗原結合片段的二聚體，其中結構域包含輕鏈可變結構域。在一些優選實施方案中，二聚體結合TNF-α。在一些優選實施方案中，二聚體包含至少一個輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包含對應于 SEQ ID N0:2(VL18)、SEQ ID NO: 3 (VLll)、SEQ ID NO: 4-19 的氨基酸序列或其TNF- α -結合片段或衍生物。在一些實施方案中，二聚體包含兩個輕鏈可變結構域，對于一個或兩個序列，所述輕鏈可變結構域包含對應于SEQ ID N0:2(VL18)和SEQ ID NO: 3 (VLlI)的氨基酸序列或其TNF-α -結 合片段或衍生物。在一些實施方案中，二聚體包含至少一個選自SEQ ID N0:32(VL18-3L-VL11)、SEQ ID NO:34和其TNF-α -結合片段或衍生物的氨基酸序列。
[0024]在一些實施方案中，至少一個可變結構域拮抗人TNF-α對TNF-α受體的結合。在一些更優選實施方案中，所述至少一個可變結構域還與至少一種其它哺乳動物TNF-α交叉反應，其中所述哺乳動物不是靈長類動物。在一些更優選的實施方案中，可變結構域與至少兩種其它哺乳動物的TNF-α交叉反應，所述至少兩種其它哺乳動物為嚙齒類和非嚙齒類物種。
[0025]在一些實施方案中，還通過消除可變結構域的至少一個中的至少一個Th表位來進一步使二聚體去免疫。例如，在一些具體實施方案中，至少一個可變結構域包含對應于SEQID N0:2(VL18)的氨基酸序列，其也通過至少一個選自T7Q、V15P、(A51V-L54R/A51V-L54E)、K63S、E79K、(C80S)、T91A和LlllK的氨基酸置換而被去免疫，置換參照SEQ ID NO: 2中的氨基酸位置。在一些具體實施方案中，至少一個可變結構域包含對應于SEQ ID N0:3(VL11)的氨基酸序列，其也通過至少一個選自 T7Q、V15P、R31S、(A51V-54R/A51V-L54E)、K63S、E79K、(C80S)、T91A、A100S和E106K的氨基酸置換而被去免疫，置換參照SEQ ID NO:3中的氨基酸位置。在一些優選實施方案中，二聚體包含至少一個包含對應于SEQ ID NO:20-24, SEQID NO:25-29的氨基酸序列或其TNF-α -結合片段或衍生物的輕鏈可變結構域。在一些優選實施方案中，二聚體包含至少一個選自SEQ ID NO:35-44(VL18-3L-VL11/PEP變體)及其TNF- α -結合片段或衍生物的氨基酸序列。
[0026]本發明的另一個方面涉及增強治療性分子在受試者中的效力物方法，包括:提供包含連接至至少一個白蛋白結合結構域或其白蛋白結合片段或衍生物的治療性分子的試劑，其中所述白蛋白結合結構域包含對應于SEQ ID NOil(PEP)的氨基酸序列，其中所述結構域通過至少一個選自E12D、T29H-K3?和A4?的氨基酸置換而被修飾，置換參照SEQ IDNO:1中的氣基酸位直；和給受試者施用試劑。
[0027]本發明的另一個方面涉及藥物組合物，其包含根據本發明的試劑和/或包含編碼試劑的核苷酸序列的核酸，以及藥學上可接受的載體。本發明的另一個方面涉及包含編碼根據本發明的試劑的核苷酸序列的核酸，以及包含其的載體和/或宿主細胞和/或藥物組合物。
[0028]本發明的另一個方面涉及制造根據本發明的試劑的方法，包括(i)提供包含編碼試劑的載體的宿主細胞；(ii)在允許試劑表達的條件下培養細胞；和(iii)從培養物回收試劑。
[0029]附圖簡述
[0030] 圖1闡釋了根據本發明的白蛋白結合結構域中所提及的置換的位置(以灰色突出顯示)，其中使用Kabat和Ordinal編號。
[0031]圖2A-B闡釋了用于與本發明的白蛋白結合結構域融合的兩個VL單結構域抗體(A-B)中所提及的置換的位置(以灰色突出顯示)，其中使用Kabat和Ordinal編號KDR以X來標不O
[0032]圖3A-B闡釋了包含根據本發明的經修飾的白蛋白結合結構域的構建體的特征。圖3A闡釋了包含本發明的白蛋白結合結構域的VL-VL-PEP構建體與人白蛋白之間的結合模式；圖3B闡釋了通過給Wistar雌性大鼠施用(以測定其體內血清半衰期)測試的VL18-3L-VL11和VL18-3L-VL11-PEP的藥代動力學；將數據歸一化，其中將最大濃度認為是施用后5分鐘所測定的(5分鐘值的百分比)。
[0033]圖4闡釋了包含抗-TNF- α多肽(VL-VL 二聚體)與本發明的白蛋白結合結構域的重組去免疫融合物(VL18-3L-VL11DI3-PEP DI#8)的考馬斯藍SDS-PAGE表達分析的結果。所表達的融合物的凝膠位置由箭頭標示。泳道1-4表示下列:泳道1:See Blue2Plus梯(Ladder) ,IOyL ;泳道2:誘導前樣品，總的蛋白質；泳道3:過夜的誘導后樣品，總的蛋白質；和泳道4:過夜的誘導后樣品，可溶性蛋白質。
[0034]圖5A-E闡釋了包含抗-TNF- α多肽(VL-VL 二聚體)與本發明的白蛋白結合結構域的去免疫融合物的下游過程發展。圖5Α闡釋了下游過程發展的圖示。圖5B-C闡釋了在對本發明的去免疫融合物(VL18-3L-VL11DI3-PEP DI#8)進行蛋白L親和純化后的考馬斯藍SDS-PAGE表達分析的結果。圖闡釋了在本發明的去免疫融合物(VL18-3L-VL11DI3-PEPDI#8)的SP瓊脂糖陽離子交換層析后進行考馬斯藍SDS-PAGE表達分析的結果。圖5E闡釋了在本發明的去免疫融合物(VL18-3L-VL11DI3-PEP DI#8)的尺寸排阻層析后進行考馬斯藍SDS-PAGE表達分析的結果。
[0035]圖6闡釋了在Wistar雌性大鼠中的佐劑誘導的關節炎模型中誘導的疾病進展。
[0036]圖7闡釋了包含抗-TNF- α多肽(VL-VL 二聚體)與本發明的白蛋白結合結構域的去免疫融合物在已建立的大鼠佐劑誘導的關節炎模型(AIA)中的治療效果。
[0037]圖8Α-Ι闡釋了基于組織學分析的去免疫VL-VL 二聚體和本發明的去免疫融合物在已建立的大鼠佐劑誘導的關節炎模型(AIA)中的治療效果。
[0038]圖9Α-Β 闡釋了在 Wistar 在大鼠(η = 3)中 1.ρ.施用后 15min、lh、3h、6h 和 24h,fac- ["mTc (CO) 3] -VL18-3L-VL11 (圖 9A)和 fac-["mTc (CO) 3] -VL18-3L-VL11-PEP (圖 9B)在相關器官中的生物分布數據，表達為％ ID/器官。
[0039]發明詳述
[0040]1.定義
[0041]術語“衍生物”，當用于蛋白質試劑(包括全長蛋白質、多聚體蛋白質、多肽、肽、其抗體和片段以及特別包括結構域例如白蛋白結合結構域)的情境中時，是指具有與第二試劑相似或相同的功能，但不一定包含與第二試劑相似或相同的氨基酸序列、修飾例如糖基化或二級、三級或四級結構的試劑。具有相似氨基酸序列的蛋白質試劑是指滿足下列的至少之一的第二蛋白質試劑:(a)具有與第二蛋白質試劑的氨基酸序列至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一的氨基酸序列的蛋白質試劑；(b)由在嚴格條件下與編碼至少5個連續氨基酸殘基、至少10個連續氨基酸殘基、至少15個連續氨基酸殘基、至少20個連續氨基酸殘基、至少25個連續氨基酸殘基、至少40個連續氨基酸殘基、至少50個連續氨基酸殘基、至少60個連續氨基酸殘基、至少70個連續氨基酸殘基、至少80個連續氨基酸殘基、至少90個連續氨基酸殘基、至少100個連續氨基酸殘基、至少125個連續氨基酸殘基或至少150個連續氨基酸殘基的第二蛋白質試劑的核苷酸序列雜交的核苷酸序列編碼的蛋白質試劑；和(c)由與編碼第二蛋白質試劑的核苷酸序列至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %或至少99 %同一的核苷酸序列編碼的蛋白質試劑。與第二蛋白質試劑具有相似結構的蛋白質試劑是指具有與第二蛋白質試劑相似的二級、三級或四級結構的蛋白質試劑。多肽的結構可通過本領域技術人員已知的方法來測定，所述方法包括但不限于肽測序、X射線晶體學、核磁共振、圓二色性和晶體學電子顯微鏡術(crystallographic electron microscopy)。[0042]為了測定兩個氨基酸序列或兩個核酸序列的百分比同一性，為了最佳比較目的將序列進行比對(例如，可在第一氨基酸序列或核酸序列中引入缺口以與第二氨基酸或核酸序列最佳比對)。然后比較對應氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的位置被與第二序列中的對應位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據時，則分子在該位置上是同一的。兩個序列之間的百分比同一性是由序列所共享的同一性位置的數目的函數(即，百分比同一性=同一重疊位置的數目/位置的總數χ100% )。在一個實施方案中，兩個序列長度相同。
[0043]兩個序列之間的百分比同一性的測定還可使用數學算法來實現。用于兩個序列的比較的數學算法的一個非限制性實例是Karlin和Altschul的算法，1990，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.87:2264-2268,如同 Karlin 和 Altschul, 1993, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.90:5873-5877中改進的。將這樣的算法整合至Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215:403 的 NBLAST 和 XBLAST 程序中。
[0044]如本文中所用，術語“衍生物”，在蛋白質的情境中，包括白蛋白結合結構域及其片段，也指包含已通過引入氨基酸殘基置換、缺失或添加改變的氨基酸序列的多肽或肽。如本文中所用，術語“衍生物”還指已被修飾(即，通過將任何類型的分子共價連接至多肽或肽)的多肽或肽。例如，但非限制性地，多肽可以被修飾，例如通過糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通過已知保護/封閉基團進行的衍生化、蛋白水解切割、連接至細胞配體或其它蛋白質等。衍生多肽或肽可使用本領域技術人員已知的技術通過化學修飾來產生，所述技術包括但不限于特異性化學切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代謝合成等。此外，衍生多肽或肽衍生物具有與其所源自的多肽或肽相似、相同或改善的功能。
[0045]如本文中所用，“衍生物”與“變體”可互換地使用。
[0046]如本文中所用，術語“片段”是指這樣的肽或多肽，所述肽或多肽包含另一個多肽的氨基酸序列的至少5個連續氨基酸殘基、至少10個連續氨基酸殘基、至少15個連續氨基酸殘基、至少20個連續氨基酸殘基、至少25個連續氨基酸殘基、至少40個連續氨基酸殘基、至少50個連續氨基酸殘基、至少60個連續氨基酸、至少70個連續氨基酸殘基、至少連續80個氨基酸殘基、至少連續90個氨基酸殘基、至少連續100個氨基酸殘基、至少連續125個氨基酸殘基、至少150個連續氨基酸殘基、至少連續175個氨基酸殘基、至少連續200個氨基酸殘基或至少連續250個氨基酸殘基的氨基酸序列。在具體的實施方案中，多肽的片段保持多肽的至少一種功能。
[0047]如本文中所用，術語“重鏈”、“輕鏈”、“可變區”、“框架區”、“恒定區”等具有它們在免疫學領域中的普通含義，并且是指天然存在的免疫球蛋白中的結構域和合成(例如，重組)結合蛋白(例如，人源化抗體、單鏈抗體、嵌合抗體等)的對應結構域。天然存在的免疫球蛋白(例如，IgG)的基本結構單元是具有2個輕鏈(L)和2個重鏈(H)的四聚體，通常表達為約150，OOODa的糖蛋白。每一條鏈的氨基末端(“η”)部分包括主要負責抗原識別的約100至110或更多個氨基酸的可變區。每一條鏈的羧基末端(“C”)部分定義恒定區，輕鏈具有單個恒定結構域，重鏈通常具有3個恒定結構域和鉸鏈區。因此，每一個輕鏈通常由可變結構域(VL)和恒定結構域(CL)構成；而每一個重鏈通常包括可變結構域(VH)和3個恒定結構域(CH1、CH2和CH3)以及鉸鏈區⑶。因此，免疫球蛋白分子例如IgG的輕鏈的結構為I1-Vlj—CL-c并且免疫球蛋白分子例如IgG的重鏈的結構為n_VH—Chi—H—Ch2—CH3_c (其中H為鉸鏈區)。抗體或抗體片段的可變區包括互補決定區(CDR)(其包含與抗原接觸的殘基)，和非CDR區段(稱為框架區段或框架區(FR或FwR)，其通常維持CDR環的結構和確定其定位(盡管某些框架殘基也可接觸抗原)。因此，'和Vh結構域具有結構n-FRl，⑶Rl，FR2，CDR2，FR3，C DR3，FR4-c。
[0048]抗體片段可從完整的常規IgG產生，并包括抗原結合片段、Fe結構域、Fab片段(F(ab))、F(ab’)片段、單鏈Fv片段(scFv) (VH-VL 二聚體)、僅重鏈結構域、僅輕鏈結構域、以及單個(單一)結構域，例如，VH結構域、VL結構域、CH1結構域、CH2結構域、CH3結構域、CL結構域等。
[0049]術語“抗體單結構域”、“單結構域抗體”或“sdAb”是指包含抗體的VH或VL結構域或由所述結構域組成的抗體片段，即單個單聚體可變抗體結構域。像完整抗體一樣，抗體單結構域可免疫特異性地結合特定抗原。然而，與完整抗體不同，抗體單結構域不顯示補體系統觸發的細胞毒性，因為它們缺少Fe區域。兩個或更多個抗體單結構域可組合以產生二聚體及其更高級的結構。
[0050]如本文中所用，術語“免疫特異性結合”、“免疫特異性識別”、“特異性結合”、“特異性識別”和類似術語是指在生理條件下特異性結合抗原(例如，表位或免疫復合物)并且不特異性結合另一種分子的分子。可以例如通過免疫測定、BIAcore或本領域技術人員已知的其它技術來鑒定特異性結合抗原的分子。特異性結合抗原的分子可以以更低的親和力(如通過例如免疫測定、BIAcore或本領域已知的其它測定確定的)結合其它肽或多肽。在一些實施方案中，特異性結合抗原的分子與其它分子(例如來自其它物種的類似蛋白質)交叉反應。
[0051]如本文中所用，術語“體內半衰期”、“血清半衰期”或“血漿半衰期”(也稱為t1/2)是指分子在給定的宿主的循環中的生物半衰期，并且表示為動物中施用的量的一半從動物的循環和/或其它組織清除所需的時間。體內半衰期是重要的臨床參數，其決定治療劑的施用量和頻率。當給定分子的清除曲線被構建為時間的函數時，曲線通常是雙相性的，具有快速“ α -相”和更長的“ β -相”，所述α -相代表經注射的分子在血管外與血管內空間之間的平衡并且部分地由分子的大小決定；所述“ β -相”代表血管內空間中的分子的分解代謝。實際中，體內半衰期通常緊密對應于β_相中的分子的半衰期。
[0052]如本文中所用，術語“核酸”和“核苷酸序列”包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA) ,RNA分子(例如，mRNA) ,DNA與RNA分子的組合或雜交DNA/RNA分子，以及DNA或RNA分子的衍生物。這樣的衍生物可使用例如核苷酸(其包括但不限于肌苷或三苯甲基化的堿基)來產生。這樣的衍生物還可包括含有經修飾的主鏈的DNA或RNA分子，所述經修飾的主鏈給分子提供了有益的特性，例如核酸酶抗性或增強的穿過細胞膜的能力。核酸或核苷酸序列可以是單鏈、雙鏈的，可包含單鏈和雙鏈部分，并且可包含三鏈部分，但優選是雙鏈DNA。
[0053]“分離的”或“純化的”分子大體上不含來自分子所源自的細胞或組織來源的細胞材料或其它污染物，或當化學合成時，大體上不含化學前體或其它化學品。語言“大體上不含細胞材料”包括下述分子制劑，其中分子與其所從中分離或重組產生的細胞的細胞組分分離。因此,大體上不含細胞材料的蛋白質包括具有少于約30%、20%、10%或5% (按干重計)的污染性蛋白質的制劑。當重組地產生分子(通常為蛋白質)時，其通常也大體上不含培養基，即培養基代表少于約30%、20%、10%或5%的制劑體積。當分子通過化學合成產生時，其通常大體上不含化學前體或其它化學品，即，其與化學前體或參與分子合成的其它化學品是分離的。因此，這樣的制劑具有少于約(按干重計)的化學前體或除目標分子外的化合物。在本發明的一個實施方案中，蛋白質，特別是融合蛋白是分離的或純化的。
[0054]如本文中所用，術語“受試者”、“宿主”和“患者”可互換地使用。受試者通常是哺乳動物例如非靈長類動物(例如，牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)或靈長類動物(例如，猴和人)，最通常為人。
[0055]2.經修飾的白蛋白結合結構域
[0056]本發明的一個方面涉及白蛋白結合結構域及其融合物，例如與生物治療劑(例如蛋白，例如免疫治療劑)的融合物，所述融合物具有減小的免疫原性和/或增加的溶解度。白蛋白結合結構域或其具有減小的免疫原性的融合物是其中結構域中的至少一個Th表位已被消除和/或減少的結構域或融合物。這樣的多肽、結構域或融合物在本文中被稱為“去免疫的”多肽、結構域或融合物。與未去免疫的白蛋白結合結構域相比，根據本發明的去免疫白蛋白結合結構域和融合物以及其白蛋白結合片段和衍生物引起在期望的宿主(例如人患者)中減小的免疫原性。可修飾白蛋白結合結構域(其與治療性分子融合或未融合)，其中修飾減小免疫原性。在一些實施方案中，融合物的治療性分子，例如治療性多肽可被單獨地去免疫。特別地，本發明包括變體白蛋白結合結構域，其被修飾以減少變體的免疫原性。
[0057]本發明的另一個方面涉及白蛋白結合結構域及其融合物，例如與生物治療劑(例如蛋白質，例如免疫治療劑)的融合物，其具有改善的溶解度，即白蛋白結合結構域及其融合物被突變以增強可溶性。這樣的多肽、結構域或融合物在本文中被稱為“溶解的”多肽、結構域或融合物。與不溶解的白蛋白結合結構域相比，根據本發明的溶解的白蛋白結合結構域和融合物以及其白蛋白結合片段和衍生物引起在期望的宿主(例如人患者)的血清中的良好溶解度。可修飾白蛋白結合結構域(其與治療性分子融合或未融合)，其中修飾改善或增強溶解度，從而使得所述結構域和/或其融合物更為可溶。在一些實施方案中，融合物的治療性分子(例如治療性多肽)可被單獨或額外修飾，從而也改善其溶解度。特別地，本發明包括變體白蛋白結合結構域，其被修飾以增強變體的溶解度。在一些特別優選的實施方案中，經修飾的白蛋白結合結構域顯示增加的溶解度和減小的免疫原性。
[0058]在一些具體的實施方案中，通過一個或多個氨基酸置換修飾白蛋白結合結構域以減小免疫原性和/或增加溶解度。按照本發明，用于減小根據本發明的白蛋白結合結構域，或其白蛋白結合片段或衍生物的免疫原性的氨基酸置換可存在于提供具有對HLA II類受體的親和力的肽(已知為Th表位)的氨基酸段內。Th表位處的置換可消除或減小對HLAII類受體的結合，因而減小免疫原性。例如，置換可存在于提供具有對于至少一種HLA II類受體(選自由DRA/DRB1、DQA/DQB和DPA/DPB構成的HLA II類受體)的親和力的肽的氨基酸段內。
[0059]在具體的實施方案中，待去免疫的白蛋白結合結構域包含對應于SEQ ID N0:1的氨基酸序列(其在本文中還可被稱為“PEP”)或由所述氨基酸序列組成。PEP的去免疫變體在本文中可被稱為“PEP變體”，也參見實施例1和圖1。
[0060]在 其它具體的實施方案中，待去免疫的PEP白蛋白結合結構域包含SEQ ID NO:1的白蛋白結合片段或由所述片段組成。在一些實施方案中，待去免疫的白蛋白結合結構域包含PEP的白蛋白結合片段(其包含SEQ ID NO:1的至少10個連續氨基酸或由所述連續氨基酸組成)或由所述白蛋白結合片段組成。在其它實施方案中，待去免疫的白蛋白結合結構域包含含有SEQ ID NO:1的至少15個連續氨基酸或由所述連續氨基酸組成的PEP的白蛋白結合片段。在其它實施方案中，待去免疫的白蛋白結合結構域包含含有SEQ ID NO:1的至少20個連續氨基酸或由所述連續氨基酸組成的PEP的白蛋白結合片段。在其它實施方案中，待去免疫的白蛋白結合結構域包含含有SEQ ID NO:1的至少25個連續氨基酸或由所述連續氨基酸組成的PEP的白蛋白結合片段。在其它實施方案中，待去免疫的白蛋白結合結構域包含含有SEQID NO:1的至少30個連續氨基酸或由所述連續氨基酸組成的PEP的白蛋白結合片段。在其它實施方案中，待去免疫的白蛋白結合結構域包含含有SEQ ID NO:1的至少35個連續氨基酸或由所述連續氨基酸組成的PEP的白蛋白結合片段。在其它實施方案中，待去免疫的白蛋白結合結構域包含含有SEQ ID NO:1的至少40個連續氨基酸或由所述連續氨基酸組成的PEP的白蛋白結合片段。
[0061]在其它實施方案中，待去免疫的白蛋白結合結構域包含至少兩個一起結合白蛋白并且各自獨立地包含SEQ ID NO:1的至少10個連續氨基酸的PEP的片段或由所述片段組成。在其它實施方案中，待去免疫的白蛋白結合結構域包含至少兩個一起結合白蛋白并且各自獨立地包含SEQ ID NO:1的至少15個連續氨基酸的PEP的片段。在其它實施方案中，待去免疫的白蛋白結合結構域包含至少兩個一起結合白蛋白并且各自獨立地包含SEQ IDNO:1的至少20個連續氨基酸的PEP的片段。在其它實施方案中，待去免疫的白蛋白結合結構域包含至少兩個一起結合白蛋白并且各自獨立地包含SEQ ID NO:1的至少10、至少20、至少30、至少40或至少50個連續氨基酸的PEP的片段或由所述片段組成。[0062]在一些實施方案中，待去免疫的白蛋白結合結構域包含對應于SEQ ID N0:1的氨基酸序列的衍生物的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成。在一些情況下，待去免疫的白蛋白結合結構域與SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性。
[0063]在某些實施方案中，待去免疫的白蛋白結合結構域相對于SEQ ID N0:1的氨基酸序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個氨基酸修飾(例如，插入、置換、缺失等)。可產生白蛋白結合結構域的氨基酸序列衍生物，從而使它們是置換、插入或缺失衍生物。缺失衍生物缺少天然多肽的一個或多個對于功能(例如，白蛋白結合)不是必需的殘基。插入突變體通常包括在肽中的非末端位點添加材料。置換衍生物通常在氨基酸序列內的一個或多個位點上包含一種氨基酸對于另一種氨基酸的交換，并且可被設計來調節肽的一種或多種性質，例如抗蛋白水解切割的穩定性，而不喪失其它功能或性質。該類型的置換優選是保守的，即，一種氨基酸被具有相似形狀和電荷的氨基酸替代。保守置換在本領域是公知的，包括例如如下變化:丙氨酸至絲氨酸；精氨酸至賴氨酸；天冬酰胺至谷氨酰胺或組氨酸?’天冬氨酸至谷氨酸；半胱氨酸至絲氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺；谷氨酸至天冬氨酸；甘氨酸至脯氨酸；組氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺；異亮氨酸至亮氨酸或纈氨酸；亮氨酸至纈氨酸或異亮氨酸；賴氨酸至精氨酸；甲硫氨酸至亮氨酸或異亮氨酸；苯丙氨酸至酪氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸；絲氨酸至蘇氨酸；蘇氨酸至絲氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸；以及纈氨酸至異亮氨酸或亮氨酸。
[0064]優選地，蛋白質的氨基酸的突變產生等同物，或甚至改進的第二代分子。例如，可用其它氨基酸置換氨基酸序列中的某些氨基酸而無可檢測的功能(例如，白蛋白結合)喪失。在產生這樣的變化中，可考慮氨基酸的親水指數。親水氨基酸指數在賦予蛋白質相互作用生物功能中的重要性在本領域中是通常被理解的。所接受的是氨基酸的相對親水性特征促成所得蛋白質的二級結構，這轉而確定蛋白質與其它分子的相互作用，例如與血清白蛋白分子的相互作用。基于它們的疏水性和電荷特征給每一個氨基酸分配親水指數；例如:異亮氨酸(+4.5);纈氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);甲硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);蘇氨酸(-0.7);絲氨酸(-0.8)；色氨酸0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);組氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);賴氨酸(-3.9);和精氨酸(-4.5)。本領域中還理解，可基于親水性有效地產生相似氨基酸的置換。與疏水性一樣，親水性的值已被分配給每一個氨基酸:精氨酸(+3.0);賴氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸(+3.0±1);絲氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(O);蘇氨酸(-0.4);脯氨酸(_0.5±1);丙氨酸(-0.5);組氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);纈氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);異亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。一般而言，等同分子可通過用一個氨基酸置換另一個氨基酸來獲得，其中它們的親水性指數在彼此的±2，優選±1內，或最優選±0.5內。所得的衍生物可顯示改善的溶解度、改善的穩定性和/或白蛋白結合，以及減小的免疫原性或本文中描述的和/或本領域已知的其它有利特征。具體地，免疫原性可通過利用免疫原性剖析分析鑒定的氨基酸置換來減小，如上文中描述的。[0065]因此，在一些實施方案中，提供了去免疫的PEP白蛋白結合結構域。在一些實施方案中，提供了被連接至治療性分子的去免疫PEP白蛋白結合結構域。“去免疫”結構域將已被突變來減少Th表位含量并且將包含一個或多個置換，所述置換通過減少或消除結合一個或多個HLA II類受體的表位來減小免疫原性。在一些實施方案中，去免疫PEP白蛋白結合結構域還包含促進結構域的表達和/或折疊，和/或促進包含去免疫PEP白蛋白結合結構域與另一種試劑的融合物的表達和/或折疊的突變，如在下文中更詳細描述的。
[0066]在一些實施方案中，去免疫PEP白蛋白結合結構域包含消除至少2個Th表位、至少3個Th表位、至少4個Th表位、至少5個Th表位、至少6個Th表位、至少8個Th表位、至少10個Th表位、至少12個Th表位或至少15個Th表位的置換。在優選實施方案中，相較于去免疫之前的結合，置換不影響或至少大體上不影響結構域或包含所述結構域的融合蛋白與血清白蛋白的結合。
[0067]備選地和/或此外，白蛋白結合結構域或其融合可被修飾來相較于其野生型PEP白蛋白結合結構域和/或其融合物增強溶解度。即，在一些實施方案中，氨基酸置換導致增加PEP白蛋白結合結構域和/或其融合物的溶解度。在一些實施方案中，試劑的溶解度可以至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍或更多增加。
[0068]在具體的實施方案中，待使其更為可溶的PEP白蛋白結合結構域包含對應于SEQID NOil(PEP)的氨基酸序列或由所述序列組成。具有增加的溶解度的PEP的變體在本文中還可稱為“PEP變體”。因此，本發明包括PEP白蛋白結合結構域的變體或其白蛋白結合片段或衍生物，所述 變體或片段或衍生物已通過本領域已知的和/或本文中描述的任何方法被修飾來減小免疫原性和/或增加溶解度。
[0069]在其它具體實施方案中，被使得更加可溶的PEP白蛋白結合結構域包含SEQ IDNO:1的白蛋白結合片段或由所述片段組成。在一些實施方案中，被使得更加可溶的白蛋白結合結構域包含含有SEQ ID NO:1的至少10個連續氨基酸或由其組成的PEP的白蛋白結合片段或由所述片段組成。在其它實施方案中，被使得更加可溶的白蛋白結合結構域包含含有SEQ ID NO:1的至少15個連續氨基酸或由所述連續氨基酸組成的PEP的白蛋白結合片段。在其它實施方案中，被使得更加可溶的白蛋白結合結構域包含含有SEQ ID N0:1的至少20個連續氨基酸或由所述連續氨基酸組成的PEP的白蛋白結合片段。在其它實施方案中，被使得更加可溶的白蛋白結合結構域包含含有SEQ ID NO:1的至少25個連續氨基酸或由所述連續氨基酸組成的PEP的白蛋白結合片段。在其它實施方案中，被使得更加可溶的白蛋白結合結構域包含含有SEQ ID NO:1的至少30個連續氨基酸或由所述連續氨基酸組成的PEP的白蛋白結合片段。在其它實施方案中，被使得更加可溶的白蛋白結合結構域包含含有SEQ ID NO:1的至少35個連續氨基酸或由所述連續氨基酸組成的PEP的白蛋白結合片段。在其它實施方案中，被使得更加可溶的白蛋白結合結構域包含含有SEQ ID NO:1的至少40個連續氨基酸或由所述連續氨基酸組成的PEP的白蛋白結合片段。
[0070]在其它實施方案中，被修飾來增加溶解度的白蛋白結合結構域包含至少兩個一起結合白蛋白并且每一個獨立地包含SEQ ID NO:1的至少10個連續氨基酸的PEP的片段或由所述片段組成。在其它實施方案中，被使得更加可溶的白蛋白結合結構域包含至少兩個一起結合白蛋白并且各自獨立地包含SEQ ID NO:1的至少15個連續氨基酸的PEP的片段。在其它實施方案中，被使得更加可溶的白蛋白結合結構域包含至少兩個一起結合白蛋白并且各自獨立地包含SEQ ID NO:1的至少20個連續氨基酸的PEP的片段。在其它實施方案中，被使得更加可溶的白蛋白結合結構域包含SEQ ID NO:1的至少10、至少20、至少30、至少40或至少50個連續氨基酸或由所述氨基酸組成。
[0071]在一些實施方案中，被使得更加可溶的白蛋白結合結構域包含對應于SEQ IDNO:1的氨基酸序列的衍生物的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成。在一些情況下，被使得更加可溶的白蛋白結合結構域與SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性。
[0072]在某些實施方案中，被使得更加可溶的白蛋白結合結構域相對于SEQ ID N0:1的氨基酸序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個氨基酸修飾(例如，插入、置換、缺失等)。可產生白蛋白結合結構域的氨基酸序列衍生物而使得它們是置換、插入或缺失衍生物，如上文中針對去免疫變體所描述的。[0073]備選地和/或此外，所述白蛋白結合結構域或其融合物可被修飾來減小免疫原性。
[0074]在具體的實施方案中，本發明的PEP白蛋白結合結構域包含對應于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其白蛋白結合片段或衍生物，其是去免疫的和/或溶解的。在一些特別的實例中，PEP通過至少一個選自E12D、T29H-K35D和A4?的氨基酸置換被去免疫，其中置換的編號參照SEQ ID NO:1中的氨基酸位置。在一些具體的實施方案中，PEP通過對應于E12D的氨基酸置換被去免疫，其中置換的編號參照SEQ ID NO:1中的氨基酸位置。在一些具體的實施方案中，PEP通過一對對應于T29H-K35D的氨基酸置換被去免疫，其中置換的編號參照SEQ ID NO:1中的氨基酸位置。在一些具體的實施方案中，PEP通過對應于A4?的氨基酸置換被去免疫，其中置換的編號參照SEQ ID NO:1中的氨基酸位置。在具體的一些實施方案中，PEP通過對應于E12D和T29H-K3?的氨基酸置換被去免疫，其中置換的編號參照SEQ ID NO:1中的氨基酸位置。在一些具體的實施方案中，PEP通過對應于E12D和A4?的氨基酸置換被去免疫，其中置換的編號參照SEQ ID NO:1中的氨基酸位置。在一些具體的實施方案中，PEP通過對應于T29H-K3?和A4?的氨基酸置換被去免疫，其中置換的編號參照SEQ ID NO:1中的氨基酸位置。在一些具體的實施方案中，PEP通過對應于E12D、T29H-K3?和A4?的氨基酸置換被去免疫，其中置換的編號參照SEQ ID NO:1中的氨基酸位置。在一些特別優選的實施方案中，將PEP去免疫來包含對應于SEQ ID N0:31的氨基酸序列。SEQ ID NO:31是指特定的去免疫PEP變體，其在本文中也稱為“PEP DI”。
[0075]在優選的實施方案中，增加溶解度和/或減小免疫原性的修飾不影響或大體上不影響白蛋白結合結構域對白蛋白的結合。在一些情況下，本發明的去免疫和/或溶解的白蛋白結合結構域、其白蛋白結合片段或衍生物或其與治療性分子的綴合物或融合物對白蛋白的親和力為至少OjXio9M'在其它情況下，所述親和力為至少IXlO4M'至少I X IO5M'至少 I X IO6M'至少 I X IO7M'至少 I X IO8M'至少 I X IO9M'至少 2 X IO9M'至少 3 X IO9IT1、至少 4 X IO9IT1、至少 5 X IO9IT1、至少 6 X IO9IT1、至少 7 X IO9IT1、至少 8 X IO9IT1 或至少9Χ109Μ'白蛋白結合可通過本領域已知的任何技術來測量。在某些情況下，白蛋白結合可通過體外測定例如于例如Epps等人(1999) J.Pharm.Pharmacol.51:41-48 ；Nguyen,等人(2006)Prot.Engin.Design Select.19:291-297 ；ffeisiger,等人(2001)J.Biol.Chem.，276:29953-29960中描述的那些測定來測量。
[0076]可在修飾以增加溶解度和/或減小免疫原性之前、期間或之后將分離的白蛋白結合結構域、其白蛋白結合片段或衍生物連接至一種或多種治療性分子。治療性分子特別包括抗體或其片段。在優選實施方案中，連接是融合物，其產生結合血清白蛋白同時維持原始的對各自抗原的結合親和力，同時不增加免疫原性(或大體上不增加免疫原性)和/或同時不降低溶解度(或大體上不降低溶解度)的產物，如下文中更詳細描述的。
[0077] 3.治療性分子
[0078]本發明的另一個方面涉及治療性分子與本文中描述的經修飾的PEP白蛋白結合結構域的綴合物和/或融合物。例如，PEP的去免疫白蛋白結合結構域、其白蛋白結合片段或衍生物可用于產生與治療性分子的綴合物和/或融合物來改善穩定性和/或血清半衰期，而不加劇免疫原性，同時維持(或大體上維持)生物利用度和/或生物活性。類似地，溶解的PEP的白蛋白結合結構域、其白蛋白結合片段或衍生物可用于制造與治療性分子的綴合物和/或融合物來改善穩定性和/或血清半衰期，而不加劇不溶解性，同時維持(或大體上維持)生物利用度和/或生物活性。不受理論束縛，策略包括與白蛋白的高親和力非共價相互作用來改善血清半衰期，其中使用已被去免疫和/或被使得更加可溶的構建體。本發明的白蛋白結合結構域至治療性分子的偶聯可允許與血清白蛋白體內締合，這轉而可延長多肽的半衰期和/或改善貯存和穩定性。此外，增加的溶解度促進制造、配制、貯存和/或生物利用度的容易性。因此，白蛋白結合結構域可用于產生與治療性分子的綴合物和/或融合物來改善貯存、穩定性、溶解度和/或血清半衰期，優選同時維持生物利用度和/或生物活性,而不加劇免疫原性。
[0079]根據本發明的經修飾的白蛋白結合結構域可連接至治療性分子或治療劑。或者，可將白蛋白結合結構域連接至治療性分子或治療劑，隨后使其經歷修飾例如以增加溶解度和/或減小免疫原性。“治療劑”在本文中可與“治療性分子”互換使用，并且包括修飾給定的生物反應的任何試劑。除非特別地另有所指，否則“治療劑”包括可預防性地使用和/或可診斷性使用的試劑。治療劑也不被解釋為受限于經典化學治療劑(化學療法)。例如，治療劑可以是藥物(例如，小的有機分子)、藥物部分、放射性活性材料、大環螯合劑、SiRNA分子或修飾生物反應的蛋白質。
[0080]“治療性蛋白”是具有一種或多種治療和/或生物活性(具體地，可用于治療、預防、減慢或減輕疾病的生物活性)的蛋白質、多肽、肽、抗體或其片段或變體。術語“治療性蛋白”可與“蛋白質治療劑”互換使用。可由治療性蛋白具有的生物活性的非窮盡清單包括:細胞的HIV感染的抑制、腸上皮細胞增殖的刺激、減小腸上皮細胞通透性、刺激胰島素分泌、支氣管擴張和血管舒張的誘導、醛固酮分泌的抑制、血壓調節、促進神經元生長、增強免疫反應、抑制免疫反應、減少血小板聚集、受體結合、增加或減少炎癥、食欲的抑制或本文中描述的生物活性的任一種或多種。本發明包括的治療性蛋白包括但不限于蛋白質、多肽、肽、抗體和生物制品。(術語肽、蛋白質和多肽在本文中可互換使用)。在一些實施方案中，本發明的治療劑包含治療性蛋白的片段或變體，例如抗體的片段或變體。此外，術語“治療性蛋白”可指治療性蛋白的內源性或天然存在的相關物。
[0081]顯示“治療活性的”多肽或“在治療上具有活性的”蛋白質意指具有與治療性蛋白(例如本文中描述的或另外地本領域已知的治療性蛋白的一種或多種)相關的一種或多種已知的生物活性和/或治療性活性的多肽。作為非限制性實例，治療性蛋白是可用于治療、預防、減慢或減輕疾病、病況或障礙的蛋白質。治療性蛋白還可以是特異性結合特定細胞類型(正常的(例如，淋巴細胞)或異常的例如(癌細胞))，從而可被用于將化合物(藥物或細胞毒性劑)特異性靶向該細胞類型的蛋白質。
[0082]蛋白質治療劑包括但不限于腫瘤壞死因子-α (TNF-α )、抗-TNF-α抗體及其抗體片段、馮.維勒布蘭德(von Willebrand)因子(vWF)、抗-vWF抗體及其抗體片段、表皮生長因子(“EGF”)或抗-EFG抗體、魚精蛋白、蛋白A、G蛋白、蛋白質轉導結構域(參見例如，Bogoyevitch等人，2002，DNA Cell Bioll2:879-894,將其通過引用整體并入本文)；毒素例如相思豆毒蛋白、蓖麻蛋白、蓖麻蛋白A、假單胞菌外毒素(例如，PE-40)或白喉毒素；白樹毒素和美洲商陸抗病毒蛋白；蛋白質例如腫瘤壞死因子；干擾素，包括但不限于α-干擾素(IFN-α)、β-干擾素(IFN-β)、神經生長因子(NGF)、血小板衍生生長因子(TOGF)，組織纖溶酶原激活物(ΤΡΑ)，細胞 凋亡劑(例如，TNF-a, TNF-β, AIM I，如PCT公布號W097/33899 中描述的),AIM II (參見，例如，PCT 公布號 W097/34911)，Fas 配體(Takahashi等人，J.1mmunol.,6:1567-574, 1994)和 VEGI (PCT 公布號 W099/23105)，血栓形成劑或抗-血管生成劑(例如，血管抑素或內皮抑素)；或生物反應修飾劑例如淋巴因子(例如，白細胞介素_1( “11-1”)、白細胞介素-2( “IL-2”)、白細胞介素-6( “IL-6”)、，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(“GM-CSF”)和粒細胞集落刺激因子(“G-CSF”))、巨噬細胞集落刺激因子(“M-CSF”)或生長因子(例如，生長激素(“GH”))；蛋白酶或核糖核酸酶、抗體、單克隆抗體、其抗體片段、單結構域抗體、二聚體以及其它非抗體蛋白質，例如可溶性受體或受體片段以及感染性試劑的抗原。
[0083]蛋白質治療劑還可包括全長序列的部分。治療性蛋白部分的非窮盡清單包括但不限于 IFNn、ANP、BINP、LANP、VDP、KUP、CNP、DNP、HCC-l、β 防衛素 _2、fractalkine、胃泌酸調節素、致死毒素肽、--ΜΡ-4、ΡΥΥ、腎上腺髓質素、葛瑞林、CGRP、IGF-1、神經氨酸苷酶、血凝素、丁酰膽堿酯酶、內皮素和機械生長因子。
[0084]非蛋白質治療劑包括但不限于抗代謝藥(例如，甲氨蝶呤、6-巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷和5-氟尿嘧啶達卡巴嗪)、烷化劑(例如，氮芥、噻替派苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉素C以及順二氯二氨鉬(II) (DDP)順鉬)、蒽環類(例如，柔紅霉素(先前稱為道諾霉素)和多柔比星)、抗生素(例如，更生霉素(dactinomycin)(先前為放線菌素(actinomycin))、博來霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))和抗-有絲分裂劑(例如，長春新堿和長春堿)等。
[0085]非蛋白質治療劑的其它具體實例包括細胞毒素(例如，細胞生長抑制劑或殺細胞齊?)或放射性元素或大環螯合劑。細胞毒素或細胞毒性試劑包括對細胞有害的任何試劑。實例包括紫杉醇、細胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、依米丁(emetine)、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、長春新堿、長春堿、秋水仙堿、多柔比星、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、1-去氫睪酮(dehydrotestosterone)、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素及其類似物或衍生物)。放射性元素可包括本領域已知的用于標記(即，產生可體內或體外檢測的信號)和/或產生治療作用(例如，1251、1311、14C等)的放射性核素(例如，α-、β_、Y-發射物等)。大環螯合劑可包括本領域已知的用于綴合放射性金屬離子的那些大環螯合劑。在某些實施方案中，大環螯合劑為1，4，7，10-四氮雜環十二烷-N，N’，N〃，N〃-四乙酸(DOTA)，其可通過連接子分子連接于抗體。此類連接子分子在本領域內是公知的并且被描述于 Denardo 等人，1998, Clin Cancer Res.4:2483-90 ;Peterson 等人，1999, Bioconjug.Chem.10:553 ;和 Zimmerman 等人,1999, Nuc1.Med.Biol.26:943-50 中，將所述每一篇文獻通過引用整體并入本文。
[0086]在一些實施方案中，可將非蛋白質治療劑本身綴合于另一種蛋白質，例如治療性蛋白，這可修飾給定的生物反應。隨后將綴合物與本發明范圍內的去免疫白蛋白結合結構域組合。用于將治療劑綴合于蛋白質例如抗體的技術是公知的；參見，例如，Arnon 等人,“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy”，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld 等人(編輯)，1985，pp.243 56,Alan R.Liss, Inc.；Hellstrom 等人，“Antibodies For DrugDelivery”, in Controlled Drug Delivery (第 2 版)，Robinson 等人(編輯)，1987，pp.62353, Marcel Dekker,Inc.；Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents InCancer Therapy:A Review，，，in Monoclonal Antibodies' 84:Biological And ClinicalApplications, Pinchera 等人(編輯),1985,pp.475 506 ;〃Analysis, Results, AndFuture Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibodies In CancerTherapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin 等人(編輯)，1985, pp.303 16, Academic Press ；和 Thorpe 等人，Immunol.Recombinantexpression vector. , 62:119 58,1982。
[0087]在一些實施方案中，可以例如在連接于根據本發明的經修飾的白蛋白結合結構域之前、之后或期間修飾治療性蛋白本身以產生衍生物。具體地，本發明包括已通過本領域已知的和/或本文中描述的任何方法修飾的去免疫PEP白蛋白結合結構域-結合的治療性蛋白，其可增加或改善治療性蛋白的血清半衰期，增加構建體的溶解度和/或減小構建體的免疫原性。例如，但非限制性地，衍生物包括已被修飾的治療性蛋白，例如通過糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、利用已知的保護/封閉基團衍生、蛋白質水解切割、至細胞配體或其它蛋白質的連接等。眾多化學修飾中的任何修飾可通過已知的技術(包括但不限于特異性化學斷裂、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代謝合成等)來進行。此外，衍生物可包含一種或多種非經典氨基酸。即，另一種延長本發明的分子的血清半衰期，改善溶解度和/或減小免疫原性的修飾，涉及使用非天然氨基酸(例如D型的)和/或使用氨基酸類似物例如氨基酸的含硫形式。在某些實施方案中，對氨基酸殘基的反應性側鏈(例如谷氨酸中的羧基側鏈)封端。封端可使用任何適當的封端基團(如本文中已知的)來實現。作為另外的實例，可通過在治療性蛋白中包含另外的抗原結合結構域(所述結構域免疫特異性地結合例如纖連蛋白)來增加或改善去免疫PEP白蛋白結合結構域-結合的治療性蛋白的血清半衰期。
[0088]作為具體的實例，作為細胞表面蛋白或分泌性蛋白的治療性蛋白可通過連接一個或多個寡糖基團來進行修飾。稱為糖基化的修飾可顯著地影響蛋白質的物理性質，并且在蛋白質穩定性、分泌和定位中可以是重要的。糖基化在沿著多肽主鏈的特定位置上發生。通常存在兩個主要類型的糖基化:特征在于O連接寡糖的糖基化，其被連接于絲氨酸或蘇氨酸殘基；和特征在于N連接寡糖的的糖基化,其被連接于Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列中的天冬酰胺殘基，其中X可以是除脯氨酸外的任意氨基酸。N-乙酰神經氨酸(也已知為唾液酸)通常是N-連接和O-連接的寡糖的末端殘基。變量例如蛋白質結構和細胞類型影響鏈內不同糖基化位點處的糖單位的數目和性質。糖基化異構體在給定的細胞類型內的相同位點處也是常見的。可修飾根據本發明使用的治療性蛋白例如細胞表面蛋白和分泌性蛋白，從而使一個或多個位點處的糖基化被改變。這可通過本領域已知的任何技術實現，例如通過它們對應的核酸序列的操作，通過其中表達它們的宿主細胞，或歸因于它們表達的其它條件。例如，糖基化異構體可通過消除或引入糖基化位點來產生，例如通過氨基酸殘基的置換或缺失，例如谷氨酰胺對天冬酰胺的置換；或非糖基化重組蛋白可通過在將不糖基化它們的宿主細胞中(例如在大腸桿菌(E.coli)或糖基化缺陷型酵母)表達蛋白質來產生。
[0089]根據本發明使用的蛋白質治療劑可包含對C和/或N末端的修飾，所述修飾包括但不限于酰胺化或乙酰化，并且其還可改善血清半衰期。乙酰化是指COCH3基團的引入并且可在蛋白質或其片段的氨基末端或賴氨酸側鏈上發生。因此，在某些實施方案中，通過乙酰化修飾治療性蛋白例如免疫特異性分子的氨基末端。在某些實施方案中，通過乙酰化修飾治療性蛋白例如免疫特異性分子中的賴氨酸側鏈。在其它實施方案中，在氨基末端和一個或多個賴氨酸側鏈上乙酰化治療性蛋白例如免疫特異性分子。
[0090]作為另一個具體實例，蛋白質的血清半衰期還可通過連接聚合物分子例如高分子量聚乙二醇(PEG)來增加。PEG可被連接至多肽或其片段，所述多肽或其片段具有或不具有多功能連接子，所述連接是通過PEG至N-或C-末端的位點特異性綴合，或通過存在于賴氨酸殘基上的ε-氨基。可使用導致生物活性的最少喪失和/或免疫原性的最小增加的線性或分枝聚合物衍生化。可以密切監控綴合的程度(例如通過SDS-PAGE和質譜法)以確保PEG分子至本發明的試劑的恰當綴合。可以通過例如尺寸排阻或離子交換層析將未反應的PEG與多肽-PEG綴合物分離。
[0091]本領域已知的增加血清半衰期的其它方法包括至抗體結構域(包括但不限于抗體恒定區，包括Fe和/或鉸鏈區(參見例如，美國專利號5，565，335和6，277，375))的綴合和/或融合；和/或至干擾素、胸腺素靶向肽和/或通透性增強蛋白(參見，例如，美國專利N0.6，319，691和5，643，570)的綴合和/或融合。修飾(例如糖基化、酰胺化、乙酰化和聚乙二醇化)可引入另外的免疫原性位點，例如另外的Th表位，增加構建體的免疫原性，從而期望另外的去免疫化。類似地，修飾(例如糖基化、酰胺化、乙酰化和聚乙二醇化)可減小構建體的溶解度，從而用于保持或改善溶解度的另外的修飾是期望的。
[0092]本發明還包括脂質體用于延長或增加本發明的試劑的血清半衰期的用途。在某些實施方案中，可使用先前描述的方法將治療性蛋白(例如包含VL或VH結構域和白蛋白結合結構域的免疫特異性分子)綴合至脂質體，參見，例如，Martin等人，1982，J.Biol.Chem.257:286_288，將所述參考文獻通過引用整體并入本文。本發明還包括適合用于特異性器官靶向(參見，例如，美國專利N0.4，544，545)或特異性細胞靶向(參見例如，美國專利申請公布號2005/0074403)的脂質體。
[0093]可通過與本文中描述的經修飾的白蛋白結合結構域組合來改善的治療劑可以是任何試劑，但通常是在少于兩周中從身體消除的試劑。在一些實施方案中，所述試劑在少于I周中被消除。在具體實施方案中，所述試劑在少于6天中，或在少于5天中，或在少于4天中，或在少于3天中或在少于2天中，或在少于I天中被消除。在更具體的實施方案中，試劑具有24小時或更短，或23小時或更短，或22小時或更短，或21小時或更短，或20小時或更短，或19小時或更短，或18小時或更短，或17小時或更短，或16小時或更短，或15小時或更短，或14小時或更短，或13小時或更短，或12小時或更短，或11小時或更短，或10小時或更短，或9小時或更短，或8小時或更短，或7小時或更短，或6小時或更短，或5小時或更短，或4小時或更短，或3小時或更短，或2小時或更短的血清半衰期(t1/2)。
[0094]在一些實施方案中，本發明的修飾(例如，去免疫的)的白蛋白結合結構域的連接改變了治療性分子的生物利用度，例如，在至粘膜表面或其它靶組織的轉運方面增加或減少生物利用度。
[0095]在某些實施方案中，連接至根據本發明的經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域增加治療劑在宿主中的半衰期。在一些實施方案中，治療劑在宿主中的半衰期以約 10%、約 20%、約 30%、約 40%、約 50%、約 60%、約 70%、約 80%、約 90%、約 100%、約150%、約200%、約300%、約500%、約1000%或更多增加。在其它實施方案中，連接至根據本發明的經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域使治療劑在宿主中的半衰期相較于單獨的試劑(未連接至經修飾的白蛋白結合結構域)的半衰期以至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍或更多增加。
[0096]在一些實施方案中，連接至根據本發明的經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域使治療劑從宿主的消除減少至少I天，至少2天,至少3天,至少4天,至少5天，至少I周或更多長。在一些實施方案中，連接至根據本發明的經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域的治療劑具有約10小時、約20小時、約30小時、約35小時、約40小時、約45小時、約50小時、約55小時、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天或更長，例如約3周、約4周或更長的血清半衰期(t1/2)。在一些具體的實施方案中，連接至根據本發明的經修飾的白蛋白結合結構域的抗-TNF-α多肽具有約35至約42小時的半衰期，例如，其中構建體對應于SEQ ID NO: 33。為了比較，在一些具體的實施方案中，未連接至經修飾的白蛋白結合結構域的抗-TNF- α多肽可具有僅約2至約5小時的半衰期，例如，其中二聚體對應于SEQ ID Ν0:32。
[0097]4.抗體
[0098]在具體實施方案中，治療劑是包含至少一種抗體或其片段(其可被綴合和/或融合至根據本發明的經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域))的治療性蛋白。這樣的治療劑可被稱為“治療性抗體”或“抗體治療劑”。融合或綴合至根據本發明的去免疫PEP白蛋白結合結構域提供了去免疫PEP白蛋白-結合結構域-抗體融合物或綴合物。這樣的抗體融合物和綴合物可通過本領域已知的任何方法來產生，例如，融合物可通過化學合成或重組技術來制造。參見實施例2。
[0099]備選地，將至少一種PEP白蛋白結合結構域、其白蛋白結合片段或衍生物連接至包含至少一種抗體或其片段的治療性蛋白，并且修飾構建體，例如對構建體進行去免疫，從而減少或消除白蛋白結合結構域中的至少一個Th表位。參見實施例3。
[0100]在一些優選的實施方案中，延長綴合和/或融合的抗體或其片段的體內半衰期，同時使免疫原性相較于未融合或未綴合的試劑減小或至少不增加(或不顯著增加)。在一些優選的實施方案中，延長綴合和/或融合的抗體或其片段的體內半衰期，同時溶解度相較于未融合或未綴合的試劑得到增加或至少不減小(或不顯著減小)。參見實施例4-6。
[0101] 在具體的實施方案中，抗體治療劑是單結構域抗體，具體地，包括其二聚體，例如VL-VL 二聚體和VH-VH 二聚體。在具體的實施方案中，抗體治療劑是單克隆抗體、多特異性抗體、人源化抗體、合成抗體、嵌合抗體、多克隆抗體、單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、抗獨特型(抗-1d)抗體(包括例如，針對本發明的抗體的抗-1d和抗-抗-1d抗體)、雙抗體、微型抗體、納米抗體或上述任何抗體的抗原結合片段，包括但不限于Fab片段、F(ab’ )片段、二硫化物連接的雙特異性Fvs (sdFv)和/或胞內抗體。抗體治療劑還可包括抗體分子的其它部分，例如，Fe結構域、CH1結構域、CH2結構域、CH3結構域、CL結構域等。治療劑可包括可來源于任何物種(例如，兔、小鼠、大鼠)的免疫球蛋白分子，但通常為人免疫球蛋白分子。免疫球蛋白可為任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)和/或種類(例如，IgG1'IgG2、IgG3、IgG4UgAjP IgA2)和/或亞類。通常地，經修飾的PEP白蛋白結合結構域-結合的抗體或其抗原結合片段結合抗原的相同表位，并且在某些實施方案中可以是人源化的。
[0102]可適合于與本發明一起使用的單克隆抗體的實例包括但不限于在名稱Remicade?
下銷售并且用于治療類風濕關節炎和克羅恩病的英夫利昔單抗；在名稱Humira?下銷
售的阿達木單抗和在名稱Simponi?下銷售的戈利木單抗,兩者也用于治療類風濕關節
炎；巴利昔單抗，用于治療腎移植物的急性排斥；貝伐珠單抗(人源化的)，用作抗-血管生成性癌癥治療劑；阿昔單抗，用于在冠狀動脈血管成形術中防止凝固；達珠單抗(人源化的)，也用于治療腎移植物的急性排斥；吉妥珠單抗(人源化的)，用于治療復發的急性骨髓性白血病；阿侖珠單抗(人源化的)，用于治療B細胞白血病；利妥昔單抗，用于治療非何杰金氏淋巴瘤；帕利珠單抗(人源化的)，用于治療兒童的Rsv感染；曲妥珠單抗(人源化
的)，在名稱Herceptin?下銷售并且用作一些類型的乳腺癌的抗-癌療法;尼妥珠單抗
(人源化的)，目前正處于臨床試驗中，等等。
[0103]在特別優選的實施方案中，治療劑包含抗TNF-α的抗體，如在下文中更詳細討論的。
[0104]在某些實施方案中，治療劑包括可綴合和/或融合至根據本發明的經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域的可溶性受體。這樣的可溶性受體融合物和綴合物可通過本領域已知的任何方法產生，例如，融合物可通過化學合成或重組技術來制造。可溶性
受體的實例包括例如依那西普,其在名稱Enbrel?下銷售并且用于治療免疫疾病例如類
風濕關節炎、青少年特異性關節炎、強直性脊柱炎、牛皮癬關節炎和斑塊狀銀屑病。在優選的實施方案中，綴合和/或融合的可溶性受體或其片段的體內半衰期被延長，同時，相較于未綴合或未融合的試劑，綴合物或融合物的免疫原性被減小，或不增加，或未實質上增加。備選地，或此外，在優選實施方案中，綴合和/或融合的可溶性受體或其片段的體內半衰期被延長，同時相較于未綴合或未融合的試劑，綴合物或融合物的溶解度被增加，未減少或未實質上減少。
[0105]在某些實施方案中，包含經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域-結合的抗體的試劑是雙特異性的或多特異性的。可使用本領域公知的方法形成雙特異性或多特異性分子，例如使本文中描述的或本領域已知的一個或多個分子彼此和/或與不同表位結合多肽融合或化學綴合，其中雙特異性或多特異性分子的結合結構域顯示對于至少兩種不同抗原的親和力。例如，經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域與抗體或抗體片段的融合物包含第一和第二 VL結構域，或第一和第二 VH結構域，其中所述第一和第二結構域具有不同的結合特異性(即，結合不同抗原)。在其它實施方案中，融合物可包含一個VL，或一個VH結構域，和/或一個抗原結合多肽，其中VL結構域，或VH結構域，和/或抗原結合多肽顯示不同的結合特異性(即結合不同的抗原)。在一些優選實施方案中，融合物包含兩個結合相同靶的VL結構域，例如，抗TNF-α的VL-VL異二聚體，如在下文中更詳細描述的。
[0106]在某些實施方案中，包含結合至經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域的抗體或其抗原結合片段的試劑不包含VH結構域，例如兔VH結構域，和/或不包含來源于兔之外的任何物種的VH結構域。在其它實施方案中，試劑不包含VL結構域和/或不包含來源于兔之外的任何物種的VL結構域。在某些實施方案中，包含結合至抗體或其抗原結合片段的經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域的試劑結合抗原的表位，所述抗原在某些物種例如小鼠和/或大鼠中為免疫中性的或非免疫原性的。在某些實施方案中，包含結合至經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域的抗體或其抗原結合片段的試劑不包含VH結構域，例如 人VH結構域，和/或不包含來源于人之外的任何物種的VH結構域。在其它實施方案中，試劑不包含VL結構域和/或不包含來源于人之外的任何物種的VL結構域。
[0107]在某些實施方案中，包含結合至抗體或其抗原結合片段的修飾(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域的試劑不包含CH1結構域。在其它實施方案中，試劑不包含CH1結構域、CH2結構域、CL結構域、CH3結構域，或H結構域(鉸鏈區)的一個或多個，或不包含CHi結構域、CH2結構域、CL結構域、CH3結構域或H結構域(鉸鏈區)的任一個。在其它實施方案中，試劑包含CH1結構域、H結構域(鉸鏈區)、CH2結構域、(^結構域或CH3結構域之一，并且不包含來源于免疫球蛋白的任何其它恒定結構域或鉸鏈區(例如，在某些實施方案中，試劑包含CH1結構域，但不包含H結構域(鉸鏈區)、CH2結構域或CH3結構域的任一個；或包含CH2結構域，但不包含CH1結構域、H結構域(鉸鏈區)或CH3結構域的任一個，等)。在一些實施方案中，包含結合至抗體或其抗原結合片段的經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域的試劑僅包含重鏈，僅包含輕鏈，僅包含VH結構域，僅包含VL結構域，或上述片段和/或結構域的任意組合。
[0108]在某些實施方案中，包含結合至抗體或其抗原結合片段的經修飾的(例如，去免疫的)ΡΕΡ的本發明的試劑包含一個或多個支架殘基變化，所述殘基變化改善試劑的穩定性和/或抗原結合親和力；和/或進一步減小構建體的免疫原性。對于本領域技術人員來說是已知的標準技術可用于在編碼治療性抗體或其片段的核苷酸序列中引入突變，所述技術包括例如定點誘變和PCR介導的誘變，這產生氨基酸置換。在某些實施方案中，衍生物具有在一個或多個預測的非必需氨基酸殘基中產生的保守氨基酸置換。
[0109]本發明還包括連接至治療劑和另外的抗原結合結構域例如異源多肽(即，無關的多肽；或其部分，通常為所述多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100個氨基酸)以產生融合蛋白的經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域。例如，可將治療性蛋白融合或綴合于抗體單結構域或其二聚體構建體、Fab片段，Fe片段，Fv片段，F(ab)2片段，scFv,微型抗體，納米抗體或其部分。用于將多肽融合或綴合于抗體部分的方法在本領域是已知的。參見，例如，美國專利號 5，336，603,5, 622，929,5, 359，046,5, 349，053,5, 447，851 和 5，112，946 ；EP307, 434 ；EP367, 166 ;國際公布號 W096/04388 和 W091/06570 ；Ashkenazi 等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:10535-10539 ；Zheng 等人，1995，J.1mmunol.154:5590-5600 ；和 Vil 等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:11337-11341。
[0110]通過將經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域-結合的治療性分子融合或綴合于對于特定細胞表面受體是特異性的其它分子，可在體外或體內將治療劑靶向特定細胞類型。這樣的融合或綴合可產生本發明的雙特異性或多特異性多肽。體外用途包括例如使用本領域已知的方法的體外免疫測定和純化方法。參見，例如，PCT公布號 W093/21232 ；EP439, 095 ；Naramura 等人，1994，Immunol.Lett.，39:91-99 ;美國專利號 5,474,981 ;Gillies 等人，1992，Proc Natl Acad Sci, 89:1428-1432 ;和 Fell 等人，1991，J.1mmunol.，146:2446-2452，將所述每一篇專利和文獻通過引用整體并入本文。[0111]在某些實施方案中，人源化本發明的治療性蛋白和/或其片段。人源化提供了減小本發明的試劑的免疫原性的備選策略或另外的策略。人源化多肽是這樣的多肽:其包含至少一個能夠免疫特異性結合預定抗原的免疫球蛋白可變結構域(或其變體或片段)，并且包含具有大體上為人免疫球蛋白的氨基酸序列的框架區(FR)，以及具有大體上為非人免疫球蛋白的氨基酸序列的CDR。一般而言，人源化分子例如人源化抗體將包含至少I個、通常2個可變結構域的大體上全部，其中高變區的全部或大體上全部對應于非人免疫球蛋白或可變結構域的高變區；然而框架區的全部或大體上全部是人免疫球蛋白序列的框架區。對于治療性蛋白(特別是抗體)的一些用途，可優選將人源化分子用于例如人的體內使用和體外檢測測定。
[0112]—般而言，通過利用來自非人物種的具有期望的特異性、親和力和/或能力的高變區(供體抗體；例如，來自兔VH或VL結構域的供體CDR)殘基替代人免疫球蛋白(或可變結構域和/或其片段)的高變區殘基來產生人源化抗體。人們稱供體分子已通過“人源化”的過程被“人源化”，因為所得的人源化分子預期與提供CDR的供體抗體結合相同的抗原。例如，可構建包含一個或多個來自兔供體抗體的CDR和來自人免疫球蛋白的框架區的人源化抗體。
[0113]經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域與抗體或抗體片段的人源化融合物或綴合物可包含例如選自任何種類的人免疫球蛋白(包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)以及任何同種型(包括IgGp IgG2, IgG3和IgG4)的受體抗體，其中一個或多個高變區殘基被替代。在一些情況下，人免疫球蛋白(受體抗體)或其片段的FR殘基也被對應的非人殘基替代。通常地，框架區中的框架殘基被來自CDR或可變結構域供體的對應殘基置換，以改變(優選改善)抗原結合。這些框架置換通過本領域公知的方法被鑒定，例如通過CDR與框架殘基的相互作用的建模以鑒定對于抗原結合是重要的框架殘基，和通過序列比較以鑒定特定位置處的罕見框架殘基。(參見，例如，Queen等人，美國專利號5，585，089 ;美國公布號 2004/0049014 和 2003/0229208 ;美國專利號 6，350，861 ;6，180，370 ;5，693，762 ；5,693，761 ;5，585,089 ;和 5，530，101 以及 Riechmann 等人，1988，Nature332:323，將全部所述專利和參考資料通過引用整體并入本文)。[0114]在一些實施方案中，經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域與抗體或其抗原結合片段的融合物或綴合物包含人源化分子，其中將至少一個來自供體兔可變結構域的⑶R移植至受體框架區。在其它實施方案中，將至少2個，更常見地全部3個供體兔VH和/或VL結構域的⑶R移植至受體框架區。在一些實施方案中，治療性分子不包含完整免疫球蛋白，或可包含單個免疫球蛋白可變結構域(例如，％或'結構域)或兩個單結構域的二聚體，但可能不包含任何其它免疫球蛋白結構域或區域(例如，Fe, CH1, CH2, CH3^CL等)。
[0115]恒定區不需要存在，但如果它們存在，則它們優選與人免疫球蛋白恒定區大體上同一，即，至少約85-90%，通常地約95%或更高的同一。因此，根據其中治療性分子包含人源化免疫球蛋白的實施方案，所述免疫球蛋白的所有部分(除CDR外)與天然人免疫球蛋白序列的對應部分大體上同一。例如，人源化分子可包含與天然人免疫球蛋白序列的對應部分大體上同一的CL和/或CH1結構域和/或免疫球蛋白恒定區(Fe)的至少一部分。此外，人源化分子可包含未在受體抗體或供體抗體中發現的殘基。可進行這些修飾來進一步改善功能性，例如免疫原性。可進行其它修飾來在期望的宿主例如人中減小免疫原性和/或增加溶解度，如上文中詳述的。
[0116]在一些實施方案中，本發明的人源化分子是衍生物。這樣的人源化分子在非人例如兔CDR的一個或多個中包含氨基酸殘基置換、缺失或添加。本發明的人源化分子的衍生物，當與本發明的非衍生人源化分子相比較時，可具有大體上相同的結合、更好的結合或更差的結合。在具體實施方案中，CDR的1、2、3、4或5個氨基酸殘基被置換、缺失或添加(即，突變)。然而，這樣的突變通常不廣泛。通常地，至少75%、更常見地90%、最常見地超過95 %的人源化殘基將對應于親本FR和CDR序列的殘基。如本文中所用，由術語“人源化抗體”包括的其它修飾包括蛋白質和/或抗體表面再建的方法例如美國專利5，770，196 ；5，776,866 ;5，821，123 ;和5，896，619 (每一個都屬于Studnicka等人)(將其每一個通過引用整體并入本文)中描述的那些方法。
[0117]在某些實施方案中，本發明的人源化分子還包含免疫球蛋白恒定區(Fe)(通常地人免疫球蛋白的恒定區)的至少部分。可關于所提出的抗體功能(特別是可能需要的效應子功能)選擇人源化抗體的恒定結構域。在一些實施方案中，本發明的人源化分子的恒定結構域是人IgA，IgE, IgG,或IgM結構域。在具體的實施方案中，當期望將本發明的人源化分子用于治療性用途以及需要抗體效應子功能時，使用人IgG恒定結構域，特別是IgG1和IgG3同種型的恒定結構域。例如，恒定結構域可包含補體固定恒定結構域，其中期望人源化分子例如抗體顯示細胞毒性活性，并且種類通常為IgG115在備選的實施方案中，當期望本發明的人源化分子用于治療目的并且不需要抗體效應子功能時，使用1862和IgG4同種型。例如，如果細胞毒性活性不是想要的，則恒定結構域可為18匕種類的。本發明的人源化分子還可包含來自超過一個種類或同種型的序列，并且選擇特定的恒定結構域來最優化期望的效應子功能在本領域技術人員的能力之內。
[0118]人源化分子(特別是抗體)可使用本領域已知的多種技術來產生，所述技術包括但不限于CDR移植(歐洲專利號EP239，400 ;國際公布號W091/09967 ;和美國專利號5，225，539、5，530，101和5，585，089)、壤飾(veneering)或表面再建(歐洲專利N0.EP592,106 和 EP519, 596 ；Padlan, 1991, Molecular Immunology28(4/5):489-498 ；Studnicka 等人,1994, Protein Engineering? (6): 805-814 ;和 Roguska 等人,1994, ProcNatl Acad Sci USA91:969-973)、鏈改組(美國專利號5，565，332)和在下述中公開的技術:例如美國專利號6，407，213,5, 766，886,5, 585，089、國際公布號W09317105, Tan等人，2002，J.1mmunol.169:1119-25，Caldas 等人，2000，Protein Eng.13:353-60, Morea等人，2000，Methods20:267-79，Baca 等人，1997，J.Biol.Chem.272:10678-84，Roguska等人，1996，Protein Eng.9:895-904, Couto 等人，1995，CancerRes.55 (23Supp): 5973s_5977s, Couto 等人,1995, Cancer Res.55:1717-22，Sandhu, 1994,Genel50:409-10, Pedersen 等人，1994，J.Mol.Biol.235:959-73，Jones 等人，1986，Nature321:522-525, Riechmann 等人,1988, Nature332:323 和 Presta,1992, Curr.0p.Struct.Biol.2:593-596(將其每一篇通過引用整體并入本文)。人源化抗體還可獲自轉基因小鼠和/或人抗體的文庫。
[0119]在一些實施方案中，治療性抗體對于靶抗原和/或表位的親和力得到增加。例如，可將噬菌體展示技術用于增加治療性分子對于靶抗原和/或表位的親和力。稱為親和力成熟的技術使用誘變或CDR步移和使用靶抗原和/或其表位進行的再選擇來鑒定以更高的對抗原的親和力(當與所選序列的初始集合相比較時)結合的本發明的氨基酸序列。誘變完整密碼子而非單個核苷酸導致氨基酸突變的半隨機化庫。可構建具有變體克隆集合的文庫，所述變體克隆的每一個通過單個CDR中的單個氨基酸改變而不同并且包含代表每一個CDR殘基的每一個可能的氨基酸置換的變體。可以例如通過將固定的突變體與經標記的抗原接觸來篩選具有增加的對于抗原的結合親和力的突變體。本領域中已知的任何篩選方法(例如，ELISA)可用于鑒定具有增加的對抗原的親合力的突變抗體(參見Wu等人，1998，Proc Na tl.Acad.Sc1.USA95:6037 ;Yelton 等人，1995，J.1mmunology 155:1994，將所述文獻的每一篇通過引用整體并入本文)。
[0120]本文中描述的多肽的結合特異性可通過本領域已知的用于測定結合對相互作用的任何方法來評價，所述方法包括但不限于ELISA、蛋白質印跡、表面等離子體共振(例如，BIAcore)和放射性免疫測定。本領域中已知的用于評價結合多肽特異性的任何方法可用于鑒定按照本發明使用的多肽，所述多肽顯示某種范圍的Kd，例如大于0.0OlnM但不大于5nM,不大于ΙΟηΜ，不大于15nM，不大于20nM，不大于25nM，不大于30nM，不大于35nM，不大于40nM,不大于45nM或不大于50nM,如通過BIAcore測定確定的。
[0121]本發明還提供了對于特定目標抗原具有高結合親和力的經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域-抗體融合物和/或綴合物，或其片段。在具體的實施方案中，本發明的試劑或其片段具有至少IO5M-1 S—1、至少SxlO5M-1S'至少IO6M-1 S—1、至少δχΙΟ--、至少10118_1、至少5110118_1或至少IO8M^的締合速率常數或1^率(抗體(Ab) +抗原(Ag)Ab-Ag)。在一個實施方案中，本發明的試劑或其片段具有至少ZxlO5M-1S'至少SxlO5M-1S'至少 IO6IT1S'至少 5χ106Μ?、至少 IO7IT1S'至少 5χ107Μ? 或至少 IO8M-1S-1 的 kon。
[0122]在具體的實施方案中，本發明的經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域以及其白蛋白結合片段和衍生物結合于特異性結合TNF-α (特別是人TNF-α)的抗體或或抗體片段。這樣的抗體及其片段在本文中統稱為“抗-TNF-α多肽”并且用于例如治療、預防、延遲或控制其中細胞因子TNF-α被牽涉為致病劑的病況。不希望受理論束縛，抗-TNF-α多肽可拮抗人TNF-α對其同源受體的結合。抗-TNF多肽優選還與至少一種非靈長類哺乳動物TNF-α交叉反應，從而促進除靈長類動物外的哺乳動物的臨床前測試。在更優選的實施方案中，抗-TNF多肽與至少一種嚙齒類動物和至少一種非嚙齒類動物物種交叉反應。嚙齒類動物物種包括例如大鼠、小鼠、松鼠、沙鼠、豪豬、河貍、金花鼠、豚鼠和田鼠。
[0123]在一些實施方案中，融合于本發明的經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域的抗-TNF-α多肽是抗體單結構域，例如，輕鏈可變結構域。如本文中所用，“單結構域抗體”可與“抗體單結構域”互換使用。在其它實施方案中，抗-TNF-α多肽為兩個抗體單結構域的二聚體，例如兩個輕鏈可變結構域的異二聚體。在其它實施方案中，抗-TNF-α多肽包含結合TNF- α的3個或更多個抗體單結構域，或1、2、3或更多個抗體單結構域的抗原結合片段或衍生物。在一些實施方案中，單個單結構域通過連接子(例如肽連接子或化學連接子)連接。在一些實施方案中，肽連接子也被去免疫。在一些實施方案中，抗體單結構域的一個或多個也被去免疫。抗體單結構域可獲自利用抗原TNF-α免疫的動物(例如，利用人TNF-α分子免疫的兔)。
[0124]在一些實施方案中，選擇顯示對人TNF-α的高度結合以及與大鼠和/或小鼠TNF-a，或與來自一個或多個其它非人物種(優選包括除靈長類動物外的相對小的哺乳動物，更優選包括一種嚙齒類動物和一種非嚙齒類動物物種)的TNF-α交叉反應的單結構域。相對小的哺乳動物可包括大鼠、小鼠、豚鼠、倉鼠等。該方法提供了適合用于本發明的抗-TNF-α多肽，其中可在人患者中實現治療作用，而可在大鼠和/或小鼠模型中關于效力和毒理學測定對這樣的多肽進行體內測試。即，交叉反應性有助于通過允許在動物中進行假定的治療劑的某些體內(臨床前)測試來降低成本，所述動物的TNF-α連同人的TNF-a是所述假定的治療劑的結合靶。
[0125]在一些優選實施方案中，抗-TNF-α多肽包含融合至經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域的VL-VL異二聚體，其中一個或兩個VL結構域被去免疫。在一些甚至更優選的實施方案中，VL-VL異二聚體包含SEQ ID NO: 2 (VL18)或SEQ ID NO: 3 (VLlI)的一個或兩個，所述序列的一個或兩個也被去免疫。在具體的實施方案中，將抗-TNF-α異二聚體融合于去免疫的PEP變體。在其它實施方案中，抗-TNF-a多肽包含融合于去免疫PEP變體的VL18或VLlI，其中VL18和VLll的一個或兩個也被去免疫。
[0126]在具體的實施方案中，抗-TNF-a多肽包含輕鏈可變結構域，所述可變結構域包含對應于SEQ ID N0:2(VL18)的氨基酸序列或其抗原結合片段或衍生物，所述可變結構域或其抗原結合片段或衍生物被去免疫，例如通過至少一個選自T7Q、V15P、(A51V-L54R/A51V-L54E)、K63S、E79K、(C80S)、T91A 和 LlllK 的氨基酸置換。編號是指 SEQ ID NO: 2 ^氨基酸位置。同樣地，括號之間的值是指種系濾過的肽，例如(C80S);雙突變體通過連字符連接，例如A51V-L54R ;并且在括號內提供了涉及相同位置的備選提出的置換(通過斜杠隔開，例如(A51V-L54R/A51V-L54E)) ο
[0127]在具體的實施方案中，抗-TNF-a多肽包含輕鏈可變結構域，所述可變結構域包含對應于SEQ ID N0:3(VL11)的氨基酸序列或其抗原結合片段或衍生物，其例如通過至少一個選自 T7Q、V15P、R31S、(A51V-54R/A51V-L54E)、K63S、E79K、(C80S)、T91A、A100S 和E106K(其中編號參照SEQ ID N0:3的氨基酸殘基)的氨基酸置換而被免疫。參見實施例7和圖2A-B。
[0128] 在其它具體實施方案中，抗-TNF-a多肽包含輕鏈可變結構域，所述可變結構域包含至少一個選自SEQ ID N0.:4-19(其它兔VL)、SEQ ID NO:20-24(5個去免疫的VL18變體)、SEQ ID NO:25-29 (5個去免疫的VLll變體)和其TNF- α -結合片段或衍生物的序列。在一些具體實施方案中，抗-TNF-α多肽包含兩個輕鏈可變結構域的二聚體，所述可變結構域的一個或兩個包含至少一個選自SEQ ID NO:2(VL18)、SEQ ID NO: 3 (VLl I)、SEQ IDN0.:4-19(其它兔 VL)、SEQ ID NO: 20-24 (5 個去免疫的 VL18 變體)、SEQ ID NO:25-29 (5 個去免疫的VLl I變體)及其TNF-α-結合片段或衍生物的序列。對應于SEQ ID N0:20_24的5個去免疫的VL18變體在本文中還可分別稱為VL18#1、VL18#2、VL18#3、VL18#4和VL18#5。對應于SEQ ID NO:25-29的5個去免疫的VLll在本文中還可分別稱為VL11#1、VL11#2、VL11#3, VL11#4 和 VL11#5。
[0129]在具體的實施方案中，將抗-TNF- a多肽偶聯至白蛋白結合結構域，所述白蛋白結合結構域包含對應于SEQ ID N0:1(PEP)的氨基酸序列或其白蛋白結合片段或衍生物，其可例如通過至少一個選自E12D、T29H-K3?和Α4?(其中編號參照SEQ ID NO:1的氨基酸序列)的氨基酸置換而被去免疫。在一些特別優選的實施方案中，將抗-TNF-a多肽偶聯至白蛋白結合結構域，所述白蛋白結合結構域包含對應于SEQ ID N0:31的氨基酸序列。
[0130]在其它具體實施方案中，抗-TNF-a多肽包括二聚體，其中二聚體結合于本發明的經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域。在更具體的實施方案中，二聚體包含對應于SEQ ID N0:32(VL18-3L-VL11)的氨基酸序列、其抗原結合片段或衍生物。在更具體的實施方案中，本發明的試劑包含SEQ ID N0:33(VL18-3L-VL11-PEP)或其抗原結合片段或衍生物，其進一步在PEP和/或其它位置上被去免疫。例如，在具體的實施方案中，本發明的試劑包含至少一個選自SEQ ID NO:34-44(11個VLl 8-3L-VL11/PEP變體)或其TNF-a -結合片段或衍生物的氨基酸序列。“3L”是指包含對應于SEQ ID NO:30的氨基酸序列的特定肽連接子。參見實施例7和圖3A-B。
[0131]在一些實施方案中，本發明的試劑包含選自SEQ ID NO:34-44的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成。這些序列對應于11個VL18-3L-VL11/PEP變體，其已被去免疫。SEQID NO: 34是指其中PEP被去免疫(如本文中描述的)的VL18-3L-VL11-PEP構建體，并且在本文中也稱為“VL18-3L-VL11-PEP DI”。SEQ ID NO:35-39 是指去免疫 VL18-3L-VL11 構建體，其在本文中也分別稱為 VL18-3L-VL11DI#1、VL18_3L_VL11DI#2、VL18_3L_VL11DI#3、VL18-3L-VL11DI#4 和 VL18-3L-VL11DI#5。可根據本發明將對應于 SEQ ID NO:35-39 ^構建體的任一個連接于經修飾的PEP白蛋白結合結構域。例如，SEQ ID N0:40-44是指去免疫VL18-3L-VL11-PEP構建體，其在本文中也分別稱為VL18_3L-VL11DI#1_PEPDI, VL18-3L-VL11DI#2-PEP D1、VL18_3L-VL11DI#3_PEP D1、VL18_3L-VL11DI#4_PEP DI 和VL18-3L-VL11DI#5-PEP DI。
[0132]本發明的經修飾的融合物可通過本領域已知的或本文中描述的任何技術來產生，如下文中詳述的。
[0133]5.產生融合物或綴合物的方法
[0134]本發明包含連接于本文中公開的經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域或其白蛋白結合片段或衍生物的治療性分子；或可以其它方式對治療性分子進行工程化以包含經修飾的白蛋白結合結構域、其片段或衍生物。如上文中所指出的，連接包括重組融合和化學綴合(包括共價和非共價綴合)。連接不必是直接的，而且還可通過連接子例如肽連接子序列或通過化學綴合發生。連接的試劑可稱為“經修飾的PEP白蛋白結合結構域融合物”或“經修飾的PEP白蛋白結合結構域綴合物”。參見實施例8-10。
[0135]用于將治療性部分綴合至多肽的技術是公知的；參見，例如，Amon等人,“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy”，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld 等人(編輯)，1985，pp.243-56，Alan R.Liss, Inc.) ；Hellstrom 等人，“Antibodies ForDrug Delivery”，in Controlled Drug Delivery (第 2 版)，Robinson 等人(編輯),1987, pp.623-53, Marcel Dekker,Inc.)。
[0136]經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域與目標治療性蛋白之間的蛋白質連接子可被選擇來維持柔性和正確的折疊，優選以便連接的產物顯示對白蛋白以及對目標治療性蛋白的原始靶(例如，抗體的抗原或其片段)的結合。這樣的結合測定對于本領域技術人員來說是已知的。
[0137]連接子可以是例如肽連接子或化學連接子。化學連接子的實例包括但不限于馬來酰亞胺連接子、生物相容性聚合物(優選具有約I至約100個原子的長度)、醛/希夫堿連接、suphydryl連接等。參見，例如，屬于Selinfreund的美國專利公布申請N0.2011/0196085。
[0138]備選地，可使用肽連接子，例如其中多肽構建體與連接性連接子一起表達為融合蛋白。肽連接子通常包含柔性氨基酸殘基，例如甘氨酸和絲氨酸，以便相鄰結構域相對于彼此自由移動，如上文中提及的。在一些實施方案中，使用的肽連接子在長度上為2至100個氨基酸，在長度上為5 至80、10至50、10至20或15至20個氨基酸。肽連接子的實例包括但不限于多聚甘氨酸、多聚絲氨酸、多聚賴氨酸、多聚谷氨酸、多聚異亮氨酸或多聚精氨酸殘基或其組合。在具體的實施方案中，多聚甘氨酸或多聚絲氨酸連接子包括至少5、
6、7、8、9、10、12、15、20、30和40個甘氨酸和/或絲氨酸殘基。在另一個具體的實施方案中，連接子涉及甘氨酸和/或絲氨酸殘基的重復，例如(Gly-Ser)n殘基或(Gly-Ser)nS基(Glu或Lys殘基散布在各處)例如以增加溶解度。包含甘氨酸和絲氨酸重復的其它連接子包括例如(Gly)4-Ser 重復；Gly-Gly-Ser-Gly 重復；Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser 重復；或(Gly)4-Ser-(Gly)3-Ser重復；各為1、2、3、4、5、6、7或更多的重復。標準連接子包括(GGGGS) ； (GGGGS) 2 ； (GGGGS) 3 ； (GGGGS) 4 ； (GGGGS) 5 ； (GGGGS) 6。在一些具體的實施方案中，連接子包含根據式[Ser-(Gly)4]n-(Ser)2-Gly-的重復，其中η為1、2、3、4、5或7。在其它實施方案中，η為6、8、9、10或更大的整數。
[0139]在另一個具體實施方案中，連接子包括脯氨酸和蘇氨酸殘基，例如((PT)3T(PT)3T(PT)3S)連接子。另外的肽連接子被提供于 Argos P.“An investigationof oligopeptides linking domains in protein tertiary structures and possiblecandidates for general gene fusion.，，J Mol Biol211 (4):943_58，1990 ;Crasto，CJ 等人“LINKER:a program to generate linker sequences for fusion proteins.TroteinEngl3 (5):309_12，2000 ;George，RA 等人“An analysis of protein domain linkers:their classification and role in protein folding.，，Protein Engl5 (11):871-9，2002 ;和 Arai R，等人“Design of the linkers which effectively separatedomains of a bifunctional fusion protein.，’Protein Engl4(8):529-32, 2001 中(將所述文獻的每一篇通過引用整體并入本文)。
[0140]在一些實施方案中，將治療性蛋白融合于根據本發明的經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域。融合蛋白可通過標準重組DNA技術或通過蛋白質合成技術(例如通過使用肽合成儀)來產生。例如，編碼融合蛋白的核酸分子可通過常規技術(包括自動化DNA合成儀)來合成。
[0141]在一些實施方案中，經修飾的PEP白蛋白結合結構域融合物(或綴合物)包括與連接于白蛋白結合結構域，或其白蛋白結合片段或衍生物的第一治療劑不同的至少第二治療劑。連接的治療劑可稱為嵌合多肽。用于產生嵌合多肽(特別是抗體)的方法在本領域是已知的。一旦獲得編碼本發明的試劑的核酸序列，可使用本領域公知的技術，通過重組DNA技術產生用于產生具有經修飾的PEP白蛋白結合結構域的融合物的載體。
[0142]可使用本領域技術人員公知的方法構建表達載體，所述表達載體包含根據本發明的融合多肽的編碼序列以及適當的轉錄和翻譯控制信號。可通過常規技術(例如，電穿孔、脂質體轉染和磷酸鈣沉淀)將包含本發明的試劑(例如具有經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域的融合蛋白)的核苷酸序列的表達載體轉移至宿主細胞，隨后可利用常規技術培養經轉染的細胞以產生本發明的多肽。宿主表達系統包括可籍以產生多肽的編碼序列以及隨后純化所述編碼序列的媒介物，還包括當用適當的核苷酸編碼序列轉化或轉染時可原位表達本發明的多肽的細胞。用于表達具有本發明的經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域的重組融合物的宿主細胞可以是例如細菌細胞例如大腸桿菌細胞，或真核生物細胞。
[0143]在具體的實施方案中，大腸桿菌Tuner? (DE3)細胞用于大規模表達本發明的融合物。“Tuner?菌株”是大腸桿菌BL21的IacZY缺失突變體，其有助于細胞培養物中蛋白質表達水平的受控調節。表達水平通過Iac通透酶(IacY)突變來控制，所述突變允許IPTG均一地進入至群體中的細胞，從而產生響應不同IPTG濃度的濃度依賴性勻一誘導。“DE3”表示宿主是λ DE3的溶素原(Iysogen)，其具有在lacUV5啟動子的控制下的T7RNA聚合酶基因的染色體拷貝。
[0144]一旦本發明的經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域融合物被重組表達，可通過本領域已知的用于試劑純化的任何方法，例如通過層析(例如，離子交換層析、親和層析(特別是在蛋白A后利用對于特定抗原的親和力的)和尺寸柱層析)、離心、差異溶解度，或通過用于蛋白質的純化的任何其它標準技術來進行純化。可將本發明的多肽融合于標志物序列例如肽，以幫助純化。在具體的實施方案中，純化包括用于在于大腸桿菌中表達后去除外毒素的鎳親和層析。在另一個具體的實施方案中，純化包括蛋白L和/或人白蛋白親和層析，例如，如在下列實施例中更詳細描述的。
[0145]可使用本領域已知的用于表征結合對相互作用的任何基于免疫學或生物化學的方法，表征根據本發明構建的經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域融合物和/或綴合物對結合伴侶(例如，在抗體的情況下，對抗原和/或表位)的特異性結合。特異性結合可以例如使用基于免疫學或生物化學的方法來測定，所述方法包括但不限于ELISA測定、表面等離子體共振測定、免疫沉淀測定、親和層析和平衡透析。可用于分析本發明的分子的免疫特異性結合和交叉反應性的免疫測定包括但不限于使用技術的競爭性和非競爭性測定系統，所述技術，僅舉幾例，為例如蛋白質印跡、放射性免疫測定、ELISA(酶聯免疫吸附測定)、“夾心”免疫測定、免疫沉淀測定、沉淀素反應、凝膠擴散沉淀素反應、免疫擴散測定、凝集反應測定、補體固定測定、免疫放射測定(immunoradiometric assay)、突光免疫測定和蛋白A免疫測定。這樣的測定是常規的并且在本領域是公知的(參見，例如，Ausubel 等人，編輯，1994，Current Protocols in Molecular Biology,第 I 卷，Johnffiley&Sons, Inc., New York,將所述參考資料通過引用整體并入本文)。
[0146]本發明的經修飾的(例如，去免疫的)白蛋白結合結構域融合物和/或綴合物，還可使用本領域已知的用于表征免疫特異性蛋白與目標抗原和/或表位的相互作用的動力學參數的任何基于表面等離子體共振的測定來進行測定。可使用商購可得的任何SPR儀器，包括但不限于BIAcore儀，可獲得自BiacoreAB (Uppsala, Sweden) ；IAsys 儀，可獲自 Affinity Sensors (Franklin, Mass.) ；IBIS系統，可獲自 Windsor Scientific Limited (Berks, UK) ；SPR-CELLIA 系統，可獲自Nippon Laser and Electronics Lab (Hokkaido, Japan);以及 SPR Detector Spreeta,可獲自Texas Instruments (Dallas, Tex.)。關于基于SPR的技術的綜述，參見Mullet等人，2000，Methods22:77-91 ;Dong 等人，2002，Review in Mol.Biotech.,82:303-23 ；Fivash 等人，1998，Current Opinion in Biotechnology9:97-101 ；Rich 等人，2000，Current Opinion in Biotechnologyll:54-61 ;將所述參考資料全部通過引用整體并入本文。此外，美國專利號 6，373，577 ;6，289，286 ;5，322，798 ;5，341，215 ;6，268，125中描述的用于測量蛋白質間相互作用的任何SPR儀和基于SPR的方法包括在本發明的方法中，將所述美國專利全部通過引用整體并入本文。[0147]6.編碼本發明的多肽的多核苷酸
[0148]本發明提供了包含編碼本發明的多肽(例如經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域、其白蛋白結合片段或衍生物以及其與治療性蛋白的融合物)的核苷酸序列的多核苷酸。在具體的實施方案中，本發明的多核苷酸包含編碼本文中公開的多肽例如SEQID NO: 1-44的一個或多個的核酸或由所述核酸組成。本發明還包括在高嚴格、中等嚴格或低嚴格雜交條件下與編碼本發明的多肽的多核苷酸雜交的多核苷酸。
[0149]可通過本領域已知的任何方法獲得多核苷酸，并確定所述多核苷酸的核苷酸序列。例如，編碼本發明的多肽的多核苷酸可從來自適當來源(例如，獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus))的核酸產生。如果包含編碼特定多肽的核酸的來源是不可獲得的，但本發明的多肽的氨基酸序列是已知的，則可化學合成編碼多肽的核酸并且使用本領域公知的方法將其克隆進入可復制克隆載體。
[0150]一旦確定本發明的多核苷酸的核苷酸序列，可使用本領域公知的用于克隆和操作核苷酸序列的方法(例如重組DNA技術、定點誘變、PCR等)來操作核苷酸序列。如上所述，這樣的突變的序列可提供具有增強的藥物性質例如改善的血清半衰期和/或減小的免疫原性的本發明的多肽。
[0151]備選地，可化學合成編碼融合產物的核酸。例如，通過使用本發明的融合多肽的期望的氨基酸序列，可使用例如本領域公知的方法設計、化學合成對應的核苷酸序列，并將其克隆進入可復制克隆載體。
[0152]本發明還提供了包含至少一個編碼本發明的試劑的多核苷酸的載體。在一些實施方案中，載體是表達載體。本發明還提供了包含本發明的一個或多個載體的宿主細胞。載體、表達載體和宿主細胞可包括上文中詳細論述的那些載體、表達載體和宿主細胞。
[0153]使用方法
[0154] 本發明包括涉及給宿主施用包含連接于治療性分子的PEP的至少一個經修飾的白蛋白結合結構域或其白蛋白結合片段或衍生物的試劑，以預防、治療或改善與疾病、病狀或感染相關的癥狀。可給宿主(特別是給人)施用作為抗疾病、病狀或感染的預防劑和/或治療劑的具有本發明的經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域的融合蛋白和/或綴合物，以治療、預防或改善與疾病、病狀或感染相關的一個或多個癥狀。同樣地作為基于蛋白質的融合物和基于分子的綴合物，本發明的預防劑和治療劑包括但不限于編碼融合物和綴合的分子的核酸。試劑可以以本領域已知的和/或本文中描述的藥學上可接受的組合物的形式提供。可單獨地或與其它預防劑和/或治療劑組合地施用具有本發明的經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域的融合物和/或綴合物。在優選實施方案中，宿主或受試者是人，例如，需要連接至治療性分子的PEP的至少一個經修飾的白蛋白結合結構域或其白蛋白結合片段或衍生物的患者。在特別優選的實施方案中，本發明涉及例如通過給有此需要的人受試者施用根據本公開內容的包含連接于治療性分子的PEP的至少一個經修飾的白蛋白結合結構域或其白蛋白結合片段或衍生物(或包括其的核酸)的試劑而進行的對人受試者的治療。
[0155]如本文中所用，術語“治療劑”是指可用于治療或減輕與疾病、病狀或感染相關的癥狀的任何試劑。如本文中所用，“治療有效量”是指當給患病受試者施用時在所述疾病的治療或控制中提供至少一種治療益處的試劑的量。此外，針對本發明的試劑的治療有效量意指在疾病或病況的治療或控制中提供至少一種治療益處的試劑(單獨的或與其它療法組合的)的量。
[0156]如本文中所用，術語“預防劑”是指可用于預防或延遲病況，或預防或延遲疾病、病狀、病況或感染，或減緩疾病、病狀、病況或感染的進展，或防止其復發或擴散的任何試劑。“預防有效量”是指當給易患病的受試者施用時在所述疾病的預防或延遲中提供至少一種預防性益處的預防劑的量。預防有效量還可指足以預防或延遲受試者的疾病、病狀、病況或感染的發生，或減緩疾病、病狀、病況或感染的進展的試劑的量，或足以延遲疾病、病狀、病況或感染的發作或使所述發作降至最低的量；或足以預防或延遲其復發或擴散的量。預防有效量還可指足以預防或延遲疾病、病狀、病況或感染的癥狀的加劇的試劑的量。此外，針對本發明的預防劑的預防有效量意指提供至少一種預防性益處的預防劑(單獨的或與其它試劑組合)的量。
[0157]可將本發明的預防劑給對疾病、病狀、病況或感染“易感的”受試者施用。對特定疾病、病狀、病況或感染“易感的”受試者是顯示與疾病、病狀、病況或感染的發展相關的癥狀，或具有對于這樣的疾病、病狀、病況或感染的基因構成、環境暴露或其它風險因子但其中癥狀還未處于被診斷為疾病、病狀、病況或感染的水平上的受試者。例如，具有類風濕關節炎的家族史的患者可稱得上對其易感的患者。
[0158]在一些實施方案中，提供了用于增強治療性分子在受試者中的效力的方法。所述方法可包括提供包含連接于PEP的至少一個經修飾的白蛋白結合結構域或其白蛋白結合片段或衍生物的治療性分子的試劑；和給受試者施用所述試劑。可以例如在獲得給定的有益結果然而未加劇免疫原性所需的治療劑的給藥的量和/或頻率和/或持續時間方面增強效力。當獲得給定的結果所需的總劑量減半時，效力可被認為是加倍的。不希望受理論束縛，至如本文中教導的白蛋白結合結構域的連接可增加治療劑的血清半衰期，而不影響或大體上不影響其治療性質，例如其生物利用度和/或生物活性，結果是需要施用的更少。此外，去免疫減小構建體的免疫原性和/或所述相同修飾或其它修飾可改善溶解度。例如，在某些實施方案中，至根據本發明的去免疫PEP白蛋白結合結構域的連接增加治療劑在宿主中的效力。在一些實施方案中，治療劑在宿主中的效力以約10%、約20%、約30%、約40%、約 50%、約 60%、約 70%、約 80%、約 90%、約 100%、約 150%、約 200%、約 300%、約500%、約1000%或更多增加。這樣的改變的藥代動力學還可允許治療方案的變化。
[0159]因此，在一些實施方案中，提供了用于改變治療性分子的治療方案的方法，其中改變是治療病況所需的分子的量的減少。分子的量的減少可以指治療性分子的劑量的減少和/或給藥頻率的減少，和/或方案的持續時間的減少，以便治療可更早結束。減少的量的使用可減少不利副作用，降低醫療成本，和/或改善患者順從性。如上文中所述，減少可歸因于至根據本發明的白蛋白結合結構域的連接，其中連接在體內延長治療性分子的血清半衰期，優選不減少或大體上不減少其治療特性。例如，在某些實施方案中，至根據本發明的去免疫PEP白蛋白結合結構域的連接減少治療劑的總劑量。劑量可以約10%、約20%、約30%、約 40%、約 50%、約 60%、約 70%、約 80%、約 90%、約 100%、約 150%、約 200%、約300%、約500%、約1000%或更多減少。增加的溶解度可進一步減少需要的劑量。此外，由于去免疫結構域的使用，可實現劑量的減少而在其施用后不增加，或大體上不增加宿主中對試劑的免疫反應。
[0160]術語治療上有效的和預防上有效的包括本文中提供的施用的劑量和頻率。取決于施用的具體的治療劑或預防劑、疾病的嚴重度和類型、施用途徑以及患者的年齡、體重、反應和過去的醫療史，劑量和頻率通常可根據對于每一個患者是特定的因素而變化，并且應當根據醫生的判斷 和每一個患者的情況來決定。適當的方案可由本領域技術人員通過考慮這樣的因素和通過按照例如文獻中報導的和Physician’s Desk Reference (第56版，2002)中推薦的劑量來選擇。可重復施用預防劑和/或治療劑。所述方法的幾個方面可變化，例如施用預防劑或治療劑的時間方案，無論是分開施用還是作為混合物施用這樣的試劑。
[0161]將為有效的本發明的試劑的量可通過標準臨床技術來確定。可從來源于體外或動物模型測試系統的劑量-反應曲線外推出有效劑量。對于本發明的方法中使用的任何試劑，最初可從細胞培養測定評估治療有效劑量。可在動物模型中配制劑量以獲得循環血漿濃度范圍，其包括如在細胞培養中測定的IC5(I(即，實現癥狀的半最大抑制的測試化合物的濃度)。這樣的信息可用于更準確地確定在人中的有用劑量。血漿中的水平可以例如通過高效液相色譜來測量。
[0162]可在用于人之前，在適當的動物模型系統中測試預防劑和/或治療劑以及其組合。這樣的動物模型系統包括但不限于大鼠、小鼠、雞、牛、猴、豬、狗、兔等。可使用本領域公知的任何動物系統。在本發明的具體實施方案中，在小鼠模型中測試預防劑和/或治療劑。這樣的模型系統被廣泛使用并且對于本領域技術人員來說是已知的。
[0163]在一些具體的實施方案中，使用基于大鼠、小鼠或除靈長類動物外的其它小的哺乳動物的TNF-α相關病況的動物模型系統。例如，在具體的實施方案中，在小鼠或大鼠模型系統(例如已建立的大鼠-佐劑-誘導的關節炎(AIA)模型或膠原誘導的關節炎(CIA)模型)中測試結合于本發明的去免疫白蛋白結合結構域的推定的預防性和/或治療性抗-TNF-α多肽。AIA模型相較于CIA模型是侵襲性大得多的關節炎模型。在這樣的系統而非基于靈長類動物的模型系統中進行的測試，在體內和/或臨床前測試中提供了減少的成本的優勢。不希望受理論束縛，在除靈長類動物外的動物中進行的測試是可行的，其中基于與大鼠和/或小鼠TNF- a，或與另一種非靈長類動物的小的哺乳動物的TNF- α的交叉反應性選擇抗-TNF-a抗體分子。這樣的抗體提供了適合用于本發明的試劑，其中可在人患者中實現治療作用，而可在大鼠和/或小鼠模型中進行體外測試，例如低毒性測試。
[0164]另一個動物模型涉及轉基因小鼠(Tgl97)模型。關節炎的Tgl97模型是具有人TNF-a失調的表達(從而導致與人類風濕關節炎的病狀十分相似的關節炎病狀的自發發展)的人源化TNF轉基因小鼠模型(Keffer等人1991 “Transgenic mice expressinghuman tumor necrosis factor:a predictive genetic model of arthritis，，The EMBOJournal 10 (13):4025-4031,將所述文獻的內容通過引用整體并入本文)。Tgl97小鼠在4_7周齡發展具有100%發病率的慢性多關節炎并且提供了用于評估用于治療類風濕性關節炎的人治療劑的快速體內模型。該模型成功地用于確立Remicade?的治療效果并且目前被廣泛地用于測試生物仿制藥或新型抗人TNF-α療法的效力研究。也參見實施例lla-b和圖4-5。
[0165]一旦在動物模型中測試本發明的預防劑和/或治療劑，可在臨床試驗中測試它們以確立它們的效力。可按照本領域技術人員已知的常用方法建立臨床試驗，并且可確立本發明的試劑的最佳施用劑量和途徑以及毒性特征譜。例如，臨床試驗可被設計來測試抗-TNF-α多肽與本發明的經修飾的(例如，去免疫的)白蛋白結合結構域的融合物的抗人患者的類風濕關節炎的效力和毒性。參見下文中的實施例12-19。
[0166]在一些實施方案中，以約0.1ng至約Ig的總劑量施用抗-TNF-α多肽來治療人患者的TNF-a相關病況例如類風濕關節炎。在更具體的實施方案中，以約0.1yg至約Img ;約Iyg至約500 μ g ;約10 μ g至約400 μ g ;或約50 μ g至約200 μ g的總劑量施用抗-TNF-α多肽。
[0167]可通過標準藥物程序在細胞培養物或實驗動物中測定本發明的預防劑和/或治療劑的毒性和效力，例如用于確定LD5tl (導至50 %的群體死亡的劑量)和ED5tl (在50 %的群體中治療上有效的劑量)。毒性作用與治療作用之間的劑量比是治療指數，其可被表達為比率LD5(i/ED5(i。顯示大的治療指數的預防劑和/或治療劑是優選的。雖然可使用顯示毒副作用的預防劑和/或治療劑，但應當小心地設計將這樣的試劑靶向患病組織的部位以使對未受影響的細胞的潛在損害降至最低程度，從而減小副作用的遞送系統。
[0168]獲自細胞培養物測定和動物研究的數據可用于配制用于人的預防劑和/或治療劑的劑量范圍。這樣的試劑的劑量優選在包括ED5tl的循環濃度的范圍內，而幾乎無毒性或無毒性。取決于采用的劑型和使用的施用途徑，劑量可在該范圍內變化。
[0169]可將用作疾病、病狀、病況或感染的拮抗劑的本發明的治療劑或預防劑給宿主施用以治療 、預防或改善與疾病、病狀、病況或感染相關的一種或多種癥狀。例如，包含連接于抗體或其抗原結合片段的根據本發明的經修飾的(例如，去免疫的)PEP白蛋白結合結構域的試劑可用作抗病毒感染的拮抗劑。即，可給宿主施用經修飾的PEP白蛋白結合結構域與抗體或其抗原結合片段的融合物(其中抗體或片段破壞或阻止病毒抗原與其宿主細胞受體之間的相互作用)以治療、預防或改善與病毒感染相前的一種或多種癥狀。
[0170]在具體的實施方案中，相對于在抗體融合物不存在的情況下抗原對其宿主細胞受體的結合，具有抗體或其抗原結合片段的經修飾的PEP白蛋白結合融合物阻止病毒或細菌抗原結合其宿主細胞受體至少99%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、至少50%、至少45%、至少40%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%或至少10%。在另一個實施方案中，相對于在抗體融合物不存在的情況下抗原對其宿主細胞受體的結合，抗體融合物的組合阻止病毒或細菌抗原對其宿主細胞受體的結合至少99%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、至少50%、至少45%、至少40%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%或至少10%。
[0171]還可給動物施用經修飾的PEP白蛋白結合結構域與抗體或其抗原結合片段的融合物(所述融合物不阻止病毒或細菌抗原結合其宿主細胞受體，但抑制或下調病毒或細菌復制)以治療、預防或改善與病毒或細菌感染相關的一種或多種癥狀。抗體抑制或下調病毒或細菌復制的能力可通過本文中描述的或以其它方式在本領域已知的技術來確定。例如，病毒復制的抑制或下調可通過檢測動物中病毒的滴度來測定。
[0172]在具體的實施方案中，相對于在抗體融合物不存在的情況下病毒或細菌的復制，具有抗體或其抗原結合片段的經修飾的PEP白蛋白結合結構域的融合物下調病毒或細菌復制至少99%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、至少50%、至少45%、至少40%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%或至少10%。在另一個實施方案中，相對于在抗體融合物的組合不存在的情況下病毒或細菌的復制，抗體融合物的組合抑制或下調病毒或細菌復制至少99%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、至少50%、至少45%、至少40%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%或至少10%。
[0173]具有本發明的經修飾的PEP白蛋白結合結構域的融合物還可用于預防、抑制或減少癌細胞的生長或轉移。在具體的實施方案中，相對于在融合物不存在的情況下的生長或轉移，融合物抑制或減少癌細胞的生長或轉移至少99%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、至少50%、至少45%、至少40%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%或至少10%。在另一個實施方案中，相對于在融合物的組合不存在的情況下的生長或轉移，根據本發明的融合試劑的組合抑制或減少癌癥的生長或轉移至少99 %、至少95 %、至少90 %、至少85 %、至少80 %、至少75 %、至少70 %、至少60 %、至少50%、至少45%、至少40%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%或至少10%。癌癥的實例包括但不限于白血病(例如，急性白血病例如急性淋巴細胞白血病和急性骨髓性白血病)、贅生物(neoplasms)、腫瘤(例如，纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤(osteogenic sarcoma)、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、Ewing瘤(Ewing’s tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管原癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、腎母細胞瘤(Wilms’ tumor)、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽覺神經瘤、少突神經膠質瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤和視網膜母細胞瘤)、重鏈疾病、轉移、或特征在于不受控制的細胞生長的任何疾病或病況。
[0174]本發明的經修飾的PEP白蛋白結合結構域的融合物還可用于減輕具有炎性癥狀和/或病況的動物(特別是哺乳動物)的炎癥。例如，可施用包括用作免疫反應的激動劑的區域的、具有經修飾的PEP白蛋白結合結構域的融合物以治療、預防或改善與免疫病況相關的一種或多種癥狀。在具體的實施方案中，根據本發明的融合物使動物的炎癥相對于未施用所述融合物的動物的炎癥減輕至少99%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75 %、至少70 %、至少60 %、至少50 %、至少45 %至少40 %、至少35 %、至少30 %、至少25%、至少20%或10%。在另一個實施方案中，具有與經修飾的PEP白蛋白結合結構域的融合物的組合使動物的炎癥相對于未施用所述融合物的組合的動物的炎癥減輕至少99%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、至少50%、至少45 %、至少40 %、至少35 %、至少30 %、至少25 %、至少20 %或至少10 %。炎性病況的實例包括但不限于類風濕性關節炎、脊椎關節病、炎性腸病、克羅恩病、多發性硬化和哮喘。
[0175]在具體實施方案中，可施用經修飾的PEP白蛋白結合結構域、其白蛋白結合片段或衍生物與抗-TNF-α多肽的融合物以治療、延遲、預防、減緩或改善與類風濕關節炎相關的一種或多種癥狀。類風濕關節炎的特征在于滑膜關節的炎癥反應(滑膜炎)，從而導致軟骨的破壞和關節的關節強直。滑膜炎涉及滑膜襯里關節和腱鞘的炎癥。受影響的關節變得腫脹、壓痛和僵硬。類風濕關節炎的其它特征性癥狀包括類風濕結節，其在直徑上可以為數毫米至數厘米，通常在皮下，并且通常在骨突上方發現；以及脈管炎，其導致皮膚的發紫變色。肺、腎、心臟和血管 也可受影響。例如，肺的纖維化和胸腔積液與類風濕關節炎相關；并且腎淀粉樣變性可因慢性炎癥而發生。同樣地，類風濕關節炎患者更易患動脈粥樣硬化、心肌梗塞和中風。
[0176]在優選的實施方案中，根據本發明的試劑使動物的滑膜關節的炎癥相對于未施用所述試劑的動物的滑膜關節的炎癥減輕至少99 %、至少95 %、至少90 %、至少85 %、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、至少50%、至少45%至少40%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%或至少10%。在特別優選的實施方案中，炎癥的減輕導致受影響關節的腫脹、壓痛和/或僵硬減輕。在一些優選實施方案中，根據本發明的試劑減小動物的類風濕結節，在例如它們的身體突起物的頻率和/或其大小方面。在一些優選實施方案中，根據本發明的試劑減少脈管炎，例如減小皮膚上脈管炎的變色的廣度和/或程度。
[0177]在另一個具體實施方案中，經修飾的PEP白蛋白結合結構域與免疫球蛋白的融合物用于被動免疫療法(用于治療或預防)。在具體的實施方案中，將經修飾的PEP白蛋白結合結構域與抗體的融合物施用給動物，所述動物為與融合的抗體的物種來源或物種反應性相同的物種來源或物種反應性的動物。因此，在一個實施方案中，給人患者施用經修飾的PEP白蛋白結合結構域與人或人源化抗體的融合物以進行治療或預防。
[0178]作為另一個具體實例，經修飾的PEP白蛋白結合結構域與利鈉肽的融合物可用于治療心血管病況。例如，在一個實施方案中，經修飾的PEP白蛋白結合結構域與利鈉肽的融合物用于治療充血性心力衰竭、心肌梗塞后、高血壓、食鹽敏感高血壓、心絞痛、外周動脈疾病、低血壓、心臟容量過載、心失代償、心力衰竭、非血液動力學CHF、左心室功能不全、呼吸困難、心肌再灌流損傷、左心室復建和/或升高的醛固酮水平(這可導致血管收縮、受損的心輸出量和/或高血壓)中的一種或多種。
[0179]在另一個具體的實施方案中，連接于SiRNA的經修飾的PEP白蛋白結合結構域的融合物，可用于治療或預防由基因的過表達或錯誤表達引起的疾病以及因包含突變的基因的表達引起的疾病。siRNA活性的機制及其使用模式在本領域是公知的，參見，例如，Provost 等人，2002，EMBO J.，21:5864-5874 ；Tabara 等人，2002，Celll09:861_71 ；Ketting 等人,2002, Cellll0:563 ;和 Hutvagner&Zamore, 2002, Science297:2056,將每一篇所述文獻通過引用整體并入本文。
[0180]利用治療或預防有效量的本發明的試劑治療受試者可包括單次治療或可包括一系列治療。例如，可每天一次、每天兩次或每天三次施用包含本發明的試劑的藥物組合物。在一些實施方案中，可每天一次、隔天一次、每周一次、每周二次、每二周一次、每月一次、每六周一次、每兩個月一次、每年兩次或每年一次施用試劑。還將理解，某些試劑的有效劑量，例如包含抗體或其抗原結合片 段的試劑的有效劑量在治療過程中可增加或減少。
[0181]在一些實施方案中，指示持續治療，例如在長期的基礎上，例如在慢性炎性病況例如類風濕關節炎的持續治療和/或處理中。例如，在具體的實施方案中，在一段時間(例如至少6個月、至少I年、至少2年、至少5年、至少10年、至少15年、至少20年或有此需要的受試者的余生)中施用本發明的試劑。
[0182]還可將本發明的治療劑或預防劑與一種或多種用于治療特定疾病、病狀或感染的其它藥物(例如抗癌劑、抗炎劑或抗病毒劑)有利地組合使用。
[0183]可將本發明的治療劑或預防劑與一種或多種用于治療、預防或處理疾病、病狀或感染的其它預防劑和/或治療劑組合施用。例如，可單獨施用或與其它預防劑和/或治療劑組合地施用具有本發明的經修飾的PEP白蛋白結合結構域的融合物和/或綴合物。組合作用可以是疊加的或協同性的。例如，可同時或在不同時間點上以任意順序順次施用每一種預防劑或治療劑；然而，如果不同時施用，應當在時間上充分接近地施用它們以提供期望的治療性或預防性作用。可以以任何適當的形式和通過任何適當的途徑分開地施用每一種治療劑。
[0184]在不同實施方案中，以小于I小時的間隔、約I小時的間隔、約I小時至約2小時的間隔、約2小時至約3小時的間隔、約3小時至約4小時的間隔、約4小時至約5小時的間隔、約5小時至約6小時的間隔、約6小時至約7小時的間隔、約7小時至約8小時的間隔、約8小時至約9小時的間隔、約9小時至約10小時的間隔、約10小時至約11小時的間隔、約11小時至約12小時的間隔、不超過24小時的間隔、不超過48小時的間隔、不超過72小時的間隔、不超過96小時的間隔、不超過5天的間隔、不超過6天的間隔、不超過I周的間隔、不超過2周的間隔、不超過3周的間隔、不超過I個月的間隔、不超過2個月的間隔或不超過3個月的間隔施用不同的預防劑和/或治療劑。在某些實施方案中，在相同患者拜訪內施用兩種或更多種試劑。
[0185]本發明通過給受試者施用有效量的包含連接于治療性分子的經修飾的PEP白蛋白結合結構域或其白蛋白結合片段或衍生物的試劑；或通過施用包含至少一種本發明的試劑的藥物組合物來提供治療、預防和改善一種或多種與疾病、病狀或感染相關的癥狀的方法。[0186]各種遞送系統是已知的并且可用于施用本發明的試劑，例如包封在脂質體、微粒、微膠囊中、能夠表達經修飾的PEP白蛋白結合結構域的融合物的重組細胞的中(參見，例如，Wu和Wu, 1987，J.Biol.Chem.262:4429-4432)，作為逆轉錄病毒或其它載體的一部分的核酸構建體，等等。施用本發明的試劑的方法包括但不限于胃腸外施用(例如，真皮內、肌內、腹膜內、靜脈內和皮下，包括輸注或推注注射)，硬膜外和通過經由上皮或粘膜或粘膜襯里(例如，鼻內、口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)的吸收。在具體的實施方案中，肌內、靜脈內或皮下施用本發明的試劑，可將所述試劑與其它生物活性劑一起施用。在更具體的實施方案中，可將本發明的包含抗-TNF-α多肽和經修飾的PEP白蛋白結合結構域的融合物配制作為無菌產品用于皮下施用。施用可以是全身性的或局部的。
[0187]在具體的實施方案中，可能希望將本發明的試劑或包含所述試劑的藥物組合物局部施用至需要治療的區域；這可以通過例如但不限于局部輸注，通過注射或通過植入物來實現，所述植入物是多孔的、無孔的或膠狀材料，包括膜例如硅橡膠膜或纖維。通常地，當施用包含抗體或其抗原結合片段的試劑時，必須小心地使用抗體或抗原結合片段不吸附至其上的材料。
[0188]在另一個實施方案中，可將試劑于媒介物，特別是脂質體中進行遞送(參見Langer, Science, 249:1527 1533, 1990 ；Treat 等人，in Liposomes in the Therapyof Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (編輯)，Liss, NewYork, pp.353 365(1989) ；Lopez-Berestein,同上，pp.3 17 327 ;—般性地參見同上)。
[0189]在另一個具體的實施方案中，可將包含免疫特性分子的本發明的試劑于持續釋放制劑中進行遞送，例如，其中制劑提供延長釋放，從而延長施用的試劑的半衰期。適合使用的控釋系統包括但不限 于擴散控制系統、溶劑控制系統和化學控制系統。擴散控制系統包括例如貯存裝置，其中本發明的免疫特異性分子被封閉在裝置內，以便分子的釋放受通過擴散屏障的滲透控制。常見的貯存裝置包括例如膜、膠囊、微膠囊、脂質體和中空纖維。單塊(基質)裝置是第二種類型的擴散控制系統，其中將免疫特異性分子分散或溶解在速率控制基質(例如，聚合物基質)中。包含免疫特異性部分的本發明的試劑可均一擴散在整個速率控制基質中，并且釋放速率受到通過基質的擴散控制。適用于單炔基質裝置的聚合物包括天然存在的聚合物、合成聚合物和合成修飾的天然聚合物以及聚合物衍生物。
[0190]本發明還包括包含連接于診斷劑的經修飾的PEP白蛋白結合結構域的試劑。對于診斷應用，例如可檢測的物質。可將這樣的分子在診斷上用于例如監控疾病、病狀或感染的發展或進展(作為臨床試驗程序的一部分)來例如測定給定的治療方案的效力。
[0191]可檢測的物質的實例包括各種酶，酶包括但不限于辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；輔基復合物例如但不限于鏈霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；熒光材料例如但不限于傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發光材料例如但不限于魯米諾；生物發光材料例如但不限于螢光素酶、螢光素和水母發光蛋白；放射性材料例如但不限于鉍(213Bi)、碳(14C)、鉻(51Cr)、鈷(57Co)、氟(18F)'禮(153GcU159Gd)、鎵(68Ga、67Ga)、鍺(68Ge) M (166Ho)'銦(115In、113In、112In、mIn)、碘(1311、1251、1231、121I)、鑭(14tlLa)、镥(177Lu)、猛(54Mn)、鑰(99Mo),鈀(103Pd)'磷(32P)、鐠(142Pr)'钷(149Pm)、錸(186Re、188Re)、銠(105Rh)、釕(97Ru)、釤(153Sm)、鈧(47Sc)、硒(75Se), II (85Sr)、硫(35S)、锝("Tc)、鉈(20ITi)'錫(113Sru117Sn)、氚(3H)、氙(133Xe)、鐿(169Yb、175Yb)! (9°Y)、鋅(65Zn);使用各種正電子發身斷層攝影術的正電子發射金屬和/或非放射性順磁性金屬離子。此外，上述示蹤放射金屬的任一種當根據本發明的方法綴合于經修飾的PEP白蛋白結合結構域時也可顯示治療作用。
[0192]可將可檢測的物質直接或間接地偶聯或綴合于經修飾的PEP白蛋白結合結構域或連接至其的治療劑本身，例如抗體或其抗原結合片段。參見，例如，美國專利號4，741，900 (通過引用整體并入本文)描述了金屬離子至抗體的綴合以用作診斷劑。
[0193]8.藥物組合物和試劑盒
[0194]本發明還提供了包含藥學上可接受的載體和試劑的藥物組合物，所述試劑包含連接于治療性分子的PEP的至少一種經修飾的(例如，去免疫的)白蛋白結合結構域或其白蛋白結合片段或衍生物。在具體的實施方案中，術語“藥學上可接受的”意指由聯邦或州政府的管理機構批準或美國藥典或其它公認藥典中所列用于動物，更具體地用于人的。術語“載體”是指與試劑一起施用的稀釋劑、佐劑(例如，弗氏完全和不完全佐劑)、賦形劑或媒介物。這樣的藥物載體可以是無菌液體，例如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的那些，包括例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當靜脈內施用藥物組合物時，水是常用載體。鹽水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可被用作液體載體，特別是用于可注射溶液。適當的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、無水脫脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。藥學上可接受的載體、賦形劑和穩定劑的另外實例包括但不限于緩沖劑例如磷酸鹽、檸檬酸鹽以及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量多肽；蛋白質，例如血清白蛋白和明膠；親水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖以及其它糖類包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑例如EDTA ;糖醇例如甘露醇或山梨醇；形成鹽的抗衡離子例如鈉；和/或非離子型表面活性劑例如TWEEN?、聚乙二醇(PEG)和PLUR0NICS?，如本領域中已知的。除了上述成分外，本發明的藥物組合物還可包括潤滑劑、濕潤劑、甜味劑、調味劑、乳化劑、懸浮劑和防腐劑。這些組合物可采取溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、持續釋放制劑等形式。
[0195]還可將本發明的組合物配制為中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括但不限于與陰離子形成的鹽例如來源于鹽酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等的鹽，和與陽離子形成的鹽例如來源鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨乙醇、組氨酸、普魯卡因等的鹽。
[0196]在本發明的某些實施方案中，提供了按照本發明的方法使用的藥物組合物，所述藥物組合物包含治療上和/或預防上有效量的本發明的試劑以及藥學上可接受的載體。
[0197]在優選的實施方案中，本發明的試劑是大體上純的(即，大體上不含限制其作用或產生不期望的副作用的物質)。在具體的實施方案中，宿主或受試者是動物，優選地為哺乳動物例如非靈長類動物(例如，牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)和靈長類動物(例如，猴例如食蟹猴和人)。在優選實施方案中，宿主是人。
[0198]本發明還提供了可用于上述方法的試劑盒。在一個實施方案中，所述試劑盒在例如一個或多個容器中包含本發明的一種或多種試劑。在另一個實施方案中，試劑盒還在一個或多個容器中包含一種或多種可用于治療疾病的其它預防劑或治療劑。
[0199]本發明還提供了包裝在標明試劑或活性劑的量的熔封容器例如安瓿或密封小袋中的本發 明的試劑。在一個實施方案中，試劑以干燥無菌凍干粉劑或無水濃縮物的形式被提供于熔封容器中，并且可以被重構，例如用水或鹽水重構成適當的濃度以給受試者施用。通常地，將試劑以至少5mg,更常見地至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg或至少75mg的單位劑量以干燥無菌凍干粉劑的形式提供于熔封容器中。在備選的實施方案中，本發明的試劑以液體形式被提供于標明試劑或活性試劑的量和濃度的熔封容器中。通常地，將試劑的液體形式以至少lmg/ml、至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/kg或至少25mg/ml提供于熔封容器中。
[0200] 本發明的組合物包括可用于制造藥物組合物的大量藥物組合物(例如，不純的或非無菌組合物)以及藥物組合物(即，適合于給受試者或患者施用的組合物)。大量藥物組合物可用于制備單位劑型，例如，包含預防或治療有效量的本文中公開的試劑或這些試劑的組合以及藥學上可接受的載體。
[0201]本發明還提供了包括一個或多個裝有一種或多種本發明的試劑的容器的藥物包裝或試劑盒。此外，還可在藥物包裝或試劑盒中包括一種或多種用于治療疾病的其它預防劑或治療劑。本發明還提供了包括一個或多個裝有本發明的藥物組合物的一種或多種成分的容器的藥物包裝或試劑盒。任選地與這樣的容器結合的可以是由管理藥物或生物產品的制造、使用或銷售的政府機構規定的形式的聲明，該聲明反映被所述機構批準進行制造、使用或銷售而用于人施用。
[0202]在一些實施方案中，皮下施用本發明的預防劑或治療劑。皮下施用允許例如在皮下施用后數分鐘之內快速遞送試劑。在具體的實施方案中，例如，將治療性分子與本發明的經修飾的PEP白蛋白結合結構域的融合物與藥學上可接受的載體一起提供，其中所述載體適合用于皮下施用。一般地，載體將是無菌的并且具有可與至血液中的施用相容的同滲重摩。
[0203]有利于自我施用的試劑盒和裝置在一些實施方案中也是優選的。例如，用于遞送胰島素或阿達木單抗的“筆”可用于進行本發明的試劑的皮下遞送。(參見，例如，McCoy EK,等人 2010 “A Review of Insulin Pen Devices，，PostgradMedl22(3):81-88;和 Pearson, TL.2010 “Practical Aspects of Insulin PenDevices, ” Symposium, J.0f Diabetes Sci and Tech, 4 (3):522-531,將所述文獻的每一篇通過引用整體并入本文)。用于遞送治療性分子與本發明的去免疫白蛋白結合結構域的融合物的筆裝置可以是一次性的或可重復使用的，并且可預先充滿或被設計來與試劑的藥筒一起使用。市售的預先充滿的一次性筆包括在商品名Humalog?、ICwikPen?、HumuUn?、Lantus?、Apidra?,
Levendr?、NoYolog⑩、FlexPen?等下銷售的所述筆。市售的可再充的筆包括
在商品名 Autopen ⑩，Huma Pee?, luxura?, Novo Pea? 和 OpttClik 翁等下
銷售的所述筆。筆裝置提供了對用于通過皮下途徑自我施用治療劑的瓶-和-注射器方式的另一選擇，并且可提供許多優勢，包括更大的使用容易性，更大的可攜帶性和方便性，改善的給藥準確性，更少的疼痛，更大的社會接受性，更大的組件性和更大的患者順從性。
[0204]在一些實施方案中，筆具有回撥特征，從而允許通過“回撥”逆轉待施用的量。在一些實施方案中，筆具有對最后劑量或最后數次劑量的記憶和數字顯示。筆通常被保存在室溫下，可使用絕緣的貯存包裝，其中將筆保存在經受極端溫度的地方。可將筆裝置與筆針頭一起銷售或分開銷售。筆針頭可具有多種規格和/或長度。規格可以為約25至約35規例如29規、30規、31規或32規，長度為約2mm至約30mm,例如長度為約3mm、約5mm、約10mm、約 12.7_、約 15_、約 20mm 或約 25_。
[0205]—般而言，將本發明的組合物的成分分別提供或在單位劑型中一起提供，例如作為干燥的凍干粉劑或無水濃縮物(在標示有試劑或活性劑的量的熔封容器例如安瓿或密封小袋(sachette)中)。當將通過輸注施用組合物時，其可用裝有無菌藥品級水或鹽水的輸液瓶進行分散。當通過注射施用組合物時，可提供一安瓿的無菌注射用水或鹽水，以便可在施用前混合成分。
[0206]為了所有目的，本文中引用的所有參照資料(包括專利申請和公開案)都通過引用整體并入本文，其引用程度就如同為了所有目的將每一個別公開案或專利或專利申請特定且個別地通過引用整體并入本文一樣。可對本發明進行許多修飾和變化而不背離其精神和范圍，這對于本領域技術人員來說將是顯然的。本文中描述的具體實施方案僅通過舉例說明的方式提供，并且本發明僅受所附權利要求的術語以及這些權利要求有權享有的等同物的全部范圍所限。實施例
[0207]實施例1 -去免疫白蛋白結合結構域的測序
[0208]對去免疫白蛋白結合結構域(PEP)進行測序。去免疫結構域包含如下4個置換:E12D、T29H-K3?和A4?，其中編號參照SEQ ID N0:1中的氨基酸位置。在列表中，雙突變體通過連字符連接例如T29H-K35D。所提出的用于置換的位置以灰色突出顯示。包含置換的PEP結構域的序列示于圖1中。
[0209]實施例2-去免疫白蛋白結合結構域融合物的構建
[0210]包含去免疫白蛋白結合結構域及其白蛋白結合片段或衍生物的DNA片段使用PCR來產生，并且分別在片段5’和3’末端添加SpeI和NcoI限制位點。對所得的PCR片段進行凝膠純化，用SpeI和NcoI限制性酶消化，將其克隆進入噬菌粒載體pComb3X。表達的肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1 (PEP)，還包含至少一個選自E12D、T29H-K3?和A4?的氨基酸置換，其中編號參照SEQ ID NO:1中的氨基酸位置(PEP)，以及其白蛋白結合片段或衍生物。這些表達的肽稱為PEP變體。
[0211]將PEP變體融合于幾個小的結構域抗體片段(sdAb)來產生抗體融合物，以測試sdAb融合物是否可保持對它們各自的抗原的結合親和力，同時也實現對人、大鼠和/或小鼠血清白蛋白的結合。制備融合蛋白，其中PEP變體在sdAb的N末端區域或C末端區域。
[0212]為了表達和純化融蛋白，將包含每一個基因的pET28a質粒用于轉化大腸桿菌Tuner (DE3)細胞。
[0213]將每一個克隆的新鮮菌落在37°C于補充有卡那霉素的SB培養基中生長過夜。將IOml的細胞樣品用于接種IL補充有卡那霉素的SB培養基。將細胞在37°C生長直至A6tltol達到0.9。通過添加0.1mM異丙基-1-巰基-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導抗體表達，在16°C下繼續生長18小時。誘導后，通過離心(4，000Xg，4°C，15min)收獲細菌，重懸浮于50ml補充有蛋白酶抑制劑(Roche)的平衡緩沖液(20mMH印es，IM NaCl，30mM咪唑，10%甘油，PH7.4)中。通過超聲處理裂解細胞。使用離心(14000Xg，4°C，30min)來除去細胞碎片，將上清液通過0.2- μ m注射式過濾器進行過濾。
[0214]在4°C進行所有層析步驟。首先，使用C末端His-標簽，通過鎳螯合劑親和層析純化抗體片段提取物。利用O至300mM咪唑(于20mM Hepes, 0.5M NaCl ;10%甘油(ρΗ7.4)中)的線性咪唑梯度洗脫結合的蛋白質。將適當的級分混合，濃縮，隨后使用Superdex柱和Ifepes緩沖液(20mM Hepes, 200mM NaCl, 5%甘油，pH7.4)通過尺寸排阻層析進行純化。通過SDS-PAGE，隨后通過考馬斯藍染色和利用綴合有HRP的抗-HA單克隆抗體的蛋白質印跡來分析純化的抗體片段。通過測量280nm處的光密度來測定蛋白質濃度。
[0215]實施例3-去免疫白蛋白結合結構域融合物的備選構建
[0216]包含疫白蛋白結合結構域及其白蛋白結合片段或衍生物的DNA片段使用PCR來產生，并且分別在片段5’和3’末端添加SpeI和NcoI限制位點。對所得的PCR片段進行凝膠純化，用SpeI和NcoI限制性消化，將其克隆進入噬菌粒載體pComb3X。表達的肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1 (PEP)，或其白蛋白結合片段或衍生物。
[0217]將對應于SEQ ID NO:1及其白蛋白結合片段或衍生物的肽融合于幾個小的結構域抗體片段或其二聚體(例如，VL-VL sdAb)以產生PEP融合物，及其白蛋白結合片段或衍生物。進行針對人T細胞表位的電腦模擬(in silico)評估，作為PEP融合物及其白蛋白結合片段或衍生物的去免疫策略以降低Th表位含量。
[0218]提出了氨基酸置換的清單:
[0219]提出的氨基酸置換
[0220]在下列清單中，雙突變體通過連字符連接，例如T29H-K35D。在PEP中提出了 4個氨基酸置換:E12D、T29H-K35D 和 A4?。
[0221]在一個或多個sdAb結構域中也提出了氨基酸置換。
[0222]如上所述表達去免疫PEP融合物及其白蛋白結合片段或衍生物。表達的肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1 (PEP)，還包含至少一個選自E12D、T29H-K3?和A4?的氨基酸置換，其中編號參照SEQ ID N0:1(PEP)中的氨基酸位置，以及其白蛋白結合片段或衍生物。這些表達的肽也稱為PEP變體。
[0223]將PEP變體融合于幾個小的結構域抗體片段(sdAb)來產生抗體融合物，從而測試sdAb融合物是否可保持對它們各自的抗原的結合親和力，同時也實現對人、大鼠和/或小鼠血清白蛋白的結合。制備融合蛋白，其中PEP變體在sdAb的N末端區域或C末端區域。如上所述表達和純化融合蛋白。
[0224]實施例4:去免疫白蛋白結合結構域融合物結合血清白蛋白
[0225]實施例2和3的融合物對白蛋白的結合通過ELISA來檢測。如簡要地描述的，進行結合ELISA:將來自人、大鼠或小鼠血清的10 μ g/ml白蛋白在4°C固定在96孔板中過夜。在用PBS/3%豆漿封閉2小時后，將重組抗體片段(sdAb)及其與去免疫白蛋白結合結構域的融合物在室溫下溫育lh。在用PBS洗滌孔后，將抗-HA-HRP mAb (Roche)用于檢測。測量405nm處的光密度，以一式三份進行測定。
[0226]結合研究比較PEP變體-sdAb融合物與未融合的sdAb對人、大鼠和小鼠血清白蛋白的每一種的結合。融合物顯示在一個或多個濃度上對人、小鼠和大鼠白蛋白的每一種的增加的血清白蛋白結合。即，通過根據本發明的融合物產生的白蛋白結合顯示相較于未融合的目標sdAb數倍例如5倍或6倍或更多倍的改善。[0227]競爭ELISA還顯示根據本發明的融合物的白蛋白結合。如簡要地描述的進行競爭性ELISA:將遞增濃度的PEP變體-sdAb融合物用10 μ g的不同白蛋白的每一種在室溫進行預溫育lh，隨后添加至利用對應白蛋白涂覆的微量滴定板。利用小鼠綴合有HRP的抗-HA-標簽抗體進行檢測，在405nm處讀取吸光度。在每一種情況下，預溫育減少結合。
[0228]實施例5:去免疫融合物顯示改善的體內藥代動力學
[0229]通過給大鼠和小鼠施用以檢測其在體內的血清半衰期來測試實施例2和3的融合物的藥代動力學。通過IP或IV注射以不同濃度施用融合物；同時類似地給對照大鼠施用未融合的sdAb。將IOOmg融合物1.P.注射進入Wistar雌性大鼠。以5、30、60、120和360分鐘、24小時、48小時和72小時的規則間隔從被注射的大鼠獲得血漿樣品，通過ELISA測定融合物或未融合的sdAB的濃度。簡而言之，將對應抗原在4°C固定在384孔板(80ng/孔)，進行過夜。在用豆漿封閉2h后，以一式二份滴定重組抗體片段，將其在室溫溫育lh。使用ABTS底物，利用小鼠綴合有HRP的抗-HA抗體(Roche)進行檢測。在ELISA-讀數器中在450nm處測量吸光度。獲得每一個時間點的血衆濃度，將其與兩室消除模型(two-compartmentelimination model)擬合。考慮第一時間點(5分鐘)處的最大濃度而將數據歸一化。
[0230]藥代動力學研究比較PEP變體-sdAb融合物與未融合的sdAb的體內血清半衰期。融合物在一個或多個濃度上顯示增加的血清半衰期。即，根據本發明的融合物的體內血清半衰期顯示相較于未融合的 目標sdAb數倍例如200-500% (即，2至10倍)的改善。結果示于圖3B中。
[0231]實施例6:去免疫融合物保持抗原結合特異性
[0232]使用ELISA就sdAb部分對它們各自的抗原的結合特異性而言分析實施例2和3的融合物的結合。如上所述進行結合ELISA。簡而言之,將給定的sdAb的抗原以80ng/孔于4°C固定在96孔板中進行過夜。在用PBS/3 %豆漿封閉2h后，將重組抗體片段(sdAb)及其與PEP變體的融合物在室溫溫育lh。在用PBS洗滌孔后，將抗-HA-HRP mAb (Roche)用于檢測。測量405nm處的光密度，以一式三份進行測定。
[0233]結合研究比較PEP變體-sdAb融合物與未融合的sdAb對對應于給定的sdAb的抗原的結合。每一種融合物在一個或多個濃度上維持對其各自的抗原的特異性結合。即，通過根據本發明的融合物產生的抗原結合顯示相較于未融會的sdAb大致相同的結合特異性。
[0234]實施例7-VL18-3L-VL11 和 VL18-3L-VL11-PEP 的去免瘡
[0235]特定PEP構建體抗-TNF- α多肽VL18-3L-VL11-PEP (VL 二聚體與PEP的融合物)的去免疫詳述如下。
[0236]進行了針對人T細胞表位的電腦模擬評估(Alogonomics Epibase?-L0NZA),作為減少Th表位含量的VL18-3L-VL11-PEP的去免疫策略。使用Tripole建模工具(LONZA)開發了 VL18-3L-VL11-PEP 的 3D 模型。
[0237]基于假定的T細胞表位的剖析和定位的結果，提出了氨基酸置換的清單:
[0238]提出的氨基酸置換
[0239]在下文中的總結清單中，雙突變體通過連字符連接，例如A51V-L54R，涉及相同位置的變體置換在括號中給出，以斜杠相隔，例如(A51V-L54R/A51V-L54E)。此外，兩個暴露于溶劑的框架半胱氨酸至絲氨酸的突變被提出用以增加穩定性。
[0240]在P印中:E12D、T29H-K3?和A4? (4個提出的氨基酸置換，其中置換的編號參照SEQ ID NO:1中的氨基酸位置(PEP))。
[0241]在VL18 中:T7Q、V15P、(A51V-L54R/A51V-L54E)、K63S、E79K、(C80S)、T91A、LlllK(9個提出的氨基酸置換，其中置換的編號參照SEQ ID NO:2中的氨基酸位置)。
[0242]在VLll 中:T7Q、V15P、R31S、(A51V-54R/A51V-L54E)、K63S、E79K、(C80S)、T91A、A100S和E106K(11個提出的氨基酸置換，其中置換的編號參照SEQ ID N0:3中的氨基酸位置)。
[0243]包含置換的VL18和VLll的序列分別示于圖2A-B中。PEP結構域的序列提供于圖1中，如上文中所述。附圖顯示不同結構域的Kabat和Ordinal編號。⑶R以x標示。提出的置換的位置以灰色突出顯示。VL18-3L-VL11-PEP與人白蛋白之間的結合模式示于圖3中。
[0244]實施例8 -去免瘡VL18-3L-VL11-PEP融合物的合成
[0245]作為實施例7的提出的氨基酸置換的結果，如下文中表1和2中所示，合成假定的VL18-3L-VL11-PEP的去免疫變體。還在C末端添加了編碼HA-標簽序列(YPYDVPDYA)的序列。通過NheI和XhoI消化將編碼去免疫變體的基因克隆進入pET28a表達載體。
[0246]表1
[0247]
[0248]
【權利要求】
1.一種試劑，其包含連接至至少一個白蛋白結合結構域或其白蛋白結合片段或衍生物的治療性分子， 其中所述白蛋白結合結構域包含對應于SEQ ID NO=I(PEP)的氨基酸序列，其中所述結構域被至少一個選自E12D、T29H-K3?和A45D的氨基酸置換修飾，所述置換參照SEQ IDNO:1中的氨基酸位置；和 其中相較于所述治療性分子，所述試劑具有增加的血清半衰期。
2.權利要求1的試劑，其中所述白蛋白結合結構域包含氨基酸置換E12D，所述置換參照SEQ ID NOil(PEP)中的氨基酸位置。
3.權利要求1的試劑，其中所述白蛋白結合結構域包含氨基酸置換T29H-K35D，所述置換參照SEQ ID NOil(PEP)中的氨基酸位置。
4.權利要求1的試劑，其中所述白蛋白結合結構域包含氨基酸置換A4?，所述置換參照SEQ ID NOil(PEP)中的氨基酸位置。
5.權利要求1的試劑，其中所述白蛋白結合結構域包含對應于SEQID N0:31的氨基酸序列。
6.上述權利要求的任一項的試劑，其中所述血清半衰期以至少約5倍增加。
7.上述權利要求的任一項的試劑，其中所述血清半衰期以至少約8倍增加。
8.上述權利要求 的任一項的試劑，其中所述血清半衰期以至少約10倍增加。
9.上述權利要求的任一項的試劑,其中所述血清半衰期為至少約30小時。
10.上述權利要求的任一項的試劑，其中所述血清半衰期為至少約40小時。
11.上述權利要求的任一項的試劑，其中相較于所述治療性分子，所述試劑還具有增加的溶解度。
12.權利要求11的試劑，其中所述溶解度以至少約2倍增加。
13.權利要求11的試劑，其中所述溶解度以至少約5倍增加。
14.權利要求11的試劑，其中所述溶解度以至少約10倍增加。
15.權利要求11的試劑，其中所述溶解度以至少約15倍增加。
16.上述權利要求的任一項的試劑，其中所述連接是通過連接子。
17.上述權利要求的任一項的試劑，其中所述連接子是肽連接子。
18.權利要求17的試劑，其中所述肽連接子包含對應于SEQID N0:30的氨基酸序列。
19.上述權利要求的任一項的試劑，其中所述治療性分子是治療性多肽或肽。
20.權利要求19的試劑，其中將所述治療性多肽或肽連接至所述白蛋白結合結構域作為融合物。
21.權利要求19或20的試劑，其中所述治療性分子選自魚精蛋白、gp60、gp30、gpl8、蛋白A、G蛋白、蛋白質轉導結構域、毒素、細胞毒素、放射性核素和大環螯合劑。
22.權利要求19或20的試劑，其中所述治療性分子是抗體或抗體片段。
23.權利要求22的試劑，其中治療性抗體或抗體片段選自單克隆抗體、多特異性抗體、人源化抗體、合成抗體、嵌合抗體、多克隆抗體、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、抗獨特型(抗-1d)抗體、雙抗體、微型抗體、納米抗體、單結構域抗體、Fab片段、F(ab’)片段、二硫化物連接的雙特異性Fv (sdFv)和胞內抗體。
24.權利要求23的試劑，其中所述治療性分子包含兩個抗體單結構域或其抗原結合片段的二聚體，其中所述結構域包含輕鏈可變結構域。
25.權利要求24的試劑，其中所述二聚體結合TNF-α。
26.權利要求25的試劑，其中所述二聚體包含至少一個含有對應于SEQIDN0:2(VL18)、SEQ ID NO: 3 (VLll)、SEQ ID N0:4_19的氨基酸序列的輕鏈可變結構域或其TNF- α -結合片段或衍生物。
27.權利要求25的試劑，其中所述二聚體包含兩個含有對應于SEQIDNO: 32 (VL18-3L-VL11)的氨基酸序列的輕鏈可變結構域或其TNF- α -結合片段或衍生物。
28.權利要求25-27的任一項的試劑，其中所述至少一個可變結構域拮抗人TNF-α對TNF-α受體的結合。
29.權利要求28的試劑，其中所述至少一個可變結構域還與至少一種其它哺乳動物TNF-α交叉反應,其中所述哺乳動物不是靈長類動物。
30.權利要求29的試劑，其中所述可變結構域與至少兩種其它哺乳動物的TNF-α交叉反應，所 述至少兩種其它哺乳動物是嚙齒類和非嚙齒類物種。
31.權利要求24-30的任一項的試劑，其中所述二聚體通過消除所述可變結構域的至少一個中的至少一個Τη表位而被進一步去免疫。
32.權利要求31的試劑，其中所述至少一個可變結構域包含對應于SEQIDNO:2(VL18)的氨基酸序列，其也通過至少一個選自T7Q、V15P、(A51V-L54R/A51V-L54E)、K63S、E79K、(C80S)、T9IA和LlllK的氨基酸置換被去免疫，所述置換參照SEQ ID NO:2中的氨基酸位置。
33.權利要求31的試劑，其中所述至少一個可變結構域包含對應于SEQIDNO: 3 (VLll)的氨基酸序列，其還通過至少一個選自T7Q、V15P、R31S、(A51V-54R/A51V-L54E)、K63S、E79K、(C80S)、T91A、A100S和E106K的氨基酸置換被去免疫，所述置換參照SEQ ID NO:3中的氨基酸位置。
34.權利要求31的試劑，其中所述二聚體包含至少一個選自SEQID NO: 20-24,SEQ IDNO:25-29,SEQ ID NO:34-44 (VL18-3L-VL11/PEP 變體)及其 TNF-α -結合片段或衍生物的氨基酸序列。
35.一種增強治療性分子在受試者中的效力的方法，包括: 提供包含連接于至少一個白蛋白結合結構域或其白蛋白結合片段或衍生物的所述治療性分子的試劑，其中所述白蛋白結合結構域包含對應于SEQ ID NO=I(PEP)的氨基酸序列，其中所述結構域通過至少一個選自E12D、T29H-K3?和Α4?的氨基酸置換被修飾，所述置換參照SEQ ID NO:1中的氨基酸位置；和 給所述受試者施用所述試劑。
36.權利要求35的方法，其中所述試劑包含氨基酸置換E12D，所述置換參照SEQIDNO:1中的氨基酸位置。
37.權利要求35的方法，其中所述試劑包含氨基酸置換T29H-K35D，所述置換參照SEQID NO:1中的氨基酸位置。
38.權利要求35的方法，其中所述試劑包含氨基酸置換A4?，所述置換參照SEQIDNO:1的氨基酸位置。
39.權利要求35的方法，其中相較于所述治療性分子，所述試劑具有增加的血清半衰期。
40.權利要求35-39的任一項的方法，其中所述連接是通過連接子。
41.權利要求40的方法，其中所述連接子是肽連接子。
42.權利要求35-41的任一項的方法，其中所述治療性分子是治療性多肽或肽。
43.權利要求42的方法，其中將所述治療性多肽或肽連接于所述白蛋白結合結構域作為融合物。
44.權利要求42或43的方法，其中所述治療性分子選自魚精蛋白、gp60、gp30、gpl8、蛋白A、G蛋白、蛋白質轉導結構域、毒素、細胞毒素、放射性核素和大環螯合劑。
45.權利要求42或43的方法，其中所述治療性分子是抗體或抗體片段。
46.權利要求45的方法，其中所述治療性抗體或抗體片段選自單克隆抗體、多特異性抗體、人源化抗體、合成抗體、嵌合抗體、多克隆抗體、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、抗獨特型(抗-1d)抗體、雙抗體、微型抗體、納米抗體、單結構域抗體、Fab片段、F(ab’)片段、二硫化物連接的雙特異性Fv (sdFv)和胞內抗體。
47.權利要求46的方法，其中所述治療性分子包含兩個抗體單結構域或其抗原結合片段的二聚體，其中所述結構域包含輕鏈可變結構域。
48.一種藥物組合物，其包含權利要求1-34的任一項的試劑和藥學上可接受的載體。
49.一種核酸,其包含編碼權利要求19-34的任一項的試劑的核苷酸序列。
50.—種包含權利要求49的核酸的載體。
51.—種包含權利要求50的載體的宿主細胞。
52.—種制備權利要求19-34的任一項的試劑的方法，包括: (i)提供包含編碼所述試劑的載體的宿主細胞； (?)在允許所述試劑表達的條件下培養所述細胞；和 (iii)從所述培養物回收所述試劑。
【文檔編號】C07K19/00GK103958542SQ201280055034
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2012年9月19日 優先權日:2011年9月23日
【發明者】F·N·卡斯塔涅拉埃雷斯達席爾瓦, S·弗爾克爾科爾特-雷亞爾, S·費雷拉洛倫特格蘭舒洛倫索 申請人:抗菌技術,生物技術研究與發展股份有限公司