涉及核酸納米和微米技術的組合物和方法

涉及核酸納米和微米技術的組合物和方法
【專利摘要】本發明提供了由多個寡核苷酸組成的、具有受控的大小和形狀的核酸結構，及其合成方法。結構至少部分通過單鏈寡核苷酸的自裝配形成。所得的結構中的每個寡核苷酸的位置是已知的。相應地，結構可以由特異性進行修飾。
【專利說明】涉及核酸納米和微米技術的組合物和方法
[0001]發明背景
[0002]涉及核酸納米結構(或微米結構)合成的先前工作涉及“DNA折紙”方法，其中長度幾千堿基的天然存在“支架”DNA通過使用多條輔助鏈折疊成結構，所述輔助鏈各自與支架DNA的兩個、三個或更多個非鄰接區雜交。此類折疊方法部分受限于獲得除了目前使用中那種(即長度約7千堿基的M13mpl8病毒基因組DNA)外的支架的能力。它們在其通用性方面受限，因為每個核酸結構需要輔助鏈的特異性設計和設置，以便生成支架DNA的必需折疊。
[0003]更加早期的工作涉及核酸“瓦(tile)”單體的使用，所述核酸“瓦”單體各自由多至5個單鏈寡核苷酸構成，具有相對剛性的核心結構和與其他單體雜交的側翼序列，以便形成核酸結構。使用這些瓦單體產生的最復雜的結構是4乘4平方結構。
[0004]更近期的工作涉及相同單鏈寡核苷酸子集的使用，以形成特定周長的DNA管。這個工作受限于其僅形成少數類型結構即絲帶和管的能力。此外，基于用于生成結構的單鏈寡核苷酸的性質，最終用戶不能對此類結構的大小施加很多控制。
[0005]發明概述
[0006]本發明提供了用于制備具有已知和預定的并因此受控的大小、形狀和復雜性的核酸結構的新型方法，以及核酸結構自身。本發明的核酸結構通過使多個單鏈寡核苷酸以序列特異性方式彼此結合進行制備。核酸結構和單鏈寡核苷酸如此設計，使得每個結構中的每個寡核苷酸的位置是已知的，并且因此使得在結構中的每個位置處的核苷酸序列是已知的。了解在結構中的每個寡核苷酸的位置和因此每個位置處的核苷酸序列的能力促進以限定和受控的方式的結構修飾。本發明還提供了多種核酸結構，所述核酸結構就大小、形狀和/或復雜性而言是基本上單分散的。多種核酸結構的成員還可以就每個結構內的寡核苷酸定位而言彼此是相同的，允許以相同方式修飾多種核酸結構。多種結構因此可以表征為就修飾而言也是單分散的。如本文描述的，這種方法的通用性至少部分通過使用來自310寡核苷酸庫的子集，使用“一鍋式(one-pot)”退火反應生成至少107個不同形狀的核酸結構的能力得到證實。
[0007]本發明的特定核酸結構由具有交叉或半交叉或其一些組合的平行雙螺旋組成。一般地，多個單鏈寡核苷酸退火以在結構中形成雙螺旋。
[0008]核酸結構中的每個寡核苷酸可以是獨特的(即，它可以僅在每個結構中出現一次)，或它可以出現一次、兩次、三次或甚至更頻率出現。本發明考慮了具有一個或多個獨特寡核苷酸的核酸結構。在一些情況下，促成雙螺旋的至少一個寡核苷酸是獨特的。在一些情況下，結構中的至少一個雙螺旋包含在該螺旋或整體結構中不同于所有其他寡核苷酸的寡核苷酸。
[0009]本發明還提供了用于生成核酸結構的單鏈寡核苷酸。提供了不同的多個單鏈寡核苷酸，其中所述多個的性質和組成取決于所需結構的設計，包括形狀、大小和復雜性。如本文更詳細地解釋的，所述多個一般包含2結構域和4結構域寡核苷酸。
[0010]本發明考慮了在性質上是模塊的單鏈寡核苷酸和核酸結構。本發明的方法允許通過包括和/或排除已知寡核苷酸子集制備多種形狀的核酸結構。該方法還考慮了例如通過使此類結構基于序列特異性彼此退火，核酸結構彼此的模塊裝配。在這些實施方案的一些中，彼此退火的核酸結構可以共享共同形狀(例如兩者都可以是管，或兩者都可以是網格)。該方法還考慮了通過使用接頭使兩種或更多種核酸結構彼此連接制備的復合核酸結構，所述接頭可以對于核酸結構是整合的或不整合的。在這些實施方案中，彼此連接的核酸結構可以具有相同或不同形狀。
[0011]本發明進一步考慮了通過在單個容器中組合多個已知單鏈寡核苷酸，并允許寡核苷酸以預定的方式在合適條件下自裝配的核酸結構合成。類似地，兩種或更多種核酸結構可以在單個容器中組合，且允許以預定的方式在合適條件下基于核苷酸序列互補性而自裝配，從而形成更大的核酸結構。
[0012]因此，在一個方面，本發明提供了包含多個退火的寡核苷酸的核酸結構，每個寡核苷酸包含排列成至少兩個平行雙螺旋的至少兩個結構域，其中至少一個雙螺旋包含獨特結構域。
[0013]在一些實施方案中，至少一個雙螺旋包含2個或更多個獨特結構域。在一些實施方案中，至少50%的雙螺旋包含一個或多個獨特結構域。在一些實施方案中，該結構包含至少5個、至少10個或至少20個平行雙螺旋。
[0014]在另一個方面，本發明提供了包含多個退火的寡核苷酸的核酸結構，每個寡核苷酸包含排列成至少兩個平行雙螺旋的至少兩個結構域，其中至少一個雙螺旋是獨特的。
[0015]在一些實施方案中，該結構包含2個或更多個獨特雙螺旋。在一些實施方案中，至少50%的雙螺旋是獨特的。在一些實施方案中，至少50%的雙螺旋包含一個或多個獨特結構域。在一些實施方案中，該結構包含至少5個、至少10個或至少20個平行雙螺旋。
[0016]在另一個方面，本發明提供了包含多個退火的寡核苷酸的核酸結構，每個寡核苷酸包含排列成至少兩個平行雙螺旋的至少兩個結構域，其中該結構中的至少一個寡核苷酸是獨特的。
[0017]在一些實施方案中，該結構中的至少50%寡核苷酸是獨特的。在一些實施方案中，該結構中的所有寡核苷酸都是獨特的。在一些實施方案中，該結構包含至少5個、至少10個或至少20個平行雙螺旋。
[0018]在另一個方面，本發明提供了包含前述權利要求中任一項的多個核酸結構的組合物，其中所述多個是至少50%同質的。
[0019]在另一個方面，本發明提供了包括在單個容器中使多個單鏈寡核苷酸退火以形成核酸結構的方法，其中所述單鏈寡核苷酸各自包含至少兩個結構域，并且至少一個單鏈寡核苷酸以比多個中的其他寡核苷酸的摩爾濃度低10倍的摩爾濃度存在。
[0020]在另一個方面，本發明提供了包括在單個容器中使多個單鏈寡核苷酸退火以形成核酸結構的方法，其中所述單鏈寡核苷酸各自包含至少兩個結構域，并且至少一個單鏈寡核苷酸以比多個中的其他寡核苷酸的摩爾濃度低100倍的摩爾濃度存在。
[0021]在一些實施方案中,退火通過經過一段時間的溫度轉變而發生。在一些實施方案中，溫度轉變是從高溫到約室溫的溫度變化。在一些實施方案中，溫度轉變是從約90°C到約室溫的溫度變化。在一些實施方案中，退火經過約12-24小時的時期發生。
[0022]在另一個方面，本發明提供了通過前述方法中的任何制備的核酸結構。
[0023]在另一個方面，本發明提供了包含通過間隔物-接頭彼此綴合的，前述權利要求中任一項的至少兩個核酸結構的復合核酸結構。
[0024]在一些實施方案中，間隔物-接頭包含核酸元件和非核酸元件。在一些實施方案中，間隔物-接頭包含碳鏈。在一些實施方案中，間隔物-接頭是同雙功能間隔物-接頭。
[0025]在前述方面中任一個的一些實施方案中，第一個子集的寡核苷酸包含2個結構域，并且第二個子集的寡核苷酸包含4個結構域。在一些實施方案中，寡核苷酸長度是21-104個核苷酸。在一些實施方案中，單鏈寡核苷酸是DNA寡核苷酸。在一些實施方案中，單鏈寡核苷酸是L-DNA寡核苷酸。在一些實施方案中，單鏈寡核苷酸是RNA寡核苷酸。在一些實施方案中，單鏈寡核苷酸包含修飾例如但不限于主鏈修飾、糖修飾、堿基修飾。單鏈寡核苷酸可以是關于此類及其他修飾同質的或異質的。
[0026]在一個方面，本發明提供了包含多個獨特寡核苷酸的核酸結構，其中所有寡核苷酸長度都小于lkb。在一些實施方案中，寡核苷酸長度小于100個堿基。在一些實施方案中，該結構中的一些寡核苷酸長度是η個寡核苷酸(其中η代表10.5倍數的整數)，并且一些寡核苷酸長度是η/2。在一些實施方案中，一些寡核苷酸長度是約42個核苷酸(例如4結構域寡核苷酸)，并且一些寡核苷酸長度是約21個核苷酸(例如2結構域寡核苷酸)。
[0027]本發明考慮了具有寡核苷酸的多種排列的核酸結構。在一些實施方案中，核酸結構包括寡核苷酸，其包含例如5個結構域，其中2個此類結構域與結構中的不同和分離的寡核苷酸上的一個結構域結合。在一些實施方案中，與另一個寡核苷酸中的單個結構域結合的2個結構域可以不彼此鄰接，或當與其他單個結構域結合時，彼此連接。在一些實施方案中，該結構包含半交叉。在一些實施方案中，該結構含有交叉。在一些實施方案中，該結構含有半交叉和交叉。
[0028]應當理解在下文更詳細地討論的前述概念和另外概念的所有組合(條件是此類概念并不互相矛盾)考慮作為本文公開的本發明主題的部分。特別地，在本公開內容結束時出現的請求保護的主題的所有組合考慮作為本文公開的本發明主題的部分。還應當理解還可以在通過引用并入的任何公開內容中出`現的本文明確采用的術語應給予與本文公開的具體概念最一致的含義。
[0029]附圖簡述
[0030]應當理解圖不一定按比例繪制，而是將重點放在一般舉例說明本文討論的多個概念上。
[0031]圖1是包含4個結構域的單鏈寡核苷酸(本文稱為4結構域單鏈寡核苷酸)的示意圖。每個結構域是不同核苷酸序列(如可以由不同顏色表示的)。如本文討論的，每個結構域特征在于其序列及其長度。箭頭表示寡核苷酸的3’末端，并且寡核苷酸的另一個末端是5’末端。本發明的某些寡核苷酸僅包含2個結構域(并且這些在本文中被稱為2結構域寡核苷酸)。每個寡核苷酸通過其結構域數目、此類結構域的次序及其總體核苷酸序列限定。
[0032]圖2Α是核酸結構區域的示意圖，顯示4結構域單鏈寡核苷酸(在該圖中表示為“U”形結構)和2結構域單鏈寡核苷酸(由底部的線性結構表示，在本文中也稱為邊界寡核苷酸)。舉例說明的是結構域間、寡核苷酸間鍵和螺旋之間的半交叉。半交叉也得到舉例說明，并且如該圖中所示，這些由磷酸鹽主鏈部分組成。半交叉一般不包含核苷酸，并且因此不促成序列特異性結合且不指定結構中的寡核苷酸定位或位置。為了舉例說明的目的，顯示了與彼此和/或其他寡核苷酸鍵合的4結構域寡核苷酸中的九個。在這個舉例說明中，所有九個都具有相對于彼此的獨特序列(如可以由不同顏色表示的)。
[0033]圖2B是兩個核酸結構區域的示意圖，顯示2和4結構域單鏈寡核苷酸的排列。在頂部示意圖中，每個4結構域寡核苷酸以“U”形配置，并且僅提供在它促成的兩個雙螺旋中的的單個半交叉。在下部示意圖中，4結構域寡核苷酸之一促成它促成的雙螺旋之間的兩個半交叉。該結構因此含有交叉和多個半交叉。相同寡核苷酸可以表征為具有5’ d2-a-b-c-dl3’的結構域次序，其中結構域dl和d2與形成雙螺旋的結構域d*結合。結構域由不同標識符標記，以指示相對于彼此的獨特序列。
[0034]圖2C是顯示核酸結構中的4結構域寡核苷酸的另外其他考慮的排列的示意圖。頂部結構包含多個交叉。底部結構包含多個半交叉。頂部結構中的交叉之間的距離大于底部結構中的半交叉之間的距離。例如，頂部結構中的距離可以是4個結構域，而底部結構中的距離可以是2個結構域。包含頂部排列的核酸結構已在實驗上制備。
[0035]圖3A是由12個不同寡核苷酸構成的四個平行雙螺旋網格(A)和由40個不同寡核苷酸構成的八個平行雙螺旋正方形(B)的示意圖。
[0036]圖3B-F是通常成形為網格但具有不同大小的核酸結構的略圖。大小可以表示為雙螺旋數目和每個雙螺旋的螺旋轉角數目。一般地，螺旋轉角數目在結構中的雙螺旋之間是相似或相同的。這些圖各自由多個獨特寡核苷酸組成，所述獨特寡核苷酸通過其結構域含量和次序鑒定。每個結構域通過某一字母-數字指名而鑒定，并且每個寡核苷酸通過其結構域含量和次序而鑒定。寡核苷酸、其指名及其結構域和序列組成的列表在表1中提供。圖3F中的網格是由具有表1中提供的序列的362個不同寡核苷酸構成的24個雙螺旋網格。圖3B-3D中的網格包含這些寡核苷酸的子集，并且可以包括另外的2結構域寡核苷酸作為邊界寡核苷酸。
[0037]圖3G是顯示具有兩個相同寡核苷酸(標記為5’ a-b-c_d3’ )的核酸結構的區域的示意圖。
[0038]圖4是組合且退火以形成網格核酸結構的多個單鏈寡核苷酸的示意圖。還顯示的是在不存在純化的情況下的退火過程產物的瓊脂糖凝膠電泳分析，和這些產物的原子力顯微(AFM)圖像。比例尺代表lOOnm。
[0039]圖5A是多種形狀核酸結構(頂部)和退火后產物的AFM圖像(底部)的示意圖。比例尺代表lOOnm。示意圖還舉例說明使用具有已知寡核苷酸圖的起始網格結構用于生成多種形狀核酸結構的方法。
[0040]圖5B和C是不同大小且具有不同邊緣的兩個三角形核酸結構的示意圖。兩個結構都已在實驗上制備。
[0041]圖是可以制成管的網格的示意圖。頂部行的結構域a24.X*和b24.X*將分別與底部行的a24.X和b24.x結合，以形成管形狀。
[0042]圖6是具有缺乏寡核苷酸的內部區的矩形核酸結構的示意圖。該圖舉例說明此類復合結構可以通過基于結構的預定的和已知寡核苷酸圖，簡單地從用于制備結構的多個中排除已知寡核苷酸容易地形成。
[0043]圖7是由網格制備的管狀核酸結構的透射電子顯微鏡檢查(TEM)圖像，所述網格是圖5的矩形網格長度的三倍和圖5的矩形網格寬度的三分之一。這些管使用網格所需的約80%寡核苷酸生成，并且包括一些另外的寡核苷酸以充當連接物。[0044]圖8是顯示具有L形核酸結構的四個平行雙螺旋正方形核酸結構的退火的示意圖。該圖舉例說明根據本發明的核酸結構合成的模塊方法。
[0045]圖9是顯示使用間隔物-接頭三個矩形核酸結構彼此附著的示意圖。取決于間隔物-接頭的放置和長度，可以制備多個這些復合結構。
[0046]圖1OA和B是顯示具有“手柄(handles)”的核酸結構的示意圖(A)和AFM圖像(B)。手柄作為附著至2結構域邊界寡核苷酸的另外結構域提供，導致3結構域邊界寡核苷酸。在該圖中，雙重T (T2)間隔物存在于第二個和第三個結構域之間，其中第三個結構域代表手柄結構域。與第三個結構域互補的寡核苷酸可以包括在退火反應中。在該圖中，這個互補寡核苷酸指示y*，并且在其3’末端處具有生物素修飾。生物素部分隨后可以用于結合鏈霉親和素。AFM圖像顯示與標記的鏈霉親和素結合的此類結構。本發明考慮了在結構中的任何地方，包括在邊界、邊緣和/或內部摻入此類手柄結構域。
[0047]圖11是關于依照本發明生成的多種結構的簡圖(上圖)和相應AFM圖像(下圖)的匯集。
[0048]圖12是多個矩形、內環形結構的AFM圖像。
[0049]發明詳述
[0050]本發明在其最廣泛的含義中涉及制備具有預定的且因此受控的形狀、大小和復雜性的核酸結構的方法。本發明部分基于出乎意料的發現:選擇多個單鏈寡核苷酸可以自裝配，以形成具有受控的形狀、大小、復雜性和修飾的核酸結構。具有多個預定的形狀和受控的大小的穩定核酸結構可以僅使用多個單鏈寡核苷酸形成是尤其令人驚訝的。
[0051]本發明的核酸結構包含以預定的或已知方式排列(經由序列特異性退火)的多個寡核苷酸。因此，結構中的每個寡核苷酸的位置是已知的。以這種方式，結構可以例如通過在特定位置處附著部分進行修飾。這可`以通過使用經修飾的寡核苷酸作為其實材料或通過在形成結構后修飾特定寡核苷酸來實現。因此，了解所得到的結構中的起始寡核苷酸各自的位置為結構提供了可尋址性。
[0052]在一些情況下，本發明的核酸結構可以通過單鏈寡核苷酸的自裝配過程進行制備。在這些自裝配方法中，單鏈寡核苷酸在單個容器中組合并允許基于序列互補性彼此退火。在一些情況下，這個退火過程涉及在高溫下放置寡核苷酸且隨后逐步降低溫度，以便有利于序列特異性結合。如本文使用的，術語“自裝配”指寡核苷酸以序列特異性方式、以預定的方式且無需外部受控的(例如通過寡核苷酸或核酸結構的順次添加)彼此退火的能力。
[0053]本發明因此尤其提供了包含本發明的單鏈寡核苷酸的組合物，制備具有多個預定的或已知大小、形狀、復雜性和修飾的核酸結構的方法，具有多個預定的或已知大小、形狀、復雜性和修飾的核酸結構，多個核酸結構，其中此類多個可以是就大小、形狀、復雜性和修飾而言基本上單分散的，包含兩種或更多種核酸結構的組合結構，和制備此類復合結構的方法。本發明還提供了使用本發明的核酸結構和復合結構的方法。本發明的這些方面和實施方案將在本文中更詳細地描述。
[0054]核酸結構:
[0055]本發明的核酸結構由多個寡核苷酸組成，所述多個寡核苷酸以序列特異性方式彼此結合。本發明的寡核苷酸一般包含兩個或更多個結構域。圖1提供了4結構域寡核苷酸的示意圖。在形成核酸結構的退火過程前，寡核苷酸處于單鏈形式。[0056]—般地，寡核苷酸的每個結構域與結構中的另一個寡核苷酸的另一個結構域結合。圖2A提供了結構區域中2和4結構域單鏈寡核苷酸之間的排列和結合相互作用的示意圖。2結構域寡核苷酸在底部由直箭頭顯示，并且4結構域寡核苷酸作為U形箭頭顯示。當存在于本發明的核酸結構中時，4結構域寡核苷酸具有約3nm乘7nm的面積。它們在本文中可以被稱為單鏈塊(SST)。在核酸結構的背景中，每個SST可以視為“分子像素”。圖各自中的箭頭代表寡核苷酸的3’末端。相似表示在圖2B (上)中提供。圖2B (下)顯示備選實施方案，其中寡核苷酸由5個結構域組成，并且這些結構域中的兩個一起與物理上分開的寡核苷酸上的另一個結構域結合。當與其他結構域結合時，指示dl和d2的這兩個結構域不直接彼此綴合，相反在它們之間基本上存在缺口。該結構隨后還包含基于5’-d2-a-b-c-dl-3’寡核苷酸的定向的交叉。另外其他的排列顯示于圖2C中。如舉例說明的，寡核苷酸可這樣排列，從而使得結構包含交叉(如圖2C上所示)、半交叉(如圖2C下所示)、或這些的組合(如圖2B下所示)。寡核苷酸還可以這樣排列，從而使得交叉和/或半交叉在不同距離發生，所述不同距離包括但不限于每兩個結構域或每四個結構域等。應當理解本發明因此考慮了關于核酸結構內的寡核苷酸的多種結合排列。[0057]然而，在一些情況下，核酸結構中的某些結構域可能不與結構中的另一個結構域結合。例如，在一些情況下，具有聚T結構域的寡核苷酸存在于結構中，優選在邊界處和在導致聚T結構域是單鏈的配置中。
[0058]作為另一個例子，結構域可以用作手柄用于對其他結構或其他部分退火。此類手柄結構域顯示于圖1OA中網格結構的上和下邊界處。包含生物素部分的寡核苷酸與這些手柄結合，并且結構隨后與鏈霉親和素接觸。鏈霉親和素結合的位置顯示于圖1OB中。
[0059]在結構內的寡核苷酸一般在平行排列中對自身進行排列以形成雙螺旋。這些雙螺旋在本文中可互換地被稱為螺旋。此類結構的例子在圖3A中提供。左圖舉例說明了 4螺旋網格結構，并且右圖舉例說明了 8螺旋網格結構。這些雙螺旋由于選擇的單鏈寡核苷酸群體彼此的序列特異性退火而形成。結構中的每個雙螺旋由多個結構域組成。這些結構域與其他寡核苷酸中的互補結構域結合，以形成螺旋。鄰近螺旋通過半交叉彼此連接。
[0060]本發明提供了核酸結構可以在合成前進行設計，并且其大小、形狀、復雜性和修飾可以通過在合成過程中使用某些選擇寡核苷酸進行指定且得到控制。例如，圖3B-F舉例說明了用于許多不同大小網格的寡核苷酸圖。結構中的每個結構域和每個寡核苷酸的位置是已知的且在這些圖中提供。結構域和寡核苷酸的核苷酸序列在表1中提供。
[0061]表1的寡核苷酸可以用于生成310 “像素”畫布(canvas)，由其可以生成多種形狀的核酸結構。該表含有4結構域內部和邊界寡核苷酸的序列和2結構域邊界寡核苷酸的序列。4結構域內部寡核苷酸代表像素，而2結構域和4結構域邊界寡核苷酸與由內部寡核苷酸產生的結構的上、下和側面邊緣結合，從而阻止不需要的結構聚集。該表因此包含310個4結構域(像素或內部)寡核苷酸、24個4結構域(垂直邊界)寡核苷酸、和28個2結構域(水平邊界)寡核苷酸。應當理解，當310內部寡核苷酸庫的子集用于生成特定形狀的結構時，取決于內部寡核苷酸的所需結構的邊緣處存在的序列，可能需要不同的2結構域和4結構域邊界寡核苷酸。使用本文提供的教導且參考圖中的某些包括但不限于圖2B和3A，本領域普通技術人員能夠測定此類邊界寡核苷酸的序列。
[0062]應當理解因此內部寡核苷酸促成結構的所需形狀，并且邊界寡核苷酸阻止結構彼此不需要的聚集。
[0063]還應當理解表1的序列是自然界中的代表，并且本發明可以使用另一個寡核苷酸庫執行。此類寡核苷酸庫可以基于本文提供的教導手動或通過計算機方法設計。
[0064]例如，寡核苷酸庫可以使用如下過程進行構建，所述過程使序列對稱性降到最低或使具有完全隨機序列的SST基序增加。任一過程可以采用軟件例如Uniquimer。對于基于序列最小化的設計，存在序列生成的幾個標準:1)核苷酸(即A、C、G、T) 一個接一個隨機生成。2)針對所生成的那些的互補核苷酸根據堿基配對原則進行匹配:A對T并且反之亦然，C對G并且反之亦然。3)不允許超過某一長度(8nt或9nt)的重復區段。當此類重復區段在設計過程中出現時，最近生成的核苷酸將突變，直至滿足重復區段需求。4)不允許四個連續A、C、G或T堿基。5)在單鏈連接點處的預先指定的核苷酸(例如對于大多數鏈，T和G分別用于第21和22個核苷酸)用于避免在連接點周圍的滑動堿基。然而，在使用完全隨機序列的設計中，不應用在步驟3到5中的限制。
[0065]寡核苷酸中的一些或全部可以手動設計。例如，在例示結構的一些中，手動設計和/或最佳化用于手柄區段序列設計(例如容納3’生物素鏈的手柄區段用于鏈霉親和素標記和聚T結構域的串聯)。另外，在一些情況下，手動組合來自不同SST結構的區段，以將現有結構轉化成新結構。例如，引入另外的SST行以將矩形設計轉換成管設計(例如將24HX 28T矩形設計轉換成24HX28T桶設計，并且將24HX28T矩形設計轉換成8HX84T管設計)。類似地，還將管設計手動轉換成矩形設計(例如將12HX 177T管轉換成36HX41T矩形)。
[0066]在一些情況下，核酸結構中的至少一個結構域將是獨特的，預期該結構域僅在該結構中出現一次。結構可以由一個或多個獨特結構域組成，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 個或更多個獨特結構域。在一些實施方案中，結構中的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、80%或90%結構域是獨特的。例如，結構可以包含第一多個結構域和第二多個結構域，所述第一多個結構域各自僅在該結構中出現一次，并且這些獨特結構域可以代表結構中的總結構域的75%，所述第二多個結構域各自在該結構中出現超過一次，并且這些重復結構域可以代表結構中的總結構域的25%。顯而易見的是其他百分比也是可能的。在一些實施方案中，結構中的每個結構域都是獨特的。復合結構中的每一個結構域(即包含由間隔物-接頭彼此連接的兩個或更多個核酸結構的結構)可以是或不是獨特的。
[0067]在一些情況下，結構中的雙螺旋中的至少一個結構域將是獨特的，預期該結構域僅在該雙螺旋中出現一次。結構域可以在相同結構內的其他螺旋中存在，并且因此它在整個核酸結構的背景下可以不是獨特的。這在圖3G中舉例說明。指定5’-a-b-c-d-3’的寡核苷酸在該結構中存在兩次。指定a及其互補體a*和b及其互補體b*的結構域存在于結構中的兩個螺旋中，如結構域c及其互補體c*和d及其互補體d* —樣。在螺旋中可以存在
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個結構域，其在該螺旋中的背景下是獨特的。螺旋中的獨特結構域可以代表該螺旋中的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、80%、90%或100%結構域。螺旋中的獨特結構域可以位于結構末端或附近。螺旋中的獨特結構域可以彼此鄰接，或它們可以彼此分散開。它們可以通過重復結構域(即，在螺旋中出現超過一次的結構域)彼此分開。
[0068]該結構可以包含具有獨特結構域的一個或多個螺旋。這類螺旋可以代表結構中存在的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%或100%螺旋。如果超過一個這個螺旋
類型存在于該結構中，則它們可以彼此鄰近，或它們可以由其他螺旋(包括不含獨特結構域的螺旋)分開。例如，具有獨特結構域的螺旋可以在結構中與缺乏獨特結構域的螺旋交替。
[0069]因此，在一些情況下，核酸結構可以包含兩個或更多個螺旋，所述螺旋各自具有一個或多個獨特結構域，其中所述結構域就個別螺旋自身而言是獨特的，并且可能在就結構整體而言是獨特的。個別螺旋中的一個或多個獨特結構域可以存在于結構中的其他螺旋中。個別螺旋中的一個或多個獨特結構域可以是該結構中的其他螺旋中的一個或多個獨特結構域。
[0070]在一些情況下，結構中的一個或多個螺旋各自可以完全由獨特結構域組成，預期這些結構域各自每個螺旋僅出現一次或每個結構僅出現一次。
[0071]因此，在一些情況下，本發明的核酸結構包含至少一個獨特的雙螺旋。獨特雙螺旋是具有如下結構域組成的螺旋，所述結構域組成不同于結構中的任何其他螺旋。獨特雙螺旋因此還將具有不同于結構中的任何其他螺旋的核苷酸序列。
[0072]在另外其他情況下，本發明的核酸結構可以這樣設計，從而使得它們包含由獨特結構域組成的一個區域和由非獨特或重復結構域組成的另一個區域。
[0073]結構至少部分通過使單個容器中的多個已知寡核苷酸退火而形成。這在圖4中舉例說明。該圖顯示預期網格結構的示意圖和退火后過程的AFM圖像。退火后過程的凝膠電泳分析顯示兩個條帶，一個對應于未結合的寡核苷酸并且一個對應于該結構。該方法提供了從可以用于生成某一大小的網格的已知寡核苷酸庫開始，可以從該庫中排除選擇寡核苷酸，以便形成不同形狀和/或大小的結構。
[0074]可以使用這些方法制備的多種結構顯示于圖5A (上)中。還顯示的是由此類方法產生的退火后產物。可以用于生成三角形結構的詳細寡核苷酸圖也在圖5B和C中提供。可以用于生成管形結構的詳細寡核苷酸圖在圖中提供。本發明還考慮了排除對于結構是內部的寡核苷酸。例如，圖6舉例說明了具有內部空隙模式的結構(即缺乏任何寡核苷酸的預定的區域)。
[0075]因此，在一些情況下，伴隨在結構中的每個位置處存在的特定寡核苷酸的了解，最終用戶設計核酸結構例如具有特定長度和寬度的維度的網格。實際上，最終用戶有指示結構內的每個寡核苷酸的精確位置的物理圖。在圖中(和因此在核酸結構中)的每個位置處每個寡核苷酸的特性的了解，允許最終用戶使用特定結構作為起點改造特定模式或形狀。通過從組合的寡核苷酸混合物中排除一個或多個已知寡核苷酸以形成核酸結構，和/或包括另外的已知寡核苷酸，可以發生此類改造。
[0076]因此，作為例子和如本文證實的，最終用戶可以設計具有特定長度和寬度，并且由多個獨特寡核苷酸組成的二維網格。最終用戶了解網格中的每個位置處的寡核苷酸的特性。除了能夠合成網格自身外，最終用戶還能夠使用網格作為起點設計且合成一個或多個其他核酸結構。如本文證實的，多個 形狀的核酸結構可以通過從庫中排除一個且通常多個寡核苷酸進行合成，所述庫將用于制備整個網格。這些形狀包括心形、人字形和三角形，以及具有內部開口或洞的網格或其他結構。
[0077]本發明因此提供了用于合成許多不同核酸結構的方法，而無需從新設計每個結構。相反，從起始核酸結構例如網格開始，通過排除預先選擇的寡核苷酸和/或包括預先選擇的寡核苷酸，可以簡單形成多種其他核酸結構。以這種方式，最終用戶使用以模塊模式的單鏈寡核苷酸，取決于所需核酸結構的最終形狀和大小，包括或排除多個的成員。多個的寡核苷酸成員之間的相互作用不預期可觀改變，并且因此最終用戶不需要基本上由草圖(scratch)設計每一個新核酸結構。相反，最終用戶制備每個寡核苷酸的原料，且將多個原料以對應于其在結構和單個容器中的相對頻率的相對濃度組合在一起，以便形成所需形狀、大小和復雜性的核酸結構。
[0078]所需形狀和大小的核酸結構中的單鏈寡核苷酸的選擇和排列可以手動或通過計算機算法完成。此類計算機算法的例子是對于公眾可公開獲得的Uniquimer。
[0079]如前述圖的一些中舉例說明的，本發明的核酸結構的大小可以在退火過程期間得到控制。通過設計具有一個或多個獨特結構域、或者一個或多個獨特螺旋的結構，且因此在退火過程中使用選擇的寡核苷酸群體，來實現這個大小控制。核酸結構的大小因此一般也是預定的。
[0080]核酸結構的大小可以通過其維度中的一個、兩個或三個的距離表示。此類維度可以各自獨立地在長度是納米或微米或更長。例如，結構可以包含一個或兩個維度，各自具有在5-100納米、5-500納米、5-1000納米，包括10-100納米、10-500納米或10-1000納米范圍中的長度。在一些實施方案中，它們可以具有約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900nm 或更多的一個或多個維度。在一些實施方案中，該結構是約3nm乘7nm或約4nm乘7nm。在一些實施方案中，該結構是60nm乘lOOnm。
[0081]核酸結構的大小還可以通過雙螺旋數目以及這些雙螺旋的長度呈現。雙螺旋的長度可以表示為螺旋中的螺旋轉角數目。應當理解本發明考慮了制備處于納米和微米尺度或更大的結構。
[0082]核酸結構的大小還可以呈現為它包含的4結構域寡核苷酸(SST)數目。范圍可以是I到超過1000。本文例示的結構中的`許多由等于或少于310個SST組成。然而，應當理解促成核酸結構的SST的數目可以取決于所需的結構大小和/或修飾程度和/或所需的復雜性而改變。與先前報告的一鍋式退火結構相比較，例示結構中的一些包含至少4倍的不同分子組分。
[0083]核酸結構的大小還可以呈現為它包含的核苷酸數目。本文例示的結構中的一些包含至少約15，000個核苷酸，并且一些包含約45，000個核苷酸。例示結構中的一些包含是典型DNA折紙結構(即由單個支架鏈和多個訂書針鏈組成的結構)的至少3倍的核苷酸。
[0084]本發明的核酸結構可以采取任何形狀或形式。可以使用本發明的方法產生的多種形狀和形式的例子在圖5A-D、6、7和11中舉例說明。重要的是，使用本發明的方法，基于在結構中的每一個位置處的寡核苷酸特性(和因此序列)的了解，能夠以精確控制預定且因此預先設計核酸結構的形狀、形式和大小。該方法的功效通過在第一次嘗試中生成110個目的結構中的103個的94%成功率加以證實。在第一次嘗試中未生成的7個結構中，主要通過去除狹窄連接點和區域，將4個輕微重新設計，且隨后后續成功產生。顯著地，使用例如310寡核苷酸庫的不同子集制備的不同結構可以合成和純化后混合，即使當不同結構包含相同SST時，也不喪失結構完整性。
[0085]如本文討論的，核酸結構可以通過在單個退火反應中組合且退火多個單鏈寡核苷酸合成，以獲得所需形狀、大小、復雜性和修飾的核酸結構。本發明還考慮了通過以模塊方式使分開的更小核酸結構彼此退火來合成核酸結構。這種方法在圖8中舉例說明，其中分開制備4雙螺旋正方形結構和L形結構，并且隨后彼此組合且退火，以形成8雙螺旋正方形。相應地，本發明的結構可以如圖4中舉例說明的使寡核苷酸彼此退火和/或通過如圖8中舉例說明的使更小的結構彼此退火形成。這種方法已用于將網格形結構彼此和管形結構彼此融合在一起。此類融合還可以無需從其起始合成退火反應溶液中純化結構而發生。因此，無論是否純化，結構都可以組合且退火。
[0086]在一些實施方案中，結構通過對其實施高溫隨后實施緩慢冷卻過程進行退火。高溫可以是約50°C、約45°C或約40°C，并且冷卻過程預期將溶液冷卻至約室溫(例如約25°C)。冷卻期可以是幾小時，包括2、3、4、5、6、7、8、9或10小時或更久。備選地，可以組合核酸結構，且允許在單個溫度包括例如室溫下退火相同時間段。
[0087]在其他實施方案中，與所有結構的同時混合和退火相比較，本發明考慮了結構的交錯或順次添加(和退火)。順次添加在更復雜結構的合成中可以是特別有用的。在一些情況下，這些及其他退火方法可以在靜止環境中或在流動下執行。流動環境允許非退火的寡核苷酸或核酸結構在后續組分添加前去除。
[0088]本發明還提供了多個核酸結構。如本文使用的，術語多個預期超過一個，并且可以與術語群體可互換地使用。此類多個可以包含10、50、100、500、1000個或更多個結構。此類多個可以具有不同程度的同質性，預期多個中的一定百分比核酸結構就大小、形狀、復雜性和/或修飾而言彼此相同。多個結構因此可以是具有某一特征的結構中至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%同質的。例如，多個網格形狀的結構可以是至少50%同質的，預期該多個中的至少50%結構是網格形狀的。
[0089]此類多個可以是單分散的，預期其成員在一個或多個特征包括大小、形狀、復雜性和/或修飾方面可以是相同的。多個對于這些特征全部可以是單分散的。在一些情況下，多個是基本上單分散的。基本上單分散的指其中至少50%、60%、70%、80%、90%或更多的結構具有大約相同的形狀、大小、復雜性和/或具有相同的修飾的多個。在一些實施方案中，至少10%、20%、30%、40%或更多的結構具有大約相同的形狀、大小、復雜性和/或具有相同的修飾。示例性多個顯示于圖12中。
[0090]多個中的同質性(和相反的異質性)程度可以使用許多技術進行測定，所述技術包括但不限于AFM或TEM和凝膠電泳。這些技術已用于測定制備的結構群體中的同質性程度，如實施例中討論的。重要的是，已發現本文提供的退火方法重現性獲得具有占優勢的核酸結構種類的群體。此外，占優勢的種類看起來與使用本發明的設計和作圖方法預期的種類相同。
[0091]如許多圖中舉例說明的，在一些情況下，一旦形成核酸結構，就可以仍存在單鏈的結構域。這些可以例如在邊界處存在。此類邊界由圖中提供的結構的左和右邊界表示。已發現依照本發明此類結構域的性質可以影響退火過程的效率和得率。更具體而言，如果這些單鏈區域具有混合的核苷酸序列，則結構更可能凝聚且得率降低。此類凝聚可以通過操縱這些單鏈區域的核苷酸序列得到降低。特別地，在序列中是聚T的單鏈區域更不可能引起凝聚，導致更佳的結構得率。這些聚T結構域例如顯示于圖3B-F中，表示為TlO或T11，以指示結構域中的胸苷數目。還可以使用聚A和聚C序列。因此，在一些實施方案中，某些單鏈結構域可以存在于結構中，并且此類結構域可以在序列中彼此相同。
[0092]在某些實施方案中，邊界區域可以由聚T結構域和混合序列的其他結構域的混合物組成，前提是該結構基本上不凝聚。在這些情況下，混合序列結構域可以用于使兩個或更多個結構彼此退火，例如如圖8中所示。此類結構域數目可以是6、8、10個或更多個。
[0093]本發明的結構可以在合成過程中或合成后進行修飾。它們可以通過使用修飾的寡核苷酸在合成過程中進行修飾。例如，用于生成結構的一個或多個寡核苷酸可以與目的部分綴合。經修飾的寡核苷酸可以用于生成本發明的結構，前提是此類修飾不干擾寡核苷酸與所需的其他寡核苷酸結合以便形成所需結構的能力。另外或備選地，該結構可以是合成后修飾的。
[0094]考慮了任何修飾，前提是它不干擾寡核苷酸與彼此的退火，并且它不使得結構更不穩定，除非那是由修飾另外預期的。修飾在性質中可以是但不限于化學或酶促的。修飾可以涉及核酸綴合部分的使用。該部分在性質中可以是但不限于金屬、有機和無機的。該部分可以與核酸綴合，所述核酸能夠識別且結合結構中的寡核苷酸。例如，此類核酸可以是三聯體形成寡核苷酸。在其他情況下，一個或多個非核酸部分可以與結構永久或瞬時、共價或非共價附著。本發明考慮了獨特和/或非獨特的寡核苷酸可以是修飾的。結構中的寡核苷酸自身可以與一個或多個結構域綴合，所述結構域不促成結構，而是用于使部分與結構結合。應當理解，因為結構中的每個寡核苷酸和每個結構域的位置可以是預定的，所以每個修飾對最終所得到的結構的位置也可以是預定的。換言之，結構中的每個寡核苷酸的位置的了解促進結構的可尋址性。
[0095]單鏈寡核苷酸:
[0096]本發明的核酸結構使用多個單鏈寡核苷酸進行設計且制備，所述單鏈寡核苷酸以序列特異性方式彼此退火。寡核苷酸可以通過其長度、其序列及其結構域組成進行表征。它們結構域的數目和序列控制每個寡核苷酸的結合活性和位置。它們的結構域數目一般控制每個寡核苷酸將與結構中的寡核苷酸結合的數目。
[0097]在一些情況下，用于制備結構的寡核苷酸包含偶數數目的結構域。每個寡核苷酸一般包含至少兩個結構域。在一些實施方案中，用于制備結構的寡核苷酸可以是2和4結構域寡核苷酸。還能夠使用寡核苷酸的其他組合形成結構，包括但不限于2和6結構域寡核苷酸、3和6結構域寡核苷酸、2和8結構域寡核苷酸、4和8結構域寡核苷酸等。
[0098]如本文使用的，結構域指核苷酸序列(即，具有以序列特異性方式與其互補體結合的能力的許多鄰接核苷酸或核苷酸類似物)。多個寡核苷酸或核酸結構中的結構域可以這樣設計，從而使得它們對另一個寡核苷酸中的結構域退火。寡核苷酸的所有結構域的共同互補性促進此類寡核苷酸的自裝配，以形成核酸結構。
[0099] 結構域長度可以改變。促成相同螺旋的兩個鄰接結構域的組合長度一般具有h Xk的長度，其中h表示制備完全螺旋轉角所需的單體單位(例如核苷酸)數目，并且k表示I或更大的任何整數。例如，對于B形DNA，一般每個螺旋轉角存在10.5個核苷酸，而對于RNA，每個螺旋轉角存在11個核苷酸。因此，對于在性質中是B形DNA的結構域，促成相同螺旋的兩個鄰接結構域的組合長度可以表示為10.5*k(四舍五入至最近整數)，其中k表示I或更大的任何整數，其中*指示乘號。
[0100]在其中來自相同寡核苷酸的兩個鄰接結構域促成相同螺旋的情況下，兩個結構域的長度將是相關的。假定兩個此類結構域的組合長度為X，其中X為如上定義的h*k。在這種情況下，一個結構域具有長度為y，并且另一個結構域具有長度為x-y，前提是y是I或更大。例如，在一個實施方案中，第一個和第二個DNA結構域各自可以長度范圍為1-20個核苷酸，前提是兩個結構域的組合長度是21個核苷酸。
[0101]在一些實施方案中，促成相同螺旋的兩個鄰接結構域可以具有長度約21+/-2個核苷酸的組合長度，或10.5個核苷酸的任何整數倍數。因此，單個結構域可以具有例如1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個核苷酸的長度。兩個鄰接結構域可以具有例如19、20、21、22或23個核苷酸的總組合長度。2結構域寡核苷酸可以具有例如21+/-2個核苷酸的長度。4結構域寡核苷酸可以具有例如42+/-4個核苷酸的長度。
[0102]因此，一般而言，參與具有如上定義的總長度x=h*k的相同雙螺旋的兩個連續結構域，X可以是h*k+/-a,其中a=0、l、2、…、y，其中y= (h/2) *k (四舍五入至最近整數)。例如，在一個實施方案中，h=ll (在RNA的情況下)，k=l，并且y=6。因此，x可以是11+/-0、1、2、3、4、5或6。作為另一個例子，對于h=10.5 (在B形DNA的情況下)，k=2、y=10。因此，X 可以是 21+/-1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10。 [0103]在一些重要實施方案中，結構域具有10或11個核苷酸的長度，兩個鄰接結構域具有21個核苷酸的長度，并且4結構域寡核苷酸具有42個核苷酸的長度。應當理解本發明考慮了具有兩個鄰接結構域(兩者促成單個螺旋)的寡核苷酸，所述結構域具有21個核苷酸倍數的長度。
[0104]本發明考慮了結構域長度組合例如10-11-11-10、11-10-10-11、11-10-11-10、和10-11-10-11，其中第一個數目表示第一個結構域的長度，第二個數目表示第二個結構域的長度，第三個數目呈現第三個結構域的長度，并且第四個數目表示第四個結構域的長度，并且其中四個結構域如圖1中排列。
[0105]一般在給定合成方法或所得的結構中，具有相同結構域數目的寡核苷酸也將具有相同長度。例如，在一個實施方案中，所有4結構域寡核苷酸將具有相同長度,并且所有2結構域寡核苷酸將具有相同長度(但該長度將不同于4結構域寡核苷酸的長度)。更具體而言，一些實施方案將使用一個長度(例如η個核苷酸)的4結構域寡核苷酸和該長度一半(例如η/2個核苷酸)的2結構域寡核苷酸。
[0106]4結構域“內部”寡核苷酸表示用于本發明結構的單體單位。作為獨立的單體，4結構域寡核苷酸沒有定義明確的結構。然而，在與鄰近2和/或4結構域寡核苷酸相互作用后，它折疊成塊樣形狀。這與先前的塊單體形成對比，所述先前的塊單體單獨折疊成具有限定的結構上剛性(或半剛性)的主體和幾個粘性末端的多鏈結構。
[0107]本發明考慮了包含任何數目的單鏈寡核苷酸的核酸結構。例如，核酸結構可以包含而不限于少至4個和多達1000個(或更多個)寡核苷酸。類似地，用于生成核酸結構的多個寡核苷酸可以包含而不限于少至4個不同類型的寡核苷酸(如通過核苷酸序列限定的)和多達1000個(或更多個)不同寡核苷酸種類(如通過核苷酸序列限定的)。因此，取決于實施方案，核酸結構可以包含 4、5、6、7、8、9、10、15、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500 個或更多個寡核苷酸。類似地，取決于實施方案，用于生成核酸結構的多個寡核苷酸可以包含4、5、6、7、8、9、10、15、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500個或更多個不同寡核苷酸。
[0108]在本發明的背景下，寡核苷酸包括DNA例如D形DNA和L形DNA和RNA，及其多種修飾。修飾包括堿基修飾、糖修飾和主鏈修飾。這些的非限制性例子在下文提供。
[0109]可以用于本發明中的DNA變體的非限制性例子是L-DNA (文獻中已知的DNA的主鏈對映體)、肽核酸(PNA)bisPNA夾、假互補PNA、鎖核酸(LNA)或上述的共核酸例如DNA-LNA共核酸。應當理解在本發明的產物和方法中使用的寡核苷酸在性質中可以是同質的或異質的。例如，它們在性質中可以完全是DNA，或它們可以由DNA和非DNA (例如LNA)單體或序列組成。因此，可以使用核酸元件的任何組合。寡核苷酸修飾可以使得寡核苷酸在某些條件下對降解更穩定和/或更不敏感。例如，在一些情況下，寡核苷酸是核酸酶抗性的。
[0110]寡核苷酸可以具有同質主鏈(例如完全是磷酸二酯或完全是硫代磷酸酯)或異質(或嵌合)主鏈。硫代磷酸酯主鏈修飾使得寡核苷酸對核酸酶更不敏感，并且因此在某些條件下更穩定(與天然磷酸二酯主鏈核酸相比較)。可以為寡核苷酸提供更多穩定性的其他連接包括但不限于二硫代硫酸酯連接、甲基膦酸酯連接、甲基硫代磷酸酯連接、硼膦酸酯連接、肽連接、烷基連接、去磷酸型連接等。因此，在一些情況下，寡核苷酸具有非天然存在的主鏈。
[0111]寡核苷酸可以在體外合成。用于合成核酸的方法包括自動化核酸合成也是本領域已知的。具有修飾的主鏈例如包含硫代磷酸酯連接的主鏈的寡核苷酸并且包括包含嵌合修飾主鏈的那些可以使用采用氨基磷酸酯或H-膦酸酯化學的自動化技術合成。(F.E.Eckstein, "Oligonucleotides and Analogues-A Practical Approach^IRL Press,Oxford, UK,1991,以及 M.D.Matteucci 和 Μ.H.Caruthers, Tetrahedron Lett.21,719(1980))芳基和烷基膦酸酯連接可以例如如美國專利號4，469，863中所述進行制備；并且例如如美國專利號5，023，243和歐洲專利號092，574中所述的烷基磷酸三酯連接(其中荷電氧部分是烷基化的)可以通過自動化固相合成使用商購可得的試劑進行制備。用于制備其他DNA主鏈修飾和置換的 方法已得到描述。Uhlmann E等人(1990) Chem Rev90:544 ；Goodchild J( 1990)Bioconjugate Cheml: 165 ；Crooke ST等人(1996)Annu Rev PharmacolToxicol36:107-129 ;和 Hunziker J 等人(1995)Mod Synth Methods7:331-417。
[0112]寡核苷酸可以另外或備選地在其糖中包含修飾。例如，核糖單位或e-D-2’-脫氧核糖單位可以替換為經修飾的糖單位，其中經修飾的糖單位例如選自β -D-核糖、a -D-2’ -脫氧核糖、L-2’ -脫氧核糖、2’ _F_2’ -脫氧核糖、阿拉伯糖、2’ -F-阿拉伯糖、2’ -O- (C1-C6)烷基-核糖，優選地2’ -O- (C1-C6)烷基-核糖是2’ -O-甲基核糖、2’-O- (C2-C6)烯基-核糖、2’-[O- (C1-C6)烷基-O- (C1-C6)烷基]-核糖、2’_NH2_2’-脫氧核糖、β -D-木-呋喃糖、α -阿拉伯呋喃糖、2，4-雙脫氧-β -D-赤式-己-吡喃糖和碳環(例如在Froehler J (1992) Am Chem Socll4:8320中描述的)和/或開鏈糖類似物(例如在Vandendriessche等人(1993) Tetrahedron49:7223中描述的)和/或雙環糖類似物(例如在 Tarkov M 等人(1993) Helv Chim Acta76:481 中描述的)。
[0113]寡核苷酸可以包含在其堿基中的修飾。經修飾的堿基包括經修飾的胞嘧啶(例如5-取代胞嘧啶(例如5-甲基-胞 嘧啶、5-氟-胞嘧啶、5-氯-胞嘧啶、5-溴-胞嘧啶、5-碘-胞嘧啶、5-羥基-胞嘧啶、5-羥甲基-胞嘧啶、5- 二氟甲基-胞嘧啶、和未被取代或取代的5-炔基-胞嘧啶)、6_取代胞嘧啶、N4-取代胞嘧啶(例如N4-乙基-胞嘧啶)、5_氮雜-胞嘧啶、2-巰基-胞嘧啶、異胞嘧啶、假-異胞嘧啶、具有稠環系統的胞嘧啶類似物(例如N，N’-丙烯胞嘧啶或吩噁嗪)、和尿嘧啶及其衍生物(例如5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-溴乙烯基-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羥基-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶)、經修飾的鳥嘌呤例如7-脫氮雜鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-取代鳥嘌呤(例如7-脫氮雜-7- (C2-C6)炔基鳥嘌呤)、7-脫氮雜-8-取代鳥嘌呤、次黃嘌呤、N2-取代鳥嘌呤(例如N2-甲基-鳥嘌呤)、5-氨基-3-甲基-3H，6H-噻唑并[4，5-d]嘧啶_2，7-二酮、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、嘌呤、吲哚、腺嘌呤、取代的腺嘌呤(例如N6-甲基-腺嘌呤、8-氧代-腺嘌呤)、8_取代鳥嘌呤(例如8-羥基鳥嘌呤和8-溴鳥嘌呤)、和6-硫代鳥嘌呤。核酸可以包含通用堿基(例如3-硝基批咯、P-喊基、4-甲基-吲哚、5_硝基-Π引哚和K喊基)和/或芳環系統(例如氟苯、二氟苯、苯并咪唑或二氯苯并咪唑、1-甲基-1H-[1，2，4]三唑-3-羧酸酰胺)。可以摻入本發明的寡核苷酸內的特定堿基對是由Yang等人NAR，2006，34 (21):6095-6101報告的dZ和dP非標準核堿基對。dZ嘧啶類似物是6-氨基-5-硝基-3- (I’ - β -D-2’ -脫氧呋喃核糖基)_2(IH)-吡啶酮，并且其沃森-克里克互補體dP嘌呤類似物是2-氨基-8- （-1’-β -D- 1’-脫氧呋喃核糖基)-咪唑并[l，2-a]-l，3，5-三嗪-4 (8H)-酮。
[0114]合成方法:
[0115]本發明考慮了通過退火過程合成核酸結構。在一種方法中，一旦單鏈寡核苷酸已得到鑒定且合成(例如使用商業廠商例如Bioneer)，它們就在單個容器例如但不限于管、孔、小瓶等中組合。使用的寡核苷酸的摩爾量將取決于所需結構中每個寡核苷酸的頻率和所需結構的量。在一些實施方案中，寡核苷酸可以以等摩爾濃度存在。在一些實施方案中，每個寡核苷酸可以以約IOOnM的濃度存在。將寡核苷酸置于溶液中。優選地，溶液是緩沖的，盡管退火反應也可以在不存在緩沖液的情況下發生。溶液可以進一步包含二價陽離子例如但不限于Mg2+。陽離子或鹽濃度可以改變。示例性濃度是約25mM。溶液還可以包含EDTA或其他核酸酶抑制劑，以便阻止寡核苷酸的降解。
[0116]退火反應通過使溶液加熱且隨后允許溶液緩慢冷卻來執行。反應的溫度應足夠高，以使任何不希望有的二級結構例如發夾結構解鏈，并且確保寡核苷酸種類不會不正確地與其他非互補寡核苷酸結合。在一些實施方案中，溫度因此可以最初升高到約100°C、約95°C、約90°C、約85°C、80°C、75°C、70°C、65°C或60°C。溫度可以通過將容器置于熱水浴或加熱塊或能夠溫度控制的裝置例如PCR機器中得到升高。容器可以在該環境中保持數秒或數分鐘。一般地，約1-10分鐘的溫育是足夠的。
[0117]一旦在高溫下的溫育完成，溫度就可以以許多方式下降。溫度可以使用計算機算法以自動化方式下降，所述計算機算法使溫度下降某一量，并且在再次下降溫度前使該溫度維持某一時間段。此類自動化方法可以涉及在每個步驟中使溫度下降一度或在每個步驟時使溫度下降多度。容器隨后因此可以在相同裝置中加熱且冷卻。
[0118]提供了示例性過程。為了實現溫度中從約90°C到約25°C的下降，溫度以一度增量以10分鐘/度的速率(即90°C 10分鐘，89°C 10分鐘等)從90°C變成61°C。溫度隨后以一度增量和以約20分鐘/度的速率(即60°C 20分鐘，59°C 20分鐘等)從60°C變成25°C。關于這個過程的總退火時間是約17小時。依照本發明，在這些條件下，寡核苷酸自裝配成預定的和所需形狀和大小的核酸結構。[0119]備選地，容器可以置于不同環境下，包括例如室溫環境(例如約25°C)。在其中維持延長時間段，以便允許寡核苷酸以預定的方式彼此退火。冷卻期可以持續數小時，包括但不限于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多小時。在一些情況下，冷卻期長于20小時，并且可以是25、30、25、40、50、55、60或更多小時。
[0120]實施例描述了具體退火過程，使用在Tris-EDTA (TE)、25mMMgCl2溶液中的IOOnM寡核苷酸，并且將溶液加熱至約90°C，并且隨后經過約17小時的時期將溶液冷卻至約25°C，如上所述使用在90°C和61°C之間的10分鐘/度下降和在60°C和25°C之間的10分鐘/度下降。
[0121]用于自退火的另外一組條件包括TE/Mg2+緩沖液(20mM Tris、pH7.6，2mM EDTA,
12.5mM MgCl2)和相同的降溫過程。
[0122]寡核苷酸的化學計量學不一定是緊密調節的。
[0123]在退火過程后，反應混合物可以直接使用或它可以進一步分餾，以便進一步分餾核酸結構產物。例如，可以對反應混合物實施凝膠電泳，例如2%非變性瓊脂糖凝膠電泳，以便使目的結構與其他結構或底物在物理上分開。一般地，觀察到單個顯著條帶。條帶可以從凝膠中提取且例如經由離心進一步純化。純化產物隨后可以再次實施凝膠電泳，具有再次預期的單個條帶。純化產物可以經由AFM或TEM成像。此類成像揭示了純化產物的維度、任何修飾(例如鏈霉親和素修飾)的程度和位置，并且可以用于測定得率和純化程度。此類分析已揭示了具有接近預期維度的結構的形成。
[0124]所需產物的得率也可以在退火后進行測定。“裝配得率”可以首先通過非變性凝膠電泳進行估計，其中樣品用SYBR安全染色。得率(被稱為“凝膠得率”)計算為所需產物條帶的熒光強度和整個泳道的熒光強度(在本底校正后)之間的比例。該比例因此將是得率的指示劑。測量的凝膠得率范圍為6-40%。已發現根據本發明此類比例可以是估計過高的，因為在SYBR安全的染色效率中存在明顯的結構和序列依賴性變化。在一些情況下，得率可以是測量的凝膠得率的約60-100%。`
[0125]退火過程的效率還可以通過測量作為AFM視野中的所有可鑒定形狀百分比的“充分形成”結構的份數進行測定。如果結構在其預期輪廓中沒有直徑大于15nm的缺陷且在其內部中沒有直徑大于IOnm的缺陷，則它視為“充分形成的”。根據上述標準，跨越一系列結構已觀察到范圍為約20-85%的“充分形成的”比例或“AFM得率”。在某些情況下，這個比例可能是純化產物內“充分形成的”結構的實際比例的低估數據，由于在一些情況下結構的相對脆性和顯著的純化后損害，所述純化后損害可能在樣品沉積或成像過程中發生。通過將更多共價鍵引入裝配結構內，例如經由4寡核苷酸SST的兩個末端的連接或鄰近4寡核苷酸SST的交聯，此類脆性可以得到減輕。
[0126]對于具有深度的一些結構(例如管或桶)，充分形成的結構的程度可以使用TEM成像進行測定。在這些情況下，TEM得率定義為基于3.5nm/螺旋轉角估計，在與預期全長(例如管或桶長度)5nm偏差內測量的可鑒定結構(例如管或桶)的百分比。
[0127]本發明考慮了用于合成本發明結構的手動或自動方法。自動方法的例子計算機程序(例如MATLAB程序)提供了圖形界面，其展示由其制備結構的畫布(例如在310寡核苷酸庫的情況下，矩形畫布是起點)。鑒定在其上作圖所需結構的畫布和合成該結構所需的像素(或SST)。該程序還可以使用液態處理機器人(Bravo，Agilent)幫助使鏈挑選和混合過程自動化。因此，一旦最終用戶使結構對圖形界面作圖，計算機程序就輸出關于機器人液態處理器的指令，以挑選且混合合適的鏈用于后續退火。鏈混合物隨后在標準一鍋式退火中用于產生用于AFM成像的形狀。在多個測試中，已發現每個機器人批次在大約48小時內產生48個形狀，將每個形狀幾個人工勞力小時有效減少到I機器小時，并且避免潛在的人為錯誤。此類機器人系統用于生成本文描述的44個形狀。
[0128]程序界面特征為三個功能:(I)形狀設計，(2)移液管順序生成和(3)方案輸出。使用該程序，三個步驟涉及設計靶形狀且生成用于該形狀的退火前鏈混合物。首先，該程序展示2D網格(“分子畫布”)的示意圖，并且允許用戶由草圖描繪形狀，或上載圖像且將其轉換為靶形狀。隨后，對于該形狀生成組成成分鏈列表。基于由機器人使用的96孔板中的來源鏈排列，這個鏈列表隨后轉換為移液管順序列表。最后，生成以xml格式的一組指令(運行組)，并且可以由機器人控制軟件(Vfforks ,Agilent)直接裝載且執行。
[0129]復合結構:
[0130]本發明進一步考慮了本文描述的核酸結構自身可以基本上用作單體或構件塊，以便形成更高級別的結構或復合結構。本發明的復合結構由使用間隔物-接頭彼此連接的核酸結構組成。接頭一般對于核酸結構不是整合的，盡管它們可以經由合適的官能團與結構附著。將兩個或更多個核酸結構附著在一起的能力允許制備具有更大大小和復雜性的結構。此類結構和排列的例子顯示于圖9中。
[0131]無限制地，這些復合結構的維度可以范圍為500nm_100微米或1-1000微米。
[0132]應用:
[0133]本發明的核酸結構可以用于多種應用中，包括將獲益于在納米或微米尺度上精確地定位且重要地排列一個或多個部分的能力的應用。
[0134]例如，結構可以用作模板用于排列或模式化無機材料，例如在電子學、等離子體學和量子計算應用中有用的無機材料。可以與核酸結構附著的部分包括金屬顆粒例如金納米顆粒(參考文獻5，35)、量子點(參考文獻6)、碳納米管(參考文獻7)等。以這種方式，由本發明提供的核酸結構充當支架，在其上可以排列其他部分和/或可以伴隨納米精確度和控制合成其他結構。例如，碳納米管可以組構成功能分子電子學系統；金納米顆粒的可調幾何學排列可以用于制備功能分子電子學線路和新型等離子體學線路；磁顆粒的組構的預定的排列可以用于制備納米感應器或存儲裝置；并且量子點的組構和預定的排列可以用于制備新型量子計算機。
[0135]在其他方面，本發明考慮了本發明的核酸結構可以金屬化，以制備用于電子學的部件。DNA管已金屬化成納米線(參考文獻4，15，19)。本發明的核酸結構的受控的金屬化可以尤其用于制備具有受控的直徑且因此具有受控的電子學性質的納米線。進一步地，新型分子電子學部件和線路可以通過由本發明提供的基于支柱的核酸結構的受控的金屬化進行制備。
[0136]核酸結構還可以用作用 于生物學或有機分子的模板。此類模板分子和系統可以例如用于診斷和研究應用中。生物學或有機分子包括但不限于蛋白質和肽例如抗體和抗體片段、酶和酶結構域、受體和受體結構域、生物配體例如激素及其他發信號部分、多糖、細胞、細胞團塊等。不同策略已對于在DNA網格上的模板蛋白質加以證實(參考文獻4，23，36)。蛋白質以可編程納米精確度組構成預定的幾何學模式可以用于例如研究生物學動力蛋白的合作行為(參考文獻37)。某些核酸結構也可以用于細胞或組織培養中。在這些實施方案中，例如，結構可以用生物學部分例如生長因子和細胞外基質組分進行官能化。以這種方式，官能化結構可以在培養中排列，以模擬二維或三維體內環境。作為進一步例子，考慮可以制備更高級別的官能化結構，其顯示出用于任何特定生物學部分的濃度梯度。這些系統隨后可以用于研究關于任何數目的細胞類型的細胞發育、分化和/或運動。在另外其他情況下，本發明的更高級別的結構可以用作支架用于體外或體內細胞生長和分化。
[0137]在這些應用的多個中，本發明進一步考慮了一旦由本發明結構組成的核酸支架停止作為模板，它就可以被保留或它就可以被去除(例如通過消化或降解)。例如，如果目的是產生金顆粒的預定的排列，并且此類顆粒不依賴核酸支架根據需要彼此連接，則支架可以被去除，僅留下金納米顆粒網絡。
[0138]包括下述實施例用于舉例說明的目的并且不預期限制本發明的范圍。
實施例
[0139]實施例1.[0140]材料與方法
[0141]樣品制備。DNA鏈由 Integrated DNA Technology, Inc.或 Bioneer Corporation合成。為了裝配結構，在補充有12.5或25mM MgCl2的0.5XTE緩沖液(5mM Tris, ρΗ7.9，ImM EDTA)中，將DNA鏈混合至對于大多數結構每個鏈種類IOOnM的大致等摩爾終濃度(除了以200nM制備的基于24HX 28T矩形的不同形狀外)。濃度基于制造商規格單，并且不執行另外的內部校正。因此，關于鏈的化學計量學不受緊密控制。通過使用不同冷卻程序經過17-58小時的時期從90°C冷卻到25°C，混合物隨后在PCR熱循環儀中退火。隨后將退火的樣品應用于在冰水浴中的1.5或2百分比的瓊脂糖凝膠電泳(在補充有IOmM MgCl2的0.5XTBE緩沖液中制備且用SYBR安全預染色的凝膠)。隨后，切割靶凝膠條帶且置于Freeze，N Squeeze柱(Bio-Rad Laboratories, Inc.)內。通過在柱中的微管研棒將凝膠小片擠壓成精細小片，并且隨后對柱直接實施以438g共3分鐘的離心。通過測量在260nm處的紫外吸收，收集離心通過柱的樣品用于濃度估計。此類估計將用于在AFM或TEM成像前估計稀釋因子。`
[0142]鏈霉親和素標記。鏈霉親和素標記用兩種不同方法完成。I)標記24HX28T矩形的上和下行或內部位置。24HX28T矩形的上和下行(或內部位置)的每個塊修飾為具有3’17nt手柄(TT作為間隔物和GGAAGGGATGGAGGA，SEQ ID NO:363與3’生物素修飾的鏈互補，所述3’生物素修飾的鏈的序列為TCCTCCATCCCTTCC-生物素，SEQ ID N0.364)。上和下行(或內部位置)的特別塊和矩形網格的組分塊的剩余部分與1-2X濃度的30生物素修飾的鏈混合(當特別和共同組分塊的濃度為IOOnM并且存在14個不同特別塊種類時，3’生物素修飾的鏈的IX濃度為100X14=1400nM)，所述3’生物素修飾的鏈與在TE緩沖液(25mMMgCl2)中的特別塊的手柄序列互補。它們隨后經過17小時退火并且在瓊脂糖凝膠電泳后純化。隨后對純化的樣品實施AFM成像。在第一輪成像后，在再成像前，將鏈霉親和素(在0.5XTE緩沖液(IOmM MgCl2)中的I μ L10mg/mL)加入成像樣品(~40 μ L)共溫育2分鐘。2)標記管結構的聚-T末端。在管純化后，將3’生物素修飾的聚A鏈(5-10Χ至聚T配對物)與樣品在室溫混合過夜。隨后對樣品實施AFM成像。在第一輪成像后，在再成像前，將鏈霉親和素(在0.5XTE緩沖液(IOmM MgCl2)中的I μ L10mg/mL)加入在云母上的成像樣品共溫育2分鐘。
[0143]用于樣品制備的機器人自動化。設計MATLAB程序以幫助復雜形狀設計和通過液體處理機器人(Bravo, Agilent)的自動化鏈混合。對于每個形狀，挑選5 μ L水溶液中的10 μ M每個單鏈塊，并且混合成小于2mL的終體積(確切體積由用于靶形狀的組成成分鏈數目決定)，并且隨后真空蒸發至200 μ L的250ηΜ溶液。這個混合物隨后補充50 μ L62.5mMMg2+緩沖液，以達到準備用于退火的250 μ L最終混合物。這個退火前溶液具有下述終濃度:200nM DNA鏈/SST種類和12.5mM Mg2+。每次運行容納48個形狀并且花費約兩天結束。
[0144]AFM 成像。AFM 圖像使用具有 Digital Instruments Nanoscope V 控制器(Vecco)的SPM Multimode獲得。將伴隨純化的退火樣品的5 μ L小滴(2~5ηΜ)隨后為0.5ΧΤΕ(IOmM MgCl2)的40μ L小滴應用于新鮮切割的云母表面上，并且靜置約2分鐘。有時，執行樣品的另外稀釋以達到所需樣品密度。在少數情況下，加入補充的IOmM NiCl2，以增加DNA-云母結合的強度。樣品使用液態輕敲模式進行成像。使用的AFM尖端很短，并且SNL-1O氮化娃懸臂芯片(Vecco Probes)中的薄懸臂。
[0145]TEM成像。對于成像，將3.5 μ L樣品(I~5ηΜ)吸收到輝光放電碳涂布TEM格柵上4分鐘，且隨后使用含有25mM NaOH的2%甲酸雙氧鈾水溶液染色I分鐘。成像使用在80kV 下操作 JEOL JEM-1400 執行。
[0146]用SYBR安全染色的得率定量。得率首先通過非變性凝膠電泳進行估計。采用靶條帶的熒光強度和整個泳道的熒光強度之間的比例以呈現結構形成的總得率。對于24HX28T矩形，作為獨立的備選定量程序，比較靶條帶的強度與標準樣品(Ikb梯混合物的1500bpDNA)。基于標準樣品由強度-質量曲線推導靶條帶的質量值，并且用于計算所需結構的得率。
[0147]測量和統計學。使用由Veeco提供的Nanoscope Analysis (版本1.20)獲得AFM測量。對于距離測量任務(不同大小的矩形的長度和寬度)應用橫截面函數。選擇“充分形成的”結構用于測量。使用NIH的ImageJ (版本1.43u)分析管的TEM圖像。應用“直線”函數以便測量管的寬度。應用“分割線”函數以突出顯示且測量管的伸直長度。收集三十個樣品點用于每個距離測量(例如24HX28T矩形的寬度)，并且統計學(例如平均值、標準差)基于30個數據點。
[0148]實施例2.[0149]使用本文描述的方法，我們已使用多個單鏈寡核苷酸，以構建與由現有技術DNA折紙法制備的那些一樣大的DNA結構。更具體而言，我們已自裝配362個不同單鏈DNA，以構建大小為約60nm乘約IOOnm的矩形網格,及其衍生結構。
[0150]合成(例如Bioneer)寡核苷酸，并且在具有MgCl2 (濃度25mM)的TE緩沖溶液中以所需濃度(例如IOOnM)混合在一起。對混合物實施涉及緩慢冷卻的退火程序(例如如本文描述的，經過17小時的過程，在約90°C開始且在約25°C結束)。這個退火程序允許寡核苷酸自裝配，從而形成核酸結構。
[0151]一旦退火完成，就在結構純化前和后分析反應混合物。使用瓊脂糖凝膠電泳、AFM和TEM表征結構。
[0152]已使用這種方法制備的結構包括圖3B-F、5B_D和IOA中所示的那些(使用圖中所示的寡核苷酸，參考下表1)。圖4和5中所示的結構已使用這種方法進行制備。
[0153]實施例3.[0154]我們隨后還嘗試連接各為管形狀的兩個核酸結構，以形成更大的更高級別的結構。[0155]首先，管形結構各自通過如本文描述的混合且退火的寡核苷酸進行制備。使用經過約17小時的過程從約90°C到約25°C的溫度轉變，將寡核苷酸組合且退火。隨后將所得的核酸結構混合在一起，并且使用經過約7小時的過程從約45°C到約25°C的溫度轉變，進一步退火。與僅僅將結構在室溫維持相同時間段相比較，這個過程提供了改善得率。此外，應當注意結構可以充分退火，與它們在第一個退火步驟后是否純化無關。
[0156]
【權利要求】
1.一種核酸結構,其包含 多個退火的寡核苷酸，每個寡核苷酸包含排列成至少兩個平行雙螺旋的至少兩個結構域，其中至少一個雙螺旋包含獨特結構域。
2.權利要求1或2的核酸結構，其中至少一個雙螺旋包含2個或更多個獨特結構域。
3.權利要求1或2的核酸結構，其中至少50%的所述雙螺旋包含一個或多個獨特結構域。
4.前述權利要求中任一項的核酸結構，其中所述結構包含至少5個、至少10個或至少20個平行雙螺旋。
5.前述權利要求中任一項的核酸結構，其中第一個子集的寡核苷酸包含2個結構域，并且第二個子集的寡核苷酸包含4個結構域。
6.前述權利要求中任一項的核酸結構，其中所述寡核苷酸長度是21-104個核苷酸。
7.前述權利要求中任一項的核酸結構，其中所述寡核苷酸是DNA寡核苷酸。
8.前述權利要求中任一項的核酸結構，其中所述寡核苷酸是L-DNA寡核苷酸。
9.一種核酸結構,其包含 多個退火的寡核苷酸，每個寡核苷酸包含排列成至少兩個平行雙螺旋的至少兩個結構域，其中至少一個雙螺旋是獨特的。
10.權利要求9的核酸結構，其中所述結構包含2個或更多個獨特雙螺旋。
11.權利要求9或10的核酸結構，其中至少50%的所述雙螺旋是獨特的。
12.權利要求9-11中任一項的核酸結構，其中至少50%的所述雙螺旋包含一個或多個獨特結構域。
13.權利要求9-12中任一項的核酸結構，其中所述結構包含至少5個、至少10個或至少20個平行雙螺旋。
14.權利要求9-13中任一項的核酸結構，其中第一個子集的寡核苷酸包含2個結構域，并且第二個子集的寡核苷酸包含4個結構域。
15.權利要求9-14中任一項的核酸結構，其中所述寡核苷酸長度是21-104個核苷酸。
16.權利要求9-15中任一項的核酸結構，其中所述寡核苷酸是DNA寡核苷酸。
17.權利要求9-15中任一項的核酸結構,其中所述寡核苷酸是L-DNA寡核苷酸。
18.一種核酸結構，其包含 多個退火的寡核苷酸，每個寡核苷酸包含排列成至少兩個平行雙螺旋的至少兩個結構域，其中所述結構中的至少一個寡核苷酸是獨特的。
19.權利要求18的核酸結構，其中所述結構中的至少50%寡核苷酸是獨特的。
20.權利要求18的核酸結構，其中所述結構中的所有寡核苷酸都是獨特的。
21.權利要求18-20中任一項的核酸結構，其中所述結構包含至少5個、至少10個或至少20個平行雙螺旋。
22.權利要求18-21中任一項的核酸結構，其中第一個子集的寡核苷酸包含2個結構域，并且第二個子集的寡核苷酸包含4個結構域。
23.權利要求18-22中任一項的核酸結構，其中所述寡核苷酸長度是21-104個核苷酸。
24.權利要求18-23中任一項的核酸結構，其中所述寡核苷酸是DNA寡核苷酸。
25.權利要求18-23中任一項的核酸結構，其中所述寡核苷酸是L-DNA寡核苷酸。
26.—種包含前述權利要求中任一項的多個核酸結構的組合物，其中所述多個是至少50%同質的。
27.—種方法,其包括 在單個容器中使多個單鏈寡核苷酸退火以形成核酸結構，其中所述單鏈寡核苷酸各自包含至少兩個結構域，并且其中至少一個單鏈寡核苷酸以是所述多個中的其他寡核苷酸的摩爾濃度低10倍的摩爾濃度存在。
28.—種方法,其包括 在單個容器中使多個單鏈寡核苷酸退火以形成核酸結構，其中所述單鏈寡核苷酸各自包含至少兩個結構域，并且其中至少一個單鏈寡核苷酸以是所述多個中的其他寡核苷酸的摩爾濃度低100倍的摩爾濃度存在。
29.權利要求26-28中任一項的方法，其中退火通過經過一段時間的溫度轉變而發生。
30.權利要求29的方法，其中所述溫度轉變是從高溫到約室溫的溫度變化。
31.權利要求29的方法，其中所述溫度轉變是從約90°C到約室溫的溫度變化。
32.權利要求26-31中任一項的方法，其中所述退火經過約12-24小時的時期發生。
33.權利要求26-32中任一項的方法，其中第一個子集的寡核苷酸包含2個結構域，并且第二個子集的寡核苷酸包含4個結構域。
34.權利要求26-33中任一項的方法，其中所述寡核苷酸長度是21-104個核苷酸。
35.權利要求26-34中任一項的方法，其中所述寡核苷酸是DNA寡核苷酸。
36.權利要求26-34中任一項的方法，其中所述寡核苷酸是L-DNA寡核苷酸。
37.一種核酸結構,其通過權利要求26-36中任一項的方法制備。
38.一種復合核酸結構，其包含 通過間隔物-接頭彼此綴合的，權利要求1-25中任一項的至少兩個核酸結構。
39.權利要求38的復合核酸結構，其中所述間隔物-接頭包含核酸元件和非核酸元件。
40.權利要求38或39的復合核酸結構，其中所述間隔物-接頭包含碳鏈。
41.權利要求38-40中任一項的復合核酸結構，其中所述間隔物-接頭是同雙功能間隔物_接頭。
【文檔編號】C07H21/00GK103889998SQ201280047057
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年8月2日 優先權日:2011年8月5日
【發明者】尹鵬, 魏迪明 申請人:哈佛學院院長等