未分化細胞檢測方法及復合糖檢測方法
【專利摘要】本發明的目的是提供使用培養了干細胞的培養上清液評價細胞的分化狀態的方法。本發明中，能夠提供包含“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc”或“Fucα1-2Galβ1-3GalNAc”的糖鏈結構的“未分化糖鏈標志物”，其能夠使用干細胞的培養上清液以高靈敏度判定干細胞的未分化狀態。同時，發現能夠以高靈敏度識別該“未分化糖鏈標志物”的BC2LCN凝集素或其變體是能夠以培養上清液來判定細胞的未分化狀態的、優秀的“未分化糖鏈標志物檢測用探針”。
【專利說明】未分化細胞檢測方法及復合糖檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及使用細胞培養上清液來判定細胞的狀態的方法。特別地，涉及評價未分化細胞的存在、不存在的方法。另外，本發明涉及檢測糖蛋白質等具有糖鏈的檢測對象物質的方法。
【背景技術】
[0002]多能干細胞因其能夠分化為構成機體的所有細胞的性質以及能夠維持其未分化性的性質而獲得關注，不僅限于創新藥物篩選或闡明疾病機理的應用，而且在世界范圍內正將其作為再生醫療的材料進行研究。
[0003]2010年世界上首次利用人ES細胞的第I期臨床試驗在美國針對急性脊髓損傷開始展開，進而，針對視網膜變性疾病的使用人ES細胞的第1/2期臨床試驗的新藥臨床試驗申請(IND)被FDA批準，利用人多能干細胞的再生醫療研究正在持續飛躍性發展。
[0004]特別地，日本發現的作為新的人多能干細胞的iPS細胞因為不使用受精卵等理由故而倫理障礙較低，并且具有能夠從自體組織建立這樣的極大的優點，再生醫療臨床界也對其充滿期待。在日本，物理化學研究所發生.再生科學綜合研究中心及先端醫療中心等計劃從2013年開始以老年黃斑變性癥患者為對象使用iPS細胞進行臨床研究，慶應大學也有2015年開始對脊髓損傷患者進行臨床研究的方針。
[0005]由此，雖然ES細胞、iPS細胞這類人多能干細胞的臨床應用已被展開，但關于確保品質和安全性地供給細胞的體制尚未準備充分。對多能干細胞而言，制造方法、培養條件、保存條件等對未分化性、分化能力、增殖能力等品質產生影響。因此，如果不基于適當的方法進行管理，則有產生因生產者、使用者而異的結果的可能性。這是干細胞治療的可靠性較低、及招致因為治療導致發生健康損害等的弊端的原因。因此，可靠性和再現性高的維持培養法及計測.評價系統是必需的。
[0006]例如，細胞治療中，多能干細胞并非原樣使用，而是分化為目標細胞之后用于移植，但在分化為目標細胞的細胞源中混入了未分化的細胞時，有報道稱該未分化細胞將是腫瘤形成的原因。因此，需要開發對細胞治療中使用的細胞中是否混入了未分化細胞即腫瘤形成細胞進行評價的技術。
[0007] 另一方面，成體干細胞的種類和特性較之ES細胞、iPS細胞這類人多能干細胞而言更加多種多樣，其在臨床中的應用已作為既有技術存在。但是，穩定獲得品質適于移植的細胞并不容易，因此確立充質干細胞的品質驗證方法以及基于此確立穩定的培養方法一直是極其重要的課題。此外，即使在進行了對利用成體干細胞的細胞移植的有效性的評價、對其機制的理解及風險評價的基礎上，仍需要開發對移植前的細胞的品質驗證方法。
[0008]本發明的發明人等以前使用了凝集素微陣列，對從五種不同的體細胞(皮膚、胎兒肺、子宮內膜、胎盤動脈、羊膜)制作的人iPS細胞(114份檢測樣本)和人ES細胞(9份檢測樣本)的糖鏈情況進行了廣泛的分析。
[0009]結果發現，盡管最初的體細胞隨組織不同而具有各異的糖鏈情況，但制作的iPS細胞均顯示出基本相同的糖鏈情況，通過導入重編程基因而均收斂為與ES細胞類似的糖鏈結構。對人ES.iPS細胞與人體細胞的凝集素陣列數據進行了詳細的分析，根據分析結果，推定未分化的人ES *iPS細胞較之體細胞而言a 2_6Sia、a l_2Fuc、l型LacNAc的表達量顯著增加。進而，通過利用了 DNA陣列的糖轉移酶基因的表達分析以及利用質譜儀的方法，發現rBC2LCN僅與未分化的人ES.iPS細胞結合(非專利文獻I)。
[0010]上述rBC2LCN是使BC2LCN凝集素(YP_002232818)(其對應于來自革蘭氏陰性菌(洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cenocepacia))的BC2L-C蛋白質的N末端結構域)在大腸桿菌轉化體中表達而得的重組體，其為識別復合糖鏈的非還原末端的“Fuc a l-2Gal β l_3GlcNAc” 以及 “Fuc a l-2Gal β l_3GalNAc” 的糖鏈結構的凝集素(非專利文獻1、3)。
[0011]本發明的發明人等在利用上述凝集素陣列的實驗中，發現rBC2LCN雖然與未分化的人ES.iPS細胞反應，但與分化了的體細胞(皮膚、胎兒肺、子宮內膜、胎盤動脈、羊膜)完全不反應。認為rBC2LCN與具有“ a l-2Fuc”、“l型LacNAc”及“ a 2_6Sia”中的兩個(a l-2Fuc、I 型 LacNAc)的 “Fuc a l_2Gal β l_3GlcNAc ( = Hl 型結構)”及“Fuc a l-2Gal β l_3GalNAc ( = Η3型結構)”的糖鏈結構特異性反應。這兩個糖鏈結構在人ES.iPS細胞中高表達，并且是在分化了的皮膚、胎兒肺、子宮內膜、胎盤動脈、羊膜的細胞中幾乎不表達的糖鏈。
[0012]因此顯示，rBC2LCN識別的糖鏈配體為未分化細胞特有的新穎的未分化糖鏈標志物，并且顯示，rBC2LCN可用作針對該未分化糖鏈標志物“Fuca l_2Gal β l_3GlcNAc”和/或“Fuca l-2Gal β l_3GalNAc” (下文中有時將二者合稱為 “Fuc a l_2Gal β l_3GlcNAc/GalNAc”)的特異性探針。
[0013]這之后，Drukker等人的團隊也發現，識別“Fuc a l_2Gal β l_3GlcNAc”的抗體能識別未分化狀態的ES細胞及iPS細胞(非專利文獻2)，證實了本發明的發明人的上述發現。
[0014]但是，Drukker等人的上述抗體雖然與“Fuc a l_2Gal β l_3GlcNAc ( = Hl型結構)”特異性反應，但與“(Fuc a l-2Gal β l_3GalNAc = H3型結構)”不反應。與rBC2LCN比較而言，其不能檢測未分化細胞中的“Fuc a l_2Gal β l_3GalNAc”或“含有Fuc a l-2Gal β l-3GalNAc的糖鏈”，故而較之本發明的發明人的rBC2LCN而言存在靈敏度不夠充分的缺點。
[0015]專利文獻1:日本特開平9-301995號
[0016]專利文獻2:W02007/027495
[0017]非專利文獻I:Tateno H, Toyota M, Saito S，Onuma Y, Ito Y, Hiemori K, FukumuraM, Matsushima A, Nakanishi M, Ohnuma K,Akutsu H, Umezawa A, Horimoto K, HirabayashiJ, Asashima Μ., J Biol Chem.2011，286 (23): 20345-53.[0018]非專利文獻2:Tang C，Lee AS, Volkmer JP, Sahoo D, Nag D, Mosley AR, InlayMA, Ardehali R, Chavez SL, Pera RR, Behr B, Wu JC, Weissman IL, Drukker M., NatBiotechnol.2011, 29 (9): 829-34.[0019]非專利文獻3:Sulak 0, Cioci G,Delia M, LahmannM, Varrot A, ImbertyA, Wimmerova M., Structure.2010, 18(I):59-72.[0020]非專利文獻4:Suemori H., Yasuchika K., HasegawaK., Fujioka T., TsuneyoshiN., Nakatsuji N.Biochem.Biophys.Res.Commun.2006, 345, 926-932.[0021]非專利文獻5:Draper JS, Pigott C，Thomson JA, Andrews Pff.JAnat.2000, 200, 249-58.[0022]非專利文獻6 =Iijima et al.Chem.Bi0.Chem.2009，10，999-1006
[0023]非專利文獻7:Tateno, H.，Nakamura-Tsuruta, S.，and Hirabayashi, J.Nat.Protoc.2007, 2, 2529-2537
[0024]非專利文獻8: Ni e I sen, J.S., and McNagny, Κ.M.J Am SocNephrol, 2009，20，1669-1676.
【發明內容】
[0025]現在，檢查細胞品質時，通常利用測序儀、微陣列、流式細胞術、免疫組織科學等對細胞的基因表達、表觀基因組狀態、細胞表面標志物等的差異進行分析。但是，這些方法必須要使用細胞本身進行分析，因此存在下述大問題:不僅必需繁雜的細胞回收工序，還要將珍貴的用于細胞治療的細胞在檢查中就使用消耗掉。
[0026]此外，如上文所述，根據本發明的發明人等，能夠確定作為識別未分化細胞和分化細胞的未分化糖鏈標志物的糖鏈結構自身。但是，不僅限于Drukker等人的方法,在本發明的發明人等以前使用rBC2LCN的技術在觀察細胞表面的糖蛋白或糖脂質等具有的糖鏈這一點上均停留在現有技 術階段。即，這些技術同樣需要回收被測細胞的工序或者進一步純化的工序，并沒有解決檢測評價工序中的工序繁雜、浪費有效細胞這樣的一直以來的問題。
[0027]因此，本發明的主要目的在于提供不減少被測細胞、非侵襲性地調查細胞的狀態的方法。
[0028]本發明的發明人等制作了將rBC2LCN作為針對“Fuc a l-2Gal β l_3GlcNAc/GalNAc"的特異性探針固定化于載玻片上的基板，使用該基板評價ES細胞及iPS干細胞的分化狀態時，還嘗試了同時評價研究與培養上清液的反應性以代替評價研究細胞自身(破碎物)。
[0029]結果，出人意料地發現，將從被測細胞培養基采集的I滴培養上清液(相當于I μ L)以不施加任何純化工序的狀態直接供給至基板表面的凝集素，僅通過上述操作就能夠使用基板上的rBC2LCN評價分化狀態。具體而言，rBC2LCN與對照培養基及視黃酸存在下進行培養并分化了的iPS細胞的培養上清液不反應，但是與不存在視黃酸時維持了未分化狀態的iPS細胞的培養上清液發生特異性反應。
[0030]從以上結果可見，其顯示:具有上述“Fuca l_2Gal β l_3GlcNAc/GalNAc”糖鏈結構的未分化糖鏈標志物在未分化細胞的培養上清液中通常被分泌，但隨著通過分化誘導分化逐漸進行而減少，若完全分化則該未分化糖鏈標志物會消失。
[0031]由此，本發明中，不僅首次發現“Fuc a l_2Gal β l_3GlcNAc/GalNAc”糖鏈作為培養上清液中可觀察到的未分化糖鏈標志物發揮作用，并且，通過本發明相當于首次提供了培養上清液中可觀察到的未分化糖鏈標志物。需要說明的是，僅就本發明的發明人等知道的內容而言，在此之前，從來不存在表明在培養下維持未分化狀態的ES細胞及iPS干細胞的細胞表面的糖蛋白或糖脂質等能夠以在培養液中能被檢測的狀態溶出的教導。[0032]即表明，在對分化誘導ES細胞、iPS細胞等未分化細胞時的分化狀態進行評價時，或者為了評價將這些未分化細胞以維持未分化狀態的形式保存時的保存狀態，可采集這些未分化細胞的培養上清液，通過培養上清液中“Fuc a l-2Gal β l_3GlcNAc/GalNAc”的存在.不存在(利用該糖鏈結構特異性的凝集素及抗體等)來進行評價。使用了培養上清液的該手段不需要回收作為靶標的被測細胞自身的工序，也不需要純化特定靶標分子的工序，可以說是極其簡便的技術。特別地，“BC2LCN凝集素”具有能以高靈敏度識別“Fuc a l-2Gal β l_3GlcNAc”及“Fuc a l_2Gal β l_3GalNAc”中任一的糖鏈結構的特性，因此通過使用該凝集素，能夠提供更可靠的未分化狀態評價系統。
[0033]基于上述發現完成了本發明。
[0034]即，本發明包含以下的發明。
[0035](I) 一種判定干細胞的分化狀態的方法，其特征在于，測定干細胞的培養上清液中下述(式I)或(式2)表示的未分化糖鏈標志物的是否存在或存在量:
[0036](式I)
[0037]
【權利要求】
1.一種判定干細胞的分化狀態的方法，其特征在于，測定干細胞的培養上清液中下述(式I)或(式2)表示的未分化糖鏈標志物的是否存在或存在量: (式I)
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，使用特異性識別(式I)或(式2)表示的糖鏈結構的蛋白質來測定所述未分化糖鏈標志物的有無或存在量。
3.根據權利要求2所述的方法，其中，所述蛋白質為下述蛋白質:所述蛋白質包含序列號I所示的氨基酸序列或該氨基酸序列的一個或數個氨基酸被缺失、取代、插入或添加而得的氨基酸序列，并且特異性識別所述(式I)或(式2)表示的糖鏈結構。
4.根據權利要求1~3中任一項所述的方法，其特征在于，所述干細胞的培養上清液為對該干細胞施加了分化誘導處理后的培養上清液。
5.根據權利要求1~4中任一項所述的方法，其特征在于，測定來源于足糖萼蛋白的上述(式I)和/或(式2)表示的所述未分化糖鏈標志物的是否存在或存在量。
6.根據權利要求1~5中任一項所述的方法，其特征在于，通過使用下述蛋白質的凝集素-凝集素夾心法檢測所述未分化糖鏈標志物，所述蛋白質特異性識別所述(式I)或(式2)表示的糖鏈結構，包含序列號I所示的氨基酸序列或該氨基酸序列的一個或數個氨基酸被缺失、取代、插入或添加而得的氨基酸序列，并且沒有糖鏈。
7.一種獲得沒有混入未分化細胞的分化細胞的方法，其特征在于，確認施加了分化誘導處理的干細胞的培養上清液中不存在下述(式I)或(式2)表示的未分化糖鏈標志物并進行采集，(式1)
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，關于所述未分化糖鏈標志物不存在的確認使用下述蛋白質來進行，所述蛋白質特異性識別所述(式I)或(式2)表示的糖鏈結構，并且包含序列號I所示的氨基酸序列或該氨基酸序列的一個或數個氨基酸被缺失、取代、插入或添加而得的氨基酸序列。
9.一種用于判定干細胞的分化狀態的方法的試劑盒，其特征在于，包含特異性識別下述(式1)或(式2)表示的糖鏈結構的蛋白質， (式1)
10.根據權利要求9所述的試劑盒，其中，所述蛋白質為下述蛋白質:所述蛋白質特異性識別所述(式I)或(式2)表示的糖鏈結構，并且包含序列號I所示的氨基酸序列或該氨基酸序列的一個或數個氨基酸被缺失、取代、插入或添加而得的氨基酸序列。
11.檢測對象物質的檢測方法，其中，使具有糖鏈的檢測對象物質與針對所述糖鏈具有結合性的凝集素I和凝集素2接觸，形成由所述凝集素I與所述檢測對象物質與所述凝集素2構成的復合體，通過檢測該復合體來進行所述檢測方法，其中所述凝集素I和所述凝集素2中的至少一者為不具有糖鏈的凝集素。
12.根據權利要求11所述的檢測方法，其中，所述檢測對象物質為選自糖蛋白、糖脂質、蛋白聚糖、糖肽、脂多糖、肽聚糖及在類固醇化合物上結合了糖鏈的糖苷的復合糖。
13.根據權利要求11或12所述的檢測方法，其中，所述凝集素I與所述凝集素2具有針對互相不同的糖鏈結構的結合性。
14.根據權利要求11~13中任一項所述的檢測方法，其中，所述不具有糖鏈的凝集素為在原核細胞中表達了的重組型凝集素或改變了天然型蛋白質的糖鏈結構而得的突變型凝集素。
15.根據權利要求11~14中任一項所述的檢測方法，其中，使所述檢測對象物質與結合至不溶性載體的不具有糖鏈的所述凝集素I和未結合至不溶性載體的所述凝集素2接觸形成所述復合體，通過檢測該復合體來進行所述檢測方法。
16.根據權利要求15所述的檢測方法，包括: 第一步驟:使所述檢測對象物質與結合至不溶性載體的不具有糖鏈的所述凝集素I接觸，獲得由所述凝集素I與所述檢測對象物質構成的復合體1，和 第二步驟:使所述復合體I與所述凝集素2接觸，獲得由所述凝集素I與所述檢測對象物質與所述凝集素2構成的復合體2。
17.根據權利要求11~16中任一項所述的檢測方法，其中，所述凝集素I與所述凝集素2兩者均為不具有糖鏈的凝集素。
18.用于檢測具有糖鏈的檢測對象物質的試劑盒，所述試劑盒包含針對所述糖鏈具有結合性的凝集素I和凝集素2，所述凝集素I和所述凝集素2中的至少一者為不具有糖鏈的凝集素。
19.根據權利要求18所述的試劑盒，包含: 不溶性載體， 結合至所述不溶性載體的、不具有糖鏈的所述凝集素1，和未結合至所述不溶性載體的凝集素2。
20.根據權利要求18或19所述的試劑盒，其中，所述凝集素I和所述凝集素2兩者均為不具有糖鏈的凝集 素。
【文檔編號】C07K14/47GK103987855SQ201280053624
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2012年10月31日 優先權日:2011年11月1日
【發明者】館野浩章, 平林淳, 伊藤弓弦, 小沼泰子, 淺島誠, 久野敦, 藁科雅岐, 福田雅和 申請人:獨立行政法人產業技術綜合研究所, 和光純藥工業株式會社