用于產生纖維素降解酶的轉錄因子的制作方法
【專利摘要】本文提供用于增加由真菌宿主細胞產生一種或多種纖維素酶的方法和組合物。當前的公開是基于以下驚人的發現，即絲狀真菌細胞中轉錄調節因子clr-2的異位表達能夠在非誘導或饑餓條件下誘導纖維素酶基因的表達，引起細胞增加的纖維素酶分泌。有利地，在缺乏纖維素或纖維二糖的存在下培養的絲狀真菌細胞中，轉錄因子clr-2的異位表達引起增加的纖維素酶分泌。當前的公開尤其涉及降解含有纖維素的材料的方法、增加由真菌細胞生產一種或多種纖維素酶的方法、以及通過使經預處理的生物質材料與含有至少一個編碼clr-2或相關轉錄因子的重組核酸的真菌宿主細胞接觸來降低該經預處理生物質材料的粘度的方法。
【專利說明】用于產生纖維素降解酶的轉錄因子
[0001]相關申請的交叉參考
[0002]本申請要求于2011年7月21日提交的美國臨時申請第61/510，466號的權益，在此將其全文通過引用的方式并入。
[0003]作為ASCII文本文件的序列表的提交
[0004]在此通過引用的方式將以下以ASCII文本文件提交的內容全部并入:計算機可讀形式(CRF)的序列表(文件名:677792002140SeqList.txt，數據記錄于:2012年7月23日，大小:978KB)。
發明領域
[0005]本公開內容涉及纖維素的降解。具體地，本公開內容涉及與細胞對纖維素的應答有關的多肽，以及相關的核苷酸和組合物。本公開內容還涉及與細胞對纖維素的應答有關的多肽、核苷酸及其組合物的方法和用途。
【背景技術】
[0006]長久以來已經對源自生物質的液體燃料進行研究，以作為化石燃料的替代品。盡管用當前的生物燃料轉化過程實現的凈能量產出與溫室氣體降低尚存爭議，作為可再生的碳中性液體燃料的來源，由纖維素原料制成的生物燃料擁有巨大的潛力。目前的轉化過程嚴重依賴于纖維素到葡萄糖的酶促轉化，以發酵成乙醇或其他燃料。由絲狀真菌產生這些酶，或從另一方購買，均呈現為整個轉化過程中的主要成本。降低這一成本的努力已經成為當前對生物燃料產生的公眾和私人研究的主要焦點。
[0007]迄今，纖維素產生方面最大的進展已經由絲狀真菌的迭代隨機誘變而實現。盡管該策略已經大大降低了酶產生的成本，但產生的菌株具有數百個突變。不清楚哪些突變引起所需的收率增加，哪些突變與纖維素酶產生無關或損害纖維素酶的產生。沒有對于特定突變如何提高纖維素酶的收率的根本性理解，將難以進一步設計工程菌株，或將增加的生產率轉移至其他目標菌株。需要對于與絲狀真菌產生纖維素酶有關的生物過程的系統理解，以及需要相關的組合物和方法。
【發明內容】
[0008]為滿足上述需求，本公開內容提供一種新的方法和組合物，來增加由真菌宿主細胞產生一種或多種纖維素酶。而且，本公開內容至少部分地基于以下出人意料的發現，即絲狀真菌細胞中轉錄調節因子clr-2的異位表達(mis-expression)能夠誘導纖維素酶基因在非誘導性或饑餓條件下的表達，引起細胞的纖維素酶的分泌增加。有利地，clr-2在不存在纖維素或纖維二糖的條件下培養的絲狀真菌細胞中的異位表達引起纖維素酶分泌的增加。
[0009]因此，本公開內容的某些方面涉及一種使含有纖維素的材料降解的方法，通過:a)使含有纖維素的材料與包含至少一個編碼轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞接觸，其中，轉錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域和至少一個選自SEQ ID NO: 184、185、186和187的多肽序列；以及b)將真菌宿主細胞和含有纖維素的材料在足以使真菌宿主細胞降解含有纖維素的材料的條件下孵育。在某些實施方式中，轉錄因子蛋白含有至少一個選自SEQ ID N0:184、185、186和187的額外多肽序列。在某些實施方式中，轉錄因子蛋白含有至少兩個選自SEQ ID NO: 184、185、186和187的額外多肽序列。在某些實施方式中，轉錄因子蛋白含有至少三個選自SEQ ID N0:184、185、186和187的額外多肽序列。在某些實施方式中，轉錄因子蛋白含有SEQ ID N0:184、185、186和 187。
[0010]本公開內容的其他方面涉及一種使含有纖維素的材料降解的方法，通過:a)使含有纖維素的材料與含有至少一個編碼轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞接觸，其中轉錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域和SEQ IDNO: 184 ;以及b)將真菌宿主細胞和含有纖維素的材料在足以使真菌宿主細胞降解含有纖維素的材料的條件下孵育。在某些實施方式中，轉錄因子蛋白還含有SEQ ID N0:185。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，轉錄因子還含有SEQ ID NO: 186。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，轉錄因子還含有SEQ ID NO: 185和186。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，轉錄因子還含有SEQ ID NO: 187。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，轉錄因子還含有SEQ ID NO: 185和187。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，轉錄因子還含有SEQ ID NO: 186和187。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，轉錄因子還含有SEQ ID N0:185、186和187。
[0011]本公開內容的其他方面涉及一種使含有纖維素的材料降解的方法，通過:a)使含有纖維素的材料與含有至少一個編碼轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞接觸，其中轉錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域和SEQ IDNO: 184和185 ;以及b)將真菌宿主細胞和含有纖維素的材料在足以使真菌宿主細胞降解含有纖維素的材料的條件下孵育。在某些實施方式中，轉錄因子蛋白還含有SEQ ID N0:186。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，轉錄因子還含有SEQ ID NO: 187。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，轉錄因子還含有SEQ ID N0:186和187。
[0012] 本公開內容的其他方面涉及一種使含有纖維素的材料降解的方法，通過:a)使含有纖維素的材料與含有至少一個編碼轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞接觸，其中轉錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域和SEQID NO: 184、185和186 ;以及b)將真菌宿主細胞和含有纖維素的材料在足以使真菌宿主細胞降解含有纖維素的材料的條件下孵育。在某些實施方式中，轉錄因子蛋白還含有SEQ IDNO:187。
[0013]本公開內容的其他方面涉及一種使含有纖維素的材料降解的方法，通過:a)使含有纖維素的材料與含有至少一個編碼轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞接觸，其中轉錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域和SEQ IDNO: 184、185、186和187 ;以及b)將真菌宿主細胞和含有纖維素的材料在足以使真菌宿主細胞降解含有纖維素的材料的條件下孵育。
[0014]在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，真菌宿主細胞在足以使真菌宿主細胞表達轉錄因子蛋白的條件下孵育。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，真菌宿主細胞比對應的缺少至少一個重組核酸的真菌宿主細胞產生更大量的一種或多種纖維素酶。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，含有纖維素的材料包括生物質。在某些實施方式中，在與真菌宿主細胞接觸之前對生物質進行預處理。在某些實施方式中，預處理包括一種或多種選自以下的處理:氨纖維膨脹(AFEX)、蒸汽爆破(steamexplosion)、高溫處理、高壓處理、堿性水溶液處理、酸性溶液處理、有機溶劑處理、離子液體(IL)處理、電解水處理和磷酸處理。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，生物質包括植物材料。在某些實施方式中，植物材料選自芒草(Miscanthus)、柳枝稷、大米草、黑麥草、草蘆、象草、蘆葦、麥秸、大麥桿、油菜秸桿、燕麥秸、玉米秸桿、大豆秸桿、燕麥殼、高粱、稻殼、甘蔗渣、玉米纖維、含有可溶物的干酒糟(DDGS )、須芒草、玉米穗軸、松木、樺木、柳木、山楊木、白楊木和能源甘鹿。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，真菌宿主細胞還包括一個或多個對參與至少一種生物燃料的產生的生物化學通路的多肽進行編碼的重組核酸。在某些實施方式中，方法還包括將真菌宿主細胞與所降解的含有纖維素的材料在足以使得真菌宿主細胞將含有纖維素的材料轉化成至少一種生物燃料的條件下孵育。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，生物燃料選自乙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-戊醇和辛醇。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，將所降解的含有纖維素的材料與發酵微生物在足以由所降解的含有纖維素的材料產生至少一種發酵產物的條件下培養。 [0015]本公開內容的其他方面涉及一種增加由真菌細胞產生一種或多種纖維素酶的方法，通過:(a)提供包含至少一個編碼轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞，其中轉錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域和至少一個選自SEQ ID NO: 184、185、186和187的多肽序列；以及(b)將宿主細胞在足以支持至少一種重組核酸的表達的條件下培養，其中真菌宿主細胞比對應的缺少該至少一個重組核酸的宿主細胞產生更大量的一種或多種纖維素酶。在某些實施方式中，轉錄因子蛋白含有至少一個選自SEQ ID N0:184、185、186和187的額外多肽序列。在某些實施方式中，轉錄因子蛋白含有至少兩個選自SEQ ID N0s:184、185、186和187的額外多肽序列。在某些實施方式中，轉錄因子蛋白含有至少三個選自SEQ ID N0s:184、185、186和187的額外多肽序列。在某些實施方式中，轉錄因子蛋白含有SEQ ID N0s:184、185、186和187。在某些實施方式中，真菌宿主細胞在不存在纖維素的條件下培養。
[0016]本公開內容的其他方面涉及一種增加由真菌細胞產生一種或多種纖維素酶的方法，通過:(a)提供包含至少一個編碼轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞，其中轉錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域和SEQ IDN0:184;以及(b)將宿主細胞在足以支持該至少一個重組核酸的表達的條件下培養，其中真菌宿主細胞比對應的缺少該至少一個重組核酸的宿主細胞產生更大量的一種或多種纖維素酶。在某些實施方式中，轉錄因子蛋白還含有SEQ ID NO: 185。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，轉錄因子還含有SEQ ID NO: 186。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，轉錄因子還含有SEQ ID NO: 185和186。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，轉錄因子還含有SEQ ID NO: 187。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，轉錄因子還含有SEQ ID NO: 185和187。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，轉錄因子還含有SEQ ID NO: 186和187。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，轉錄因子還含有SEQ ID NO: 185、186和187。在某些實施方式中，真菌宿主細胞在不存在纖維素的條件下培養。
[0017]本公開內容的其他方面涉及一種增加由真菌細胞產生一種或多種纖維素酶的方法，通過:(a)提供包含至少一個編碼轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞，其中轉錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域以及SEQ IDNO: 184和185 ;以及(b)將宿主細胞在足以支持該至少一個重組核酸的表達的條件下培養，其中真菌宿主細胞比對應的缺少該至少一個重組核酸的宿主細胞產生更大量的一種或多種纖維素酶。在某些實施方式中，轉錄因子蛋白還含有SEQ ID NO: 186。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，轉錄因子還含有SEQ ID NO: 187。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，轉錄因子還含有SEQ ID N0:186和187。在某些實施方式中，真菌宿主細胞在不存在纖維素的條件下培養。
[0018]本公開內容的其他方面涉及一種增加由真菌細胞產生一種或多種纖維素酶的方法，通過:(a)提供包含至少一個編碼轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞，其中轉錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域以及SEQ IDNO: 184、185和186 ;以及(b)將宿主細胞在足以支持該至少一個重組核酸的表達的條件下培養，其中真菌宿主細胞比對應的缺少該至少一種重組核酸的宿主細胞產生更大量的一種或多種纖維素酶。在某些實施方式中，轉錄因子蛋白還含有SEQ ID N0:187。在某些實施方式中，真菌宿主細胞在不存在纖維素的條件下培養。
[0019]本公開內容的其他方面涉及一種增加由真菌細胞產生一種或多種纖維素酶的方法，通過:(a)提供包含至少一個編碼轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞，其中轉錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域以及SEQ IDNO: 184、185、186和187 ;以及(b)將宿主細胞在足以支持該至少一種重組核酸的表達的條件下培養，其中真菌宿主細胞比對應的缺少該至少一種重組核酸的宿主細胞產生更大量的一種或多種纖維素酶。在某些實施方式中，真菌宿主細胞在不存在纖維素的條件下培養。
[0020]在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，至少一個重組核酸編碼clr-2轉錄因子蛋白。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，至少一個重組核酸是SEQ ID N0:5或SEQ ID NO: 165。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，至少一個重組核酸與選自ccg-1、gpd-1、vvd、qa_2、pdA、trpC、tef-Ι和xlr-Ι的啟動子可操作地連接。
[0021]在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，真菌宿主細胞還含有至少一個編碼額外轉錄因子蛋白的額外重組核酸，其中額外轉錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域和至少一個選自SEQ ID NO: 188、189、190、191和192的多肽序列。在某些實施方式中，額外轉錄因子蛋白含有至少一個選自SEQ IDN0:188、189、190、191和192的額外多肽序列。在某些實施方式中，額外轉錄因子蛋白含有至少兩個選自SEQ ID NO: 188、189、190、191和192的額外多肽序列。在某些實施方式中，額外轉錄因子蛋白含有至少三個選自SEQ ID N0:188、189、190、191和192的額外多肽序列。在某些實施方式中，額外轉錄因子蛋白含有至少四個選自SEQ ID N0:188、189、190、191和192的額外多肽序列。在某些實施方式中，額外轉錄因子蛋白含有SEQ ID N0:188、189、190、191和192。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，真菌宿主細胞還含有至少一個編碼額外轉錄因子蛋白的額外重組核酸，其中額外轉錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域和SEQ ID N0:188。在某些實施方式中，額外轉錄因子蛋白還含有SEQ ID NO: 189。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，額外轉錄因子還含有SEQ ID NO: 190。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，額外轉錄因子還含有SEQ ID NO:189和190。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，額外轉錄因子還含有SEQ ID NO:191。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，額外轉錄因子還含有SEQ ID NO:189和191。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，額外轉錄因子還含有SEQ ID N0:190和191。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，額外轉錄因子還含有SEQ ID NO: 192。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，額外轉錄因子還含有SEQ ID NO: 189和192。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，額外轉錄因子還含有SEQ ID NO: 190和192。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，額外轉錄因子還含有SEQ ID NO:191和192。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，額外轉錄因子還含有SEQ ID NO: 189.190.191和192。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，至少一個額外重組核酸編碼clr-1轉錄因子蛋白。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，至少一個編碼額外轉錄因子的額外重組核酸是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:119或SEQID NO:183。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，至少一個額外重組核酸與選自ccg-l、gpd-l、vvd、qa_2、pdA、trpC、tef-1和xlr_l的啟動子可操作地連接。
[0022]在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，真菌宿主細胞還含有至少一個編碼半纖維素酶的重組核酸。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，真菌宿主細胞選自粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)、金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)、玉蜀泰赤 霉(Gibberella zeae)、鞭毛藻叢赤殼菌(Nectria haematococca)、稻痕病菌(Magnaporthe oryzae)、四抱脈抱菌(Neurospora tetrasperma)、大抱類殼菌(Sordaria macrospora)、球毛殼菌(Chaetomium globosum)、四抱柄抱殼(Podosporaanserina)、黃萎輪枝抱(Verticillium albo-atrum)、禾生小叢殼(Glomerellagraminicola)、Grosmannia clavigera、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、富氏葡萄抱盤菌(Botryotinia fuckeliana)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、構巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、產黃青霉(Penicillium chrysogenum)、十字花科小球腔菌(Leptosphaeria maculans)、穎枯殼針抱(Phaeosphaeria nodorum)、偃麥草核腔菌(Pyrenophora tritic1-repentis)、圓核腔菌(Pyrenophora teres)、馬爾尼菲青霉(Penicillium marneffei )、柄籃狀菌(Talaromyces stipitatus)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Uncinocarpus reesi1、厭酷球抱子菌(Coccidioides immitus)、普賽德斯球抱子菌(Coccidioides posadasii)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、嗜熱側抱霉(Sporotrichum thermophile)(嗜熱毀絲菌(Myceliophthora thermophila))、Thielavia terrestris-thermophilic、角軍纖維素枝丁頁抱(Acremonium cellulolyticus)、解脂耶羅維亞酵母(Yarrowia IipoIytiCa)、多形漢遜酵母(Hansenula poIymorpha)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)、費希新薩托菌(Neosartorya fischeri)、疏棉狀嗜熱絲抱菌(Thermomyces Ianuginosus)(短小腐質霉(Humicola brevis)、短芽孢腐質霉(Humicola brevispora)、灰腐質霉(Humicola grisea)、柔毛腐質霉(Humicola lanuginosa)、Monotospora lanuginosa、Sepedonium lanuginosum)、嗜熱踩節菌(Talaromyces thermophilus) (Talaromyces duponti1、杜邦青霉(Penicilliumdupontii))和勒克瑙金抱菌(Chrysosporium IucknowenseX
[0023]本公開內容的其他方面涉及一種降低經預處理的生物質材料的粘度的方法，通過使經預處理的生物質材料與含有至少一個編碼轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞接觸，以產生粘度降低的經預處理的生物質材料，其中轉錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域和至少一個選自SEQ ID NO: 184、185、186和187的多肽序列。在某些實施方式中，轉錄因子蛋白含有至少一個選自SEQ ID NOs: 184,185、186和187的額外多肽序列。在某些實施方式中，轉錄因子蛋白含有至少兩個選自SEQID N0:184、185、186和187的額外多肽序列。在某些實施方式中，轉錄因子蛋白含有至少三個選自SEQ ID N0:184、185、186和187的額外多肽序列。在某些實施方式中，轉錄因子蛋白含有SEQ ID N0:184、185、186和187。在某些實施方式中，至少一個額外重組核酸編碼clr-2轉錄因子蛋白。在某些實施方式中，至少一個重組核酸是SEQ ID N0:5或SEQ IDNO: 165。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，真菌宿主細胞還含有至少一個編碼額外轉錄因子的額外重組核酸，其中額外轉錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域和至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個或至少五個選自SEQID N0:188、189、190、191和192的多肽序列。在某些實施方式中，至少一個額外重組核酸編碼clr-1轉錄因子蛋白。在某些實施方式中，至少一個編碼額外轉錄因子蛋白的額外重組核酸是 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 119 或 SEQ ID NO: 183。[0024]本公開內容的其他方面涉及一種降低經預處理的生物質材料的粘度的方法，通過使預處理的生物質材料與含有至少一個編碼轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞接觸，以產生粘度降低的經預處理的生物質材料，其中轉錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域和SEQ ID N0:184。在某些實施方式中，轉錄因子蛋白還含有SEQ ID NO: 185。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，轉錄因子還含有SEQ ID NO: 186。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，轉錄因子還含有SEQ ID N0:185和186。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，轉錄因子還含有SEQ ID NO: 187。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，轉錄因子還含有SEQ ID NO: 185和187。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，轉錄因子還含有SEQ ID NO: 186和187。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，轉錄因子還含有SEQ ID N0:185、186和187。在某些實施方式中，至少一個額外重組核酸編碼clr-2轉錄因子蛋白。在某些實施方式中，至少一個重組核酸是SEQ ID N0:5或SEQID NO: 165。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，真菌宿主細胞還含有至少一個編碼額外轉錄因子的額外重組核酸，其中額外轉錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域和至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個或至少五個選自SEQ ID N0:188、189、190、191和192的多肽序列。在某些實施方式中，至少一個額外重組核酸編碼clr-1轉錄因子蛋白。在某些實施方式中，至少一個編碼額外轉錄因子蛋白的額外重組核酸是SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 119或SEQ ID NO: 183。[0025]本公開內容的其他方面涉及一種降低經預處理的生物質材料的粘度的方法，通過使預處理的生物質材料與含有至少一個編碼轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞接觸，以產生粘度降低的經預處理的生物質材料，其中轉錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸
(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域以及SEQ ID NO: 184和185。在某些實施方式中，轉錄因子蛋白還含有SEQ ID NO: 186。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，轉錄因子還含有SEQ ID NO: 187。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，轉錄因子還含有SEQ ID N0:186和187。在某些實施方式中，至少一個額外重組核酸編碼clr-2轉錄因子蛋白。在某些實施方式中，至少一個重組核酸是SEQID NO: 5或SEQ IDNO: 165。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，真菌宿主細胞還含有至少一個編碼額外轉錄因子的額外重組核酸，其中額外轉錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域和至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個或至少五個選自SEQ ID N0:188、189、190、191和192的多肽序列。在某些實施方式中，至少一個額外重組核酸編碼clr-1轉錄因子蛋白。在某些實施方式中，至少一個編碼額外轉錄因子蛋白的額外重組核酸是 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 119 或 SEQ ID NO: 183。
[0026]本公開內容的其他方面涉及一種降低經預處理的生物質材料的粘度的方法，通過使預處理的生物質材料與含有至少一個編碼轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞接觸，以產生粘度降低的經預處理的生物質材料，其中轉錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸
(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域和SEQ ID NO: 184、185和186。在某些實施方式中，轉錄因子蛋白還含有SEQ ID NO: 187。在某些實施方式中，至少一個額外重組核酸編碼clr-2轉錄因子蛋白。在某些實施方式中，至少一個重組核酸是SEQ ID N0:5或SEQ IDNO: 165。在某些可以與任意前述實施方式結合的實施方式中，真菌宿主細胞還含有至少一個編碼額外轉錄因子的額外重組核酸，其中額外轉錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域和至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個或至少五個選自SEQ ID N0:188、189、190、191和192的多肽序列。在某些實施方式中，至少一個額外重組核酸編碼clr-1轉錄因子蛋白。在某些實施方式中，至少一個編碼額外轉錄因子蛋白的額外重組核酸是 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 119 或 SEQ ID NO: 183。
[0027]在一些實施方式中，本文提供含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞。
[0028]本文還提供含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞，其中重組核酸是SEQ ID NO:5或SEQ ID NO: 165。
[0029]本文還提供含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞，其中細胞還含有至少一個編碼clr-1轉錄因子蛋白的額外重組核酸。
[0030]本文還提供含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸和至少一個編碼clr-1轉錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細胞，其中編碼clr-1蛋白的重組核酸是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:119 或 SEQ ID NO:183。 [0031]本文還提供含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸和至少一個編碼clr-1轉錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細胞，其中編碼clr-2蛋白的重組核酸是SEQ ID N0:5 或 SEQ ID NO: 165，并且編碼 clr-Ι 蛋白的重組核酸是 SEQ ID NO:2, SEQ IDNO:119 或 SEQ ID NO:183。[0032]本文還提供含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞，其中細胞還含有一個或多個編碼半纖維素酶的額外重組核酸。
[0033]本文還提供含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸和至少一個編碼clr-Ι轉錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細胞，其中細胞還含有一個或多個編碼半纖維素酶的重組核酸。
[0034]本文還提供含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞，其中宿主細胞選自粗糙脈孢菌、金龜子綠僵菌、玉蜀黍赤霉、鞭毛藻叢赤殼菌、稻瘟病菌、四孢脈孢菌、大孢糞殼菌、球毛殼菌、四孢柄孢殼、黃萎輪枝孢、禾生小叢殼、Grosmanniaclavigera、核盤菌、富氏葡萄孢盤菌、米曲霉、構巢曲霉、黑曲霉、煙曲霉、產黃青霉、十字花科小球腔菌、穎枯殼針孢、偃麥草核腔菌、圓核腔菌、馬爾尼菲青霉、柄籃狀菌、里氏木霉、Uncinocarpus reesi1、厭酷球孢子菌、普賽德斯球抱子菌、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、嗜熱側孢霉(嗜熱毀絲菌)、Thielavia terrestris-thermophilic、解纖維素枝頂孢、解脂耶羅維亞酵母、多形漢遜酵母、乳酸克魯維酵母、巴斯德畢赤酵母、禾生球腔菌、費希新薩托菌、疏棉狀嗜熱絲孢菌(短小腐質霉、短芽孢腐質霉、灰腐質霉、柔毛腐質霉、Monotosporalanuginosa、Sepedonium lanuginosum)、嗜熱踩節菌(Talaromyces duponti1、杜邦青霉)或勒克瑙金孢菌。
[0035]本文還提供含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸和至少一個編碼clr-Ι轉錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細胞，其中宿主細胞選自粗糙脈孢菌、金龜子綠僵菌、玉蜀黍赤霉、鞭毛藻叢赤殼菌、稻瘟病菌、四孢脈孢菌、大孢糞殼菌、球毛殼菌、四孢柄孢殼、黃萎輪枝孢、禾生小叢殼、Grosmannia clavigera、核盤菌、富氏葡萄孢盤菌、米曲霉、構巢曲霉、黑曲霉、煙曲霉、產黃青霉、十字花科小球腔菌、穎枯殼針孢、偃麥草核腔菌、圓核腔菌、馬爾尼菲青霉、柄籃狀菌、里氏木霉、Uncinocarpus reesi1、厭酷球孢子菌、普賽德斯球抱子菌、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、嗜熱側孢霉(嗜熱毀絲菌)、Thielavia terrestris-thermophilic、解纖維素枝頂孢、解脂耶羅維亞酵母、多形漢遜酵母、乳酸克魯維酵母、巴斯德畢赤酵母、禾生球腔菌、費希新薩托菌、疏棉狀嗜熱絲孢菌(短小腐質霉、短芽孢腐質霉、灰腐質霉、柔毛腐質霉、Monotospora lanuginosa、Sepedoniumlanuginosum)、嗜熱踝節菌(Talaromyces duponti1、杜邦青霉)或勒克瑙金孢菌。
[0036]在一些實施方式中，本文還提供一種增加真菌細胞生長的方法，該方法包括將含有至少一個編碼cllr-2轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞在介質中在足以支持重組核酸的表達的條件下孵育，其中宿主細胞的生長速率比對應的缺少該重組核酸的宿主細胞要快。
[0037]在一些實施方式中，本文還提供一種增加真菌細胞生長的方法，該方法包括將含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸和至少一個編碼clr-Ι轉錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細胞在介質中在足以支持重組核酸的表達的條件下孵育，其中宿主細胞的生長速率比對應的缺少該重組核酸的宿主細胞要快。
[0038] 在一些實施方式中，本文提供一種增加由真菌細胞產生纖維素酶的方法，該方法包括將含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞在生長介質中在足以支持該重組核酸的表達的條件下孵育，其中宿主細胞比對應的缺少該重組核酸的宿主細胞產生更大量的纖維素酶。[0039]在一些實施方式中，本文提供一種增加由真菌細胞產生纖維素酶的方法，該方法包括將含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸和至少一個編碼clr-Ι轉錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細胞在生長介質中在足以支持該重組核酸的表達的條件下孵育，其中宿主細胞比對應的缺少該重組核酸的宿主細胞產生更大量的纖維素酶。
[0040]本文還提供一種增加由真菌細胞產生纖維素酶的方法，該方法包括將含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞在不含纖維素的生長介質中在足以支持該重組核酸的表達的條件下孵育，其中宿主細胞比對應的缺少該重組核酸的宿主細胞產生更大量的纖維素酶。
[0041]本文還提供一種增加由真菌細胞產生纖維素酶的方法，該方法包括將含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸和至少一個編碼clr-Ι轉錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細胞在不含纖維素的生長介質中在足以支持該重組核酸的表達的條件下孵育，其中宿主細胞比對應的缺少該重組核酸的宿主細胞產生更大量的纖維素酶。
[0042]在一些實施方式中，本文提供一種產生一種或多種纖維素酶的方法，該方法包括:a)將含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞在介質中在足以支持該重組核酸的表達的條件下孵育，以及b)從該介質和/或該真菌宿主細胞中收集一種或多種纖維素酶。
[0043]在一些實施方式中，本文提供一種產生一種或多種纖維素酶的方法，該方法包括:a)將含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸和至少一個編碼clr-Ι轉錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細胞在介質中在足以支持該重組核酸的表達的條件下孵育，以及b)從該介質和/或該真菌宿主細胞中收集一種或多種纖維素酶。
[0044]本文還提供一種使含有纖維素的材料降解的方法，該方法包括:a)使含有纖維素的材料與含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞接觸，以及b)將真菌宿主細胞和含有纖維素的材料在支持纖維素降解的條件下孵育。
[0045]本文還提供一種使含有纖維素的材料降解的方法，該方法包括:a)使含有纖維素的材料與含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸和至少一個編碼clr-Ι轉錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細胞接觸，以及b)將真菌宿主細胞和含有纖維素的材料在支持纖維素降解的條件下孵育。
[0046]本文還提供一種將含有纖維素的材料轉化成發酵產物的方法，該方法包括:a)使含有纖維素的材料與含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞接觸，以產生糖溶液，以及b)將糖溶液與發酵微生物在足以產生發酵產物的條件下培養。
[0047]本文還提供一種將含有纖維素的材料轉化成發酵產物的方法，該方法包括:a)使含有纖維素的材料與含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸和至少一個編碼clr-Ι轉錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細胞接觸，以產生糖溶液，以及b)將糖溶液與發酵微生物在足以產生發酵產物的條件下培養。
[0048]本文還提供一種將生物質轉化成發 酵產物的方法，該方法包括:a)使生物質與含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞接觸，以產生糖溶液，以及b)將糖溶液與發酵微生物在足以產生發酵產物的條件下培養。
[0049]本文還提供一種將生物質轉化成發酵產物的方法，該方法包括:a)使生物質與含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸和至少一個編碼clr-Ι轉錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細胞接觸，以產生糖溶液，以及b)將糖溶液與發酵微生物在足以產生發酵產物的條件下培養。
[0050]本文還提供一種將生物質轉化成發酵產物的方法，該方法包括:a)對生物質進行預處理，b)使生物質與含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞接觸，以產生糖溶液，以及c)將糖溶液與發酵微生物在足以產生發酵產物的條件下培養。
[0051]本文還提供一種將生物質轉化成發酵產物的方法，該方法包括:a)對生物質進行預處理，b)使生物質與含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸和至少一個編碼clr-Ι轉錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細胞接觸，以產生糖溶液，以及c)將糖溶液與發酵微生物在足以產生發酵產物的條件下培養。
[0052]本文還提供一種將生物質轉化成發酵產物的方法，該方法包括:a)通過包括氨纖維膨脹(AFEX)、蒸汽爆破、高溫處理、高壓處理、堿性水溶液處理、酸性溶液處理、有機溶劑處理、離子液體(IL)處理、電解水處理和磷酸處理中的一種或多種的方法對生物質進行預處理，b)使生物質與含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞接觸，以產生糖溶液，以及c)將糖溶液與發酵微生物在足以產生發酵產物的條件下培養。
[0053]本文還提供一種將生物質轉化成發酵產物的方法，該方法包括:a)通過包括氨纖維膨脹(AFEX)、蒸汽爆破、高溫處理、高壓處理、堿性水溶液處理、酸性溶液處理、有機溶劑處理、離子液體(IL)處理、電解水處理和磷酸處理中的一種或多種的方法對生物質進行預處理，b)使生物質與含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸和至少一個編碼clr-Ι轉錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細胞接觸，以產生糖溶液，以及c)將糖溶液與發酵微生物在足以產生發酵產物的條件下培養。
[0054]此外，本文提供一種將植物材料轉化成發酵產物的方法，該方法包括:a)使生物質與含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞接觸，以產生糖溶液，以及b)將糖溶液與發酵微生物在足以產生發酵產物的條件下培養。
[0055]此外，本文提供一種將植物材料轉化成發酵產物的方法，該方法包括:a)使生物質與含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸和至少一個編碼clr-Ι轉錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細胞接觸，以產生糖溶液，以及b)將糖溶液與發酵微生物在足以產生發酵產物的條件下培養。
[0056]本文還提供一種將選自芒草、柳枝稷、大米草、黑麥草、草蘆、象草、蘆葦、麥秸、大麥桿、油菜稻桿、燕麥稻、玉米稻桿、大豆稻桿、燕麥殼、高粱、稻殼、甘鹿洛、玉米纖維、含有可溶物的干酒糟(DDGS )、須芒草、玉米穗軸、松木、樺木、柳木、山楊木、白楊木和能源甘蔗的植物材料轉化成發酵產物的方法，該方法包括:a)使生物質與含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞接觸，以產生糖溶液，以及b)將糖溶液與發酵微生物在足以產生發酵產物的條件下培養。
[0057]本文還提供一種將選自芒草、柳枝稷、大米草、黑麥草、草蘆、象草、蘆葦、麥秸、大麥桿、油菜稻桿、燕麥稻、玉米稻桿、大豆稻桿、燕麥殼、高粱、稻殼、甘鹿洛、玉米纖維、含有可溶物的干酒糟(DDGS )、須芒草、玉米穗軸、松木、樺木、柳木、山楊木、白楊木和能源甘蔗的植物材料轉化成發酵產物的方法，該方法包括:a)使生物質與含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸和至少一個編碼clr-Ι轉錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細胞接觸，以產生糖溶液，以及b)將糖溶液與發酵微生物在足以產生發酵產物的條件下培養。
[0058]本文還提供一種降低經預處理的生物質材料的粘度的方法，該方法包括使經預處理的生物質材料與含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞接觸，以產生粘度降低的經預處理的生物質材料。
[0059]本文還提供一種降低經預處理的生物質材料的粘度的方法，該方法包括使經預處理的生物質材料與含有至少一個編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸和至少一個編碼clr-Ι轉錄因子蛋白的額外重組核酸的真菌宿主細胞接觸，以產生粘度降低的經預處理的生物質材料。
[0060]在一些實施方式中，本文提供一種非天然出現的真菌細胞，其中該細胞天然地含有編碼clr-Ι和clr-2蛋白的基因，并且該細胞包含修飾，與對應的缺少該修飾的真菌細胞中的clr-Ι和clr-2蛋白表達相比,該修飾引起clr_l和clr_2蛋白的表達降低。
[0061]本文還提供一種非天然出現的真菌細胞，其中該細胞天然地含有編碼clr-Ι和clr-2蛋白的基因，并且該細胞含有修飾，與對應的缺少該修飾的真菌細胞中的clr-Ι和clr-2蛋白表達相比,該修飾引起clr-Ι和clr_2蛋白的表達降低,并且其中修飾由RNA1、反義RNA、T-DNA插入、轉座子插入、插入突變、定點誘變、基因的部分缺失和基因的完全缺失而引起。
[0062]本文還提供一種非天然出現的脈孢菌屬細胞，其中該細胞天然地含有編碼clr-1和clr-2蛋白的基因， 并且該細胞包含修飾，與對應的缺少該修飾的真菌細胞中的clr-Ι和clr-2蛋白表達相比,該修飾引起clr-Ι和clr_2蛋白的表達降低。
[0063]本文還提供一種非天然出現的真菌細胞，其中該細胞天然地含有編碼clr-Ι和clr-2蛋白的基因，并且該細胞包含修飾，與對應的缺少該修飾的真菌細胞中的clr-Ι和clr-2蛋白表達相比,該修飾引起clr-1和clr_2蛋白的表達降低。并且該細胞還含有編碼與纖維素代謝有關的多肽的重組核酸。
[0064]本文還提供一種非天然出現的真菌細胞，其中該細胞天然地含有編碼clr-Ι和clr-2蛋白的基因，并且該細胞包含修飾，與對應的缺少該修飾的真菌細胞中的clr-Ι和clr-2蛋白表達相比，該修飾引起clr-Ι和clr_2蛋白的表達降低,且該細胞還含有編碼纖維素酶的重組核酸。
[0065]在一些實施方式中，本文提供一種非脈孢菌屬細胞，其含有編碼一種或多種纖維素酶多肽的DNA和至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID NO:5直系同源的基因，其中該細胞含有至少一種修飾，與對應的缺少該修飾的細胞相比，該修飾引起該至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID NO: 5直系同源的基因的表達降低，并且，至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ IDN0:5直系同源的基因的表達降低，與對應的缺少該修飾的細胞中的纖維素酶多肽的表達相t匕，引起一種或多種該纖維素酶多肽的表達降低。
[0066]在一些實施方式中，本文提供一種非脈孢菌屬細胞，其含有編碼一種或多種纖維素酶多肽的DNA、至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID NO: 5直系同源的基因和至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因，其中與對應的缺少修飾的細胞相比，該細胞含有至少一種引起該至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達降低的修飾以及至少一種引起該一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因的表達降低的修飾，并且，其中至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因以及至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因的表達降低，與對應的缺少該修飾的細胞中的纖維素酶多肽的表達相比，引起一種或多種纖維素酶多肽的表達降低。
[0067]本文還提供一種非脈孢菌屬細胞，其含有編碼一種或多種纖維素酶多肽的DNA和至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因，其中該細胞含有至少一種修飾，與對應的缺少該修飾的細胞相比，該修飾引起至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達降低，并且，其中至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達降低，與對應的缺少該修飾的細胞中的纖維素酶多肽的表達相比，引起一種或多種纖維素酶多肽的表達降低，并且其中該修飾由RNA1、反義RNA、T-DNA插入、轉座子插入、插入突變、定點誘變、基因的部分缺失或基因的完全缺失造成。
[0068]本文還提供一種非脈孢菌屬細胞，其含有編碼一種或多種纖維素酶多肽的DNA、至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID NO:5直系同源的基因和至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQID NO: 2直系同源的基因，其中與對應的缺少修飾的細胞相比，該細胞含有至少一種引起該至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達降低的修飾以及至少一種引起該至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因的表達降低的修飾，并且，其中至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因以及至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因的表達降低，與對應的缺少該修飾的細胞中的纖維素酶多肽的表達相比，引起一種或多種纖維素酶多肽的表達降低，并且其中修飾由RNA1、反義RNA、T-DNA插入、轉座子插入、插入突變、定點誘變、基因的部分缺失或基因的完全缺失造成。 [0069]本文還提供一種非脈孢菌屬細胞，其含有編碼一種或多種纖維素酶多肽的DNA和至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID NO: 5直系同源的基因，其中細胞含有至少一種修飾，與對應的缺少該修飾的細胞相比，該修飾引起該至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達降低，并且，其中該至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達降低，與對應的缺少該修飾的細胞中的纖維素酶多肽的表達相比，引起一種或多種該纖維素酶多肽的表達降低，并且其中該細胞含有一個或多個RNA1-誘導載體，其中一個或多個載體產生針對一個或多個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的RNAi0
[0070]本文還提供一種非脈孢菌屬細胞，其含有編碼一種或多種纖維素酶多肽的DNA、至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID NO:5直系同源的基因和至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQID N0:2直系同源的基因，其中與對應的缺少修飾的細胞相比較，該細胞含有至少一種引起該至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達降低的修飾以及至少一種引起該至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因的表達降低的修飾，并且，其中至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因以及至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQID NO: 2直系同源的基因的表達降低，與對應的缺少該修飾的細胞中的纖維素酶多肽的表達相比較，引起一種或多種該纖維素酶多肽的表達降低，并且其中該細胞含有一種或多種RNA1-誘導載體,其中一種或多種載體產生針對一個或多個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:2直系同源的基因的RNAi。
[0071]本文還提供一種非脈孢菌屬細胞，其含有編碼一種或多種纖維素酶多肽的DNA、至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因以及編碼與纖維素代謝有關的多肽的重組核酸，其中該細胞含有至少一種修飾，與對應的缺少該修飾的細胞相比較，該修飾引起該至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達降低，并且，其中至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達降低，與對應的缺少該修飾的細胞中的纖維素酶多肽的表達相比較，引起一種或多種纖維素酶多肽的表達降低。
[0072]本文還提供一種非脈孢菌屬細胞，其含有編碼一種或多種纖維素酶多肽的DNA、至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因、至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因以及編碼與纖維素代謝有關的多肽的重組核酸，其中與對應的缺少修飾的細胞相比較，該細胞含有至少一種引起該至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ IDN0:5直系同源的基因的表達降低的修飾以及至少一種引起該一個與粗糙脈孢菌基因SEQID N0:2直系同源的基因的表達降低的修飾，并且，其中至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ IDN0:5直系同源的基因以及至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因的表達降低，與對應的缺少該修飾的細胞中的纖維素酶多肽的表達相比較，引起一種或多種該纖維素酶多肽的表達降低。
[0073]此外，本文提供一種非脈孢菌屬細胞，其含有編碼一種或多種纖維素酶多肽的DNA、至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID NO:5直系同源的基因和編碼纖維素酶的重組核酸，其中該細胞含有至少一種修飾，與對應的缺少該修飾的細胞相比較，該修飾引起該至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達降低，并且，其中至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達降低，與對應的缺失該修飾的細胞中的纖維素酶多肽的表達相比較，引起一種或多種纖維素酶多肽的表達降低。
[0074]此外，本文提供一種非脈孢菌屬細胞，其含有編碼一種或多種纖維素酶多肽的DNA、至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID NO:5直系同源的基因、至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因和編碼纖維素酶的重組核酸，其中與對應的缺少修飾的細胞相比較，該細胞含有至少一種引起該至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達降低的修飾以及至少一種引起一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因的表達降低的修飾，并且，其中至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因以及至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因的表達降低，與對應的缺少該修飾的細胞中的纖維素酶多肽的表達相比較，引起一種或多種該纖維素酶多肽的表達降低。
[0075]本文還提供一種非脈孢菌屬細胞，其含有編碼一種或多種纖維素酶多肽的DNA和至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID NO: 5直系同源的基因，其中該細胞含有至少一種修飾，與對應的缺少該修飾的細胞相比較，該修飾引起至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID NO:5直系同源的基因的表達降低，其中至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達降低，與對應的缺少該修飾的細胞中的纖維素酶多肽的表達相比較，引起一種或多種該纖維素酶多肽的表達降低，并且其中宿主細胞選自金龜子綠僵菌、玉蜀黍赤霉、鞭毛藻叢赤殼菌、稻痕病菌、四孢脈孢菌、大孢糞殼菌、球毛殼菌、四孢柄孢殼、黃萎輪枝孢、禾生小叢殼、Grosmannia clavigera、核盤菌、富氏葡萄孢盤菌、米曲霉、構巢曲霉、黑曲霉、煙曲霉、產黃青霉、十字花科小球腔菌、穎枯殼針孢、偃麥草核腔菌、圓核腔菌、馬爾尼菲青霉、柄籃狀菌、里氏木霉、Uncinocarpus reesi1、厭酷球孢子菌、普賽德斯球抱子菌、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、嗜熱側孢霉(嗜熱毀絲菌)、Thielavia terrestris-thermophilic、解纖維素枝頂孢、解脂耶羅維亞酵母、多形漢遜酵母、乳酸克魯維酵母、巴斯德畢赤酵母、禾生球腔菌、費希新薩托菌、疏棉狀嗜熱絲孢菌(短小腐質霉、短芽孢腐質霉、灰腐質霉、柔毛腐質霉、Monotospora lanuginosa、Sepedonium lanuginosum)、嗜熱踩節菌(Talaromycesduponti1、杜邦青霉)或勒克瑙金孢菌。
[0076]本文還提供一種非脈孢菌屬細胞，其含有編碼一種或多種纖維素酶多肽的DNA、至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因和至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因，其中與對應的缺失修飾的細胞相比較，該細胞含有至少一種引起至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因的表達降低的修飾以及至少一種引起一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因的表達降低的修飾，其中至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:5直系同源的基因以及至少一個與粗糙脈孢菌基因SEQ ID N0:2直系同源的基因的表達降低，與對應的缺少該修飾的細胞中的纖維素酶多肽的表達相比較，引起一種或多種該纖維素酶多肽的表達降低，并且其中宿主細胞選自金龜子綠僵菌、玉蜀黍赤霉、鞭毛藻叢赤殼菌、稻瘟病菌、四孢脈孢菌、大孢糞殼菌、球毛殼菌、四孢柄孢殼、黃萎輪枝孢、禾生小叢殼、Grosmannia clavigera、核盤菌、富氏葡萄孢盤菌、米曲霉、構巢曲霉、黑曲霉、煙曲霉、產黃青霉、十字花科小球腔菌、穎枯殼針孢、偃麥草核腔菌、圓核腔菌、馬爾尼菲青霉、柄籃狀菌、里氏木霉、Uncinocarpus reesi1、厭酷球孢子菌、普賽德斯球抱子菌、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、嗜熱側孢霉(嗜熱毀絲菌)、Thielavia terrestris-thermophilic、解纖維素枝頂孢、解脂耶羅維亞酵母、多形漢遜酵母、乳酸克魯維酵母、巴斯德畢赤酵母、禾生球腔菌、費希新薩托菌、疏棉狀嗜熱絲孢菌(短小腐質霉、短芽孢腐質霉、灰腐質霉、柔毛腐質霉、Monotospora lanuginosa、Sepedoniumlanuginosum)、嗜熱踝節菌(Talaromyces duponti1、杜邦青霉)或勒克瑙金孢菌。
[0077]在另一實施方式中，本文提供一種含有編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞，其中該細胞還含有一個或多個對參與生物燃料產生的生物化學通路的多肽進行編碼的重組核酸。
[0078]在另一實施方式中，本文提供一種含有編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸和編碼clr-Ι轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞，其中該細胞還含有一個或多個對參與生物燃料產生的生物化學通路的多肽進行編碼的重組核酸。
[0079]在另一實施方式中，本文提供一種非天然出現的真菌細胞，其中該細胞天然地含有編碼clr-Ι和clr-2蛋白的基因，并且其中細胞含有修飾，與對應的缺少該修飾的真菌細胞中的clr-Ι和clr-2蛋白的表達相比較,該修飾引起clr_l和clr_2蛋白中的一種或兩種的表達降低，其中該細胞還含有一個或多個對參與生物燃料產生的生物化學通路的多肽進行編碼的重組核酸。
[0080]本文還提供一種含有編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞，其中該細胞還含有一個或多個對參與生物燃料產生的生物化學通路的多肽進行編碼的重組核酸，并且其中生物燃料選自乙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、3-甲基-1- 丁醇、2-甲基-1- 丁醇、3-甲基-1-戊醇和辛醇。
[0081] 本文還提供一種含有編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸和編碼clr-Ι轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞，其中該細胞還含有一個或多個對參與生物燃料產生的生物化學通路的多肽進行編碼的重組核酸，并且其中生物燃料選自乙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、3-甲基-1- 丁醇、2-甲基-1- 丁醇、3-甲基-1-戊醇和辛醇。
[0082]本文還提供一種非天然出現的真菌細胞，其中該細胞天然地含有編碼clr-Ι和clr-2蛋白的基因，并且其中該細胞含有修飾，與對應的缺少該修飾的真菌細胞中的clr-1和clr-2蛋白的表達相比較,該修飾引起clr-Ι和clr_2蛋白中的一種或兩種的表達降低，其中該細胞還含有一個或多個對參與生物燃料產生的生物化學通路的多肽進行編碼的重組核酸，并且其中生物燃料選自乙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、3-甲基-1- 丁醇、2-甲基-1- 丁醇、3-甲基-1-戊醇和辛醇。
[0083]本文還提供一種將含有纖維素的材料轉化成發酵產物的方法，該方法包括使含有纖維素的材料與含有編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞接觸，并且其中該細胞還含有一個或多個對參與生物燃料產生的生物化學通路的多肽進行編碼的重組核酸。
[0084]本文還提供一種將含有纖維素的材料轉化成發酵產物的方法，該方法包括使含有纖維素的材料與含有編碼clr-2轉錄因子蛋白的重組核酸和編碼clr-Ι轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞接觸，并且其中該細胞還含有一個或多個對參與生物燃料產生的生物化學通路的多肽進行編碼的重組核酸。
[0085]本文還提供一種將含有纖維素的材料轉化成發酵產物的方法，該方法包括使含有纖維素的材料與非天然出現的真菌細胞接觸，其中該細胞天然地含有編碼clr-Ι和clr-2蛋白的基因，并且其中細胞含有修飾，與對應的缺少該修飾的真菌細胞中的clr-Ι和clr-2蛋白的表達相比較，該修飾引起clr-1和clr-2蛋白中的一種或兩種的表達降低，其中該細胞還含有一個或多個對參與生物燃料產生的生物化學通路的多肽進行編碼的重組核酸
【專利附圖】
【附圖說明】
[0086]專利或申請文件含有至少一張彩色附圖。在請求并繳納必需費用時，將由專利局提供具有彩色附圖的本專利或專利申請公開的副本。
[0087]圖1示出培養基轉換之后所分泌的酶的表達模式。圖1A示出在轉換至無碳或新碳源之后所分泌的酶的典型表達模式。圖1B示出將培養物轉換至無碳或新碳源之后16種預測的粗糙脈孢菌纖維素酶的信息豐度。圖1C示出將培養物轉換至無碳或新碳源之后12種預測的粗糙脈孢菌半纖維素酶的信息豐度。豐度給出為通過Cufflinks計算的每百萬讀段中每千堿基外顯子長度中的片段數(FPKM)。
[0088]圖2A示出轉移后I小時時纖維素與蔗糖培養物之間進行比較的完整粗糙脈孢菌(N.crassa)基因組的轉錄豐度。圖2B示出I小時時蔗糖與無碳之間進行比較的完整粗糙脈孢菌(N.crassa)基因組的轉錄豐度。圖2C示出I小時時纖維素與無碳之間進行比較的完整粗糙脈孢菌(N.crassa)基因組的轉錄豐度。圖2D示出4小時時纖維素與蔗糖之間進行比較的完整粗糙脈孢菌(N.crassa)基因組的轉錄豐度。圖2E示出4小時時蔗糖與無碳之間進行比較的完整粗糙 脈孢菌(N.crassa)基因組的轉錄豐度。圖2F示出4小時時纖維素與無碳之間進行比較的完整粗糙脈孢菌(N.crassa)基因組的轉錄豐度。將Log2倍數變化針對最大豐度作圖。出于作圖目的，在全部條件下，給予基因IFPKM的最小計數。通過Cuffdiff采用的模型，淺灰色的點在統計學上沒有差異。中灰色的點在統計學上有差異，但不是一致地相差2倍或更多倍因子。深灰色/黑色的點在統計學上有差異，并且一致地相差2倍。
[0089]圖3示出來自RNAseq和微陣列數據的差異表達基因的比較。對纖維素(CMM)vs.無碳(NC)以及纖維素vs.鹿糖(SMM)兩種條件均進行比較。圖3A不出來自CMM vs.NC(RNAseq數據，紫色圓圈)的差異表達基因以及來自CMM vs.SMM (RNAseq數據，藍色圓圈)的差異表達基因的基因集合。第三基因集合(微陣列數據，紅色圓圈)包括來自在CMM上生長30小時vs.在SMM上生長16小時的培養物的差異表達基因，Tian等人，Proc Nat AcadSci USA，106:22157-22162(2009)。三個集合的差異表達基因中的每個集合均包括上調基因和下調基因。圖3B示出圖3A中的源自RNAseq的差異分化基因列表的比較，并將它們分為上調和下調基因集合(該分析中不包括微陣列數據)。向上指的白色箭頭表示上調基因，向下指的箭頭表示下調基因。
[0090]圖4不出cdr-1 (clr-1)和cdr_2 (clr-2)缺失菌株的生長和酶分泌。圖4A不出野生型和缺失菌株在具有SMM、XMM或CMM的5ml管中的生長。圖4B示出飽和纖維素基本培養基的層上的生長。圖4C示出SMM培養物(16hr)的轉移至CMM或XMM并孵育24小時的培養物上清液的SDS-PAGE凝膠。在SDS-PAGE凝膠中，第I道顯示蛋白梯(ladder)；第2道顯示在蔗糖上生長的野生型菌株的結果；第3道顯示在蔗糖上生長的Λ clr-1缺失菌株的結果；第4道顯示在蔗糖上生長的Λ clr-2缺失菌株的結果；第5道顯示在木聚糖上生長的野生型菌株的結果;第6道顯示在木聚糖上生長的Λ clr-1缺失菌株的結果;第7道顯示在木聚糖上生長的Λ clr-2缺失菌株的結果；第8道顯示在Avicel β上生長的野生型菌株的結果；第9道顯示在Avicel #上生長的Λ clr-1缺失菌株的結果；且第10道顯示在Avicel Φ上生長的Λ clr-2缺失菌株的結果。圖4D示出在轉移至CMM或XMM24小時的16hr SMM培養物的上清液中通過來自纖維素的葡萄糖釋放(Tian等人，Proc Nat AcadSci USA, 106:22157-22162(2009))而測量的總纖維素酶活性。圖4E示出通過圖4D中CMM或XMM培養物中由木聚糖釋 放的還原糖而測量的總木聚糖酶活性。圖4F示出圖4D中CMM或XMM培養物中通過Bradford檢定而測量的總蛋白。
[0091]圖5A 不出 cdr-1 (clr_l)和 cdr_2 (clr_2)的結構域構造,不出在 Zn (2)-Cys (6)雙核集群轉錄因子之間保守的PFAM結構域。圖5B示出天然標記有cdr-1-GFP標簽且異位表達cdr-1構建體(在ccg-Ι啟動子的調控下)的構建體設計。圖5C示出在SMM生長的培養物轉移至CMM之后cdr-Ι和cdr-2的表達圖譜。圖示出源自野生型粗糙脈孢菌vs.cdr-1或cdr-2突變體中的cdr_l和cdr_2的FPKM。注意cdr_2的表達依賴于能起作用的cdr-Ι的存在,而在cdr-2突變體中cdr_l的表達與野生型類似。圖5E示出天然GFP標記的CDR-1 (CLR-1)的核定位。圖5F示出CMM vs.SMM上的ccgl:: cdr-Ι菌株中cbh-1(NCU07340)和cdr-2的相對表達，表明cdr_l的異位表達對cbh_l或cdr_2的表達水平沒有影響。
[0092]圖6示出cdr-1 (clr_l)和cdr_2 (clr_2)的最大似然系統發生樹。圖6A示出cdr-1。圖 6B 不出 cdr-2。
[0093]圖7示出cdr (clr)缺失突變體中改變了的表達圖譜。圖7A示出轉移至CMM后4hr時野生型和cdr突變菌株中預測的纖維素酶基因的轉錄豐度。圖7B示出轉移至CMM后4hr時在野生型和cdr突變菌株中預測的半纖維素酶基因的表達圖譜。圖7C示出在轉移至CMM4hr后的Acdr-1 ( Λ clr_l)與野生型相比的全局表達。圖7D示出在轉移至CMM4hr后的Λ cdr-2 ( Δ clr-2)與野生型相比的全局表達。圖7E示出在轉移至CMM后4hr對鑒別為在clr突變體和/或在野生型中纖維素與無碳比較中差異表達的基因的FPKM層次聚類。圖7F示出在圖7E聚類中的基因的主要類別。圖7G示出所選擇的纖維素酶和半纖維素酶的FPKM。預測表現出纖維素酶樣表達模式的半纖維素酶由cdr-Ι和cdr-2調節。
[0094]圖8不出cdr-1 (clr_l)和cdr_2 (clr_2)對纖維素酶調節的非限定性模式。(I)緩解葡萄糖阻遏。(2)追蹤到纖維素酶和半纖維素酶使植物細胞壁材料降解，釋放信號分子。(3，4)信號級聯激活CDR-l(CLR-l)，進一步驅動cdr-Ι以及之后的cdr_2的表達。(5)⑶R-2 (CLR-2)以及有可能的⑶R-1驅動纖維素酶和一些半纖維素酶的表達。(6)纖維素酶和半纖維素酶釋放更多的信號分子，使循環永續。
[0095]圖9示出基于貝葉斯推論的系統進化樹。圖9A示出cdr-1 (clr_l)樹。圖9B示出 cdr-2 (clr-2)樹。
[0096]圖10示出在轉移至0.2%纖維二糖后4小時在三個具有或不具有clr-Ι或clr_2缺失的β -葡糖苷酶缺失突變體(ABG)中的cbh-Ι和cdt-2的轉錄豐度。
[0097]圖1lA示出培養物上清液中通過由Avicel ?的纖維二糖釋放而測量的纖維素酶活性。培養物在蔗糖上生長24小時，然后轉移至新鮮培養基中。圖1lB示出作為clr-Ι豐度的函數的cbh-Ι的轉錄。所有測量均在自蔗糖培養物進行培養基轉換之后4小時通過RT-PCR 進行。[0098]圖12A示出自蔗糖培養基轉移之后4小時粗糙脈孢菌菌株中cbh-Ι相對于clr_2的轉錄豐度。圖12B示出在蔗糖或Avicel詹中生長之后的WT和clr_2異位表達菌株上清液中的羧甲基纖維素酶活性。圖12C示出將蔗糖生長培養物轉移至具有2%蔗糖或2%Avicel詹的新鮮培養基之后clr-2異位表達菌株的羧甲基纖維素酶活性。圖12D示出將蔗糖成長培養物轉移至具有2%蔗糖或2%Avicel⑩的新鮮培養基之后在來自clr_2異位表達菌株的培養上清液中的所分泌蛋白。
[0099]圖13A示出WT和clr-2異位表達菌株的培養物上清液的SDS-PAGE凝膠。圖13B示出在轉移至Avicel⑩后在WT粗糙脈孢菌、clr-Ι和clr-2的缺失菌株；以及轉移至無碳之后在WT和clr-2異位表達菌株中的所選擇的纖維素酶基因的轉錄豐度(RNAseq)。
[0100]圖14以FPKM示出在另外可選的誘導性條件和clr突變體中粗糙脈孢菌Avicel (φ調節子的層次聚類。
[0101]圖15示出培養基轉換到各種碳源后4小時粗糙脈孢菌裂解液中標記的和未標記的clr-1 (NCU07705)的蛋白印跡(抗-V5抗體)。Suc是指蔗糖，Avi是指Avicel⑩，NC是指無碳，Cel是指纖維二糖,Xa是指木聚糖,Xo是指木糖。V5標記的CLR-1的預計大小為~80kDa。每道均載入相等的總蛋白濃度。
[0102]圖16A示出對clr_l/2ChiPseq調節子與纖維素應答RNAseq調節子進行比較的Venn圖。圖16B示出CLR-1ChIP-Seq的圖形表示。灰色的峰表示映射到clr_l(NCU07705)和clr-2 (NCU08042)啟動子區域內若干位點的相對讀段數目。圖16C示出映射至基因組的 CLR-1 和 CLR-2ChIP_Seq 以及 4 小時 Avicel ? RNA-Seq。附圖示出 CLR-1 和 CLR-2 在調節相同基因時典型的ChIP結合模式。CLR-1和CLR-2在幾乎相同的位置與xlr_l的啟動
子結合。[0103]圖17示出構巢曲霉clr缺失菌株AclrA和AclrB的表型。圖17A示出在葡萄糖上生長然后轉換至Avicel ?培養基的Λ clrA和Λ clrB突變體的培養物上清液的酶活性。圖17B示出在Avicel iU:生長的培養物上清液中的總蛋白。圖17C示出在葡萄糖和纖維二糖(0.5%wt/vol)上培養的WT和clr突變體的菌絲體干重。圖17D通過定量RT-PCR示出在轉換至Avicel (S) 8hr之后在WT和clr突變體中對所選擇的纖維素酶基因的誘導。通過單尾非齊性方差t-檢驗的統計學顯著性，*P<0.05，**P<0.01，*林Ρ〈(λ 001。圖17Ε示出將培養物暴露于Avicel ?之后構巢曲霉Λ clrA和Λ clrB突變體中clrA和clrB的表達。將培養物在葡萄糖培養基中于37°C預生長17小時，然后轉換至Avicel遷)培養基。
[0104]圖18A示出clrB基因在clrB異位表達菌株中的表達。葡萄糖上O小時是指恰好將在葡萄糖上生長17小時的培養物轉換至具有其他碳源的培養基之前的時間。圖18B示出cbhD基因在clrB異位表達菌株中的表達。葡萄糖上O小時是指恰好將在葡萄糖上生長17小時的培養物轉換至具有其他碳源的培養基之前的時間。圖18C示出在纖維二糖上生長48小時的clrB異位表達菌株的生長和羧甲基纖維素酶活性。
[0105]圖19示出粗糙脈孢菌clrA異位表達菌株和粗糙脈孢菌clrB異位表達菌株在纖維二糖和Avicel._上的生長。圖19A示出clrA異位表達菌株在纖維二糖上的生物質聚集。圖19B示出clrA異位表達菌株在Avicel ?上的生長。圖19C示出clrB異位表達菌株在纖維二糖上的生物質聚集。圖19D示出clrB異位表達菌株在Avicel敷上的生長。
[0106]圖20A示出由染色質免疫沉淀(ChIP)峰預測的Clr-1DNA-結合基序。圖20B示出由染色質免疫沉淀(ChIP)峰預測的Clr-2DNA-結合基序。
[0107]圖21示出粗糙脈孢菌clr-Ι與顯示出保守基序的22種clr_l同源物的氨基酸序列比對。保守的PFAM04082轉錄因子結構域以突出的框表示。序列比對包括以下序列:玉蜀黍赤霉 _PH-1 (SEQ ID 勵:193)、鞭毛藻叢赤殼菌_11^^1_77-13-4 (SEQ ID NO: 194)、NCU07705 (SEQ ID NO: 2)、四孢脈孢菌 _FGSC_2508 (SEQ ID NO: 195)、大孢糞殼菌 _k_hell(SEQ ID 勵:196)、球毛殼菌」^5_148.51 (SEQ ID NO: 197)、四孢柄孢殼 _S_mat+(SEQ ID勵:198)、黃萎輪枝孢_￥&]\^.102(SEQ ID NO: 199)、禾生小叢殼 _ML 001 (SEQ ID N0:200)、金龜子綠僵菌 _ARSEF_23(SEQ ID NO:201 )、富氏葡萄孢盤菌 _B05.10(SEQ ID N0:202)、核盤菌 _1980 (SEQ ID NO: 203), Grosmannia_cIavigera_kw 1407 (SEQ ID NO: 204)、AN5808(SEQ ID 勵:205)、煙曲霉_六€293 (SEQ ID NO:206)、米曲霉 _RIB40 (SEQ ID NO:207)、產黃青霉_胃丨8(:0118丨11_54-1255 (SEQ ID NO: 208)、黑曲霉(SEQ ID NO: 209)、圓核腔菌 _f._teres_0-l (SEQ ID NO: 210)、十字花科小球腔菌 _JN3 (SEQ ID NO:211)、柄籃狀菌 _ATCC_10500 (SEQ ID NO: 212)、NCU00808 (SEQ ID NO: 213)和里氏木霉 _clr_l_ 蛋白(SEQID NO:182)。
[0108]圖22示出粗糙脈孢菌clr-1與顯示出保守基序的21種clr_2同源物的氨基酸序列比對。保守的PFAM04082轉錄因子結構域以突出的框表示。序列比對包括以下序列:AN6832 (SEQ ID N0:214) 、馬爾尼菲青霉 _ATCC_18224 (SEQ ID N0:215)、柄籃狀M _ATCC_10500 (SEQ ID NO: 216)、AN3369 (SEQ ID NO: 217)、黑曲霉 _CBS_513.88 (SEQID N0:218)、米曲霉 _RIB40 (SEQ ID NO:219)、產黃青霉 _Wisconsin_54_1255 (SEQ IDNO: 220 )、厭酷球孢子菌 _RS (SEQ ID NO: 221)、普賽德斯球抱子菌 _C735_deIta_S0ffgp (SEQID N0:222)、NCU08042 (SEQ ID NO:4)、四孢脈孢菌 _FGSC_2508 (SEQ ID NO: 223)、大孢糞殼菌 _k-hell(SEQ ID NO: 224)、四孢柄孢殼 _S_mat+(SEQID NO: 225)、禾生小叢殼 _Μ1.0Ol(SEQ ID N0:226)、稻瘟病菌_70-15(SEQ ID NO:227)、鞭毛藻叢赤殼菌_mpVI_77-13_4(SEQID NO:228)、里氏木霉(SEQ ID NO:229)、黃萎輪枝孢 _VaMs.102 (SEQ ID N0:230)、偃麥草核腔菌 _Pt-1C-BFP (SEQ ID NO: 231 )、圓核腔菌 _f._teres_0_l (SEQ ID NO: 232)、十字花科小球腔菌 _JN3 (SEQ ID NO:233)和 NCU07007 (SEQ ID NO: 234)。
【具體實施方式】
[0109]本文提供與細胞對纖維素的應答有關的多肽。本文還提供對與細胞對纖維素的應答有關的多肽進行編碼的核酸。本文還提供含有對與細胞對纖維素的應答有關的多肽進行編碼的重組核酸的宿主細胞，以及含有與細胞對纖維素的應答有關的重組多肽的宿主細胞。在一些方面，本文提供多肽clr-Ι和clr-2，以及編碼clr_l和clr_2多肽的核酸。
[0110]本文還提供使用clr-ι和clr-2多肽的方法,使用編碼clr_l和clr_2多肽的核酸的方法，以及使用含有重組clr-Ι和/或clr-2多肽或編碼clr_l和/或clr_2多肽的核酸的宿主細胞的方法。在一些方面，clr-Ι和clr-2促進纖維素酶和其他基因在應答于纖維素時的表達。因此，在一些方面，宿主細胞中重組clr-Ι和/或clr-2的表達增加宿主細胞在含有纖維素的介質中的生長速率，增加由宿主細胞產生的纖維素酶，和/或增加宿主細胞降解纖維素的速率。
[0111]此外,本文提供天然地產生clr-ι和/或clr-2多肽的細胞,其被修飾成clr_l和/或clr-2的表達降低。天然地產生clr-Ι和/或clr_2多肽但被修飾成clr_l和/或clr-2的表達降低的細胞可以用于，例如，研究纖維素酶以及細胞對纖維素的應答。
[0112]如本文所用，術語“Cdr-1 ”和“Clr-1 ”可互換地使用，且是指起到調節多種基因在真菌細胞中應答于細胞對纖維素的暴露時的轉錄的轉錄因子的作用的多肽或編碼多肽的基因。clr-Ι編碼基因的一個非限制性實例為粗糙脈孢菌基因NCU07705。
[0113]如本文所用，術語“cdr-2”和“clr-2”可互換地使用，且是指起到調節多種基因在真菌細胞中應答于細胞對纖維素的暴露時的轉錄的轉錄因子的作用的多肽或編碼多肽的基因。clr-2編碼基因的一個非限制性實例為粗糙脈孢菌基因NCU08042。
[0114]因此，在某些方面，本公開內容涉及一種使含有纖維素的材料降解的方法，通過:a)使含有纖維素的材料與含有至少一個編碼轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞接觸，其中轉錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域和至少一個、至少兩個、至少三個或至少四個選自SEQ ID N0:184、185、186和187的多肽序列；以及b)將真菌宿主細胞和含有纖維素的材料在足以使真菌宿主細胞降解含有纖維素的材料的條件下孵育。
[0115]本公開內容的其他方面涉及一種增加由真菌細胞產生一種或多種纖維素酶的方法，通過:(a)提供含有至少一個編碼轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞，其中轉錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域和至少一個、至少兩個、至少三個或至少四個選自SEQ ID NO: 184、185、186和187的多肽序列；以及(b)將宿主細胞在足以支持該至少一個重組核酸的表達的條件下培養，其中真菌宿主細胞比對應的缺少該至少一個重組核酸的宿主細胞產生更大量的一種或多種纖維素酶。
[0116]本公開內容的其他方面涉及一種降低經預處理的生物質材料的粘度的方法，通過使預處理的生物質材料與含有至少一個編碼轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞接觸，以產生粘度降低的經預處理的生物質材料，其中轉錄因子蛋白含有鋅(2)-半胱氨酸
(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域和至少一個、至少兩個、至少三個或至少四個選自SEQ ID NO: 184、185、186和187的多肽序列。
[0117]公開內容的多肽
[0118]本公開內容涉及參與到與纖維素代謝有關的基因的轉錄中的多肽。在一些方面，本公開內容涉及clr-Ι多肽。在一些方面，本公開內容涉及clr-2多肽。
[0119]如本文所用，“多肽”是包括多個連續聚合的氨基酸殘基(例如，至少約15個連續聚合的氨基酸殘基)的氨基酸序列。如本文所用，“多肽”是指氨基酸序列、寡肽、肽、蛋白或其部分，術語“多肽”和“蛋白”可互換地使用。
[0120]Clr-1
[0121]在一些方面，本公開內容涉及clr-Ι多肽。clr-Ι多肽起到轉錄因子的作用，其調節多種基因在真菌細胞中應答于細胞對纖維素的暴露時的轉錄。在一些方面，基因的表達在應答于clr-Ι表達時增加。在一些方面，基因的表達在應答于clr-Ι表達時降低。
[0122]clr-Ι是真菌特異性鋅雙核集群超家族的一員，該超家族是真菌特異性轉錄調節因子的較大較多樣的超級家族。該超家族中的轉錄因子的例子包括gal-4、ace-1和xlnR(xyr-1)(Strieker 等人,App.Micr0.Biotech., 78:211-220 (2008) )。clr-2 也是該超家族中的一員。
[0123]該多肽超家族的成員典型地含有兩個保守結構域:A)鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群PFAM00172結構域，其協調多肽與DNA的結合，和B)中央結構域，其大致對應于稱作“中央同源區”者(Campbell RN, Biochemical J.，414:177-187，(2008))，是鋅指轉錄因子中的保守結構域。在clr-Ι中，保守的中央結構域具有真菌特異性轉錄因子結構域PFAM04082。
[0124]如本文所用，“鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域”是指真菌特異性鋅雙核集群超家族的保守DNA結合結構域，典型地為釀酒酵母Gal4，其含有雙核鋅集群，其中兩個鋅離子通過六個半胱氨酸殘基結合(PFAM00172)。本公開內容的clr_l多肽及其同源物含有包括以下保守序列的“鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域” =C-E-V-C-R-S-R-K-S-R-C-D-G-T-K-P-K-C-K-L-C-T-E-L-G-A-E-C-1-Y-R-E (SEQ ID NO:235)(圖 21)。本公開內容的 clr_2 多月太及其同源物含有包括以下保守序列的“鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域” =C-A-E-C-R-R-R-K-1-R-C-D-G-E-Q-PC-G-Q-C-X-W-Y-X-K-P-K-R-C-F-Y-R-V-X-P-S-R-K (SEQ ID NO:236)，其中X可以是任意氨基酸殘基(圖22)。
[0125]如本文所用，“PFAM04082轉錄因子結構域”是指與鋅指或鋅雙核轉錄因子結構域相關的真菌特異性轉錄因子結構域。本公開內容的clr-Ι多肽及其同源物含有包括以下保守序列的 “PFAM04082 轉錄因子結構域”:1-E-A-Y-F-E-R-V-N-V-ff-Y-A-C-V-N-P-Y-T-ff-R-S-H-Y-R-T-A-L-S-N-G-F-R-E-G-P-E-S-C-1-V-L-L-V-L-A-L-G-Q-A-S-L-R-G-S-1-S-R-1-V-P-X-E-D-P-P-G-L-Q-Y-F-T-A-A-W-X-L-L-P-G-M-M-T-X-N-S-V-L-A-A-Q-C-H-L-L-A-A-A-Y-L-F-Y-L-V-R-P-L-E-A-W-N-L-L-C-T-T-S-T-K-L-Q-L-L-L-M-A-P-N-R-V-P-P-X-Q-R-E-L-S-E-R-1-Y-W-N-A-L-L-F-E-S-D-L-L-A-E-L-D-L-P-H-S-G-1-V-Q-F-E-E-N-V-G-L-P-G-G-F-E-G-E-E-D-E-X-D-E-E-A-D-X-D-Q-E-1-A-X-V-T-A-V-G-R-D-E-L-W-Y-F-L-A-E-1-A-L-R-R-L-L-N-R-V-S-Q-L-1-Y-S-K-D-T-P-Y-S-K-G-P-S-M-A-S-T-T-S-L-E-P-1-V-A-E-L-D-F-
【權利要求】
1.一種使含有纖維素的材料降解的方法，所述方法包括: a)使含有纖維素的材料與包含至少一個編碼轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞接觸，其中所述轉錄因子蛋白包含鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域和至少一個選自SEQ ID NO: 184、185、186和187的多肽序列；以及 b)將所述真菌宿主細胞和所述含有纖維素的材料在足以使所述真菌宿主細胞降解所述含有纖維素的材料的條件下孵育。
2.根據權利要求1所述的方法，其中， 所述轉錄因子蛋白包含至少一個選自SEQ ID N0:184、185、186和187的額外多肽序列。
3.根據權利要求1所述的方法，其中， 所述轉錄因子蛋白包含至少兩個選自SEQ ID N0:184、185、186和187的額外多肽序列。
4.根據權利要求1所述的方法，其中， 所述轉錄因子蛋白包含至少三個選自SEQ ID N0:184、185、186和187的額外多肽序列。
5.根據權利要求1所述的方法，其中， 所述轉錄因子蛋白包含SEQ ID NO: 184、185、186和187。
6.根據權利要求1~5中任一項所述的方法，其中， 所述真菌宿主細胞在足以使所述真菌宿主細胞表達所述轉錄因子蛋白的條件下孵育。
7.根據權利要求1~6中任一項所述的方法，其中， 所述真菌宿主細胞比對應的缺少所述至少一個重組核酸的真菌宿主細胞產生更大量的一種或多種纖維素酶。
8.根據權利要求1~7中任一項所述的方法，其中， 所述含有纖維素的材料包括生物質。
9.根據權利要求8所述的方法，其中， 所述生物質在與所述真菌宿主細胞接觸之前進行預處理。
10.根據權利要求9所述的方法，其中， 所述預處理包括選自氨纖維膨脹(AFEX)、蒸汽爆破、高溫處理、高壓處理、堿性水溶液處理、酸性溶液處理、有機溶劑處理、離子液體(IL)處理、電解水處理和磷酸處理的一種或多種處理。
11.根據權利要求8~10中任一項所述的方法，其中， 所述生物質包括植物材料。
12.根據權利要求11所述的方法，其中， 所述植物材料選自芒草、柳枝稷、大米草、黑麥草、草蘆、象草、蘆葦、麥秸、大麥桿、油菜秸桿、燕麥秸、玉米秸桿、大豆秸桿、燕麥殼、高粱、稻殼、甘蔗渣、玉米纖維、含有可溶物的干酒糟(DDGS )、須芒草、玉米穗軸、松木、樺木、柳木、山楊木、白楊木和能源甘蔗。
13.根據權利要求1~12中任一項所述的方法，其中， 所述真菌宿主細胞還包含一個或多個對參與到至少一種生物燃料的產生的生化通路中的多肽進行編碼的重組核酸。
14.根據權利要求13所述的方法，還包括: 將所述真菌宿主細胞與所降解的含有纖維素的材料在足以使所述真菌宿主細胞將含有纖維素的材料轉化成至少一種生物燃料的條件下孵育。
15.根據權利要求13或14所述的方法，其中， 所述生物燃料選自乙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、3-甲基-1- 丁醇、2-甲基-1- 丁醇、3-甲基-1-戊醇和辛醇。
16.根據權利要求1~12中任一項所述的方法，其中， 將所降解的含有纖維素的材料與發酵微生物在足以從所降解的含有纖維素的材料產生至少一種發酵產物的條件下培養。
17.一種增加由真菌細胞產生一種或多種纖維素酶的方法，所述方法包括: (a)提供包含至少一個編碼轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞，其中所述轉錄因子蛋白包含鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域和至少一個選自SEQ ID NO: 184、185、186和187的多肽序列；以及 (b)將所述宿主細胞在足以支持所述至少一個重組核酸的表達的條件下培養，其中所述真菌宿主細胞比對應的缺少所述至少一個重組核酸的宿主細胞產生更大量的一種或多種纖維素酶。
18.根據權利要求17所述的方法，其中， 所述真菌宿主細胞在不存在纖維素的條件下培養。
19.根據權利要求1~18中任一項所述的方法，其中， 所述至少一個重組核酸是SEQ ID N0:5。
20.根據權利要求1~19中任一項所述的方法，其中， 所述至少一個重組核酸與選自ccg-1和gpdA的啟動子可操作地連接。
21.根據權利要求1~20中任一項所述的方法，其中， 所述真菌宿主細胞還包含至少一個編碼額外轉錄因子蛋白的額外重組核酸，其中所述額外轉錄因子蛋白包含鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域和至少一個選自SEQ ID NO: 188、189、190、191和192的多肽序列。
22.根據權利要求21所述的方法，其中， 所述額外轉錄因子蛋白包含至少一個選自SEQ ID N0:188、189、190、191和192的額外多肽序列。
23.根據權利要求21所述的方法，其中， 所述額外轉錄因子蛋白包含至少兩個選自SEQ ID N0:188、189、190、191和192的額外多肽序列。
24.根據權利要求21所述的方法，其中， 所述額外轉錄因子蛋白包含至少三個選自SEQ ID N0:188、189、190、191和192的額外多肽序列。
25.根據權利要求21所述的方法，其中， 所述額外轉錄因子蛋白包含至少四個選自SEQ ID N0:188、189、190、191和192的額外多肽序列。
26.根據權利要求21所述的方法，其中，所述額外轉錄因子蛋白包含SEQ ID N0:188、189、190、191和192。
27.根據權利要求21~26中任一項所述的方法，其中， 至少一個編碼所述額外轉錄因子蛋白的額外重組核酸是SEQ IDN0:2。
28.根據權利要求21~27中任一項所述的方法，其中， 所述至少一個額外重組核酸與選自ccg-1和gpdA的啟動子可操作地連接。
29.根據權利要求1~28中任一項所述的方法，其中， 所述真菌宿主細胞還包含至少一個編碼半纖維素酶的重組核酸。
30.根據權利要求1~29中任一項所述的方法，其中， 所述真菌宿主細胞選自粗糙脈孢菌、金龜子綠僵菌、玉蜀黍赤霉、鞭毛藻叢赤殼菌、稻痕病菌、四孢脈孢菌、大孢糞殼菌、球毛殼菌、四孢柄孢殼、黃萎輪枝孢、禾生小叢殼、Grosmannia clavigera、核盤菌、富氏葡萄孢盤菌、米曲霉、構巢曲霉、黑曲霉、煙曲霉、產黃青霉、十字花科小球腔菌、穎枯殼針孢、偃麥草核腔菌、圓核腔菌、馬爾尼菲青霉、柄籃狀菌、里氏木霉、Uncinocarpus reesi1、厭酷球孢子菌、普賽德斯球抱子菌、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、嗜熱側孢霉(嗜熱毀絲菌)、Thielavia terrestris-thermophilic、解纖維素枝頂孢、解脂耶羅維亞酵母、多形漢遜酵母、乳酸克魯維酵母、巴斯德畢赤酵母、禾生球腔菌、費希新薩托菌、疏棉狀嗜熱絲孢菌(短小腐質霉、短芽孢腐質霉、灰腐質霉、柔毛腐質霉、Monotospora lanuginosa、Sepedonium lanuginosum)、嗜熱踩節菌(Talaromycesduponti1、杜邦青霉)和勒克瑙金孢菌。
31.一種降低經預處理的生物質材料的粘度的方法，所述方法包括: 使經預處理的生物質材料與包含至少一個編碼轉錄因子蛋白的重組核酸的真菌宿主細胞接觸，以產生粘度降低的經預處理的生物質材料，其中所述轉錄因子蛋白包含鋅(2)-半胱氨酸(6)雙核集群域、PFAM04082轉錄因子結構域和至少一個選自SEQ IDNO: 184、185、186和187的多肽序列。
32.根據權利要求31所述的方法，其中， 所述轉錄因子蛋白包含至少一個選自SEQ ID N0:184、185、186和187的額外多肽序列。
33.根據權利要求31所述的方法，其中， 所述轉錄因子蛋白包含至少兩個選自SEQ ID N0:184、185、186和187的額外多肽序列。
34.根據權利要求31所述的方法，其中， 所述轉錄因子蛋白包含至少三個選自SEQ ID N0:184、185、186和187的額外多肽序列。
35.根據權利要求31所述的方法，其中， 所述轉錄因子蛋白包含SEQ ID NO: 184、185、186和187。
36.根據權利要求31~35中任一項所述的方法，其中， 所述至少一個重組核酸是SEQ ID N0:5。
【文檔編號】C07K14/37GK103917653SQ201280046328
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2012年7月23日 優先權日:2011年7月21日
【發明者】田朝光, T·肖克, N·L·格拉斯, S·科拉代蒂, J·克雷格 申請人:加利福尼亞大學董事會