神經調節蛋白抗體及其用途

神經調節蛋白抗體及其用途
【專利摘要】本發明提供了抗神經調節蛋白抗體和在治療疾病或病癥（諸如癌癥）中使用該抗體的方法。在一個具體的實施方案中，所述抗神經調節蛋白抗體結合神經調節蛋白1α和神經調節蛋白1β同等型二者。
【專利說明】神經調節蛋白抗體及其用途
[0001]對相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年8月17日提交的美國臨時專利申請61/524，421的優先權，通過提及而將其公開內容完整收入本文。
[0003]序列表
[0004]本申請含有序列表，已經以ASCII格式經EFS-WEB提交且通過述及完整收入本文。2012年8月14日創建的所述ASCII拷貝命名為P4727R1W0_ST25.txt，并且大小為64，664個字節。
發明領域
[0005]本發明提供了神經調節蛋白抗體和在治療疾病或病癥(諸如癌癥)中使用該抗體的方法。
[0006]發明背景
[0007]對于大多數癌癥，對化療的響應較差或化療后疾病復發是死亡的一個主要原因。非小細胞肺癌(NSCLC)尤其如此，因為化療用于治療具有所有階段的疾病的患者。超過三分之二的患者呈現不可切除的晚期疾病且用前線化療、放療或二者的組合治療。然而，盡管在NSCLC的治療中攻擊性使用化療，局部晚期和晚期疾病的5年存活率仍然分別為8%和
3.5% (Doebele et al)。
[0008]對化療的部分響應和化療后的復發提示腫瘤細胞在它們的藥物敏感性方面是異質的。一些腫瘤細胞被給定藥劑有效殺死，而其它腫瘤細胞幸免。癌干細胞(CSC)在最近幾年成為熱烈研究的一個領域，因為它們為現有療法的失敗提供一種可能的解釋。數個小組報告了 CSC顯示增強的對常規化療劑和放射治療的抗性(Bao et al., 2006;Costelloet al.，2000;Dean et al.，2005;Dylla et al.，2008;Matsui et al.，2004;Phillips etal., 2006) o然而，CSC在維持已建立腫瘤的生長中或在化療后在原發性或遠距離部位再啟動腫瘤中的作用仍然有待確定。負責化療后腫瘤再生長的細胞可能根本不是干細胞，而是經由可能反映細胞周期的階段、基質-生態位相互作用、或促存活信號的水平的其它特性實現抗性的細胞。這些細胞稱作“腫瘤再啟動細胞”或TRIC。美國專利公開文本20110229493。
[0009]表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑頻繁用于治療NSCLC患者且顯示出有效治療其腫瘤包含EGFR激活性突變的大多數患者。已經顯示了經由過表達或激活突變的EGFR信號傳導脫調節(deregulation)是肺腺癌中的一個相對頻繁事件(綜述見Dahabreh etal.，2010)。EGFR是ErbB或HER酪氨酸激酶家族的原型成員，該家族包括EGFR(HERl)、HER2、HER3和HER4。最近的證據顯示了其它HER家族成員也可能在NSCLC中發揮作用。然而，它們對疾病的貢獻是不太充分表征的，并且大多數研究聚焦于其激活EGFR信號傳導的能力(Ding et al., 2008; Johnson and Janne, 2006; Kuyama et al., 2008; Zhou etal.，2006)。神經調節蛋白1 (NRGl)，也稱作調蛋白1，是HER3和HER4受體的一種配體。
[0010]神經調節蛋白家族有4種已知的成員，即NRG1、NRG2、NRG3、和NRG4 (FalIs2003;Hirsch and Wu2007)。NRGl轉錄物經歷廣泛的可變剪接，生成至少15種不同同等型。所有活性同等型共享對于活性必需且足夠的EGF樣域(Holmesl992, Yardenl991)。
[0011]已經顯示了 NRGl自分泌信號傳導調節肺上皮細胞增殖，并且在人肺發育中發揮作用(Patel et al.，2000)，而且牽涉NSCLC對EGFR抑制劑的不敏感性(Zhou etal., 2006)。
[0012]發明概述
[0013]本發明提供抗神經調節蛋白I (抗NRG1)抗體及使用它們的方法。
[0014]本發明的一個方面提供一種分離的抗NRGl抗體，其結合神經調節蛋白I α和神經調節蛋白1β。在一個實施方案中，所述抗NRGl抗體結合神經調節蛋白I β的EGF域和神經調節蛋白Ia的EGF域。在一個實施方案中,所述抗NRGl抗體結合神經調節蛋白I β的EGF域的親和力比它結合神經調節蛋白Ia的EGF域的親和力大。在具體的實施方案中，所述抗NRGl抗體結合神經調節蛋白I β的EGF域的親和力比它結合神經調節蛋白I α的EGF域的親和力大20倍，50倍，100倍,200倍,500倍，1000倍。
[0015]在一個實施方案中，所述抗NRGl抗體以IOnM或更少的kD結合神經調節蛋白1β的EGF域且以IOnM或更少的kD結合神經調節蛋白I α的EGF域。在具體的實施方案中，所述抗NRGl抗體以IOnM或更少，InM或更少，lxlO'M或更少，1χ10-2ηΜ或更少，或1χ10-3ηΜ或更少的kD結合神經調節蛋白I β的EGF域。在一個實施方案中,所述抗NRGl抗體的親和力是通過表面等離振子共振測定法測量的。
[0016]本發明的一個方面提供一種分離的抗NRGl抗體，其結合神經調節蛋白I β表位，其中該神經調節蛋白I β表位包含SEQ ID NO:4氨基酸1_37的氨基酸序列或SEQ ID NO:4氨基酸38-64的氨基酸序列。在一個實施方案中，所述神經調節蛋白I β表位包含氨基酸序列SEQ ID Ν0:4。在一個實 施方案中，所述抗NRGl抗體進一步結合神經調節蛋白Ia表位，其中該神經調節蛋白Ia表位包含SEQ ID NO:3氨基酸1_36的氨基酸序列或SEQ IDNO:3氨基酸37-58的氨基酸序列。在一個實施方案中，所述神經調節蛋白Ia表位包含氨基酸序列SEQ ID NO:3ο
[0017]在某些實施方案中，所述抗NRGl抗體為單克隆抗體。在某些實施方案中，所述抗NRGl抗體為人抗體，人源化抗體，或嵌合抗體。在某些實施方案中，所述抗NRGl抗體為結合神經調節蛋白Ia和神經調節蛋白1β的抗體片段。
[0018]本發明的另一個方面提供一種分離的抗NRGl抗體，其包含:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-H1，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-H2，和(c)包含氨基酸序列 SEQ ID NO:7 的 HVR-H3。
[0019]本發明的另一個方面提供一種分離的抗NRGl抗體，其包含:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:16的HVR-Ll，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HVR-L2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3。在一個實施方案中，所述抗NRGl進一步包含:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:16的HVR-Ll，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HVR-L2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3。
[0020]本發明的另一個方面提供一種分離的抗NRGl抗體，其包含:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:76的HVR-H1，(b)包 含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H2，和(c)包含氨基酸序列 SEQ ID NO:43 的 HVR-H3。
[0021]本發明的另一個方面提供一種分離的抗NRGl抗體，其包含:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的HVR-Ll, (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-L2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-L3。在一個實施方案中，所述抗NRGl抗體進一步包含:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的HVR-Ll, (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-L2，和
(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-L3。
[0022]本發明的另一個方面提供一種分離的抗NRGl抗體，其包含:(a)與氨基酸序列SEQID NO:21具有至少95%序列同一性的VH序列；(b)與氨基酸序列SEQ ID NO:26具有至少95%序列同一性的VL序列；或(c) (a)中的VH序列和(b)中的VL序列。在一個實施方案中，所述抗NRGl抗體包含VH序列SEQ ID NO:210在一個實施方案中，所述抗NRGl抗體包含VL序列SEQ ID NO:260在一個實施方案中，所述抗NRGl抗體包含VH序列SEQ ID NO:21 和 VL 序列 SEQ ID NO:26。
[0023]本發明的一個方面提供一種分離的抗NRGl抗體，其包含VH序列SEQ ID N0:53和VL 序列 SEQ ID NO:63。
[0024]本發明的另一個方面提供一種分離的核酸，其編碼抗NRGl抗體。本發明的另一個方面提供一種宿主細胞，其包含編碼抗NRGl抗體的核酸。
[0025]本發明的另一個方面提供一種生成抗NRGl抗體的方法，其包括培養此類宿主細胞，使得該抗體生成。
[0026]本發明的另一個方面提供一種免疫偶聯物，其包含抗NRGl抗體和細胞毒劑。
[0027]本發明的另一個方面提供一種藥物配制劑，其包含抗NRGl抗體和藥學可接受載體。在一個實施方案中，所述藥物配制劑進一步包含別的治療劑，諸如吉西他濱，帕利他賽，或順鉬，或帕利他賽和順鉬的組合。
[0028]本發明的另一個方面提供抗NRGl抗體，其用作藥物。
[0029]本發明的另一個方面提供抗NRGl抗體，其用于治療癌癥。
[0030]本發明的另一個方面提供抗NRGl抗體，其在藥物制備中。在一個實施方案中，所述藥物用于治療癌癥，諸如非小細胞肺癌，乳腺癌，卵巢癌，頭和頸癌，宮頸癌，膀胱癌，食道癌，前列腺癌，和結腸直腸癌。
[0031]本發明的另一個方面提供一種治療具有癌癥的個體的方法，其包括對該個體施用有效量的抗NRGl抗體。要治療的癌癥為例如非小細胞肺癌，乳腺癌，卵巢癌，頭和頸癌，宮頸癌，膀胱癌，食道癌，前列腺癌，和結腸直腸癌。在一個實施方案中，所述方法進一步包括對該個體施用別的治療劑，諸如吉西他濱，帕利他賽，卡鉬，和順鉬或帕利他賽，卡鉬，和順鉬中兩種或所有三種的組合。
[0032]本發明的另一個方面提供一種在癌癥患者中延長腫瘤再發生前時間的方法，其包括對該患者施用有效量的抗NRGl抗體。在一個實施方案中,所述方法進一步包括對該患者施用治療劑。在一個實施方案中，所述治療劑為化學治療劑或第二抗體。所述化學治療劑為例如吉西他濱，帕利他賽，卡鉬，和順鉬或帕利他賽，卡鉬，和順鉬中兩種或所有三種的組合。在某些實施方案中，所述 第二抗體結合EGFR，HER2，HER3，或HER4，或結合這些靶物中的兩種或更多種。在某些實施方案中，要治療的癌癥為非小細胞肺癌，乳腺癌，卵巢癌，頭和頸癌，宮頸癌，膀胱癌，食道癌，前列腺癌，和/或結腸直腸癌。在一個實施方案中，腫瘤再發生前時間的延長為比所述抗體缺失下的再發生前時間長至少1.25倍。在一個實施方案中，腫瘤再發生前時間的延長為比所述抗體缺失下的再發生前時間長至少1.50倍。
[0033]附圖簡述
[0034]圖1A:圖顯示了在其隨意的飲用水中施用媒介物(蔗糖)或dox(2gm/L)的具有已建立的Calu3-shNRGl異種移植物腫瘤的小鼠的腫瘤生長曲線。對腫瘤體積一周測量兩次，持續整個研究。數據以線性混合效應(Linear Mixed Effect, LME)模型對腫瘤體積產生的擬合呈現，作為具有自動確定的紐結(auto-determined knot)的三次樣條(cubicsplines)繪圖。
[0035]圖1B:圖顯示了用化療+蔗糖或化療+dox處理的具有已建立的Calu3_shNRGl異種移植物腫瘤的小鼠的腫瘤生長曲線。數據以LME模型對腫瘤體積產生的擬合呈現，作為具有自動確定的紐結的三次樣條繪圖。[0036]圖2A:圖顯示了用蔗糖或dox處理的具有已建立的H441_shNRGl異種移植物腫瘤的小鼠的腫瘤生長曲線U=12只/組)。數據以腫瘤體積的LME擬合分析呈現，作為具有自動確定的紐結的三次樣條繪圖。
[0037]圖2B:圖顯示了用化療+蔗糖或化療+dox處理的具有已建立的H441_shNRGl異種移植物腫瘤的小鼠的腫瘤生長曲線(n=12只/組)。數據以腫瘤體積的LME擬合分析呈現，作為具有自動確定的紐結的三次樣條繪圖。
[0038]圖3A:圖顯示了用媒介物+對照IgG (n=6)、順鉬+對照IgG (n=6)、或順鉬+HER4ECD-Fc (n=8)處理的LSL-K_rasG12D ；p53F1/+小鼠的平均腫瘤體積+/-SEM。豚草，對照鼠IgG2a抗體。
[0039]圖3B:圖顯示了通過治療方案得到的腫瘤負荷的每日倍數變化及95%置信區間。
[0040]圖3C:圖顯示了用媒介物+對照IgG (n=10)、順鉬+對照IgG (η=11)、順鉬+HER4-ECD(η=8)或媒介物 +HER4-ECD(η=7)處理的 LSL-K_rasG12D ；p53F1/F1 小鼠的腫瘤負荷自基線的平均百分比變化土SEM。
[0041]圖4A:圖顯示了來自Kras-LSL-G12D小鼠NSCLC模型的殘余腫瘤細胞中NRGlmRNA富集，顯示的數據來自一種微陣列探針且經獨立樣品之qPCR驗證。
[0042]圖4B:圖顯示了如qPCR所評估，在媒介處理和殘余化療處理Calu3腫瘤細胞中NRGl之表達。
[0043]圖4C:圖顯示了如qPCR所評估，在媒介處理和殘余化療處理H441腫瘤細胞中NRGl之表達。
[0044]圖4D:圖顯示了如qPCR所評估，在媒介處理和殘余吉西他濱和長春瑞濱處理Calu3和H441腫瘤細胞中NRGl之表達。
[0045]圖 5:NRG1 a (SEQ ID NO:3)或 NRG2 β (SEQ ID NO:4)之 EGF 域的比對。
[0046]圖6:圖顯示了抗NRGl抗體抑制1251-NRGP I結合HER3_Fc。
[0047]圖7:圖顯示了親和力成熟的抗NRGl抗體變體抑制1251-NRG0 I結合HER3_Fc。
[0048]圖8:BIAcore?測定法所測量的538.24親和力成熟變體抗NRGlIgG對NRGl β的結合親和力。
[0049]圖9:BIAcore?測定法所測量的538.24親和力成熟變體抗NRGlIgG對NRGl α的結合親和力。[0050]圖10:BIAcore?測定法所測量的538.24.71抗NRGl抗體對NRGl β和NRGl α的結合親和力。
[0051]圖11:BIAcore?測定法所測量的538.24.71抗NRGl抗體對NRGl β和NRGl α的結合親和力。
[0052]圖12:圖顯示了 526.09抗體與538.24.71抗體競爭結合HRGl α和HRGl β 二者。
[0053]圖13:表顯示了 KIRA測定法中526.09抗NGRl抗體的親和力成熟變體阻斷NRGl α和NRGl β結合抗HER3抗體之能力。
[0054]圖14:圖顯示了 526.90親和力成熟變體的BV測試的結果。
[0055]圖15:BIAcore?測定法所測量的538.90.28抗NRGl抗體對NRGl β和NRGl α的結合親和力。
[0056]圖16:如使用KIRA測定的，圖顯示了抗NRGl抗體526.90.28和538.24.71阻斷NRGl α誘導HER3活化之能力。
[0057]圖17:如使用KIRA測定的，圖顯示了抗NRGl抗體526.90.28和538.24.71阻斷NRGl β誘導HER3活化之能力。
[0058]圖18 =Western印跡顯示了在人和小鼠二者細胞中抗NRGl抗體抑制NRGl自分泌信號傳導之能力。
[0059]圖19:圖顯示了在小鼠模型系統中抗NRGl抗體+/_化療對HNSCC腫瘤生長之作
用。
[0060]圖20:顯示小鼠模型系統中抗NRGl抗體+/-化療對肺癌腫瘤生長之作用的腫瘤生長曲線以及顯示該模型系統中的無進展存活的Kaplan-Meier曲線。
[0061]圖21:顯示小鼠模型系統中抗NRGl抗體+/-化療對NSCLC LKPH2腫瘤生長之作用的腫瘤生長曲線以及顯示該模型系統中的無進展存活的Kaplan-Meier曲線。
[0062]圖22:顯示小鼠模型系統中抗NRGl抗體+/-學療對NSCLC Η596腫瘤生長之作用的腫瘤生長曲線。
[0063]圖23:顯示小鼠模型系統中抗NRGl抗體+/-化療對NSCLC LKPH2腫瘤生長之作用的腫瘤生長曲線以及顯示該模型系統中的無進展存活的Kaplan-Meier曲線。
[0064]圖24:顯示抗NRGl抗體對NRG1-HER3信號傳導驅動之腫瘤生長(A)以及對NRG1-HER4信號傳導驅動之腫瘤生長(B)的作用的腫瘤生長曲線。
[0065]圖25 -M NRG抗體的重鏈可變區氨基酸序列(SEQ ID NO:20)。
[0066]圖26:抗NRG抗體的輕鏈可變區氨基酸序列(分別是SEQ ID NO:22_27)。
[0067]圖27:抗NRG抗體的重鏈可變區氨基酸序列(分別是SEQ ID NO:52，54，56，58，60，62，63，64，66，68，70)。
[0068]圖28:抗NRG抗體的輕鏈可變區氨基酸序列(分別是SEQ ID NO:53，55，57，59，61，53，53，65，67，69，71)。
[0069]發明詳述
[0070]1.定義
[0071]出于本文中的目的， “受體人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定義的人共有框架衍生的輕鏈可變域(VL)框架或重鏈可變域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受體人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列變化。在一些實施方案中，氨基酸變化的數目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些實施方案中，VL受體人框架與VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。
[0072]“親和力”指分子(例如抗體)的單一結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間全部非共價相互作用總和的強度。除非另有指示，如本文中使用的，“結合親和力”指反映結合對的成員(例如抗體和抗原)之間1:1相互作用的內在結合親和力。分子X對其配偶體Y的親和力通常可以用解離常數(Kd)來表述。親和力可以通過本領域知道的常用方法來測量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于測量結合親和力的具體的說明性和例示性的實施方案。
[0073]“親和力成熟的”抗體指在一個或多個高變區(HVR)中具有一處或多處改變的抗體，與不擁有此類改變的親本抗體相比，此類改變導致該抗體對抗原的親和力改善。
[0074]術語“抗NRGl抗體”和“結合NRGl的抗體”指能夠以足夠的親和力結合神經調節蛋白I (NRGl)，使得抗體可用作靶向NRGl中的診斷和/或治療劑的抗體。在一個實施方案中，抗NRGl抗體對無關的、非NRGl蛋白的結合程度小于抗體對NRGl的結合的約10%，如例如通過放射性免疫測定法(RIA)測量的。在某些實施方案中，結合NRGl的抗體具有< I μ Μ、(ΙΟΟηΜ、≤ ΙΟηΜ、≤ InM、≤ 0.1nM、≤ 0.01nM、或≤ 0.0OlnM(例如 10_8M 或更少，例如 KT8M至10_13M，例如10_9M至I(T13M)的解離常數(Kd)。在某些實施方案中，抗NRGl抗體結合來自不同物種的NRGl間保守的NRGl表位。
[0075]本文中的術語“抗體”以最廣義使用，并且涵蓋各種抗體結構，包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、和抗體片段，只要它們展現出期望的抗原結合活性。
[0076]“抗體片段”指與完整抗體不同的分子，其包含完整抗體中與完整抗體結合的抗原結合的部分。抗體片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’ _SH、F(ab’ )2 ;雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv);和由抗體片段形成的多特異性抗體。
[0077]與參照抗體“結合相同表位的抗體”指在競爭測定法中將參照抗體對其抗原的結合阻斷50%或更多的抗體，且相反，參照抗體在競爭測定法中將該抗體對其抗原的結合阻斷50%或更多。本文中提供了一種例示性的競爭測定法。
[0078]術語“嵌合”抗體指其中的重和/或輕鏈的一部分自特定的來源或物種衍生，而重和/或輕鏈的剩余部分自不同來源或物種衍生的抗體。
[0079]術語“癌癥”和“癌性”指或描述哺乳動物中特征通常為細胞生長/增殖不受調節的生理狀況。癌癥的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤(例如，何杰金(Hodgkin)氏和非何杰金氏淋巴瘤)、母細胞瘤、肉瘤、和白血病。此類癌癥的更具體的例子包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺的腺癌、肺的鱗癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰腺癌、膠質瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病和其它淋巴增殖性病癥、和各種類型的頭和頸癌。
[0080]抗體的“類”指其重鏈擁有的恒定域或恒定區的類型。抗體有5大類:IgA、IgD、IgE、IgGjP IgM，并且這些中的幾種可以進一步分成亞類(同種型)，例如，IgG1, IgG2, IgG3、IgG4 JgA1、和IgA2。與不同類免疫球蛋白對應的重鏈恒定域分別稱作α、δ、ε、Y、和μ。[0081]如本文中所使用的，術語“細胞毒劑”指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞死亡或破壞的物質。細胞毒劑包括但不限于:放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y9°、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化學治療劑或藥物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、長春花生物喊類(vinca alkaloids)(長春新堿(vincristine)、長春堿(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂霉素(mitomycin) C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔紅霉素(daunorubicin)或其它嵌入劑);生長抑制劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；毒素，諸如小分子毒素或者細菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體；及下文公開的各種抗腫瘤或抗癌劑。
[0082]“效應器功能”指那些可歸于抗體Fe區且隨抗體同種型而變化的生物學活性。抗體效應器功能的例子包括:Clq結合和補體依賴性細胞毒性(CDC) ；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC);吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)下調；和B細胞活化。
[0083]藥劑(例如藥物配制劑)的“有效量”指在必需的劑量和時段上有效實現期望的治療或預防結果的量。
[0084]本文中的術語“Fe區”用于定義免疫球蛋白重鏈中至少含有恒定區一部分的C端區。該術語包括天然序列Fe區和變體Fe區。在一個實施方案中，人IgG重鏈Fe區自Cys226，或自Pro230延伸至重鏈的羧基端。然而，Fe區的C端賴氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有規定，Fe區或恒定區中的氨基酸殘基的編號方式依照EU編號系統，又稱作EU 索弓 I,如記載于 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991。
[0085]“框架”或“FR”指除高變區(HVR)殘基外的可變域殘基。一般地，可變域的FR由4個？1?域組成疋1?1、？1?2、？1?3、和？1?4。因而，HVR和FR序列在VH (或VL)中一般以如下的順序出現:FR1-H1 (LI) -FR 2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4。
[0086]術語“全長抗體”、“完整抗體”、和“全抗體”在本文中可互換使用，指與天然抗體結構具有基本上類似的結構或者具有含有如本文中所限定的Fe區的重鏈的抗體。
[0087]術語“宿主細胞”、“宿主細胞系”、和“宿主細胞培養物”可互換使用，并且指已經導入外源核酸的細胞，包括此類細胞的后代。宿主細胞包括“轉化體”和“經轉化的細胞”，其包括原代的經轉化的細胞及自其衍生的后代而不考慮傳代的次數。后代在核酸內容物上可以與親本細胞不完全相同，而是可以含有突變。本文中包括具有與在初始轉化細胞中篩選或選擇的相同的功能或生物學活性的突變體后代。
[0088]“人抗體”指擁有與由人或人細胞生成的或利用人抗體全集或其它人抗體編碼序列自非人來源衍生的抗體的氨基酸序列對應的氨基酸序列的抗體。人抗體的此定義明確排除包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。
[0089]“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列選集中最常存在的氨基酸殘基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列選集來自可變域序列亞組。通常，序列亞組是如 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，NIHPublication91-3242, Bethesda MD (1991),第1-3卷中的亞組。在一個實施方案中，對于VL，亞組是如Kabat等，見上文中的亞組κ I。在一個實施方案中，對于VH，亞組是如Kabat等，見上文中的亞組III。
[0090]“人源化”抗體指包含來自非人HVR的氨基酸殘基和來自人FR的氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施方案中，人源化抗體會包含至少一個，通常兩個基本上整個可變域，其中所有或基本上所有HVR (例如，CDR)對應于非人抗體的那些，且所有或基本上所有FR對應于人抗體的那些。任選地，人源化抗體可以至少包含自人抗體衍生的抗體恒定區的一部分。抗體(例如非人抗體)的“人源化形式”指已經經歷人源化的抗體。
[0091]如本文中所使用的，術語“高變區”或“HVR”指抗體可變域中在序列上高變的和/或形成結構上限定的環(“高變環”)的每個區。一般地，天然的4鏈抗體包含6個HVR ;三個在VH中(H1、H2、H3)，且三個在VL中(L1、L2、L3)。HVR —般包含來自高變環和/或來自“互補決定區”(CDR)的氨基酸殘基，后一種是最高序列變異性的和/或牽涉抗原識另U。例示性的高變環存在于氨基酸殘基26-32 (LI)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (Hl)、53-55 (H2)、和 96-101 (H3) (Chothia 和 Lesk, J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。例示性的CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-Hl、CDR-H2、和 CDR-H3)存在于 LI 的氨基酸殘基 24-34、L2 的 50-56,L3 的 89-97,Hl 的 31_35B、H2 的 50-65、和 H3 的 95-102 (Kabat 等，Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第 5 版 Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD(1991))。除了 VH 中的 CDRl 外，CDR—般包含形成高變環的氨基酸殘基。⑶R還包含“特異性決定殘基”，或“SDR”，其是接觸抗原的殘基。SDR包含在稱作縮短的-⑶R，或a-⑶R的⑶R區內。例示性的a-⑶R (a_⑶R-Ll、a_⑶R-L2、a-CDR-L3、a-CDR-Hl、a-CDR-H2、和 a_CDR-H3)存在于 LI 的氨基酸殘基 31_34、L2 的 50-55、L3 的 89-96、Hl 的 31-35B、H2 的 50-58、和 H3 的 95-102 (見 Almagro 和 Fransson, Front.Biosc1.13:1619-1633(2008)) ο除非另有指示，可變域中的HVR殘基和其它殘基(例如，FR殘基)在本文中依照Kabat等，見上文編號。
[0092]“免疫綴合物”指與一種或多種異源分子(包括但不限于細胞毒劑)綴合的抗體。
[0093]“個體”或“受試者”或“患者”是哺乳動物。哺乳動物包括但不限于馴養的動物(例如，牛、綿羊、貓、犬、和馬)、靈長類(例如，人和非人靈長類諸如猴)、家兔、和嚙齒類(例如，小鼠和大鼠)。在某些實施方案中，個體、受試者、或患者是人。
[0094]“分離的”抗體指已經與其天然環境的組分分開的抗體。在一些實施方案中，抗體純化至大于95%或99%的純度，如通過例如電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或反相HPLC)測定的。關于用于評估抗體純度的方法的綜述，見例如 Flatman 等,J.Chromatogr.B848:79-87 (2007)。
[0095]“分離的”核酸指已經與其天然環境的組分分開的核酸分子。分離的核酸包括通常含有核酸分子的細胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色體外或在與其天然染色體位置不同的染色體位置處存在。
[0096]“編碼抗NRGl抗體的分離的核酸”指編碼抗體重和輕鏈(或其片段)的一種或多種核酸分子，包括單一載體或分開的載體中的此類核酸分子，和存在于宿主細胞中的一個或多個位置的此類核酸分子。
[0097]如本文中所使用的，術語“單克隆抗體”指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即構成群體的各個抗體是相同的和/ 或結合相同表位，除了例如含有天然存在的突變或在單克隆抗體制備物的生成期間發生的可能的變體抗體外，此類變體一般以極小量存在。與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，單克隆抗體制備物的每個單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。如此，修飾語“單克隆”指示抗體自一群基本上同質的抗體獲得的特征，而不應解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，可以通過多種技術來生成要依照本發明使用的單克隆抗體，包括但不限于雜交瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法、和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的轉基因動物的方法，本文中描述了用于生成單克隆抗體的此類方法和其它例示性方法。
[0098]“裸抗體”指未與異源模塊(例如細胞毒性模塊)或放射性標記物綴合的抗體。裸抗體可以存在于藥物配制劑中。
[0099]“天然抗體”指具有不同結構的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體是約150，000道爾頓的異四聚糖蛋白，由二硫化物鍵合的兩條相同輕鏈和兩條相同重鏈構成。從N至C端，每條重鏈具有一個可變區(VH)，又稱作可變重域或重鏈可變域，接著是三個恒定域(CH1、CH2、和CH3)。類似地，從N至C端，每條輕鏈具有一個可變區(VL)，又稱作可變輕域或輕鏈可變域，接著是一個恒定輕(CL)域。根據其恒定域氨基酸序列，抗體輕鏈可歸入兩種型中的一種，稱作卡帕(κ)和拉姆達(入)。
[0100]術語“包裝插頁”用于指治療產品的商業包裝中通常包含的用法說明書，其含有關于涉及此類治療產品應用的適應癥、用法、劑量、施用、聯合療法、禁忌癥和/或警告的信肩、O
[0101]關于參照多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定義為比對序列并在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與參照多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測定百分比氨基酸序列同一性目的的對比可以以本領域技術范圍內的多種方式進行，例如使用公眾可得到的計算機軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領域技術人員可以決定用于比對序列的合適參數，包括對所比較序列全長獲得最大對比所需的任何算法。然而，為了本發明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比較計算機程序ALIGN-2產生的。A LIGN-2序列比較計算機程序由Genentech, Inc.編寫，并且源代碼已經連同用戶文檔一起提交給美國版權局(US Copyright Office, WashingtonD.C.，20559)，其中其以美國版權注冊號了乂邪10087注冊。公眾自Genentech, Inc.(SouthSan Francisco, California)可獲得ALIGN-2程序,或者可以從源代碼編譯。ALIGN2程序應當編譯成在UNIX操作系統(包括數碼UNIX V4.0D)上使用。所有序列比較參數由ALIGN-2程序設定且不變。
[0102]在采用ALIGN-2來比較氨基酸序列的情況中，給定氨基酸序列A相對于(to)、與(with)、或針對(against)給定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對于、與、或針對給定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)如下計算:
[0103]分數X/Y 乘 100
[0104]其中X是由序列比對程序ALIGN-2在該程序的A和B比對中評分為相同匹配的氨基酸殘基數，且其中Y是B中的氨基酸殘基總數。應當領會，若氨基酸序列A的長度與氨基酸序列B的長度不相等，則A相對于B的％氨基酸序列同一性將不等于B相對于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明確說明 ，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2計算機程序獲得的。
[0105]術語“藥物配制劑”指所處形式使得容許其中含有的活性成分的生物學活性是有效的，且不含對會接受配制劑施用的受試者具有不可接受的毒性的別的組分的制劑。
[0106]“藥學可接受載體”指藥物配制劑中與活性成分不同的，且對受試者無毒的成分。藥學可接受載體包括但不限于緩沖劑、賦形劑、穩定劑、或防腐劑。
[0107]如本文中所使用的，術語“NRG”指來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物諸如靈長類(例如人)和嚙齒類(例如，小鼠和大鼠)的任何天然的神經調節蛋白(又稱為調蛋白)，除非另有指示。該術語涵蓋“全長”、未加工的NRG及源自細胞中的加工的任何形式的NRG。該術語還涵蓋NRG的天然存在的變體，例如剪接變體或等位變體。存在著4種已知形式的 NRG:NRG1 (Holmes,ff.E.等，Science256:1205-1210 (1992)) ；NRG2 (Caraway, K.L.等，Nature387:512-516 (1997)) ;NRG3(Zhang, Ε.等，Proc Natl Acad SciUSA94:9562-9567));和 NRG4(Harari, D.等，0ncogenel8:2681-2689))。由于可變剪接，受體結合需要的NRG1EGF樣域存在著兩種活性同等型，稱為NRGl阿爾法(NRG1 α )和NRGl貝塔(NRGlP)。在 Genbank 登錄號 ΒΚ000383 (Falls, D.L.，Ex Cell Res, 284:14-30 (2003)和美國專利N0.5，367，060中顯示了例示性的人NRGl的序列。在一個實施方案中，NRGl α包含Swiss Prot登錄號Q7RTV8的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。在一個實施方案中，NRGl α的EGF域包含SEQ ID NO:1氨基酸S177-K241的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。在一個實施方案中，NRGl β包含NCBI登錄號ΝΡ_039250的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。在一個實施方案中，NRGl β的EGF域包含SEQ ID NO:2氨基酸Τ176-Κ246的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。[0108]如本文中所使用的，“治療/處理”(及其語法變型)指試圖改變所治療個體的天然過程的臨床干預，并且可以為了預防或者在臨床病理學的過程期間實施。治療的期望效果包括但不限于預防疾病的發生或再發生、減輕癥狀、減輕/減少疾病的任何直接或間接病理后果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或減輕疾病狀態、和消退或改善的預后。在一些實施方案中，使用本發明的抗NRGl抗體來延遲疾病的形成、減緩疾病的進展、預防復發、或延長腫瘤再發生前時間。在某些實施方案中，治療導致腫瘤再啟動細胞的數目減少或完全缺乏；實體瘤中的腫瘤再啟動細胞相對于腫瘤中不是腫瘤再啟動細胞的細胞的數目減少；和/或抑制腫瘤再啟動細胞的增殖。在某些實施方案中，用抗NRGl抗體的治療導致比在沒有用抗NRGl抗體治療的情況中的腫瘤再發生前時間大至少1.25、1.50、1.75、2.0倍的腫瘤再發生前時間延長。
[0109]術語“可變區”或“可變域”指抗體重或輕鏈中牽涉抗體結合抗原的域。天然抗體的重鏈和輕鏈可變域(分別為VH和VL) —般具有類似的結構,其中每個域包含4個保守的框架區(FR)和3個高變區(HVR)(見例如Kindt等Kuby Immunology,第6版，W.H.Freeman and C0.,第91頁(2007))。單個VH或VL域可以足以賦予抗原結合特異性。此外，可以分別使用來自結合抗原的抗體的VH或VL域篩選互補VL或VH域的文庫來分離結合特定抗原的抗體。見例如，Portolano 等,J.1mmunol.150:880-887 (1993) ; Clarkson等，Nature352:624-628 (1991)。
[0110]如本文中所使用的，術語“載體”指能夠增殖與其連接的另一種核酸的核酸分子。該術語包括作為自身復制型核酸結構的載體及整合入接受其導入的宿主細胞的基因組中的載體。某些載體能夠指導與其可操作連接的核酸的表達。此類載體在本文中稱為“表達載體”。
[0111]I1.組合物和方法
[0112]能經由HER3 (ErbB3)或HER4 (ErbB4)受體任一發生的神經調節蛋白(NRGl)信號傳導能觸發多種信號傳導級聯，包括PI3K/Akt，PKC, MAPK和Ras信號傳導途徑(Junttila, T.T., et al.(2009) ;Lee-HoefIich et al.，(2008) ;W02011103242;美國專利公開文本N0.20110229493)。而且，抑制NRGl信號傳導導致治療劑治療后腫瘤復發或再發生的延遲或預防(實施例2-4和W02011103242 ;美國專利公開文本N0.20110229493)。抑制NRGl誘導的信號傳導的抗NRGl抗體可用于治療與NRGl信號傳導(包括自分泌NRGl信號傳導)有關的癌癥。
[0113]因而，本發明的一個方面提供結合NRGl的抗體(抗NRGl抗體)。這些抗體可用于治療癌癥及預防用治療劑治療后的癌癥再發生和/或抗性。
[0114]在一個實施方案中，所述抗NRGl抗體結合神經調節蛋白Ia和神經調節蛋白1β同等型二者。在一個實施方案中，所述抗NRGl抗體結合神經調節蛋白I β的EGF域和神經調節蛋白Ia的EGF域。
[0115]在一些實施方案中，所述抗NRGl 抗體以 IOnM, InM, 1χ10_1ηΜ, 1χ10-2ηΜ, 1χ10-3ηΜ 或更少的kD結合神經調節蛋白I β且以IOnM, InM, lxlC^nM, lxlCT2nM, lxlCT3nM或更少的kD結合神經調節蛋白Ia。
[0116]在一些實施方案中，所述抗NRGl 抗體以 ΙΟηΜ,ΙηΜ,ΙχΙΟΛιΜ,ΙχΙΟΛιΜ,ΙχΙΟΛιΜ 或更少的kD結合神經調節蛋白I β的EGF域且以IOnM, InM, 1χ10_1ηΜ, IxlCT2nM, lxlCT3nM或更少的kD結合神經調節蛋白Ia的EGF域。
[0117]在一些實施方案中，所述抗NRGl 抗體以 ΙΟηΜ,ΙηΜ,ΙχΙΟΛιΜ,ΙχΙΟΛιΜ,ΙχΙΟΛιΜ 或更少的kD結合神經調節蛋白1 β。
[0118]在一些實施方案中，所述抗NRGl 抗體以 ΙΟηΜ,ΙηΜ,ΙχΙΟΛιΜ,ΙχΙΟΛιΜ,ΙχΙΟΛιΜ 或更少的kD結合神經調節蛋白1 β的EGF域。
[0119]在一些實施方案中，所述抗NRGl抗體結合神經調節蛋白I β的親和力等于或大于它結合神經調節蛋白Ia的親和力。在一些實施方案中，所述抗NRGl抗體結合神經調節蛋白1β的親和力比它結合神經調節蛋白Ia的親和力大10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，125，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850，900，950，1000，1500,2000 倍或更多。
[0120]在一些實施方案中，所述抗NRGl抗體結合神經調節蛋白I β的EGF域的親和力等于或大于它結合神經調節蛋白Ia的EGF域的親和力。在一些實施方案中，所述抗NRGl抗體結合神經調節蛋白I β的EGF域的親和力比它結合神經調節蛋白Ia的EGF域的親和力大 10,20,30,40,50,60,70,80,90,100，125，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650, 700, 750,800,850,900,950,1000，1500,2000 倍或更多。
[0121]在一些實施方案中，所述抗NRGl抗體結合神經調節蛋白Ia的親和力等于或大于它結合神經調節蛋白1β的親和力。在一些實施方案中，所述抗NRGl抗體結合神經調節蛋白Ia的親和力比它結合神經調節蛋白I β的親和力大10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，125，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850，900，950，1000，1500,2000 倍或更多。
[0122]在一些實施方案中，所述抗NRGl抗體結合神經調節蛋白Ia的EGF域等于或大于它結合神經調節蛋白I β的EGF域的親和力。在一些實施方案中，所述抗NRGl抗體結合神經調節蛋白Ia的EGF域的親和力比它結合神經調節蛋白I β的EGF域的親和力大10，20，30,40,50,60,70,80,90,100，125，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750,800,850,900,950,1000，1500,2000 倍或更多。
[0123]在一個實施方案中，所述抗NRGl抗體結合神經調節蛋白I β表位和神經調節蛋白Ia表位。在一個實施方案中，所述表位存在于神經調節蛋白1β和神經調節蛋白Ia的EGF域中。在一個實施方案中，抗NRGl抗體結合的神經調節蛋白I β表位來自氨基酸序列SEQ ID NO:4，在氨基酸序列SEQ ID NO:4內，或與氨基酸序列SEQ ID NO:4交疊。在一個實施方案中，抗NRGl抗體結合的神經調節蛋白I β表位來自氨基酸序列SEQ ID NO:4的一個區段，在氨基酸序列SEQ ID NO:4的一個區段內，或與氨基酸序列SEQ ID NO:4的一個區段交疊，所述區段諸如例如SEQ ID NO:4的氨基酸1-37或SEQ ID NO:4的氨基酸38-64。
[0124]在一個實施方案中，所述抗NRGl抗體結合的神經調節蛋白Ia來自氨基酸序列SEQ ID NO:3，在氨基酸序列SEQ ID NO:3內，或與氨基酸序列SEQ ID NO:3交疊。在一個實施方案中，抗NRGl抗體結合的神經調節蛋白Ia表位來自氨基酸序列SEQ ID NO:3的一個區段，在氨基酸序列SEQ ID NO:3的一個區段內，或與氨基酸序列SEQ ID NO:3的一個區段交疊，所述區段諸如例如SEQ ID NO:3的氨基酸l_36of或SEQ ID NO:3的氨基酸37-58的氨基酸序列。
[0125]另一方面，本發明提供與本文中提供的抗NRGl抗體結合相同表位的抗NRGl抗體。另一方面，本發明提供與本文中提供的抗NRGl抗體競爭結合相同表位的抗NRGl抗體。
[0126]A.例示性NRG抗體
[0127]一方面，本發明提供一種抗NRGl抗體，其包含:包含選自SEQ ID NO:5，28，34，37，39，41，和76的氨基酸序列的HVR-Hl，包含選自SEQ ID NO:6和29的氨基酸序列的HVR-H2，和包含選自SEQ ID勵:7，30，42，43，44，48，和50的氨基酸序列的狀!《13。一方面，本發明提供一種抗NRGl抗體，其包含:包含選自SEQ ID NO:8，12，16，19，和31的氨基酸序列的HVR-Ll，包含選自SEQ ID NO:9，13，17，32，46，和49的氨基酸序列的HVR-L2，和包含選自SEQ ID NO:10,11，14，15，18，20，33，35，36，38，40，45，47，和 51 的氨基酸序列的 HVR-L3。一方面，本發明提供一種抗NRGl抗體，其包含:包含選自SEQ ID NO:5，28，34，37，39，41，和76的氨基酸序列的HVR-Hl，包含選自SEQ ID NO:6和29的氨基酸序列的HVR-H2，和包含選自SEQ ID NO:7，30，42，43，44，48，和 50 的氨基酸序列的 HVR-H3，包含選自 SEQ ID NO:8，12，16，19，和31的氨基酸序列的HVR-Ll，包含選自SEQ ID NO:9，13，17，32，46，和49的氨基酸序列的 HVR-L2，和包含選自 SEQ ID NO:10，11，14，15，18，20，33，35，36，38，40，45，47，和 51的氨基酸序列的HVR-L3。
[0128]一方面，本發明提供一種抗NRGl抗體，其包含:包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-Hl，包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-H2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-H3。一方面，本發明提供一種抗NRGl抗體，其包含:包含選自SEQ ID N0:8，12，16，和19的氨基酸序列的HVR-Ll，包含 選自SEQ ID NO:9，13，和17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含選自SEQ ID勵:10，11，14，15，18，和20的氨基酸序列的狀1?-1^。一方面，本發明提供一種抗NRGl抗體，其包含:包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-Hl，包含氨基酸序列SEQ IDNO:6 的 HVR-H2，和包含氨基酸序列 SEQ ID NO:7 的 HVR-H3，包含選自 SEQ ID NO =8,12,16,和19的氨基酸序列的HVR-Ll，包含選自SEQ ID NO:9，13，和17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含選自SEQ ID勵:10，11，14，15，18，和20的氨基酸序列的狀1?-1^。
[0129]一方面，本發明提供一種抗NRGl抗體，其包含:包含選自SEQ ID NO =28,34,37,39，41，和76的氨基酸序列的HVR-Hl，包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-H2，和包含選自SEQ ID ^):30，42，43，44，48，和50的氨基酸序列的訊^-!13。一方面，本發明提供一種抗NRGl抗體，其包含:包含選自SEQ ID NO: 19和31的氨基酸序列的HVR-Ll，包含選自SEQID NO: 32，46，和 49 的氨基酸序列的 HVR-L2，和包含選自 SEQ ID NO: 33，35，36，38，40，45，47，和51的氨基酸序列的HVR-L3。一方面，本發明提供一種抗NRGl抗體，其包含:包含選自SEQ ID NO: 28，34，37，39，41，和76的氨基酸序列的HVR-Hl，包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-H2，和包含選自SEQ ID NO: 30，42，43，44，48，和50的氨基酸序列的HVR-H3，包含選自SEQ ID NO:19和31的氨基酸序列的HVR-Ll，包含選自SEQ ID NO:32，46，和49的氨基酸序列的HVR-L2，和包含選自SEQ ID NO: 33，35，36，38，40，45，47，和51的氨基酸序列的HVR-L3。
[0130]一方面，本發明提供一種抗NRGl抗體，其包含至少一種，兩種，三種，四種，五種，或六種選自下述的HVR: (a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-Hl ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-H2 ； (c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-H3 ； (d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:16的HVR-Ll ； (e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HVR-L2 ;和(f)包含氨基酸序列 SEQ ID NO:18 的 HVR-L3。
[0131]一方面，本發明提供一種抗體，其包含至少一種，至少兩種，或所有三種選自下述的VH HVR序列:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-Hl ； (b)包含氨基酸序列SEQ IDNO:6的HVR-H2 ;和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-H3。在又一個實施方案中，所述抗體包含:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 5的HVR-Hl ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-H2 ;和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-H3。
[0132]一方面，本發明提供一種抗體，其包含至少一種，至少兩種，或所有三種選自下述的VL HVR序列:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:16的HVR-Ll ； (b)包含氨基酸序列SEQ IDNO:17的HVR-L2 ;和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3。在一個實施方案中，所述抗體包含:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:16的HVR-Ll ； (b)包含氨基酸序列SEQ IDNO:17 的 HVR-L2 ;和(c)包含氨基酸序列 SEQ ID NO:18 的 HVR-L3。
[0133]另一方面，本發明的抗體包含:(a)包含至少一種，至少兩種，或所有三種選自下述的VH HVR序列的VH域:⑴包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-H1，(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-H2，和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-H3 ;和(b)包含至少一種，至少兩種，或所有三種選自下述的VL HVR序列的VL域:(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:16的HVR-Ll, (ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HVR-L2，和(c)包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 18 的 HVR-L3。
[0134]另一方面，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-Hl ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-H2 ； (c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-H3 ； (d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:16的HVR-Ll ； (e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HVR-L2 ;和(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3。
[0135]—方面,本發明提供一種抗NRGl抗體,其包含至少一種,兩種,三種，四種,五種，或六種選自下述的HVR: (a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:76的HVR-Hl ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H2 ； (c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的HVR-H3 ； (d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的HVR-Ll ； (e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-L2 ;和(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-L3。
[0136]一方面，本發明提供一種抗體，其包含至少一種，至少兩種，或所有三種選自下述的VH HVR序列:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:76的HVR-Hl ； (b)包含氨基酸序列SEQ IDNO:29的HVR-H2 ;和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的HVR-H3。在又一個實施方案中，所述抗體包含:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:76的HVR-Hl ； (b)包含氨基酸序列SEQ IDNO:29 的 HVR-H2 ;和(c)包含氨基酸序列 SEQ ID NO:43 的 HVR-H3。
[0137]一方面，本發明提供一種抗體，其包含至少一種，至少兩種，或所有三種選自下述的VL HVR序列:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的HVR-Ll ； (b)包含氨基酸序列SEQ IDNO:32的HVR-L2 ;和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-L3。在一個實施方案中，所述抗體包含:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的HVR-Ll ； (b)包含氨基酸序列SEQ IDNO:32 的 HVR-L2 ;和(c)包含氨基酸序列 SEQ ID NO:33 的 HVR-L3。
[0138]另一方面，本發明的抗體包含:(a)包含至少一種，至少兩種，或所有三種選自下述的VH HVR序列的VH域:⑴包含氨基酸序列SEQ ID NO:76的HVR-Hl，(ii)包含氨基酸序列 SEQ ID NO:29 的 HVR-H2，和(iii)包含氨基酸序列 SEQ ID NO:43 的 HVR-H3 ;和(b)包含至少一種，至少兩種，或所有三種選自下述的VL HVR序列的VL域:(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的HVR-Ll，(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-L2，和(c)包含氨基酸序列 SEQ ID NO:33 的 HVR-L3。
[0139]另一方面，本發明 提供一種抗體，其包含:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:76的HVR-Hl ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H2 ； (c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的HVR-H3 ； (d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的HVR-Ll ； (e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-L2 ;和(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-L3。
[0140]一方面，本發明提供一種抗NRGl抗體，其包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區(VH)包含氨基酸序列SEQ ID NO:210 一方面，本發明提供一種抗NRGl抗體，其包含輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區(VL)包含選自SEQ ID NO:22，23，24，25，26，和27的氨基酸序列。一方面，本發明提供一種抗NRGl抗體，其包含VH和VL，該VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:21，該VL包含選自SEQ ID NO:22，23，24，25，26，和27的氨基酸序列。
[0141]一方面，本發明提供一種抗NRGl抗體，其包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區(VH)包含選自 SEQ ID NO:52，54，56，58，60，62，63，64，66，68，70，和 72 的氨基酸序列。一方面，本發明提供一種抗NRGl抗體，其包含輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區(VL)包含選自SEQ ID NO:53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，和 75 的氨基酸序列。一方面，本發明提供一種抗NRGl抗體，其包含VH和VL，該VH包含選自SEQ ID NO:52，54，56，58，60，62，63，64，66，68，70，和 72 的氨基酸序列，該 VL 包含選自 SEQ ID NO:53，55，57，59，61，63，65，67，69,71,73,和75的氣基酸序列。
[0142]另一方面，抗NRGl抗體包含與氨基酸序列SEQ ID NO:21具有至少90%，91%，92%，93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,或100%序列同一性的VH序列。另一方面，抗NRGl抗體包含與選自SEQ ID NO:22，23，24，25，26，和27的氨基酸序列具有至少90%，91%，92%，93%，94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,或100%序列同一性的VL序列。另一方面，抗NRGl抗體包含與氨基酸序列 SEQ ID NO:21 具有至少 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,或 100%序列同一性的VH序列和與選自SEQ ID NO:22，23，24，25，26，和27的氨基酸序列具有至少90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,或 100% 序列同一性的 VL 序列。
[0143]另一方面，抗NRGl 抗體包含與選自 SEQ ID NO:52，54，56，58，60，62，63，64，66，68，70，和 72 的氨基酸序列具有至少 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,或 100%序列同一性的VH序列。另一方面，抗NRGl抗體包含與選自SEQ ID NO:53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，和 75 的氨基酸序列具有至少 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,99%，或100%序列同一性的VL序列。另一方面，抗NRGl抗體包含與選自SEQ ID NO =52,54,56，58，60，62，63，64，66，68，70，和 72 的氨基酸序列具有至少 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,96%，97%，98%，99%，或 100%序列同一性的 VH序列和與選自 SEQ ID NO:53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，和 75 的氨基酸序列具有至少 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,99%,或100%序列同一性的VL序列。[0144]另一方面，抗NRGl抗體包含與氨基酸序列SEQ ID NO:21具有至少90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，或100%序列同一性的VH序列。在某些實施方案中，具有至少90%，91%，92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,或99%同一性的VH序列相對于參照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或刪除，但是包含該序列的抗NRGl抗體保留結合NRGl α和NRGl β的能力。在某些實施方案中，在SEQ ID NO:21中替代，插入和/或刪除總共I至10個氨基酸。在某些實施方案中，在HVR以外的區域中(即在FR中)發生替代，插入，或刪除。任選地，抗NRGl抗體包含VH序列SEQ ID NO:21，包括該序列的翻譯后修飾。在一個特別的實施方案中，VH包含一種，兩種或三種選自下述的HVR: (a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-Hl，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-H2，和(c)包含氨基酸序列SEQ IDNO:7 的 HVR-H3。
[0145]另一方面，提供一種抗NRGl抗體，其中該抗體包含與氨基酸序列SEQ ID NO:26具有至少90%，91%，92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,或100%序列同一性的輕鏈可變域(VL)。在某些實施方案中，具有至少 90%，91%，92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,或 99% 同一性的VL序列相對于參照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或刪除，但是包含該序列的抗NRGl抗體保留結合NRGla和NRGl β的能力。在某些實施方案中，在SEQ ID NO:26中替代，插入和/或刪除總共I至10個氨基酸。在某些實施方案中，在HVR以外的區域中(即在FR中)發生替代，插入，或刪除。任選地，抗NRGl抗體包含VL序列SEQ ID NO:26，包括該序列的翻譯后修飾。在一個特別的實施方案中，VL包含一種，兩種或三種選自下述的HVR: (a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:16的HVR-Ll ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HVR-L2 ；和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3。
[0146]另一方面，提供一種抗NRGl抗體，其中該抗體包含上文提供的任何實施方案中的VH和上文提供的任何實施方案中的VL。在一個實施方案中，該抗體包含分別在SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:26中的VH和VL序列，包括那些序列的翻譯后修飾。
[0147]另一方面，抗NRGl抗體包含與氨基酸序列SEQ ID NO:63具有至少90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，或100%序列同一性的VH序列。在某些實施方案中，具有至少90%，91%，92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,或99%同一性的VH序列相對于參照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或刪除，但是包含該序列的抗NRGl抗體保留結合NRGl α和NRGl β的能力。在某些實施方案中，在SEQ ID NO:63中替代，插入和/或刪除總共I至10個氨基酸。在某些實施方案中，在HVR以外的區域中(即在FR中)發生替代，插入，或刪除。任選地，抗NRGl抗體包含VH序列SEQ ID NO:63，包括該序列的翻譯后修飾。在一個特別的實施方案中，VH包含一種，兩種或三種選自下述的HVR: (a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:76的HVR-H1，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H2，和(c)包含氨基酸序列SEQ IDNO:43 的 HVR-H3。
[0148]另一方面，提供一種抗NRGl抗體，其中該抗體包含與氨基酸序列SEQ ID NO:53具有至少90%，91%，92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,或100%序列同一性的輕鏈可變域(VL)。在某些實施方案中，具有至少 90%，91%，92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,或 99% 同一性的VL序列相對于參照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或刪除，但是包含該序列的抗NRGl抗體保留結合NRGla和NRGl β的能力。在某些實施方案中，在SEQ ID NO:53中替代，插入和/或刪除總共I至10個氨基酸。在某些實施方案中，在HVR以外的區域中(即在FR中)發生替代，插入，或刪除。任選地，抗NRGl抗體包含VL序列SEQ ID NO:53，包括該序列的翻譯后修飾。在一個特別的實施方案中，VL包含一種，兩種或三種選自下述的HVR:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的HVR-Ll ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-L2 ；和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-L3。
[0149]另一方面，提供一種抗NRGl抗體，其中該抗體包含上文提供的任何實施方案中的VH和上文提供的任何實施方案中的VL。在一個實施方案中，該抗體包含分別在SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:53中的VH和VL序列，包括那些序列的翻譯后修飾。
[0150]另一方面，抗NRGl抗體包含與氨基酸序列SEQ ID NO:72具有至少90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，或100%序列同一性的重鏈序列。在某些實施方案中，具有至少90%，91%，92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,或99%同一性的重鏈序列相對于參照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或刪除，但是包含該序列的抗NRGl抗體保留結合NRGl α和NRGl β的能力。在某些實施方案中，在SEQ ID NO:72中替代，插入和/或刪除總共I至10個氨基酸。在某些實施方案中，在HVR以外的區域中(即在FR中)發生替代，插入，或刪除。任選地，抗NRGl抗體包含重鏈序列SEQ ID NO:72，包括該序列的翻譯后修飾。
[0151]另一方面，提供一種抗NRGl抗體，其中該抗體包含與氨基酸序列SEQ ID Ν0:73具有至少 90%，91%，92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,或 100% 序列同一性的輕鏈。在某些實施方案中，具有至少90%，91%，92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,或99%同一性的輕鏈序列相對于參照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或刪除，但是包含該序列的抗NRGl抗體保留結合NRGla和NRGlii的能力。在某些實施方案中，在SEQ ID NO:73中替代，插入和/或刪除總共I至10個氨基酸。在某些實施方案中，在HVR以外的區域中(即在FR中)發生替代，插入，或刪除。任選地，抗NRGl抗體包含輕鏈序列SEQ ID NO:73，包括該序列的翻譯后修飾。
[0152]另一方面，提供一種抗NRGl抗體，其中該抗體包含上文提供的任何實施方案中的重鏈和上文提供的任何實施方案中 的輕鏈。在一個實施方案中，該抗體包含分別在SEQ IDNO:72和SEQ ID NO:73中的重鏈和輕鏈序列，包括那些序列的翻譯后修飾。
[0153]另一方面，抗NRGl抗體包含與氨基酸序列SEQ ID NO:74具有至少90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，或100%序列同一性的重鏈序列。在某些實施方案中，具有至少90%，91%，92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,或99%同一性的重鏈序列相對于參照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或刪除，但是包含該序列的抗NRGl抗體保留結合NRGl α和NRGlii的能力。在某些實施方案中，在SEQ ID NO:74中替代，插入和/或刪除總共I至10個氨基酸。在某些實施方案中，在HVR以外的區域中(即在FR中)發生替代，插入，或刪除。任選地，抗NRGl抗體包含重鏈序列SEQ ID NO:74，包括該序列的翻譯后修飾。
[0154]另一方面，提供一種抗NRGl抗體，其中該抗體包含與氨基酸序列SEQ ID Ν0:75具有至少 90%，91%，92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,或 100% 序列同一性的輕鏈。在某些實施方案中，具有至少90%，91%，92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,或99%同一性的輕鏈序列相對于參照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或刪除，但是包含該序列的抗NRGl抗體保留結合NRGla和NRGlii的能力。在某些實施方案中，在SEQ ID NO:75中替代，插入和/或刪除總共1至10個氨基酸。在某些實施方案中，在HVR以外的區域中(即在FR中)發生替代，插入，或刪除。任選地，抗NRGl抗體包含輕鏈序列SEQ ID NO:75，包括該序列的翻譯后修飾。
[0155]另一方面，提供一種抗NRGl抗體，其中該抗體包含上文提供的任何實施方案中的重鏈和上文提供的任何實施方案中的輕鏈。在一個實施方案中，抗體包含分別在SEQ IDNO:74和SEQ ID NO:75中的重鏈和輕鏈序列，包括那些序列的翻譯后修飾。
[0156]又一方面，本發明提供與本文中提供的抗NRGl抗體結合相同表位的抗體。在一個實施方案中，提供與下述抗NRGl抗體結合相同表位的抗體，該抗NRGl抗體包含:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-Hl ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-H2 ； (c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-H3 ； (d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:16的HVR-Ll ； (e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HVR-L2 ;和(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3。
[0157]在一個實施方案中，提供與下述抗NRGl抗體結合相同表位的抗體，該抗NRGl抗體包含:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:76的HVR-Hl ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H2 ； (c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的HVR-H3 ； (d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的HVR-Ll ； (e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-L2 ;和(f)包含氨基酸序列SEQ IDNO:33 的 HVR-L3。
[0158]在一個實施方案中，提供與包含VH序列SEQ ID NO:21和VL序列SEQ ID NO:26的抗NRGl抗體結合相同表位的抗體。在一個實施方案中，提供與包含VH序列SEQ ID NO:63和VL序列SEQ ID NO:53的抗NRGl抗體結合相同表位的抗體。
[0159]在其它實施方案中，提供與本文所述抗NRGl抗體競爭結合相同表位的抗體。
[0160]在一個實施方案中,抗NRGl抗體結合神經調節蛋白I β表位和神經調節蛋白Ia表位。在一個實施方案中，所述表位存在于神經調節蛋白1β和神經調節蛋白Ia的EGF域中。在一個實施方案中，抗NRGl抗體結合來自氨基酸序列SEQ ID NO:4，在氨基酸序列SEQ ID NO:4內，或與氨基酸序列SEQ ID NO:4交疊的神經調節蛋白I β表位。在一個實施方案中，抗NRGl抗體結合的神經調節蛋白I β表位來自氨基酸序列SEQ ID NO:4的一個區段，在氨基酸序列SEQ ID NO:4的一個區段內，或與氨基酸序列SEQ ID NO:4的一個區段交疊，所述區段諸如例如SEQ ID NO:4的氨基酸l_37of或SEQ ID NO:4的氨基酸38-64。
[0161]在一個實施方案中，抗NRGl抗體結合來自氨基酸序列SEQ ID NO:3，在氨基酸序列SEQ ID NO:3內，或與氨基酸序列SEQ ID NO:3交疊的神經調節蛋白I α表位。在一個實施方案中，抗NRGl抗體結合的神經調節蛋白Ia表位來自氨基酸序列SEQ ID NO:3的一個區段，在氨基酸序列SEQ ID NO:3的一個區段內，或與氨基酸序列SEQ ID NO:3的一個區段交疊，所述區段諸如例如SEQ ID NO:3的氨基酸1-36或SEQ ID NO:3的氨基酸37-58的氨基酸序列。
[0162]在本發明的又一個方面，依照任何上述實施方案的抗NRGl抗體為單克隆抗體，包括嵌合抗體，人源化抗體或人抗體。在一個實施方案中，抗NRGl抗體為抗體片段，例如Fv，Fab，Fab’，scFv，雙抗體，或F(ab’)2片段。在另一個實施方案中，抗體為全長抗體，例如完整IgGl抗體或其它抗體類或同種型，如本文中定義的。
[0163]在又一個方面，依照任何上述實施方案的抗NRGl抗體可單一地或組合地并入下文1-7節中描述的任何特征:
[0164]I)抗體親和力
[0165]在某些實施方案中，本文中提供的抗體具有≤ΙμΜ、≤IOOnM, ^ IOnM, ^ InM,(0.1nM、≤ 0.01nM、或≤ 0.0OlnM (例如 10-8Μ 或更少，例如 10-8Μ 至 10_13M，例如，10_9M 至I(T13M)的解離常數(Kd)。
[0166]在一個實施方案中，Kd是通過如下述測定法所述用Fab型式的感興趣抗體及其抗原實施的放射性標記抗原結合測定法(RIA)來測量的。通過在存在未標記抗原的滴定系列的情況中用最小濃度的(125I)標記抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗體包被板捕捉結合的抗原來測量Fab對抗原的溶液結合親和力(見例如Chen等，J.Mo 1.Biol.293:865-881(1999))。為了建立測定法的條件，將MK'ROTTT’FR^ 多孔板(ThermoScientific)用 50mM 碳酸鈉(pH9.6)中的 5 μ g/ml 捕捉用抗 Fab 抗體(Cappel Labs)包被過夜，隨后用PBS中的2%(w/v)牛血清清蛋白于室溫(約23°C)封閉2-5小時。在非吸附板(Nunc#269620)中，將IOOpM或26pM125I_抗原與連續稀釋的感興趣Fab混合(例如與Presta 等，Cancer Res.57:4593-4599 (1997)中抗 VEGF 抗體，Fab-12 的評估一致)。然后將感興趣的Fab溫育過夜；然而，溫育可持續更長時間(例如約65小時)以確保達到平衡。此后，將混合物轉移至捕捉板，于室溫溫育(例如I小時)。然后除去溶液，并用PBS中的0.1%聚山梨酯20 (ΡΛ?ΕΝ-2Ο?0洗板8次。平板干燥后，加入150 μ I/孔閃爍液(MICR0SCINT-20?; Packard)，然后在 T0PC0UNT ? 伽馬計數器(Packard)上對平板計數 10分鐘。選擇各Fab給出小于或等于最大結合之20%的濃度用于競爭性結合測定法。
[0167]依照另一個實施方案，Kd是使用表面等離振子共振測定法使用BIAcore?-2000
或,BIAcore?-3000 (BIAcore, Inc., P iscataway, NJ)于 25 °C 使用固定化抗原 CM5 芯
片在約10個響應單位(RU)測量的。簡言之，依照供應商的用法說明書用鹽酸N-乙基-N’ -(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物傳感器芯片(CM5，BIACORE, Inc.)。將抗原用IOmM乙酸鈉pH4.8稀釋至5 μ g/ml (約0.2 μ Μ)，然后以5 μ I/分鐘的流速注射以獲得約10個響應單位(RU)的偶聯蛋白質。注入抗原后，注入IM乙醇胺以封閉未反應基團。為了進行動力學測量，于25°C以約25 μ I/分鐘的流速注入在含0.05%聚山梨酯20 (TWEEN-20?)表面活性劑的PBS (PBST)中兩倍連續稀釋的Fab (0.78ηΜ至500ηΜ)。使用簡單一對一朗格繆爾(Langmuir)結合模型(BIACORE:.? Evaluation Software version3.2)通過同時擬合結合和解離傳感
圖計算結合速率(kj和解離速率。平衡解離常數(Kd)以比率k Jkm計算。見例如Chen等，J.Mol.Biol.293:865-881 (1999)。如果根據上文表面等離振子共振測定法，結合速率超過IO6M-1S'那么結合速率可使用熒光淬滅技術來測定，即根據分光計諸如配備了斷流裝置的分光光度計(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINC0?分光光度計(ThermoSpectronic)中用攪拌比色杯的測量,在存在濃度漸增的抗原的情況中，測量PBSPH7.2中20nM抗抗原抗體(Fab形式)于25°C的熒光發射強度(激發=295nm ;發射=340nm，16nm帶通)的升高或降低。
[0168]2)抗體片段
[0169]在某些實施方案中，本文中提供的抗體是抗體片段。抗體片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’ _SH、F(ab’)2、Fv、和scFv片段，及下文所描述的其它片段。關于某些抗體片段的綜述，見Hudson等Nat.Med.9:129-134 (2003)。關于scFv片段的綜述，見例如Pluckthiin,于 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第 113卷，Rosenburg和Moore 編，(Springer-Verlag, New York),第 269-315 頁(1994);還可見 W093/16185;及美國專利N0.5，571，894和5，587，458。關于包含補救受體結合表位殘基且具有延長的體內半衰期的Fab和F(ab’)2片段的討論，見美國專利N0.5，869，046。
[0170]雙抗體是具有兩個抗原結合位點的抗體片段，其可以是二價的或雙特異性的。見例如 EP404, 097;W01993/01161;Hudson 等，Nat.Med.9:129-134(2003);及 Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448 (1993)。三抗體和四抗體也記載于 Hudson等，Nat.Med.9:129-134 (2003)。
[0171]單域抗體是包含抗體的整個或部分重鏈可變域或整個或部分輕鏈可變域的抗體片段。在某些實施方案中，單域抗體是人單域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA ;見例如美國專利 N0.6，248，516B1)。
[0172]可以通過多種技術，包括但不限于對完整抗體的蛋白水解消化及重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)的生成來生成抗體片段，如本文中所描述的。
[0173]3)嵌合的和人源化的抗體
[0174]在某些實施方案中，本文中提供的抗體是嵌合抗體。某些嵌合抗體記載于例如美國專利 N0.4，816，567;及 Morrison 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 81:6851-6855 (1984))。在一個例子中，嵌合抗體包含非人可變區(例如，自小鼠、大鼠、倉鼠、家兔、或非人靈長類，諸如猴衍生的可變區)和人恒定區。在又一個例子中，嵌合抗體是“類轉換的”抗體，其中類或亞類已經自親本抗體的類或亞類改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
[0175]在某些實施方案中，嵌合抗體是人源化抗體。通常，將非人抗體人源化以降低對人的免疫原性，同時保留親本非人抗體的特異性和親和力。一般地，人源化抗體包含一個或多個可變域，其中HVR，例如⑶R (或其部分)自非人抗體衍生，而FR (或其部分)自人抗體序列衍生。任選地，人源化抗體還會至少包含人恒定區的一部分。在一些實施方案中，將人源化抗體中的一些FR殘基用來自非人抗體(例如衍生HVR殘基的抗體)的相應殘基替代，例如以恢復或改善抗體特異性或親和力。[0176]人源化抗體及其生成方法綜述于例如Almagro和Fransson, Front.Biosc1.13:1619-1633 (2008),并且進一步記載于例如 Riechmann等，Nature332:323_329(1988);Queen 等，Proc.Nat’ I Acad.Sc1.USA86:10029-10033(1989);美國專利 N0.5，821，337，7，527，791，6，982，321 和7, 087, 409; Kashmiri 等，Methods36:25-34 (2005)(描述了 SDR(a-CDR)嫁接);Padlan, Mol.1mmunol.28:489-498 (1991)(描述了“重修表面”);Dall ’Acqua 等，Methods36:43-60 (2005)(描述了 “FR 改組”)；及 Osbourn 等，Methods36:61-68 (2005)和 Klimka 等，Β?'-? Cancer, 83:252-260 (2000) (描述了 FR改組的“引導選擇”方法)。
[0177]可以用于人源化的人框架區包括但不限于:使用“最佳擬合(best-fit)”方法選擇的框架區(見例如Sims等J.1mmunol.151:2296 (1993))；自輕或重鏈可變區的特定亞組的人抗體的共有序列衍生的框架區(見例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,89:4285 (1992);及 Presta 等 J.1mmunol.，151:2623 (1993));人成熟的(體細胞突變的)框架區或人種系框架區(見例如Almagro和Fransson, Front.Biosc1.13:1619-1633 (2008));和通過篩選FR文庫衍生的框架區(見例如Baca等，J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及 Rosok 等，J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
[0178]4)人抗體[0179]在某些實施方案中，本文中提供的抗體是人抗體。可以使用本領域中已知的多種技術來生成人抗體。一般地，人抗體記載于van Dijk和van de ffinkel, Curr.0pin.Pharmacol.5:368-74(2001)及 Lonberg, Curr.0pin.1mmunol.20:450-459(2008)。
[0180]可以通過對轉基因動物施用免疫原來制備人抗體，所述轉基因動物已經修飾為響應抗原性攻擊而生成完整人抗體或具有人可變區的完整抗體。此類動物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，其替換內源免疫球蛋白基因座，或者其在染色體外存在或隨機整合入動物的染色體中。在此類轉基因小鼠中，一般已經將內源免疫球蛋白基因座滅活。關于自轉基因動物獲得人抗體的方法的綜述，見Lonberg, Nat.Biotech.23:1117-1125 (2005)。還可見例如美國專利N0.6，075，181和6，150，584，其描述了 XEN0M0USE?技術；美國專利N0.5，770,429，其描述了 HUMAB?.技術；美國專利N0.7,041,870,其描述了 K-M MOUSE?技術，和美國專利申請公開文本N0.US2007/0061900,其描述了VELOCIMOUSEi?.技術)。可以例如通過與不同人恒定區組合進一步修飾來自由此類動物生成的完整抗體的人可變區。
[0181]也可以通過基于雜交瘤的方法生成人抗體。已經描述了用于生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系(見例如Kozbor J.1mmunol.，133:3001 (1984) ;Brodeur 等,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第 51-63 頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及 Boerner 等,J.1mmunol., 147:86 (1991))。經由人B細胞雜交瘤技術生成的人抗體也記載于Li等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 103:3557-3562 (2006)。其它方法包括那些例如記載于美國專利N0.7，189，826 (其描述了自雜交瘤細胞系生成單克隆人IgM抗體)和Ni，XiandaiMianyixue, 26 (4): 265-268 (2006)(其描述了人-人雜交瘤)的。人雜交瘤技術(Trioma技術)也記載于 Vollmers 和 Brandlein, Histology and Histopathology, 20 (3): 927-937 (2005)及Vollmers和Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)。
[0182]也可以通過分離自人衍生的噬菌體展示文庫選擇的Fv克隆可變域序列生成人抗體。然后，可以將此類可變域序列與期望的人恒定域組合。下文描述了自抗體文庫選擇人抗體的技術。
[0183]5)文庫衍生的抗體
[0184]可以通過對組合文庫篩選具有期望的一種或多種活性的抗體來分離本發明的抗體。例如，用于生成噬菌體展示文庫并對此類文庫篩選擁有期望結合特征的抗體的多種方法是本領域中已知的。此類方法綜述于例如Hoogenboom等于Methods in MolecularBiologyl78:1-37 (O’ Brien 等編,Human Press, Totowa, NJ, 2001)，并且進一步記載于例如 McCafferty 等，Nature348:552-554;Clackson 等，Nature352:624-628(1991);Marks等，J.Mol.Biol.222:581-597(1992);Marks 和 Bradbury,于 Methods in MolecularBiology 248: 161-175 (Lo 編，Human Press, Totowa, NJ, 2003) ; Sidhu 等，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004) ; Lee 等，J.Mol.Biol.340(5): 1073-1093(2004) ; Fellouse, Proc.Natl.Acad.Sc1.USAlOl (34): 12467-12472 (2004);及 Lee 等,J.1mmunol.Methods284(1-2): 119-132(2004)。
[0185]在某些噬菌體展示方法中，將VH和VL基因的全集分別通過聚合酶鏈式反應(PCR)克隆，并在噬菌體文庫中隨機重組，然后可以對所述噬菌體文庫篩選抗原結合噬菌體，如記載于 Winter 等,Ann.Rev.Tmmunol., 12:433-455 (1994)的。卩遼菌體通常以單鏈 Fv (scFv)片段或以Fab片段展示抗體片段。來自經免疫的來源的文庫提供針對免疫原的高親和力抗體，而不需要構建雜交瘤。或者，可以(例如自人)克隆未免疫全集以在沒有任何免疫的情況中提供針對一大批非自身和還有自身抗原的抗體的單一來源，如由Griffiths等，EMBOJ, 12:725-734(1993)描 述的。最后，也可以通過自干細胞克隆未重排的V基因區段，并使用含有隨機序列的PCR引物編碼高度可變的CDR3區并在體外實現重排來合成生成未免疫文庫，如由 Hoogenboom 和 Winter, J.Mol.Biol.，227:381-388 (1992)所描述的。描述人抗體噬菌體文庫的專利公開文本包括例如:美國專利N0.5，750, 373、和美國專利公開文本N0.2005/0079574，2005/0119455，2005/0266000，2007/0117126，2007/0160598，2007/0237764，2007/0292936 和 2009/0002360。
[0186]認為自人抗體文庫分離的抗體或抗體片段是本文中的人抗體或人抗體片段。
[0187]6)多特異性抗體
[0188]在某些實施方案中，本文中提供的抗體是多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體是對至少兩種不同位點具有結合特異性的單克隆抗體。在某些實施方案中，結合特異性之一針對NRGl，而另一種針對任何其它抗原。在某些實施方案中，雙特異性抗體可以結合NRGl的兩種不同表位。也可以使用雙特異性抗體來將細胞毒劑定位于表達NRGl的細胞。雙特異性抗體可以以全長抗體或抗體片段制備。
[0189]用于生成多特異性抗體的技術包括但不限于具有不同特異性的兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈的重組共表達(見 Milstein 和 Cuello, Nature305:537 (1983))、W093/08829、和Traunecker等，EMBO J.10:3655(1991))、和“突起-入-空穴”工程化(見例如美國專利N0.5，731，168)。也可以通過用于生成抗體Fe-異二聚體分子的工程化靜電操縱效應(W02009/089004A1);交聯兩種或更多種抗體或片段(見例如美國專利N0.4，676，980，及Brennan等，Science, 229:81 (1985));使用亮氨酸拉鏈來生成雙特異性抗體(見例如Kostelny等，J.1mmunol.，148 (5): 1547-1553 (1992));使用用于生成雙特異性抗體片段的“雙抗體”技術(見例如 Hollinger 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 90:6444-6448 (1993));及使用單鏈Fv(sFv) 二聚體(見例如 Gruber 等，J.1mmunol., 152:5368 (1994));及如例如 Tutt等J.1mmunol.147:60(1991)中所描述的,制備三特異性抗體來生成多特異性抗體。
[0190]本文中還包括具有三個或更多個功能性抗原結合位點的工程化改造抗體，包括“章魚抗體”(見例如US2006/0025576A1)。
[0191]本文中的抗體或片段還包括包含結合NRGl及另一種不同抗原的抗原結合位點的“雙重作用 FAb” 或“DAF”(見例如 US2008/0069820)。
[0192]7)杭體奪體
[0193]在某些實施方案中，涵蓋本文中提供的抗體的氨基酸序列變體。例如，可以期望改善抗體的結合親和力和/或其它生物學特性。可以通過將合適的修飾引入編碼抗體的核苷酸序列中，或者通過肽合成來制備抗體的氨基酸序列變體。此類修飾包括例如對抗體的氨基酸序列內的殘基的刪除、和/或插入和/或替代。可以進行刪除、插入、和替代的任何組合以得到最終的構建體，只要最終的構建體擁有期望的特征，例如，抗原結合。
[0194]a.替代、插入、和刪除變體
[0195]在某些實施方案中，提供了具有一處或多處氨基酸替代的抗體變體。替代誘變感興趣的位點包括HVR和FR。保守替代在表1中在“保守替代”的標題下顯示。更實質的變化在表1中在“例示性替代”的標題下提供，并且如下文參照氨基酸側鏈類別進一步描述的。可以將氨基酸替代引入感興趣的抗體中，并且對產物篩選期望的活性，例如保留/改善的抗原結合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。
[0196]表1
[0197]
【權利要求】
1.一種分離的抗NRGl抗體，其結合神經調節蛋白Ia和神經調節蛋白1β。
2.權利要求1的抗體，其中所述抗體結合神經調節蛋白Iβ的EGF域和神經調節蛋白Ia的EGF域。
3.權利要求2的抗體，其中所述抗體結合神經調節蛋白1β的EGF域的親和力比它結合神經調節蛋白I a的EGF域的親和力大20倍，50倍，100倍，200倍，500倍，或1000倍。
4.權利要求1-3任一項的抗體，其中所述抗體以IOnM或更少的kD結合神經調節蛋白Iβ的EGF域且以IOnM或更少的kD結合神經調節蛋白Ia的EGF域。
5.權利要求1-4任一項的抗體,其中所述抗體以IOnM或更少，InM或更少，ΙχΙΟ^ηΜ,1χ10-2ηΜ,或1χ10-3ηΜ的kD結合神經調節蛋白I β的EGF域。
6.權利要求3-5任一項的抗體，其中所述親和力是通過表面等離振子共振測定法測量的。
7.權利要求1-6任一項的抗體，其中所述抗體結合神經調節蛋白1β表位，其中該神經調節蛋白I β表位包含SEQ ID NO:4氨基酸1_37的氨基酸序列或SEQ ID NO:4氨基酸38-64的氨基酸序列。
8.權利要求7的抗體，其中所述神經調節蛋白Iβ表位包含氨基酸序列SEQ ID Ν0:4。
9.權利要求7或8的的抗體，其中所述抗體進一步結合神經調節蛋白Ia表位，其中該神經調節蛋白I a表位包含SEQ ID NO:3氨基酸1_36的氨基酸序列或SEQ ID NO:3氨基酸37-58的氨基酸序列。
10.權利要求9的抗體，其中所述神經調節蛋白Ia表位包含氨基酸序列SEQID NO:3。
11.權利要求ι-?ο任一項的抗體，其為單克隆抗體。
12.權利要求1-11任一項的抗體，其為人抗體，人源化抗體，或嵌合抗體。
13.一種分離的抗NRGl抗體，其包含:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-Hl，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-H2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-H3。
14.一種分離的抗NRGl抗體，其包含:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:16的HVR-L1，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HVR-L2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3。
15.權利要求13的抗體，其進一步包含:(a)包含氨基酸序列SEQID NO:16的HVR-Ll，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HVR-L2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3。
16.一種分離的抗NRGl抗體，其包含:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:76的HVR-H1，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的HVR-H3。
17.一種分離的抗NRGl抗體，其包含:(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的HVR-Ll，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-L2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-L3。
18.權利要求16的抗體，其進一步包含:(a)包含氨基酸序列SEQID NO:31的HVR-Ll，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-L2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-L3。
19.權利要求1-12任一項的抗體，其包含:(a)與氨基酸序列SEQID NO:21具有至少95%序列同一性的VH序列；(b)與氨基酸序列SEQ ID NO:26具有至少95%序列同一性的VL序列；或(c) (a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
20.一種分離的抗NRGl抗體，其包含VH序列SEQ ID NO:21和VL序列SEQ ID NO:26。
21.一種分離的抗NRGl抗體，其包含VH序列SEQ ID NO:53和VL序列SEQ ID NO:63。
22.分離的核酸，其編碼權利要求1-21任一項的抗體。
23.—種宿主細胞，其包含權利要求22的核酸。
24.一種生成抗體的方法，其包括培養權利要求23的宿主細胞，使得該抗體生成。
25.一種免疫偶聯物，其包含權利要求1-21任一項的抗體和細胞毒劑。
26.—種藥物配制劑，其包含權利要求1-21任一項的抗體和藥學可接受載體。
27.權利要求26的藥物配制劑，其進一步包含別的治療劑。
28.權利要求27的藥物配制劑，其中所述別的治療劑為吉西他濱(gemcitabine)，帕利他賽(paclitaxal),或順鉬(cisplatin),或帕利他賽和順鉬的組合。
29.權利要求1-21任一項的抗體，其用作藥物。
30.權利要求1-21任一項的抗體，其用于治療癌癥。
31.權利要求1-21任一項的抗體在制`備藥物中的用途。
32.權利要求31的用途，其中所述藥物用于治療癌癥。
33.權利要求30的抗體或權利要求32的用途，其中所述癌癥選自下組:非小細胞肺癌，乳腺癌，卵巢癌，頭和頸癌，宮頸癌，膀胱癌，食道癌，前列腺癌，和結腸直腸癌。
34.一種治療具有癌癥的個體的方法，其包括對該個體施用有效量的權利要求1-21任一項的抗體。
35.權利要求34的方法，其中所述癌癥選自下組:非小細胞肺癌，乳腺癌，卵巢癌，頭和頸癌，宮頸癌，膀胱癌，食道癌，前列腺癌，和結腸直腸癌。
36.權利要求34或35的方法，其進一步包含對該個體施用別的治療劑。
37.權利要求36的方法，其中所述別的治療劑選自下組:吉西他濱，帕利他賽，卡鉬(car bop I at i η),和順鉬或帕利他賽,卡鉬,和順鉬中兩種或所有三種的組合。
38.一種在癌癥患者中延長腫瘤再發生前時間的方法，其包括對該患者施用有效量的權利要求1-21任一項的抗體。
39.權利要求38的方法，其進一步是包括對該患者施用治療劑。
40.權利要求39的方法，其中所述治療劑為化學治療劑或第二抗體。
41.權利要求40的方法，其中所述化學治療劑選自下組:吉西他濱，帕利他賽，卡鉬，和順鉬或帕利他賽，卡鉬，和順鉬中兩種或所有三種的組合。
42.權利要求40的方法，其中所述第二抗體結合選自下組的靶物:EGFR，HER2，HER3，或HER4，或結合兩種或更多種選自下組的靶物:EGFR，HER2，HER3，或HER4。
43.權利要求42的方法，其中所述癌癥選自下組:非小細胞肺癌，乳腺癌，卵巢癌，頭和頸癌，宮頸癌，膀胱癌，食道癌，前列腺癌，和結腸直腸癌。
44.權利要求38的方法，其中腫瘤再發生前時間的延長為比所述抗體缺失下的再發生前時間長至少1.25倍或至少1.50倍。
【文檔編號】C07K16/22GK103890007SQ201280050667
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年8月16日 優先權日:2011年8月17日
【發明者】E.杰克遜, G.謝弗, Y.吳 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司