由蛋白g細胞膜外結構域突變體的串聯型多聚體組成的新型改性蛋白的制作方法

由蛋白g細胞膜外結構域突變體的串聯型多聚體組成的新型改性蛋白的制作方法
【專利摘要】本發明的目的是提供不損害在中性區域的高的抗體結合活性的、相比含野生型的蛋白G的細胞膜外結構域的蛋白質，在弱酸性區域的免疫球蛋白的Fc區域和的結合性和/或同Fab區域的結合性更降低的優良的蛋白質，同時使用此蛋白質，可使抗體不變性而容易地捕捉、回收。本發明涉及不損害在中性區域的高的抗體結合活性，相比由具有對具有免疫球蛋白G的Fc區域的蛋白質的結合活性的野生型的細胞膜外結構域組成的多聚體，在弱酸性區域的免疫球蛋白的Fc區域和的結合性和/或同Fab區域的結合性降低的，由具有對具有免疫球蛋白G的Fc區域的蛋白質的結合活性的該細胞膜外結構域的突變體的串聯型多聚體組成的蛋白質等。
【專利說明】由蛋白G細胞膜外結構域突變體的串聯型多聚體組成的新型改性蛋白
【【技術領域】】
[0001 ] 本發明涉及(包含)由抗體結合性蛋白蛋白G的細胞膜外結構域突變體的串聯型多聚體組成的新型改性蛋白質、編碼該蛋白質的核酸、及利用了該蛋白質的抗體結合性的抗體、免疫球蛋白G或有免疫球蛋白G的Fc區域的蛋白質的捕獲劑、和填充了該捕獲劑而得到的蛋白質分離純化用層析用柱等。
【【背景技術】】
[0002]蛋白G是來源于鏈球菌的蛋白質,其是在鏈球菌(Streptococcus)屬鏈球菌的細胞膜中存在的膜蛋白質，已知對免疫球蛋白G (抗體中的一種)的Fc區域具有特異性結合活性(非專利文獻1、專利文獻1)。蛋白G是由多個結構域組成的多結構域型膜蛋白質，顯示有對具有免疫球蛋白G的Fc區域的蛋白質的結合活性(以下，稱為“抗體結合活性”)的是其中的一部分的細胞膜外結構域(非專利文獻2)。例如在圖1中顯示的來源于G148株的蛋白G的情況中，顯示抗體結合活性的是B1、B2、B3這3個結構域(有文獻也記做C1、C2、C3結構域)。另外，在GX7805株的蛋白G中存在3個抗體結合結構域，在GX7809的蛋白G中存在2個抗體結合結構域。已知這些均為將近60個氨基酸的小型蛋白質，在其氨基酸序列之間顯示了高的相同性)。另外已知，切斷蛋白G而將各結構域單獨分開，仍保持抗體結合活性(非專利文獻3)。
[0003]對于蛋白G的細胞膜外結構域而言，現在已上市，利用其選擇性的抗體結合活性的多種含有蛋白G細胞膜外結構域的制品(例如，用于抗體純化的親和層析用載體(專利文獻3、4)或用于檢測抗體的檢查試劑、研究試劑等)。已知蛋白G的細胞膜外結構域和抗體的結合力在中性~弱酸性區域高，在強酸性區域低(非專利文獻4)。所以，當目的是抗體的分離、回收、純化時，首先，使含血清等的抗體的樣品溶液處于中性狀態，使接觸固定化蛋白G的細胞膜外結構域的珠等的水不溶性的固相支持體，選擇性地吸附抗體。此后，用中性~弱酸溶液(PH5~8)清洗而除去抗體以外的成分。最后，通常加pH2.4~3.5的強酸性溶液而使抗體從固定化的蛋白G脫離，與強酸性溶液一同洗脫(專利文獻3)。由此，可以高的純度分離、回收、純化抗體。
[0004]但是，抗體置于pH2.4~3.5的強酸性溶液的話會因變性凝集等而品質下降，根據抗體的種類的不同，有時還會喪失原本的功能(非專利文獻4)。為了防止其發生，嘗試在比PH2.4~3.5更高的pH的弱酸性區域處理，但由于蛋白G的細胞膜外結構域和抗體的結合力強，在弱酸性區域抗體不從蛋白G上洗脫下來，得不到足夠的回收量。另一方面，已知蛋白G細胞膜外結構域還與Fab結合(非專利文獻2)、一個抗體分子可在Fc區域和Fab區域這2個區域與蛋白G細胞膜外結構域結合。一旦變成這樣的結合狀態，則抗體和蛋白G的細胞膜外結構域不容易解離，難以回收抗體。
[0005] 至今本發明人等也開發過由有熱穩定性、對變性劑的化學穩定性、及對蛋白質分解酶的抗性等(有時將這些特性總稱，簡稱為“蛋白質穩定性”)的蛋白G的細胞膜外結構域突變體組成的改性蛋白質(專利文獻5及專利文獻6)、還開發過在弱酸性區域的免疫球蛋白的Fc區域和的結合性和/或同Fab區域的結合性降低的改性蛋白質(專利文獻7)。但是，這些改性蛋白質均僅含顯示抗體結合活性的1個結構域。
[0006]【現有技術文獻】
[0007]【專利文獻】
[0008]專利文獻1:特表平03-501801公報
[0009]專利文獻2:專利第2764021號公報
[0010]專利文獻3:特開平03-128400號公報
[0011]專利文獻4:特開2003-088381號公報
[0012]專利文獻5:特開2009-95322號公報 [0013]專利文獻6:特開2009-118749號公報
[0014]專利文獻7:特開2009-297018號公報
[0015]【非專利文獻】
[0016]非專利文獻1:Bjorck L,Kronvall G.(1984)Purification and some propertiesof streptococcal protein G，a novel IgG—binding reagent.J Immunol.133，969—974。
[0017]非專利文獻2:Boyle Μ.D.P.，Ed.(1990) Bacterial Immunoglobulin BindingProteins.Academic Press，Inc.，San Diego, CA，USA。
[0018]非專利文獻3:Gallagher T，Alexander P，Bryan P，Gilliland GL.(1994) Twocrystal structures of the Blimmunoglobulin-binding domain of streptococcalprotein G and comparison with NMR.Biochemistry 19，4721—4729。
[0019]非專利文獻4:Gagnon P.(1996) Purification Tools for MonoclonalAntibodies，Validated Biosystems Inc.，Tucson，AZ，USA。
【
【發明內容】
】
[0020]【發明要解決的技術課題】
[0021]從而，本發明要解決的課題是解決上述現有技術中的問題，再者，提供用于抗體純化等的實用性優良的新的蛋白質、再者，提供以固定化了該蛋白質為特征的、可用作抗體純化用親和層析填充劑等的抗體、免疫球蛋白G或有免疫球蛋白G的Fc區域的蛋白質(抗體等)的捕獲劑。
[0022]更具體而言，提供不損害在中性區域的高的抗體結合活性的、相比含野生型的蛋白G的細胞膜外結構域的蛋白質，在弱酸性區域的免疫球蛋白的Fc區域和的結合性和/或同Fab區域的結合性更降低的優良的蛋白質，同時實現使用此蛋白質而使抗體不變性，進而容易地捕捉、回收抗體的目的。
[0023]再者，本發明要解決的課題是提供填充該捕獲劑而成的蛋白質分離純化用層析用柱，特別是，抗體純化用的親和層析用柱。
[0024]【解決課題的技術方案】
[0025]本發明人想到，從固定化蛋白G的細胞膜外結構域的固相支持體進行抗體的酸洗脫時，為了防止抗體被強酸降低質量，認為可以通過改變蛋白G的細胞膜外結構域的氨基酸序列使之可被弱酸性溶液從固相支持體洗脫。銳意研究的結果終于開發出串聯連結抗體結合性蛋白質的蛋白G的細胞膜外結構域突變體而構成的由串聯型多聚體組成的蛋白質，該蛋白質有與野生型蛋白G同等的在中性區域的與免疫球蛋白Fc區域的結合性，并且，在弱酸性區域的與免疫球蛋白Fc區域的結合性比野生型蛋白G細胞膜外結構域的串聯型多聚體還大大降低，還有，由此串聯型多聚體組成的蛋白質對IgGl及IgG3等不同亞類的人免疫球蛋白Fc區域顯示同樣的效果，此外，經確認此串聯型多聚體相比由相同的結構域突變體組成的單體中性區域的抗體結合性更為優良，從而完成本發明。
[0026]即，本發明的各實施方式如下。
[0027]【實施方式1】
[0028]蛋白質，其由細胞膜外結構域突變體的串聯型多聚體組成，所述細胞膜外結構域突變體的串聯型多聚體具有對具有免疫球蛋白G的Fc區域的蛋白質的結合活性。
[0029]【實施方式2】
[0030]實施方式1所述的蛋白質，其為串聯型三聚體、串聯型四聚體、或者串聯型五聚體。
[0031]【實施方式3】
[0032]實施方式1或2所述的蛋白質，其中構成多聚體的細胞膜外結構域突變體彼此相同。
[0033]【實施方式4】
[0034]實施方式1~3中任一項所述的蛋白質，其中各細胞膜外結構域突變體由接頭序列連結的。
[0035]【實施方式5】
[0036]實施方式1~4中任一項所述的蛋白質，其中具有對具有免疫球蛋白G的Fc區域的蛋白質的結合活性的細胞膜外結構域是鏈球菌(Streptococcus)屬鏈球菌的蛋白G的B1、B2、或者B3中的任一個。
[0037]【實施方式6】
[0038]實施方式1~5中任一項所述的蛋白質，其中具有對免疫球蛋白G的Fc區域的結合活性，并且，相比由野生型蛋白G.B結構域的串聯型多聚體組成的蛋白質，至少，對免疫球蛋白G的Fab區域的結合活性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低。
[0039]【實施方式7】
[0040]實施方式1~6中任一項所述的蛋白質，其中構成多聚體的至少一個細胞膜外結構域突變體是以下的突變體蛋白質:
[0041]是野生型蛋白G*B1結構域蛋白質的突變體蛋白質，由以下的(a)所示的氨基酸序列組成，或由在(a)所示的氨基酸序列中，1個或數個氨基酸殘基缺失、取代、插入或附加的氨基酸序列組成，具有對免疫球蛋白G的Fc區域的結合活性，并且，相比野生型蛋白G.B1結構域蛋白質，至少，對免疫球蛋白G的Fab區域的結合活性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低的突變體蛋白質:
[0042](a)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
[0043](上述氨基酸序列中，X35表示Asn或Lys，X36表示Asp或Glu，X37表示Asn、His、或者 Leu, X47 表示 Asp 或 Pro, X48 表示 Ala、Lys 或 Glu, X22 表示 Asp 或 His, X25 表示 Thr或 His,X32 表示 Gin 或 His,X40 表示 Asp 或 His,X42 表示 Glu 或 His, XII 表示 Thr 或 Arg,X17 表示 Thr 或 lie ;不過，同時 X35 是 Asn 或 Lys、X36 是 Asp 或 Glu、X37 是 Asn 或 Leu、X47 是 Asp 或 Pro、X48 是 Ala、Lys 或 Glu、X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gin、X40 是 Asp、X42是Glu、XII是Thr,并且排除X17是Thr的情況)。
[0044]【實施方式8】
[0045]實施方式1~6中任一項所述的蛋白質，其中構成多聚體的至少一個細胞膜外結構域突變體是以下的突變體蛋白質:
[0046]是野生型蛋白G.Β2結構域蛋白質的突變體蛋白質，由以下的(b)所示的氨基酸序列組成，或由在(b)所示的氨基酸序列中，1個或數個氨基酸殘基缺失、取代、插入或附加的氨基酸序列組成，具有對免疫球蛋白G的Fc區域的結合活性，并且，相比野生型蛋白G.B2結構域蛋白質，至少，對免疫球蛋白G的Fab區域的結合活性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低的突變體蛋白質:
[0047](b)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
[0048](上述氨基酸序列中 ，X35表示Asn或Lys,X36表示Asp或Glu,X37表示Asn、His、或者 Leu, X47 表示 Asp 或 Pro, X48 表示 Ala、Lys 或 Glu, X22 表示 Asp 或 His, X25 表示 Thr或 His,X32 表示 Gin 或 His,X40 表示 Asp 或 His,X42 表示 Glu 或 His, XII 表示 Thr 或 Arg,X17 表示 Thr 或 lie ;不過，同時 X35 是 Asn 或 Lys、X36 是 Asp 或 Glu、X37 是 Asn 或 His、X47 是 Asp 或 Pro、X48 是 Ala、Lys 或 Glu、X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gin、X40 是 Asp、父42是6111、乂11是1111'，并且排除乂17是11^的情況。)
[0049]【實施方式9】
[0050]實施方式1~6中任一項所述的蛋白質，其中構成多聚體的至少一個細胞膜外結構域突變體是以下的突變體蛋白質:
[0051]是野生型蛋白G.Β3結構域蛋白質的突變體蛋白質，由以下的(c)所示的氨基酸序列組成，或由在(c)所示的氨基酸序列中，1個或數個氨基酸殘基缺失、取代、插入或附加的氨基酸序列組成，具有對免疫球蛋白G的Fc區域的結合活性，并且，相比野生型蛋白G.B3結構域蛋白質，至少，對免疫球蛋白G的Fab區域的結合活性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低的突變體蛋白質:
[0052](c)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyValTrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
[0053](上述氨基酸序列中，X35表示Asn或Lys，X36表示Asp或Glu，X37表示Asn、His、或者 Leu，X47 表示 Asp 或 Pro，X48 表示 Ala、Lys 或 Glu、X22 表示 Asp 或 His，X25 表示 Thr或 His，X32 表示 Gin 或 His，X40 表示 Asp 或 His，XII 表示 Thr 或 Arg，X17 表示 Thr 或 lie ;不過，同時 X35 是 Asn 或 Lys、X36 是 Asp 或 Glu、X37 是 Asn 或 His、X47 是 Asp 或 Pro、X48是 Ala、Lys 或 Glu、X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gin、X40 是 Asp、XII 是 Thr，并且排除X17成Thr的情況)。[0054]【實施方式10】
[0055]實施方式1~6中任一項所述的蛋白質，其中構成多聚體的至少一個細胞膜外結構域突變體是以下的突變體蛋白質:
[0056]是野生型蛋白G.B1結構域蛋白質的突變體蛋白質，由以下的(d)所示的氨基酸序列組成，或由在(d)所示的氨基酸序列中，1個或數個氨基酸殘基缺失、取代、插入或附加的氨基酸序列組成，具有對免疫球蛋白G的Fc區域的結合活性，并且相比野生型蛋白G.Β1結構域蛋白質，對免疫球蛋白G的Fab區域的結合活性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低的上述突變體蛋白質:
[0057](d)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
[0058](上述氨基酸序列中，X22表示Asp或His,X25表示Thr或His, X32表示Gin或His, X40 表示 Asp 或 Hi s, X42 表示 Glu 或 His, XII 表示 Thr 或 Arg, X17 表示 Thr 或 lie ;不過，同時 X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gin、X40 是 Asp、X42 是 Glu、XII 是 Thr,并且排除X17是Thr的情況)。
[0059]【實施方式11】
[0060]實施方式1~6中任一項所述的蛋白質，其中構成多聚體的至少一個細胞膜外結構域突變體是以下的突變體蛋白質:
[0061]是野生型蛋白G.B2結構域蛋白質的突變體蛋白質，由以下的(e)所示的氨基酸序列組成，或由在(e)所示的氨基酸序列中，1個或數個氨基酸殘基缺失、取代、插入或附加的氨基酸序列組成，具有對免疫球蛋白G的Fc區域的結合活性，并且相比野生型蛋白G.Β2結構域蛋白質，對免疫球蛋白G的Fab區域的結合活性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低的上述突變體蛋白質:
[0062](e)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
[0063](上述氨基酸序列中，X22表示Asp或His,X25表示Thr或His, X32表示Gin或His, X40 表示 Asp 或 His, X42 表示 Glu 或 His, XII 表示 Thr 或 Arg, X17 表示 Thr 或 lie ;不過，同時 X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gin、X40 是 Asp、X42 是 Glu、XII 是 Thr,并且排除X17是Thr的情況)。
[0064]【實施方式12】
[0065]實施方式1~6中任一項所述的蛋白質，其中構成多聚體的至少一個細胞膜外結構域突變體是以下的突變體蛋白質:
[0066]是野生型蛋白G.B3結構域蛋白質的突變體蛋白質，由以下的(f)所示的氨基酸序列組成，或由在(f)所示的氨基酸序列中，1個或數個氨基酸殘基缺失、取代、插入或附加的氨基酸序列組成，具有對免疫球蛋白G的Fc區域的結合活性，并且相比野生型蛋白G.Β3結構域蛋白質，對免疫球蛋白G的Fab區域的結合活性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低的上述突變體蛋白質:
[0067](f)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyValTrpThrTyrAspAspAl
aThrLysThrPheThrValThrGlu
[0068](上述氨基酸序列中，X22表示Asp或His,X25表示Thr或His, X32表示Gin或His,X40表示Asp或His,XII表示Thr或Arg,X17表示Thr或lie ;不過,同時X22是Asp、X25是Thr、X32是Gin、X40是Asp、XII是Thr,并且排除X17是Thr的情況)。
[0069]【實施方式13】
[0070]實施方式1~6中任一項所述的蛋白質，其中構成多聚體的至少一個細胞膜外結構域突變體是以下的突變體蛋白質:
[0071]是野生型蛋白G*B1結構域蛋白質的突變體蛋白質，由以下的(g)所示的氨基酸序列組成，或由在(g)所示的氨基酸序列中，1個或數個氨基酸殘基缺失、取代、插入或附加的氨基酸序列組成，具有對免疫球蛋白G的Fc區域的結合活性，并且，相比野生型蛋白G.B1結構域蛋白質，對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低的上述突變體蛋白質:
[0072](g)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
[0073](上述氨基酸序列中，X22表示Asp或His,X25表示Thr或His, X32表示Gin或His, X40 表示 Asp 或 His，X42 表示 Glu 或 His ;不過，同時 X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是Gin、X40是Asp,并且排除X42是Glu的情況)。
[0074]【實施方式14】
[0075]實施方式1~6中任一項所述的蛋白質，其中構成多聚體的至少一個細胞膜外結構域突變體是以下的突變體蛋白質:
[0076]是野生型蛋白G.Β2結構域蛋白質的各突變體蛋白質，由以下的(h)所示的氨基酸序列組成，或由在(h)所示的氨基酸序列中，1個或數個氨基酸殘基缺失、取代、插入或附加的氨基酸序列組成，具有對免疫球蛋白G的Fc區域的結合活性，并且相比野生型蛋白G.Β2結構域蛋白質，對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低的上述突變體蛋白質:
[0077](h)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
[0078](上述氨基酸序列中，X22表示Asp或His,X25表示Thr或His, X32表示Gin或His, X40 表示 Asp 或 His，X42 表示 Glu 或 His ;不過，同時 X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是Gin、X40是Asp,并且排除X42是Glu的情況)。
[0079]【實施方式15】
[0080]實施方式1~6中任一項所述的蛋白質，其中構成多聚體的至少一個細胞膜外結構域突變體是以下的突變體蛋白質:
[0081]是野生型 蛋白G.Β3結構域蛋白質的各突變體蛋白質，由以下的(i)所示的氨基酸序列組成，或由在(i)所示的氨基酸序列中，1個或數個氨基酸殘基缺失、取代、插入或附加的氨基酸序列組成，具有對免疫球蛋白G的Fc區域的結合活性，并且相比野生型蛋白G.Β3結構域蛋白質，對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低的上述突變體蛋白質:
[0082](i)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyValTrpThrTyrAspAspAl
aThrLysThrPheThrValThrGlu
[0083](上述氨基酸序列中，X22表示Asp或His,X25表示Thr或His, X32表示Gin或His, X40表示Asp或His ;不過，同時X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln，并且排除X40是Asp的情況)。
[0084]【實施方式16】
[0085]實施方式1~6中任一項所述的蛋白質，其中構成多聚體的至少一個細胞膜外結構域突變體由SEQ ID NO: 13~20中任何一個所示的氨基酸序列組成，或由在該氨基酸序列中，1個或數個氨基酸殘基缺失、取代、插入或附加的氨基酸序列組成。
[0086]【實施方式17】
[0087]實施方式1~6中任一項所述的蛋白質，其中構成三聚體的3個細胞膜外結構域突變體由SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列、或者在該氨基酸序列中，1個或數個氨基酸殘基缺失、取代、插入或附加的氨基酸序列組成。
[0088]【實施方式18】
[0089]融合蛋白質，其由將實施方式1~17中任一項所述的蛋白質的氨基酸序列和其他蛋白質的氨基酸序列連結的氨基酸序列組成。
[0090]【實施方式19】
[0091]核酸，其編碼實施方式1~18中任一項所述的蛋白質。
[0092]【實施方式20】
`[0093]實施方式19所述的核酸，其中構成多聚體的細胞膜外結構域突變體是由SEQ IDNO:22~29中任何一個所示的堿基序列組成的核酸。
[0094]【實施方式21】
[0095]核酸，其與由與實施方式19或20所述的核酸的堿基序列互補的序列組成的核酸在嚴格的條件下雜交，編碼具有對免疫球蛋白G的Fc區域的結合活性，并且，相比由野生型蛋白G.B結構域的串聯型多聚體組成的蛋白質，至少，對免疫球蛋白G的Fab區域的結合活性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低的蛋白質。
[0096]【實施方式22】
[0097]重組載體，其含有實施方式19~21中任一項所述的核酸。
[0098]【實施方式23】
[0099]轉化體，其被導入實施方式22所述的重組載體。
[0100]【實施方式24】
[0101]固定化蛋白質，其特征在于實施方式1~18中任一項所述的蛋白質固定化在水不溶性的固相支持體上。
[0102]【實施方式25】
[0103]抗體、免疫球蛋白G或有免疫球蛋白G的Fc區域的蛋白質的捕獲劑，其含實施方式1~18中任一項所述的蛋白質。
[0104]【實施方式26】
[0105]抗體、免疫球蛋白G或有免疫球蛋白G的Fc區域的蛋白質的捕獲劑，其含實施方式24所述的固定化蛋白質。[0106]【發明效果】
[0107]通過本發明可提供，在中性區域維持原本的抗體結合活性，相比例如，由[SEQ IDNO: 1]所表示的氨基酸序列組成的野生型的蛋白G.B1結構域的串聯型多聚體，與IgGl及IgG3等的不同亞類的人免疫球蛋白G的Fc區域的在弱酸性區域的結合性更大降低，另一方面，相比由相同的結構域突變體組成的單體，在中性區域的抗體結合性優良的由串聯型多聚體組成的蛋白質。結果，通過利用本發明的串聯型多聚體，使捕捉的抗體在弱酸性區域中，在無變性的狀態下更容易地洗脫變得可能。
[0108]從而，在填充含該蛋白質的本發明的捕獲劑的蛋白質分離純化用層析用柱中，使捕捉的抗體在弱酸性區域中，在無變性的狀態下更容易地洗脫變得可能。
[0109]再有，在本說明書中引用的專利文獻7中，盡管公開了相當于本發明的串聯型多聚體的一般概念，但實際上未記載合成例，對如上述一樣的顯著的效果更無任何記載或提示。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0110]【圖1】是顯示鏈球菌屬(Streptococcussp.)G148來源的蛋白G的基因的結構的圖。
[0111]【圖2】是顯示蛋白G的抗體結合結構域的氨基酸序列的圖(加下劃線部是與B1結構域的相異部分)。
[0112]【圖3】是顯示鏈球菌屬(Streptococcussp.)G148來源的蛋白G的基因的堿基序列(SEQ ID N0:30)的圖(加下劃線部對應于結構基因、粗體字部對應于抗體結合結構域)。
[0113]【圖4】是顯示草酰乙酸脫羧酶α-亞基c-末端結構域(OXADac)-蛋白G突變體融合蛋白質的N末序列(SEQ ID N0:31)的圖(加下劃線部是對應于OXADac的氨基酸序列)。
[0114]【圖5】是顯示蛋白G.B2結構域和人免疫球蛋白Gi的Fc區域的復合物的立體結構的圖。
[0115]【圖6】是顯示蛋白G.Β3結構域和小鼠免疫球蛋白Gi的Fab區域的復合物的立體結構的圖。
[0116]【圖7】是顯示使用固定化柱的突變體蛋白質的在弱酸性區域的抗體解離性評價
(1)的結果的坐標圖。
[0117]【圖8】是顯示使用固定化柱的突變體蛋白質的在弱酸性區域的抗體解離性評價
(2)的結果的坐標圖。
[0118]【圖9】是將突變體蛋白質的抗體結合解離活性由表面等離子體共振(SPR)法評價的結果。從上段分別示M-PG01、M-PG07、M-PG19的傳感圖。突變體蛋白質的濃度是100，200，300，400，500nM。
[0119]【圖10】是顯示突變體蛋白質的抗體親和性(1/KD)的pH依賴性的坐標圖。
[0120]【圖11】是顯示突變體蛋白質的抗體親和性的相對的變化的坐標圖。將在各pH的解離常數(KD)用PH7.4的KD標準化。
[0121]【圖12】是顯示突變體蛋白質M-PG19的立體結構(左)的圖。為了比較，一并顯示野生型蛋白G.B1結構域的立體結構(右)。
[0122]【圖13】顯示在3’末端側融合半胱氨酸殘基、His標簽的三聚體野生型PG(CGB01H-3D，圖13上)及作為本發明的蛋白質的變異型PG (CGB19H-3D，圖13下)的結構域
結構及變異氨基酸。
[0123]【圖14】是顯示由環氧活化的CGB01H-3D固定化柱的pH梯度親和層析的結果的坐標圖。
[0124]【圖15】是顯示由環氧活化的CGB19H-3D固定化柱的pH梯度親和層析的結果的坐標圖。
[0125]【圖16】是顯示由CGB19H-3D固定化SulfoLink柱的pH梯度親和層析的結果的坐標圖。
[0126]【圖17】是顯示由環氧活化的CGB01H-3D固定化柱的pH階段的變化親和層析的結果的坐標圖。
[0127]【圖18】是顯示由環氧活化的CGB19H-3D固定化柱的pH階段的變化親和層析的結果的坐標圖。
[0128]【圖19】是顯示由環氧活化的固定化柱的pH階段的變化親和層析的結果的坐標圖。
[0129]【圖20】是顯示由CGB19H-3D固定化SulfoLink柱的pH階段的變化親和層析的結果的坐標圖。
[0130]【圖21】是顯示蛋白G的細胞膜外結構域突變體的串聯型多聚體和同突變體的單體的比較的坐標圖。
[0131]【圖22】顯示蛋白G的細胞膜外結構域突變體的單體(CGB19H-1D)、本發明的串聯型三聚體(CGB19H-3D)、本發明的串聯型四聚體(CGB19H-4D)、及本發明的串聯型五聚體(CGB19H-5D)的結構域結構。
[0132]【圖23】是顯示蛋白G的細胞膜外結構域突變體的單體(CGB19H-1D)和本發明的串聯型三聚體(CGB19H-3D)、本發明的串聯型四聚體(CGB19H-4D)、或者本發明的串聯型五聚體(CGB19H-OT)的比較的相同質量的在蛋白質固定化條件下的SPR測定的結果。
[0133]【圖24】是圖23的相同分子數的在蛋白質固定化條件下的SPR測定的結果。
[0134]【圖25】是顯示從圖22，23的SPR測定結果求出的在中性緩沖液中的抗體結合率的比較的柱狀圖(固定化量:相同質量(上)、相同分子數(下))。
[0135]【圖26】是顯示從圖22，23的SPR測定結果求出的在酸性緩沖液中的抗體解離率的比較的柱狀圖(固定化量:相同質量(上)、相同分子數(下))。
[0136]【實施方式】
[0137]作為鏈球菌來源的蛋白質的蛋白G已知有對免疫球蛋白G (—種抗體)的Fc區域的特異性結合活性(參考文獻1)、是在利用此抗體結合性的抗體的純化或除去、及利用抗體的診斷、治療、檢查等中有用的蛋白質。蛋白G在由多個結構域組成的多結構域型膜蛋白質中，顯示對有免疫球蛋白G的Fc區域的蛋白質的結合活性(以下。稱為“抗體結合活性”)是其中的一部分的細胞膜外結構域(參考文獻2)。例如，在圖1、圖3、及[SEQ ID N0:30]中所示的G148株來源的蛋白G的情況中，顯示抗體結合活性的是B1、B2、B3的3個結構域(根據文獻也表示為C1、C2、C3結構域)。另外，在GX7805株的蛋白G中存在3個抗體結合結構域，在GX7809的蛋白G中存在2個抗體結合結構域。這些均為將近60個氨基酸的小型蛋白質，在其氨基酸序列之間見到高的相同性(圖2)。另外已知，切斷蛋白G而分離各結構域單獨，仍保持抗體結合活性(參考文獻3)。
[0138]本發明涉及這樣的由具有對具有免疫球蛋白G的Fc區域的蛋白質的結合活性的細胞膜外結構域的突變體的串聯型多聚體組成的蛋白質。多聚體以上述野生型為基準，可適宜作為、例如，二聚體、三聚體、四聚體、或者五聚體。再者，本發明的蛋白質中含的構成多聚體的各自的細胞膜外結構域突變體彼此不同，或彼此相同。
[0139]再者，各細胞膜外結構域突變體也可由接頭序列連結。這樣的接頭配可考慮各突變體的氨基酸序列等，本領域技術人員適宜設計而制備。
[0140]又、本發明的蛋白質也可為由在N末端側或C末端側連結任意其他蛋白質的氨基酸序列的融合型氨基酸序列組成的融合蛋白質。例如，也可作為[氨基酸序列(a)]_接頭序列E-蛋白質A、或者，蛋白質B-接頭序列F-[氨基酸序列(a)]-接頭序列G-蛋白質C-接頭序列H-[氨基酸序列(c)]。作為這樣的融合蛋白質中使用的其他氨基酸序列，可舉出例如，圖4或[SEQ ID NO:31]所示的草酰乙酸脫羧酶α -亞基c-末端結構域(OXADac)的氨基酸序列。此時的OXADac-蛋白G突變體融合蛋白質在單一分子中具有OXADac區域來源的親和素結合活性和蛋白G突變體區域來源的抗體結合活性的多個功能，可如后述實施例所示。
[0141]例如，以His標簽附帶或與其他蛋白質的融合蛋白質的形態合成本發明的蛋白質時，合成之后，將標簽和突變體蛋白質之間，或者其他蛋白質和本發明的蛋白質之間用序列特異性蛋白分解酶分解，也有在本發明的蛋白質的N末端側或C末端側殘留1個至數個氨基酸殘基的情況，另外，在使用大腸桿菌等生產本發明的蛋白質時，有在N末端側附加起始密碼子來源的甲硫氨酸等的情況，由這些的氨基酸殘基的附加，如下所示，本發明的蛋白質的活性不變。另外，由這些的氨基酸殘基的附加，也無喪失設計的變異帶來的效果的情況。從而，本發明的蛋白質當然也含這些變異。再有，為了制成無這樣的氨基酸殘基的附加的本發明的蛋白質，例如，可將使用大腸桿菌等生產的蛋白質再使用甲硫氨酰氨基肽酶等的酶選擇性地切斷N末的氨基酸殘基(參考文獻7)、由反應混合物通過層析等分離純化而得到。
[0142]成為本發明的蛋白質中含的串聯型構成多聚體的突變體的原來的，具有對具有作為免疫球蛋白G的Fc區域的蛋白質的結合活性的細胞膜外結構域的適宜例，可舉出鏈球菌(Streptococcus)屬鏈球菌的蛋白G的B1、B2、或者B3中的任一個。
[0143]本發明的蛋白質有具有對免疫球蛋白G的Fc區域的結合活性，并且，相比由野生型蛋白G.B結構域的串聯型多聚體組成的蛋白質，至少，對免疫球蛋白G (IgGl及IgG3)的Fab區域的結合活性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合活性顯著地降低的優良的特性。
[0144]作為本發明的蛋白質中含的串聯型構成多聚體的至少一個細胞膜外結構域突變體的優選的實施方式，列舉以下的突變體蛋白質。
[0145]A.本發明的突變體蛋白質的第1實施方式如以下的(1)、(2)所示。
[0146](1)特征在于是以由SEQ ID NO: 1或2所示的氨基酸序列組成的野生型蛋白G.Β1或同 Β2 結構域蛋白質中的，Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Glu42、Thr44之中之任何1個以上的氨基酸殘基作為突變對象部位而被其他氨基酸殘基取代的突變體蛋白質，該突變對象部位的各氨基酸殘基被以下(i)~
(iii)之中任何一個所示的氨基酸殘基取代的，對免疫球蛋白G的Fc區域有結合活性，并且相比野生型蛋白G.B1或B2結構域蛋白質，對免疫球蛋白G的Fc區域的在弱酸性區域的結合活性降低的上述突變體蛋白質。
[0147](i)在突變對象部位的氨基酸殘基是非帶電荷氨基酸殘基時，向帶電荷氨基酸殘基的取代
[0148](ii)在突變對象部位的氨基酸殘基是帶電荷氨基酸殘基時，向顯示相反電荷的帶電荷氣基酸殘基的取代
[0149](iii)突變對象部位的氨基酸殘基的向組氨酸殘基的取代。
[0150](2)特征在于是以由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列組成的野生型蛋白G.B3結構域蛋白質中的，Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Thr44之中之任何1個以上的氨基酸殘基作為突變對象部位而被其他氨基酸殘基取代的突變體蛋白質，該突變對象部位的各氨基酸殘基被以下(i)~(iii)之任何中所示的氨基酸殘基取代的，對免疫球蛋白G的Fc區域有結合活性，并且相比野生型蛋白G*B3結構域蛋白質，對免疫球蛋白G的Fc區域的在弱酸性區域的結合活性降低的上述突變體蛋白質。
[0151](i)在突變對象部位的氨基酸殘基是非帶電荷氨基酸殘基時，向帶電荷氨基酸殘基的取代
[0152](ii)在突變對象部位的氨基酸殘基是帶電荷氨基酸殘基時，向顯示反電荷的帶電荷氣基酸殘基的取代
[0153](iii)突變對象部位的氨基酸殘基的向組氨酸殘基的取代。
[0154]上述(1)及(2 )的突變體蛋白質是基于以下選定的突變對象部位及該部位的氨基酸殘基的取代設計，由基因工程學的方法得到的。
`[0155]〔基于與Fc的結合表面解析的突變對象部位的選定和取代的氨基酸殘基的特別指定〕
[0156]導入用于設計本發明的突變體蛋白質的氨基酸序列的變異的部位使用蛋白G.B2結構域和免疫球蛋白G的Fc區域結合的復合物的立體結構原子座標數據(參考文獻4)選定。為了降低在弱酸性區域的蛋白G的細胞膜外結構域的抗體結合性，將與和Fc區域的結合直接相關的蛋白G的細胞膜外結構域的結合表面的氨基酸殘基及其周邊的氨基酸殘基從野生型取代為非野生型即可。從而，首先，在蛋白G.B2結構域和免疫球蛋白G的Fc區域結合的復合物中，特別指定在從Fc區域一定的距離的范圍內存在的蛋白G.Β2結構域的氨基酸殘基，將其作為突變對象部位的候選。接下來，為了使伴隨氨基酸取代的蛋白G的細胞膜外結構域的結構不穩定化處于最小限度，上述的候選之中，僅將露出到蛋白G.Β2結構域的分子表面的氨基酸殘基確定為突變對象部位。
[0157]從而，具體而言，如后述實施例中所示，將上述的距離范圍設定為6.5Λ以內，并且將露出表面積比設為40%以上，從而蛋白G.B2結構域的野生型氨基酸序列(SEQ ID N0:2)之中的，Asp22、Ala24、Thr25> Lys28> Val29、Lys31> Gln32、Asn35、Asp36、Gly38> Asp40、Glu42、Thr44的13個被選定為突變對象部位。
[0158]另外，如上所述，由于蛋白G的各細胞膜外結構域序列相同性極其高，也幾乎無B1、B2、B3結構域的立體結構的差異，對B2結構域-Fc復合物的立體結構的見解也可適用于B1及B3結構域-Fc復合物。從而，從B2結構域-Fc復合物的立體結構導出的13個是，突變對象部位只要在相當的位置有相同的種類的氨基酸，不僅是在B2結構域，在B1及B2結構域中也可選定為突變對象部位。即，蛋白G*B1結構域的野生型氨基酸序列(SEQ ID N0:1)之中的，Asp22、Ala24、Thr25> Lys28> Val29、Lys31> Gln32、Asn35、Asp36、Gly38> Asp40、Glu42、Thr44的13個，另外，蛋白G.B3結構域的野生型氨基酸序列(SEQ ID N0:3)之中的，Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Thr44 的 10 個被選定為突變對象部位。
[0159]另一方面，取代該突變對象部位的原來的氨基酸殘基的氨基酸殘基特別指定以下的(i)~(iii)中的任何一種。
[0160](i)突變對象部位的野生型的氨基酸殘基有非帶電荷的側鏈的氨基酸(Gly、Ala、Val、Leu、lie、Ser、Thr、Asn、Gln、Phe、Tyr、Trp、Met、Cys、Pro)時，被有帶電荷的側鏈的氨基酸(Asp、Glu、Lys、Arg、His)取代。帶電荷氨基酸依賴于pH而化學狀態變化大，所以可使蛋白G.B2結構域的抗體結合性在中性區域和弱酸性區域變化。
[0161](ii)突變對象部位的野生型的氨基酸殘基是帶電荷氨基酸時，被顯示反電荷的帶電荷氨基酸取代。與上述同樣地，帶電荷氨基酸依賴于pH而化學狀態變化大，所以可使蛋白G.B2結構域的抗體結合性在中性區域和弱酸性區域變化。
[0162](iii)突變對象部位的野生型的氨基酸殘基是組氨酸以外的情況時被組氨酸取代。由于組氨酸在中性區域和弱酸性區域化學狀態變化大，可使蛋白G.B2結構域的抗體結合性在中性區域和弱酸性區域變化。
[0163]具體而言，如后述實施例中所示，作為取代位置的氨基酸殘基，對于Asp22特別指定Lys、Arg、或者His,對于Ala24 (僅B1,B2結構域)特別指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,對于Thr25特別指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,對于Lys28特別指定Asp、Glu、或者His,對于Val29 (僅B1,B2結構域)特別指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,對于Lys31特別指定Asp、Glu、或者His,對于Gln32特別指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,對于Asn35特別指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,對于Asp36特別指定Lys、Arg、或者His,對于Gly38特別指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,對于Asp40特別指定Lys、Arg、或者His,對于Glu42 (僅Bl, B2結構域)特別指定Lys、Arg、或者His,對于Thr44特別指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His。但是，由這些氨基酸殘基的特別指定的氨基酸序列是，Asn35被Lys取代和/或Asp36被Glu取代，除去該取代位置以外的氨基酸序列成為與野生型蛋白G的各細胞膜結構域的氨基酸序列相同的情況。由此，與后述的本發明人的申請中涉及的升高蛋白G細胞膜結構域的穩定性的突變體蛋白質區別開來。
[0164]B.本發明的突變體蛋白質的第2實施方式如以下的(3)所示。
[0165](3)特征在于將由SEQ ID NO: 1~3中任何一個所示的氨基酸序列組成的野生型蛋白 G.Bl、B2 或 B3 結構域蛋白質中的，作為 LyslO、Thr 11, Lysl3、Glyl4、Glul5、Thrl6、Thrl7、Asn35、Asp36、Gly38之中的任何1個以上的氨基酸殘基作為突變對象部位，被除半胱氨酸之外的其他種類的氨基酸殘基取代的，對免疫球蛋白G的Fc區域有結合活性，并且相比各對應的野生型蛋白G.Bl、B2或B3結構域蛋白質，對免疫球蛋白G的Fab區域的結合性降低的突變體蛋白質。上述(3)的突變體蛋白質是基于如下選定的突變對象部位及該部位的氨基酸殘基的取代設計，由基因工程學方法得到的。
[0166]〔基于與Fab的結合表面解析的突變對象部位的選定和取代的氨基酸殘基的特別指定〕[0167]導入用于設計本發明的突變體蛋白質的氨基酸序列的變異的部位使用蛋白G.B3結構域和免疫球蛋白G的Fab區域結合的復合物的立體結構原子座標數據(參考文獻5)選定。已知蛋白G的細胞膜外結構域對于免疫球蛋白G的Fc區域也結合，對于Fab區域也結合(參考文獻2)。從而，1個抗體分子可同時與多個蛋白G的細胞膜外結構域結合，成為這樣的狀態，則抗體和蛋白G的細胞膜外結構域的相互作用成為多價，變得無容易地被切斷。從而，要想降低在弱酸性區域的蛋白G的細胞膜外結構域的抗體結合性，將與和Fab區域的結合直接相關的蛋白G的細胞膜外結構域的結合表面的氨基酸殘基從野生型取代為非野生型即可。從而，首先，在蛋白G.B3結構域和免疫球蛋白G的Fab區域結合的復合物中，特別指定在從Fab區域一定的距離的范圍內存在的蛋白G —各細胞膜B3結構域的氨基酸殘基，將其作為突變對象部位的候選。接下來，為了使伴隨氨基酸取代的蛋白G的細胞膜外結構域的結構不穩定化處于最小限度，上述的候選之中，僅將露出到蛋白G.Β3結構域的分子表面的氨基酸殘基確定為突變對象部位。
[0168]具體而言,如后述實施例中所示，將上述的距離范圍設定為4.0產以內，并且使露出表面積比成為40%以上，從而[SEQ ID N0:3]所示的蛋白G*B3結構域的野生型氨基酸序列之中的，LyslO、Thrll、Lysl3、Glyl4、Glul5、Thrl6、Thrl7、Asn35、Asp36、Gly38 的 10個被選定為突變對象部位。另外，如上所述，蛋白G的各細胞膜外結構域如上所述相同性極其高，這些的突變對象部位在B1、B2、B3的何結構域中也共同存在。從而，這些不僅是在B3結構域，在B1及B2結構域中也可被選定為突變對象部位。
[0169]另一方面，取代該突變對象部位的原來的氨基酸殘基的氨基酸殘基可由以下的方法特別指定。(iV)被野生型的氨基酸和半胱氨酸以外的其他種類的氨基酸殘基取代。由此，除了避免伴隨半胱氨酸的導入的交聯反應的危險性，還可導致與由野生型的氨基酸的變異的Fab區域的結合性的 降低。
[0170]具體而言，如后述實施例中所示，作為取代野生型蛋白G各細胞外結構域蛋白質的氨基酸殘基，對于LyslO特別指定Lys和Cys之外的殘基，對于Thrll特別指定Thr和Cys之外的殘基，對于Lysl3特別指定Lys和Cys之外的殘基，對于Glyl4特別指定Gly和Cys之外的殘基，對于Glul5特別指定Glu和Cys之外的殘基，對于Thr 16特別指定Thr和Cys之外的殘基，對于Thr 17特別指定Thr和Cys之外的殘基，對于Asn35特別指定Asn和Cys之外的殘基，對于Asp36特別指定Asp和Cys之外的殘基，對于Gly38特別指定Gly和Cys之外的殘基。但是，由這些的氨基酸殘基的選定的氨基酸序列是，Asn35被Lys和/或Asp36被Glu取代，除去該取代位置以外的氨基酸序列成為與野生型蛋白G的各細胞膜結構域的氨基酸序列相同的情況。由此，與后述的本發明人的申請中涉及的升高蛋白G細胞膜結構域的穩定性的突變體蛋白質區別開來。
[0171]C.本發明的突變體蛋白質的第3實施方式共有用于改良對上述免疫球蛋白Fc區域的結合性的氨基酸殘基的取代和用于改良向Fab區域的結合性的氨基酸殘基的取代。
[0172]〔基于與Fc及Fab的結合表面解析的突變對象部位的選定和取代的氨基酸殘基的特別指定〕
[0173]將基于上述與Fc的結合表面解析特定的突變對象部位和取代的氨基酸殘基，及基于上述Fab的結合表面解析特別指定的突變對象部位和取代的氨基酸殘基組合，進行突變對象部位的選定和取代的氨基酸殘基的特別指定。具體而言，作為突變對象部位，蛋白G.Bl、B2結構域的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO: 1，2)之中的，Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asp40、Glu42、Thr44、LyslO、Thrll、Lysl3、Glyl4、Glul5、Thrl6、Thrl7、Asn35、Asp36、Gly38 的 20 個被選定為突變對象部位。其中 Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asp40、Glu42、Thr44 是用于改良對 Fc 區域的結合性的靶部位，另外，LyslO、Thrll、Lysl3、Glyl4、Glul5、Thrl6、Thr 17 是用于改良對 Fab 區域的結合性的靶部位。其中，Asn35、Asp36、Gly38是對Fc區域的結合性的改良部位的同時是對Fab區域的結合性的改良部位。從而，被用于對于對Asn35、Asp36、Gly38的Fc區域的結合性的改良的上述A中所示的氨基酸殘基取代也同時是用于對Fab區域的結合性的改良的，除半胱氨酸殘基之外的向其他氨基酸殘基的取代。
[0174]即，本說明書中所說的氨基酸殘基取代的“共有”是指，在用于對Fc區域的結合性的改良的突變對象部位和用于對Fab區域的結合性的改良的突變對象部位被不同地選定時，除了組合氨基酸殘基的取代的情況之外，作為用于這兩者的結合性的改良的突變對象部位，選定相同的部位，在進行上述A中所示的氨基酸殘基的取代時也以該意義定義。 [0175]作為取代的氨基酸殘基，對于Asp22選定Lys、Arg、或者His,對于Ala24選定Asp、Glu、Lys、Arg、或者 His,對于 Thr25 選定 Asp、Glu、Lys、Arg、或者 His,對于 Lys28 選定 Asp、Glu、或者 His,對于 Val29 選定 Asp、Glu、Lys、Arg、或者 His,對于 Lys31 選定 Asp、Glu、或者His,對于 Gln32 選定 Asp、Glu、Lys、Arg、或者 His,對于 Asp40 選定 Lys、Arg、或者 His,對于 Glu42 選定 Lys、Arg、或者 His,對于 Thr44 選定 Asp、Glu、Lys、Arg、或者 His,對于 LyslO選定Lys和Cys之外的殘基，對于Thrll選定Thr和Cys之外的殘基，對于Lysl3選定Lys和Cys之外的殘基，對于Gly 14選定Gly和Cys之外的殘基，對于Glul5選定Glu和Cys之外的殘基，對于Thrl6選定Thr和Cys之外的殘基,對于Thrl7選定Thr和Cys之外的殘基，對于Asn35選定Asn和Cys之外的殘基,對于Asp36選定Asp和Cys之外的殘基,對于Gly38選定Gly和Cys之外的殘基。
[0176]另一方面，對于蛋白G.B3結構域而言，野生型氨基酸序列(SEQ ID N0:3)之中的，Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asp40、Thr44、LyslO、Thrll、Lysl3、Glyl4、Glul5、Thrl6、Thrl7、Asn35、Asp36、Gly38 的 17 個被選定為突變對象部位。其中 Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asp40、Thr44是用于改良對Fc區域的結合性的突變對象部位，另外，LyslO、Thrll、Lysl3、Glyl4、Glul5、Thrl6、Thr 17是用于改良對Fab區域的結合性的突變對象部位。其中Asn35、Asp36、Gly38是對Fc區域的結合性的改良部位的同時也是對Fab區域的結合性的改良部位的點是共同的，被用于對于對Asn35、Asp36、Gly38的Fc區域的結合性的改良的上述A中所示的氨基酸殘基取代也同時是用于對Fab區域的結合性的改良的除半胱氨酸殘基之外的向其他氨基酸殘基的取代，這與上述蛋白G.B1或B2結構域同樣。
[0177]但是，基于上述氨基酸殘基的選定設定的氨基酸序列是Asn35被Lys取代和/或Asp36被Glu取代，除去該取代位置以外的氨基酸序列成為與野生型蛋白G的各細胞膜結構域的氨基酸序列相同的情況。由此，與后述的本發明人的申請中涉及的升高蛋白G細胞膜結構域的穩定性的突變體蛋白質區別開來。
[0178]本發明的突變體蛋白質的具體例如以下(a)~(c)中所示。
[0179](a)是野生型蛋白G.B1結構域蛋白質的突變體蛋白質，由以下的(a)所示的氨基酸序列組成，或由在(a)所示的氨基酸序列中，1個或數個氨基酸殘基缺失、取代、插入或附加的氨基酸序列組成，具有對免疫球蛋白G的Fc區域的結合活性，并且，相比野生型蛋白G.Β1結構域蛋白質，至少，對免疫球蛋白G的Fab區域的結合活性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低的突變體蛋白質。
[0180](a)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
[0181](上述氨基酸序列中，X35表示Asn或Lys，X36表示Asp或Glu，X37表示Asn、His、或者 Leu，X47 表示 Asp 或 Pro，X48 表示 Ala、Lys 或 Glu，X22 表示 Asp 或 His，X25 表示 Thr或 His，X32 表示 Gln 或 His，X40 表示 Asp 或 His，X42 表示 Glu 或 His，XII 表示 Thr 或 Arg,X17 表示 Thr 或 lie ;不過，同時 X35 是 Asn 或 Lys、X36 是 Asp 或 Glu、X37 是 Asn 或 Leu、X47 是 Asp 或 Pro、X48 是 Ala、Lys 或 Glu、X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gln、X40 是 Asp、X42是Glu、XII是Thr,并且排除X17是Thr的情況。)
[0182](b)是野生型蛋白G.B2結構域蛋白質的突變體蛋白質，由以下的(b)所示的氨基酸序列組成，或由在(b)所示的氨基酸序列中，1個或數個氨基酸殘基缺失、取代、插入或附加的氨基酸序列組成，具有對免疫球蛋白G的Fc區域的結合活性，并且，相比野生型蛋白G.Β2結構域蛋白質，至少，對免疫球蛋白G的Fab區域的結合活性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低的突變體蛋白質。
[0183](b)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
[0184](上述氨基酸序列中，X35表示Asn或Lys，X36表示Asp或Glu，X37表示Asn、His、或者 Leu，X47 表示 Asp 或 Pro，X48 表示 Ala、Lys 或 Glu，X22 表示 Asp 或 His，X25 表示 Thr或 His，X32 表示 Gln 或 His，X40 表示 Asp 或 His，X42 表示 Glu 或 His，XII 表示 Thr 或 Arg,X17 表示 Thr 或 lie ;不過，同時 X35 是 Asn 或 Lys、X36 是 Asp 或 Glu、X37 是 Asn 或 Leu、X47 是 Asp 或 Pro、X48 是 Ala`、Lys 或 Glu、X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gln、X40 是 Asp、X42是Glu、XII是Thr,并且排除X17是Thr的情況。)
[0185](c)是野生型蛋白G.B3結構域蛋白質的突變體蛋白質，由以下的(c)所示的氨基酸序列組成，或由在(c)所示的氨基酸序列中，1個或數個氨基酸殘基缺失、取代、插入或附加的氨基酸序列組成，具有對免疫球蛋白G的Fc區域的結合活性，并且，相比野生型蛋白G.Β3結構域蛋白質，至少，對免疫球蛋白G的Fab區域的結合活性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低的突變體蛋白質。
[0186](c)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyValTrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
[0187](上述氨基酸序列中，X35表示Asn或Lys，X36表示Asp或Glu，X37表示Asn、His、或者 Leu，X47 表示 Asp 或 Pro，X48 表示 Ala、Lys 或 Glu、X22 表示 Asp 或 His，X25 表示 Thr或 His，X32 表示 Gln 或 His，X40 表示 Asp 或 His，XII 表示 Thr 或 Arg，X17 表示 Thr 或 lie ;不過，同時 X35 是 Asn 或 Lys、X36 是 Asp 或 Glu、X37 是 Asn 或 Leu、X47 是 Asp 或 Pro、X48是八1&、1^8或6111322是八8口325是1111'332是6111340是八8口342是6111、乂11 是 Thr，并且排除X17是Thr的情況。)
[0188]再有，上述(a)~(c)的氨基酸殘基的定義中，條件是與野生型蛋白G的各細胞膜結構域蛋白質及后述的本發明人的申請中涉及的升高蛋白G細胞膜結構域的穩定性的突變體蛋白質區別開來。
[0189]更具體性的本發明的突變體蛋白質加以下的(d)~(i)中所示。
[0190](d)是野生型蛋白G.B1結構域蛋白質的突變體蛋白質，由以下的(d)所示的氨基酸序列組成，或由在(d)所示的氨基酸序列中，1個或數個氨基酸殘基缺失、取代、插入或附加的氨基酸序列組成，具有對免疫球蛋白G的Fc區域的結合活性，并且相比野生型蛋白G.B1結構域蛋白質，對免疫球蛋白G的Fab區域的結合活性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低的上述突變體蛋白質。
[0191](d)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
[0192](上述氨基酸序列中，X22表示Asp或His,X25表示Thr或His, X32表示Gln或His, X40 表示 Asp 或 His, X42 表示 Glu 或 His, XII 表示 Thr 或 Arg, X17 表示 Thr 或 lie ;不過，同時 X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gln、X40 是 Asp、X42 是 Glu、XII 是 Thr,并且排除X17是Thr的情況。)
[0193](e)是野生型蛋白G.B2結構域蛋白質的突變體蛋白質，由以下的(e)所示的氨基酸序列組成，或由在(e)所示的氨基酸序列中，1個或數個氨基酸殘基缺失、取代、插入或附加的氨基酸序列組成，具有對免疫球蛋白G的Fc區域的結合活性，并且相比野生型蛋白G.B2結構域蛋白質，對免疫球蛋白G的Fab區域的結合活性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低的上述突變體蛋白質。
[0194](e)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
[0195](上述氨基酸序列中，X22表示Asp或His,X25表示Thr或His, X32表示Gln或His, X40 表示 Asp 或 His, X42 表示 Glu 或 His, XII 表示 Thr 或 Arg, X17 表示 Thr 或 lie ;不過，同時 X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gln、X40 是 Asp、X42 是 Glu、XII 是 Thr,并且排除X17是Thr的情況。)
[0196](f)是野生型蛋白G.B3結構域蛋白質的突變體蛋白質，由以下的(f)所示的氨基酸序列組成，或由在(f)所示的氨基酸序列中，1個或數個氨基酸殘基缺失、取代、插入或附加的氨基酸序列組成，具有對免疫球蛋白G的Fc區域的結合活性，并且相比野生型蛋白G.B3結構域蛋白質，對免疫球蛋白G的Fab區域的結合活性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低的上述突變體蛋白質。
[0197](f)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyValTrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
[0198](上述氨基酸序列中，X22表示Asp或His,X25表示Thr或His, X32表示Gln或His,X40表示Asp或His,XII表示Thr或Arg,X17表示Thr或lie ;不過,同時X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、XII是Thr,并且排除X17是Thr的情況。)
[0199](g)是野生型蛋白G.B1結構域蛋白質的突變體蛋白質，由以下的(g)所示的氨基酸序列組成，或由在(g)所示的氨基酸序列中，1個或數個氨基酸殘基缺失、取代、插入或附加的氨基酸序列組成，具有對免疫球蛋白G的Fc區域的結合活性，并且，相比野生型蛋白G.B1結構域蛋白質，對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低的上述突變體蛋白質。
[0200](g)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
[0201](上述氨基酸序列中，X22表示Asp或His,X25表示Thr或His, X32表示Gln或His, X40 表示 Asp 或 His，X42 表示 Glu 或 His ;不過，同時 X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是Gln、X40是Asp,并且排除X42是Glu的情況。)
[0202](h)是野生型蛋白G*B2結構域蛋白質的各突變體蛋白質，由以下的(h)所示的氨基酸序列組成，或由在(h)所示的氨基酸序列中，1個或數個氨基酸殘基缺失、取代、插入或附加的氨基酸序列組成，具有對免疫球蛋白G的Fc區域的結合活性，并且相比野生型蛋白G.B2結構域蛋白質，對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低的上述突變體蛋白質。
[0203](h)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
[0204](上述氨基酸序列中，X22表示Asp或His,X25表示Thr或His, X32表示Gln或His, X40 表示 Asp 或 His，X42 表示 Glu 或 His ;不過，同時 X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是Gln、X40是Asp,并且排除X42是Glu的情況。) [0205](i)是野生型蛋白G*B3結構域蛋白質的各突變體蛋白質，由以下的(i)所示的氨基酸序列組成，或由在(i )所示的氨基酸序列中，1個或數個氨基酸殘基缺失、取代、插入或附加的氨基酸序列組成，具有對免疫球蛋白G的Fc區域的結合活性，并且相比野生型蛋白G.B3結構域蛋白質，對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低的上述突變體蛋白質。
[0206](i)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyValTrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
[0207](上述氨基酸序列中，X22表示Asp或His,X25表示Thr或His, X32表示Gln或His, X40表示Asp或His ;不過，同時X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln，并且排除X40是Asp的情況)。再有，上述(d)~(i)的氨基酸殘基的定義中，條件是，與野生型蛋白G的各細胞膜結構域蛋白質區別開來。
[0208]從上述可知，在本發明的突變體蛋白質的設計中，選定的突變對象部位及取代該部位的氨基酸殘基不限于各一個，所以可從取代突變對象部位及該部位的氨基酸殘基之中適宜選擇，設計突變體蛋白質的氨基酸序列。例如，為了對免疫球蛋白G的Fc區域的結合性的改良，作為突變對象部位，選擇野生型蛋白G.B1或B2結構域的氨基酸序列中的Asp22、Thr25、Gln32、Asp40、及Glu42，作為與其對應的取代的氨基酸殘基，選擇Asp22His、Thr25His、Gln32His、Asp40His、及Glu42His，對蛋白G.Β1或B2結構域的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO: 1、2)進行任何1個氨基酸取代或組合這些氨基酸取代的至最大5個變異位置/5取代的點變異或多重變異，可設計多個突變體蛋白質的氨基酸序列。上述的，(g)、(h)的氨基酸序列呈現這樣的至最大5個變異位置/5取代的點變異及多重變異，是本發明的突變體蛋白質之一例。
[0209]另外，除了對上述免疫球蛋白G的Fc區域的結合性的改良之外，作為再加對Fab區域的結合性的改良的突變體蛋白質的例，可舉出對蛋白G.Β1或B2結構域的野生型氨基酸序列進行例如，選擇野生型蛋白G.Β1或Β2結構域的Thrll及Thrl7，作為與其對應的取代的氨基酸殘基，選擇ThrllArg及Thrl7Ile，將這些加到上述至最大5個變異位置/5取代的變異而導入的最大7個變異位置/7取代的變異的突變體蛋白。上述(d)及(e)的氨基酸序列顯示這樣的至最大7個變異位置/7取代的點變異或多重變異的例，這些氨基酸序列之中，有 ThrllArg 和 / 或 Thrl7Ile 的變異，并且有上述 Asp22His、Thr25His、Gln32His、Asp40His、及Glu42His所示的變異之中任何一個以上的變異，除了對免疫球蛋白G的Fc區域的結合性的改良之外，還改良對Fab區域的結合性。 [0210]另一方面，上述(i)的氨基酸序列雖是野生型蛋白G.B3的突變體蛋白質的氨基酸序列的例，但除了成為作為上述用于對F c區域的結合性改良的變異的A s p 2 2 H i s、Thr25His、Gln32His、Asp40His中的任何1個以上、至最大4個變異位置/4取代的變異之外，與(g)、(h)的氨基酸序列同樣地設計。另外，上述(f)的氨基酸序列雖是野生型蛋白G.B3的突變體蛋白質的氨基酸序列的例，但除了成為作為上述用于對Fc區域的結合性改良的變異的Asp22His、Thr25His、Gln32His、Asp40His、作為上述用于對Fab區域的結合性的改良的變異的ThrllArg、Thrl7Ile中的任何1個以上、至最大6個變異位置/6取代的變異之外，與(d)、(e)的氨基酸序列同樣地設計。
[0211]在本發明中，除了這樣的變異之外，還可再加已知使蛋白G的細胞膜外結構域的性質優化的變異。由本發明人的從前的研究可知例如，升高對蛋白G的細胞膜外結構域的熱穩定性、變性劑的化學穩定性、及對分解酶的抗性的變異方法(專利文獻6)。SP，Asn35Lys、Asp36Glu、Asn37His、Asn37Leu、Asp47Pro、Ala48Lys、及 Ala48Glu 之中一以上的變異的導入升高蛋白G.Β1、Β2或Β3結構域之上述穩定性。這些的變異可通過組合本發明中的用于對免疫球蛋白G的Fc區域的結合特性和/或對Fab區域的結合特性的改良的上述變異，從而使本發明的突變體蛋白質變得更有用。
[0212]例如，對蛋白G.Β1或B2結構域的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO: 1，2)進行將這些變異加到上述的最大7個變異位置/7取代而導入的至最大12個變異位置/14取代的多重變異，從而可設計更穩定化的，多個突變體蛋白質的氨基酸序列。
[0213]上述的，(a)、(b)的氨基酸序列顯示這樣的最大12個變異位置/14取代的點變異及多重變異，但排除加到野生型的序列而僅用于穩定化的變異。
[0214]這些的(a)、(b)的氨基酸序列中，Asn35Lys、Asp36Glu、Asn37His、Asn37Leu、Asp47Pro、Ala48Lys及Ala48Glu之中，任何一個以上的變異的導入除了上述的最大7個變異位置/7取代的效果的對免疫球蛋白G的Fab區域的結合特性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合特性的改良之外，升高蛋白G.B1或B2結構域突變體蛋白質的穩定性。
[0215]另一方面，上述(c)顯示野生型蛋白G.Β3的突變體蛋白質的氨基酸序列的例，顯示最大11個變異位置/13取代的點變異及多重取代，但除了成為上述用于對Fc區域的結合性改良用的變異的，Asp22His、Thr25His、Gln32His、Asp40His中的任何1個以上、至最大4變異位置/4取代的變異之外，與(a)、(b)的氨基酸序列同樣地設計。從而，(c)的氨基酸序列中，Asn35Lys、Asp36Glu、Asn37His、Asn37Leu、Asp47Pro、Ala48Lys 及 Ala48Glu 之中，任何一個以上的變異的導入除了對免疫球蛋白G的Fab區域的結合特性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合特性的改良之外，同樣地升高蛋白G.B3結構域突變體蛋白質的穩定性。[0216]本發明中的突變對象部位，如上所述使用蛋白G的B2結構域-Fc復合物及同B3結構域-Fab復合物的各立體結構原子座標數據選定，但Bl結構域不僅是在氨基酸序列(圖
2)、在立體結構上也與B2結構域幾乎無差異，所以上述選定的變異的效果對各自的結構域等同有效。另外，B3結構域，不僅在氨基酸序列(圖2)、在立體結構上也與B2結構域幾乎無差異，所以B2結構域中的上述選定的變異的效果對各結構域等同有效。
[0217]例如，上述選定的12個變異位置的野生型氨基酸殘基在上述B2結構域和上述B1結構域之間全部共同。從而，對與B2結構域相同性高的B1氨基酸序列導入將上述選定的5個變異位置/5取代、或者7個變異位置/7取代、或者12個變異位置/14取代組合的點變異及多重變異，可作為B1結構域的突變體蛋白質的氨基酸序列。另外，上述選定的12個變異位置的野生型氨基酸只要除去42位，在上述B2結構域和上述B3結構域之間全部共同(42位的野生型氨基酸殘基在B2結構域中是Glu42、在B3結構域中是Val42)。從而，對與B2結構域相同性高的B3結構域的氨基酸序列導入將從上述選定的5個變異位置/5取代、或者7個變異位置/7取代、或者12個變異位置/14取代，除去僅42位的變異位置的4個變異位置/4取代、或者6個變異位置/6取代、或者11個變異位置/13取代組合的點變異及多重變異，可作為B3結構域的突變體蛋白質的氨基酸序列。這如后述實施例中所示，還可從使用蛋白G的B2結構域-Fc復合物及同B3結構域-Fab復合物的各立體結構原子座標數據選定的B1結構域的突變體蛋白質有期望的性能得知。
[0218]以上、本發明的突變體蛋白質的氨基酸序列不限于一個，存在多個，這些中，具體例示優選的序列，則可舉出例如，[SEQ ID NO: 13]、[SEQ ID NO: 14]、[SEQ ID NO: 15]、[SEQID NO: 16]、[SEQ ID NO: 17]、[SEQ ID NO: 18]、[SEQ ID NO: 19]、或者[SEQ ID NO: 20]所
示的氨基酸序列。
[0219][SEQ ID NO: 13]所示的突變體蛋白質是，對[SEQ ID NO: 1]所示的蛋白G.Bl結構域的野生型氨基酸序列，向從發明人的從前的研究得知升高對蛋白G的細胞膜外結構域的熱穩定性、變性劑的化學穩定性、及對分解酶的抗性的部位導入變異的蛋白質，[SEQ IDNO: 14]、[SEQ ID NO: 15]、[SEQ ID NO: 19]、及[SEQ ID NO: 20]所示的突變體蛋白質是，除此之外，向基于與Fc的結合表面解析選定的部位導入變異的蛋白質。
[0220]另一方面，[SEQID NO: 16]、[SEQ ID NO: 17]、及[SEQ ID NO: 18]所示的突變體蛋白質是，對[SEQ ID NO: 1]所示的蛋白G*B1結構域的野生型氨基酸序列，向由發明人的從前的研究得知升高蛋白G的細胞膜外結構域的熱穩定性、對變性劑的化學穩定性、及對分解酶的抗性的部位，和基于Fab的結合表面解析選定的部位導入變異的蛋白質。
[0221]本發明的突變體蛋白質只要對抗體或免疫球蛋白G或有免疫球蛋白G的Fc區域的蛋白質有結合活性，相比野生型的蛋白G的各細胞膜外結構域蛋白質，至少，對免疫球蛋白G的Fab區域的結合活性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低，則在上述本發明的突變體蛋白質中任何一個所示的氨基酸序列中，一個或數個(例如，2個~5個)的氨基酸殘基發生缺失、取代、插入、附加等的變異也可，從而，它們對成為基準的各氨基酸序列，序列相同性是90%以上、優選為95%以上、更優選為98%以上。
[0222]作為本發明的蛋白質之一例，可舉出實施例中記載的，構成串聯型多聚體的3個細胞膜外結構域突變體由SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列組成的蛋白質。
[0223]1.蛋白質的制造
[0224](1)由基因工程學方法的蛋白質的制造
[0225]a.編碼突變體蛋白質的基因
[0226]在本發明中為了制造上述設計的蛋白質，可使用基因工程學方法。
[0227]這樣的方法中使用的基因是由編碼上述A~C中所示的蛋白質、更具體而言，上述(a)~(i)中的任一個所示的氨基酸序列，或者在(a)~(i)中任何一個所示的氨基酸序列中1或數個氨基酸殘基有缺失、取代或附加的氨基酸序列的蛋白質，并且編碼與抗體或免疫球蛋白G或有免疫球蛋白G的Fc區域的蛋白質有結合活性，并且相比中性區域在弱酸性區域的結合活性降低的蛋白質的核酸組成，例如，更具體而言，由[SEQ ID N0:22]~[SEQID NO:29]所示的任何的堿基序列組成的核酸。
[0228]另外，作為本發明中使用的基因，可舉出與由與以上的核酸的堿基序列互補的序列組成的核酸在嚴格的條件下雜交的核酸，并且編碼對抗體或免疫球蛋白G或有免疫球蛋白G的Fc區域的蛋白質有結合活性，并且相比對應的各野生型蛋白G —細胞膜外結構域蛋白質，對免疫球蛋白G的Fab區域的結合活性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低的上述突變體蛋白質的蛋白質的核酸。其中，嚴格的條件是指，形成特異性的雜交體，不形成非特異性的雜交體的條件。例如，例如，是指有高的相同性(相同性為60%以上、優選為80%以上、更優選為90%以上、最優選為90%以上)的核酸雜交的條件。更具體而言是指，鈉濃度是150~900mM、優選為600~900mM，溫度是60~68°C、優選為65°C的條件。例如雜交條件是65°C，清洗的條件是在含`0.1%SDS的0.1XSSC中65°C、10分鐘的情況，由慣例方法、例如DNA印跡、點印跡雜交等確認雜交時，稱之為在嚴格的條件下雜交。
[0229]作為編碼本發明的蛋白質的基因，根據本發明的蛋白質的希望得到的結構，含以上的核酸和編碼上述任意的接頭序列的核酸。也可為編碼構成串聯型多聚體的各突變體蛋白質的核酸和編碼接頭序列的核酸分別交替多個連結，或者也可將該核酸和編碼任意的蛋白質的氨基酸序列的核酸連結，設計為編碼融合型氨基酸序列。
[0230]b.基因、重組載體及轉化體
[0231]上述的本發明的基因可由化學合成、PCR、盒變異法、位點特異性變異導入法等合成。例如，化學合成多個在末端有20個堿基對左右的互補區域的至100堿基左右的寡核苷酸，可通過將這些組合進行重疊延伸法(參考文獻8)來全合成目的基因。
[0232]本發明的重組載體可通過向適當的載體連結(插入)含上述的堿基序列的基因而得到。作為本發明中使用的載體，只要是可在宿主中復制的或可將目的基因重組進宿主基因組的，就不特別限定。例如，可舉出噬菌體、質粒、粘粒、噬菌粒等。
[0233]作為質粒DNA，可舉出放線菌來源的質粒(例如pK4，pRK401, pRF31等)、大腸桿菌來源的質粒(例如pBR322，pBR325，pUC118，pUC119，pUC18等)、枯草芽孢桿菌來源的質粒(例如pUB110，pTP5等)、酵母來源的質粒(例如YEpl3，YEp24，YCp50等)等，作為噬菌體DNA，可舉出λ噬菌體(λgtlO、λgtll、λZAP等)。再者，也可使用逆病毒或痘苗病毒等的動物病毒、桿狀病毒等的昆蟲病毒載體。
[0234]為了將載體插入基因，首先采用，將純化的DNA用適當的限制性內切酶切斷，插入適當的載體DNA的限制性內切酶部位或多克隆位點而連結到載體的方法等。基因有必要整合入載體至表達本發明的突變體蛋白質。從而，在本發明的載體中，啟動子、基因的堿基序列之外，根據期望可連結增強子等的順式元件、剪接信號、聚A附加信號、選擇標志物、核糖體結合序列(SD序列)、起始密碼子、終止密碼子等。另外，也可連結用于使制造的蛋白質的純化容易的標簽序列。作為標簽序列，可利用編碼His標簽、GST標簽、MBP標簽、BioEase標簽等的公知的標簽的喊基序列。
[0235]是否基因被插入載體的確認可利用公知的基因工程學技術進行。例如，在質粒載體等的情況中，可通過使用感受態細胞將載體亞克隆，提取DNA后，使用DNA測序儀特定其堿基序列來確認。對于其他載體也可使用細菌或其他宿主進行亞克隆的，可利用同樣的方法。另外，利用藥劑抗性基因等的選擇標志物的載體篩選也有效。
[0236]轉化體可通過將本發明的重組載體以本發明的突變體蛋白質可表達的方式導入宿主細胞來得到。作為轉化中使用的宿主，只要是可表達蛋白質或多肽，就無特別限定。例如，可舉出細菌(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等)、酵母、植物細胞、動物細胞(COS細胞、CH0細胞等)、昆蟲細胞。
[0237]在以細菌作為宿主時，優選重組載體可在該細菌中自律復制的同時，由啟動子、核糖體結合序列、起始密碼子、編碼本發明的突變體蛋白質的核酸、轉錄終止序列構成。作為大腸桿菌，可舉出例如大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21等,作為枯草芽孢桿菌，可舉出例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等。向細菌的重組載體的導入方法，只要是向細菌導入DNA的方法，就無特別限定。例如可舉出熱休克法、使用鈣離子的方法、電穿孔法
坐寸。
[0238]以酵母作為宿主時，使用例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等。向酵母的重組載體的導入方法，只要是向酵母導入DNA的方法，就無特別限定，可舉出例如電穿孔法、原生質球法、醋酸鋰法等。
[0239]以動物細胞作為宿主時，使用猴細胞⑶S_7、Vero、中國倉鼠卵巢細胞(CH0細胞)、小鼠L細胞、大鼠GH3、人FL細胞等。作為向動物細胞的重組載體的導入方法，可舉出例如電穿孔法、磷酸鈣法、脂轉染法等。
[0240]以昆蟲細胞作為宿主時，使用Sf9細胞等。作為向昆蟲細胞的重組載體的導入方法，可舉出例如磷酸鈣法、脂轉染法、電穿孔法等。
[0241]確認基因是否被導入宿主可由PCR法、Southern雜交法、Northern雜交法等進行。例如，從轉化體制備DNA，設計DNA特異性引物進行PCR。接下來，對于PCR的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳或毛細管電泳等，由溴化乙唳、SyberGreen液等染色，通過作1條條帶檢測擴增產物，可確認轉化。另外，也可使用預先由熒光染料等標記的弓丨物進行PCR，檢測擴增產物。
[0242]c.由轉化體培養的蛋白質的取得
[0243]在作為重組蛋白質制造時，本發明的蛋白質可通過培養上述的轉化體，從該培養物采集來得到。培養物可指，培養上清、培養細胞或培養菌體或細胞或菌體的破碎物之任何。培養本發明的轉化體的方法根據宿主的培養中使用的通常的方法進行。[0244]培養以大腸桿菌或酵母菌等的微生物作為宿主而得到的轉化體的培養基含有微生物可利用的碳源、氮源、無機鹽類等，只要是可有效進行轉化體的培養的培養基，也可使用天然培養基、合成培養基之任何。作為碳源，可舉出葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉等的碳水化物、醋酸、丙酸等的有機酸、乙醇、丙醇等的醇類。作為氮源，可舉出氨、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨等的無機酸或有機酸的銨鹽或其他含氮化合物之外，還可舉出胨、肉提取物、玉米漿等。作為無機物，可舉出磷酸一鉀、磷酸二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。培養，通常在振蕩培養或通氣攪拌培養等的好氧的條件下，于20~37°C進行12小時~3天。
[0245]培養后，在菌體內或細胞內生產本發明的蛋白質時，通過重復實施超聲波處理、冷凍融解，均漿器處理等破碎菌體或細胞而采集該蛋白質。另外，在菌體外或細胞外生產該蛋白質時，直接使用培養液，由離心分離等除去菌體或細胞。其后，通過單獨或適宜組合使用蛋白質的分離純化中使用的一般生物化學方法、例如硫酸銨沉淀、凝膠層析、離子交換層析、親和層析等，可從上述培養物中分離純化本發明的蛋白質。
[0246]另外，利用混合蛋白質的生物合成反應中涉及的因子(僅酶、核酸、ATP、氨基酸等)的，所謂的無細胞合成系統，則不使用活細胞，可由載體將本發明的突變體蛋白質在試管內合成(參考文獻9)。其后，使用與上述同樣的純化法，可從反應后的混合溶液分離純化本發明的突變體蛋白質。
[0247]為了確認分離純化的本發明的蛋白質是否是由目的氨基酸序列組成的蛋白質，分析含該蛋白質的樣品。作為分析方法，可利用SDS-PAGE、蛋白印跡、質譜分析、氨基酸分析、氨基酸測序儀等(參考文獻10)。
[0248](2)由其他方法的蛋白質的制造
[0249]本發明的蛋白質也可由有機化學方法、例如固相肽合成法等制造。利用這樣的方法的蛋白質的生產方法在當【技術領域】公知，接下來對其進行簡潔說明。
[0250]由固相肽合成法以化學方式制造蛋白質時，優選利用自動合成機，通過重復活化的氨基酸衍生物的縮聚反應，在樹脂上合成有本發明的蛋白質的氨基酸序列的保護多肽。接下來，將此保護多肽從樹脂上切斷，則一同側鏈的保護基也同時切斷。已知在此切斷反應中，根據樹脂或保護基的種類、氨基酸的組成，有適宜的混合物(參考文獻11 )。此后，從有機溶劑層將粗純化蛋白質移到水層，純化目的蛋白質。作為純化法，可利用逆相層析等(參考文獻11)。
[0251]2.蛋白質的固定化
[0252]本發明的蛋白質，利用其抗體結合性，可作為抗體等的捕獲劑利用。該抗體捕獲劑可在抗體的純化或除去、利用抗體的診斷、治療、檢查等中使用。
[0253]本發明的抗體捕獲劑只要含本發明的蛋白質，可為任何形態，優選為，將本發明的突變體蛋白質固定化到水不溶性的固相支持體的形態是適宜的。作為使用的水不溶性載體，可舉出玻璃珠、硅膠等的無機載體、交聯聚乙烯基醇、交聯聚丙烯酸酯、交聯聚丙烯酰胺、交聯聚苯乙烯等的合成高分子或結晶性纖維素、交聯纖維素、交聯瓊脂糖、交聯葡聚糖等的多糖類制成的有機載體、還有由這些的組合得到的有機-有機、有機-無機等的復合載體等，在其中，由于親水性載體非特異吸附比較少，抗體或免疫球蛋白G或有免疫球蛋白G的Fc區域的蛋白質的選擇性是良好而優選。這里說到的親水性載體是指，使構成載體的化合物成為平板狀時的與水的接觸角是60度以下的載體。作為這樣的載體，可舉出纖維素、殼聚糖、葡聚糖等的多糖類、聚乙烯基醇、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物皂化物、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸接枝化聚乙烯、聚丙烯酰胺接枝化聚乙烯、玻璃等制成的載體作為代表例。
[0254]作為市售品，可例示作為多孔質纖維素凝膠的GCL2000、GC700、烯丙基葡聚糖和亞甲基雙丙烯酰胺由共價鍵交聯的Sephacryl S-1000、作為丙烯酸系的載體的Toyopearl、作為瓊脂糖系的交聯載體的Sephar0SeCL4B、作為由環氧基活化的聚甲基丙烯酰胺的EupergitC250L等。但是，在本發明中不僅限于這些載體、活化載體。上述的載體可各自單獨使用，也可將任意2種以上混合。另外、作為本發明中使用的水不溶性載體，從本抗體捕獲劑的使用目的及方法來看，表面積大是優選的，有多數適當大小的細孔，即，多孔質是優選的。
[0255]作為載體的形態，珠狀、纖維狀、膜狀(也包括中空絲)等均可，可選任意的形態。從具有特定的排除極限分子量的載體制作的容易度來看珠狀是特別優選使用的。珠狀的平均粒徑以10~2500 μ m的容易使用，尤其是，從配體固定化反應的容易度的方面來看，25 μ m~800 μ m的范圍是優選的。
[0256]再者，在載體表面存在可在配體的固定化反應中使用的官能基，則適合于配體的固定化。作為這些官能基的代表例，可舉出羥基、氨基、醛基、羧基、巰基、硅烷醇基、酰胺基、環氧基、琥珀酰亞胺基、酸酐基、碘乙酰基等。
[0257]在向上述載體的突變體蛋白質的固定化中，通過使突變體蛋白質的立體障礙變小來升高捕捉效率，再者 ，為了抑制非特異性的結合，經親水性間隔物固定化是更優選的。作為親水性間隔物，例如，使用將兩末端用羧基、氨基、醛基、環氧基等取代的聚亞烷基氧化物的衍生物是優選的。
[0258]導入上述的載體的突變體蛋白質及作為間隔物使用的有機化合物的固定化方法及條件不特別限定，一般而言例示將蛋白質或肽固定化到載體時采用的方法。可舉出使載體與溴化氰、表氯醇、二縮水甘油基醚、甲苯磺酰氯化物、三氟乙磺酰氯化物、肼等反應而活化載體(由載體原本具有的官能基而作為配體固定化的化合物變成易反應的官能基)、與作為配體固定化的化合物反應、固定化的方法、另外，通過向載體和作為配體固定化的化合物存在的系統加如碳二亞胺一樣的縮合試劑、或者，如戊二醛一樣分子中具有多個官能基的試劑而縮合、交聯的固定化方法，但在捕獲劑的滅菌時或利用時適用蛋白類不容易從載體脫離的固定化方法是更優選的。
[0259]1.蛋白質及抗體捕獲劑的性能確認試驗
[0260]如上述一樣制造的突變體蛋白質及蛋白質(以下，也簡稱為“蛋白質”)、及抗體捕獲劑可選擇可進行以下的性能確認試驗的良好的物質，本發明的蛋白質及抗體捕捉材料均有良好的性能。
[0261](1)抗體結合性試驗
[0262]本發明的蛋白質的抗體結合性可利用蛋白印跡、免疫沉降、下拉測定、ELISA (酶聯免疫吸附測定)、表面等離子體共振(SPR)法等確認一評價。在其中，SPR法由于可無需標記地實時經時觀察活體間的相互作用，從而可從速度論的觀點定量評價突變體蛋白質的結合反應。[0263]另外，固定化到水不溶性的固相支持體的突變體蛋白質的抗體結合性可用上述的SPR法或液相層析法確認一評價。在其中，液相層析法可的確評價給抗體結合性帶來的pH依賴性。
[0264](2)蛋白質的熱穩定性試驗
[0265]本發明的突變體蛋白質的熱穩定性可利用圓二色性(CD)光譜、熒光光譜、紅外分光法、示差掃描熱量測定法、加熱后的殘留活性等進行評價。在其中，CD光譜由于是敏銳反映蛋白質的二級結構的變化的分光學分析方法，觀測突變體蛋白質的對溫度的立體結構的變化，可熱力學地定量評價結構穩定性。
[0266]〔參考文獻〕 [0267]參考文獻1 ;Bjorck L,Kronvall G.(1984)Purification and some propertiesof streptococcal protein G，a novel IgG—binding reagent.J Immunol.133，69—74。
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[0277]參考文獻11 ;大野茂男、西村善文監修(1997)蛋白質實驗流程2_結構解析編、秀潤社
[0278]以下，使用實施例具體說明本發明。但是，本發明的技術的范圍不限于這些實施例。再有，在本說明書中，各種氨基酸殘基用以下的縮寫記載。Ala ;L-丙氨酸殘基、Arg;L-精氨酸殘基、Asp ；L-天冬氨酸殘基、Asn ；L-天冬酰胺殘基、Cys ;L_半胱氨酸殘基、Gln ；L-谷氨酰胺殘基、Glu ;L_谷氨酸殘基、Gly ;L_甘氨酸殘基、His ;L_組氨酸殘基、lie ;L-異亮氨酸殘基、Leu ；L-亮氨酸殘基、Lys ;L_賴氨酸殘基、Met ；L-甲硫氨酸殘基、Phe ;L_苯丙氨酸殘基、Pro ;L-脯氨酸殘基、Ser ；L-絲氨酸殘基、Thr ；L-蘇氨酸殘基、Trp ；L-色氨酸殘基、Tyr ；L-酪氨酸殘基、Val ；L-纈氨酸殘基。另外，在本說明書中，將肽的氨基酸序列，以其氨基末端(以下稱為N末端)位于左側，羧基末端(以下稱為C末端)位于右側的方式，根據常規方法記述。
【實施例】
[0279]【實施例1】
[0280]在本實施例中，選定用于設計向蛋白G的Bl、B2、或者B3結構域導入變異的成為本發明的基礎的突變體蛋白質(此后稱為“改性蛋白G”)的氨基酸序列的導入變異的部位，特別指定取代的氨基酸殘基。
[0281]【1.基于與Fc的結合表面解析的突變對象部位的選定和取代的氨基酸殘基的特別指定】
[0282]首先，蛋白G.Β2結構域和人免疫球蛋白Gi的Fc區域的復合物的立體結構座標數據從作為國際性的蛋白質立體結構數據庫的Protein Data Bank (PDB ；http://www.rcsb.0rg/pdb/home/home.do)下載(PDB編碼:1FCC)。接下來，將是在從Fc區域(6,5▲的距離的范圍內存在的蛋白G.Β2結構域的氨基酸殘基，并且，在蛋白G.Β2結構域單獨的情況具有40%以上的露出表面積比的氨基酸殘基使用該立體結構座標數據進行計算，選定為突變對象部位。選定的部位的氨基酸殘基是[SEQ ID N0:2]所示的蛋白G*B2結構域的野生型氨基酸序列之中的，Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Glu42、Thr44的13個。圖5表示了這些的突變對象部位的位置。這些突變對象部位在B1結構域中也共同存在。從而，這些不僅是在B2結構域，在B1結構域中也可選定為突變對象部位。即，將[SEQ ID NO: 1]所示的蛋白G.B1結構域的野生型氨基酸序列之中的，Asp22、Ala24、Thr25>Lys28>V`al29、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Glu42、Thr44的13個選定為突變對象部位。另外，這些的突變對象部位之一部分在B3結構域中也共同存在。從而，這些不僅是在B2結構域，在B3結構域中也可選定為突變對象部位。SP，選定[SEQ ID N0:3]所示的蛋白G.B3結構域的野生型氨基酸序列之中的，Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Thr44 的 10 個為突變對象部位。
[0283]另一方面，取代選定的突變對象部位的原來的氨基酸殘基的氨基酸殘基，(i)在原來的氨基酸殘基有非帶電荷的側鏈的氨基酸(Gly、Ala、Val、Leu、lie、Ser、Thr、Asn、Gln、Phe、Tyr、Trp、Met、Cys、Pro)時，特別指定為有帶電荷的側鏈的氨基酸(Asp、Glu、Lys、Arg、His)，(ii)在原來的氨基酸殘基是帶電荷氨基酸時，特別指定為顯示反電荷的帶電荷氨基酸。或者，(iii)在原來的氨基酸殘基是組氨酸以外的氨基酸殘基時，特別指定組氨酸。SP，對于Asp22特別指定Lys、Arg、或者His,對于Ala24特別指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,對于Thr25特別指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,對于Lys28特別指定Asp、Glu、或者His,對于Val29特別指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,對于Lys31特別指定Asp、Glu、或者His,對于 Gln32 特別指定 Asp、Glu、Lys、Arg、或者 His,對于 Asn35 特別指定 Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,對于Asp36特別指定Lys、Arg、或者His,對于Gly38特別指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,對于Asp40特別指定Lys、Arg、或者His,對于Glu42特別指定Lys、Arg、或者His,對于Thr44特別指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His取代的氨基酸殘基。
[0284]再有，本實施例的計算使用ccp4i4.0 (Daresbury Laboratory, UK Science andTechnology Facilities Council)、Surface Racer3.0for Linux (Dr.0leg Tsodikov,TheUniversity of Michigan)、Red Hat Enterprise Linux WS release 3 (Red Hat)(以上軟件)、Dell Precision Workstation370 (Dell)(以上硬件)執行。
[0285]【2.基于與Fab的結合表面解析的突變對象部位的選定和取代的氨基酸殘基的特別指定】 [0286]首先，將蛋白G.B3結構域和小鼠免疫球蛋白Gi的Fab區域的復合物的立體結構座標數據從作為國際性的蛋白質立體結構數據庫的Protein Data BankCPDB ；http://www.rcsb.0rg/pdb/home/home.do)下載(PDB編碼:1IGC)。接下來，將是在從Fab區域4.0人的距離的范圍內存在的蛋白G.Β3結構域的氨基酸殘基，并且，在蛋白G.Β3結構域單獨的情況具有40%以上的露出表面積比的氨基酸殘基使用該立體結構座標數據進行計算，選定為突變對象部位。選定的部位的氨基酸殘基是[SEQ ID N0:3]所示的蛋白G*B3結構域的野生型氛基酸序列之中的，LyslO、Thrll> Lysl3> Glyl4> Glul5、Thrl6> Thrl7、Asn35、Asp36、Gly38的10個。圖6表示了這些的突變對象部位的位置。這些的突變對象部位在Bl、B2、B3的何結構域中共同存在。從而，這些不僅是在B3結構域，在B1及B2結構域中也可選定為突變對象部位。即，將[SEQ ID NO: 1]及[SEQ ID NO:2]所示的蛋白G.Bl結構域及B2結構域的野生型氨基酸序列之中的，LyslO、Thrll、Lysl3、Glyl4、Glul5、Thrl6、Thrl7、Asn35、Asp36、Gly38的10個選定為突變對象部位。
[0287]另一方面，取代選定的突變對象部位的原來的氨基酸殘基的氨基酸殘基特別指定為(iv)原來的氨基酸和半胱氨酸以外的其他種類的氨基酸殘基。即，對于LyslO特別指定Lys和Cys之外的殘基，對于Thrll特別指定Thr和Cys之外的殘基，對于Lysl3特別指定Lys和Cys之外的殘基，對于Gly 14特別指定Gly和Cys之外的殘基，對于Glul5特別指定Glu和Cys之外的殘基，對于Thr 16特別指定Thr和Cys之外的殘基，對于Thr 17特別指定Thr和Cys之外的殘基，對于Asn35特別指定Asn和Cys之外的殘基，對于Asp36特別指定Asp和Cys之外的殘基，對于Gly38特別指定Gly和Cys之外的殘基取代的氨基酸殘基。
[0288]再有，本實施例的計算使用ccp4i 4.0 (Daresbury Laboratory,UK Science andTechnology Facilities Council)> Surface Racer 3.0 for Linux (Dr.0leg Tsodikov,The University of Michigan)、Red Hat Enterprise Linux WS release 3(Red Hat)(以上軟件)、Dell Precision Workstation370 (Dell)(以上硬件)執行。
[0289]【3.基于與Fc及Fab的結合表面解析的突變對象部位的選定和取代的氨基酸殘基的特別指定】
[0290]將基于上述Fc和的結合表面解析及上述Fab的結合表面解析選定的突變對象部位和特別指定的取代的氨基酸殘基組合。
[0291]即，將[SEQ ID NO: 1]所示的蛋白G.Bl結構域的野生型氨基酸序列之中的，Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asp40、Glu42、Thr44、LyslO、Thrll、Lysl3、Glyl4、Glul5、Thrl6、Thrl7、Asn35、Asp36、Gly38 的 20 個選定為突變對象部位。取代原來的氨基酸殘基的氨基酸殘基是，對于Asp22特別指定Lys、Arg、或者His，對于Ala24特別指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,對于Thr25特別指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,對于Lys28特別指定Asp、Glu、或者His,對于Val29特別指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,對于Lys31特別指定Asp、Glu、或者His,對于Gln32特別指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,對于Asp40特別指定Lys、Arg、或者His,對于Glu42特別指定Lys、Arg、或者His,對于Thr44特別指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,對于LyslO特別指定Lys和Cys之外的殘基，對于Thrll特別指定Thr和Cys之外的殘基，對于Lysl3特別指定Lys和Cys之外的殘基，對于Gly 14特別指定Gly和Cys之外的殘基，對于Glul5特別指定Glu和Cys之外的殘基，對于Thr 16特別指定Thr和Cys之外的殘基，對于Thr 17特別指定Thr和Cys之外的殘基，對于Asn35特別指定Asn和Cys之外的殘基，對于Asp36特別指定Asp和Cys之外的殘基，對于Gly38特別指定Gly和Cys之外的殘基。
[0292]另外，將[SEQ ID NO:2]所示的蛋白G.B2結構域的野生型氨基酸序列之中的，Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asp40、Glu42、Thr44、LyslO、Thrll、Lysl3、Glyl4、Glul5、Thrl6、Thrl7、Asn35、Asp36、Gly38 的 20 個選定為突變對象部位。取代原來的氨基酸殘基的氨基酸殘基是，對于Asp22特別指定Lys、Arg、或者His，對于Ala24特別指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,對于Thr25特別指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,對于Lys28特別指定Asp、Glu、或者His,對于Val29特別指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,對于Lys31特別指定Asp、Glu、或者His,對于Gln32特別指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,對于Asp40特別指定Lys、Arg、或者His,對于Glu42特別指定Lys、Arg、或者His,對于Thr44特別指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,對于LyslO特別指定Lys和Cys之外的殘基，對于Thrll特別指定Thr和Cys之外的殘基，對于Lysl3特別指定Lys和Cys之外的殘基，對于Gly 14特別指定Gly和Cys之外的殘基，對于Glul5特別指定Glu和Cys之外的殘基，對于Thr 16特別指定Thr和Cys之外的殘基，對于Thr 17特別指定Thr和Cys之外的殘基，對于Asn35特別指定Asn和Cys之外的殘基，對于Asp36特別指定Asp和Cys之外的殘基，對于Gly38特別指定Gly和Cys之外的殘基。
[0293]另外，將[SE Q ID NO:3]所示的蛋白G.B3結構域的野生型氨基酸序列之中的，Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asp40、Thr44、LyslO、Thrll、Lysl3、Glyl4、Glul5、Thrl6、Thrl7、Asn35、Asp36、Gly38的17個選定為突變對象部位。
[0294]取代原來的氨基酸殘基的氨基酸殘基是，對于Asp22特別指定Lys、Arg、或者His，對于Thr25特別指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,對于Lys28特別指定Asp、Glu、或者His,對于Lys31特別指定Asp、Glu、或者His,對于Gln32特別指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,對于Asp40特別指定Lys、Arg、或者His,對于Thr44特別指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,對于LyslO特別指定Lys和Cys之外的殘基，對于Thrll特別指定Thr和Cys之外的殘基，對于Lysl3特別指定Lys和Cys之外的殘基，對于Glyl4特別指定Gly和Cys之外的殘基，對于Glul5特別指定Glu和Cys之外的殘基，對于Thr 16特別指定Thr和Cys之外的殘基，對于Thr 17特別指定Thr和Cys之外的殘基，對于Asn35特別指定Asn和Cys之外的殘基，對于Asp36特別指定Asp和Cys之外的殘基，對于Gly38特別指定Gly和Cys之外的殘基。
[0295]【實施例2】
[0296]在本實施例中，利用上述選定的突變對象部位和上述特別指定的取代的氨基酸殘基的信息設計改性蛋白G的氨基酸序列。
[0297]從上述可知，由于突變對象部位及取代該部位的氨基酸殘基不限于各一個，可從突變對象部位及取代該部位的氨基酸殘基之中適宜選擇而設計突變體蛋白質的氨基酸序列。其選擇可隨機進行，也可考慮結構活性相關等的其他公知的信息。另外，也可與已知使蛋白G的細胞膜外結構域的性質優化的變異組合。在本實施例中，從在實施例1的“1.基于與Fc的結合表面解析的突變對象部位的選定和取代的氨基酸殘基的特別指定”選定的部位，選擇Asp22、Thr25、Gln32、Asp40、及Glu42，作為與其對應的取代的氨基酸殘基，選擇Asp22His、Thr25His、Gln32His、Asp40His、及 Glu42His，對[SEQ ID NO: 1]所示的蛋白 G.Β1結構域的野生型氨基酸序列進行將這5個變異位置/5取代組合的點變異或多重變異，由此設計[SEQ ID NO: 10]所示的多個改性蛋白G的氨基酸序列。
[0298]另外，從在實施例1的“2.基于與Fab的結合表面解析的突變對象部位的選定和取代的氨基酸殘基的特別指定”選定的部位，選擇Thrll及Thrl7，作為與其對應的取代的氨基酸殘基，選擇ThrllArg及Thrl7Ile，對[SEQ ID NO: 1]所示的蛋白G.Bl結構域的野生型氨基酸序列進行將這些加到上述的5個變異位置/5取代而得到的7個變異位置/7取代組合的點變異或多重變異，由此設計[SEQ ID NO:7]所示的多個改性蛋白G的氨基酸序列。
[0299]再者，選擇從發明人的從前的研究已知升高蛋白G的細胞膜外結構域的熱穩定性、對變性劑的化學穩定性、及對分解酶的抗性的Asn35Lys、Asp36Glu、Asn37His、Asn37Leu、Asp47Pro、A la48Lys、及 Ala48Glu，對[SEQ ID NO: 1]所示的蛋白 G.Bl 結構域的野生型氨基酸序列進行將這些加到上述的7個變異位置/7取代而得到的12個變異位置/14取代組合的點變異或多重變異，由此設計[SEQ ID N0:4]所示的多個改性蛋白G的氨基酸序列。
[0300]在本實施例中，作為對應于上述12個變異位置/14取代的具體氨基酸序列，最終篩選[SEQ ID N0:13]~[SEQ ID NO: 20]，實際合成顯示此序列的改性蛋白G，評價其分子特性。
[0301]【實施例3】
[0302]在本實施例中，設計編碼改性蛋白G的氨基酸序列的核酸的堿基序列。
[0303]對于編碼改性蛋白G的基因的堿基序列而言，基于設計的改性蛋白G的氨基酸序列，利用Gene Designer (DNA2.0lnc.),設計為在大腸桿菌的表達效率最適。再有，由于突變體蛋白質從蛋白質合成的實際的觀點出發，分成以下的2系統而制造，基因的堿基序列考慮載體的喊基序列而每系統進彳丁微調節。0XADac-PG蛋白質制造為在N末端側有早酸乙酸脫羧酶α -亞基c-末端結構域(OXADac)的序列，C末端側有改性蛋白G的序列的融合蛋白質。即，合成為[SEQ ID N0:31]和[SEQ ID NO: 13]~[SEQ ID N0:20]連結的氨基酸序列。M-PG蛋白質是，作為無標簽，無融合的單純蛋白質，使用大腸桿菌制造。因此，向設計的氨基酸序列附加起始密碼子序列。即，Μ-PG蛋白質合成為在[SEQ ID NO: 13]~[SEQID NO:20]的N末端附加Met的氨基酸序列。
[0304]【實施例4】
[0305]在本實施例中，合成含編碼改性蛋白G的基因的質粒載體，接下來使用大腸桿菌，制造表1中所示的草酰乙酸脫羧酶α -亞基c-末端結構域(OXADac)和突變體蛋白質的融合蛋白質(OXADac-PGOl、0XADac_PG07、0XADac_PG13、0XADac_PG14、0XADac_PG15、0XADac-PG16、0XADac_PG17、0XADac_PG19、0XADac_PG20)。
[0306][(1) OXADac-PG表達用質粒的合成】
[0307]對于整合由[SEQ ID N0:21]~[SEQ ID N0:29]的堿基序列組成的PG基因(pgOl、pg07、pgl3、pgl4、pgl5、pgl6、pgl7、pgl9、或者 pg20)的進入質粒 pD0NR221_PG (DNA2.0)和表達用質粒 Champion pET104.1-DEST (Invitrogen),使用 Gateway LR Clonase EnzymeMix (Invitrogen)進行相同重組。使用反應液轉化保存用大腸桿菌DH5a株(東洋紡，Competent high)。將得到的轉化體用集落 PCR、DNA 測序(GE Healthcare Bioscience,BigDye Terminator vl.1)篩選，使用 QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen)提取OXADac-PG表達用質粒。
[0308][(2) OXADac-PG融合蛋白質的表達和固定化】
[0309]使用OXADac-PG表達用質粒轉化表達用大腸桿菌BL21 (DE3) (Novagen)。將預培養的轉化體以2.5ml/500ml在LB培養基中繼代，振蕩培養至達到0.D._=0.8~1.0。為了表達OXADac-PG融合蛋白質而加IPTG (0.5mM)，再于37°C振蕩培養2小時。將回收的菌體懸浮于10ml的PBS中，進行超聲波破碎之后過濾滅菌，將其作為全蛋白質溶液。使用IgGSepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare Bioscience) microspin 嘗試純化全蛋白質溶液之一部分，由SDS-PAGE確認表達及純化。將其余注入設置HiTrap鏈霉親和素HP柱(GEHealthcare Bioscience)的液相層析裝置 AKTApurifier (GE Healthcare Bioscience),以0.3ml/min的條件(運行緩沖液:20mM Na磷酸鹽(pH6.7)，150mM NaCl)運轉，從而將OXADac-PG融合蛋白質固定化到柱上。OXADac由于在分子內有1個生物素化賴氨酸，選擇性地并且非可逆地結合于柱內的鏈霉親和素上。再有，為了使固定化量最大化，相對于HiTrap鏈霉親和素HP柱的結合容許量，注入大過量(10倍以上)的OXADac-PG融合蛋白質。
[0310]【表1】
[0311]表1:制造的改性蛋白G
[0312]
【權利要求】
1.蛋白質，其由對具有免疫球蛋白G的Fc區域的蛋白質有結合活性的、細胞膜外結構域突變體的串聯型多聚體組成。
2.權利要求1所述的蛋白質，其為串聯型三聚體、串聯型四聚體、或者串聯型五聚體。
3.權利要求1或2所述的蛋白質，其中構成多聚體的細胞膜外結構域突變體彼此相同。
4.權利要求1~3中任一項所述的蛋白質，其中各細胞膜外結構域突變體由接頭序列連結。
5.權利要求1~4中任一項所述的蛋白質，其中對具有免疫球蛋白G的Fc區域的蛋白質有結合活性的細胞膜外結構域是鏈球菌(Streptococcus)屬鏈球菌的蛋白G的B1、B2、或B3中的任一種。
6.權利要求1~5中任一項所述的蛋白質，其對免疫球蛋白G的Fc區域有結合活性，并且相比由野生型蛋白G.B結構域的串聯型多聚體組成的蛋白質，至少，其對免疫球蛋白G的Fab區域的結合活性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低。
7.權利要求1~6中任一項所述的蛋白質，其中構成多聚體的至少一個細胞膜外結構域突變體是以下的突變體蛋白質:是野生型蛋白G.B1結構域蛋白質的突變體蛋白質，由以下的(a)所示的氨基酸序列組成，或由在(a)所示的氨基酸序列中，缺失、取代、插入或附加1個或數個氨基酸殘基的氨基酸序列組成，其對免疫球蛋白G的Fc區域有結合活性，并且，相比野生型蛋白G*B1結構域蛋白質，至少，其對免疫 球蛋白G的Fab區域的結合活性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低:(a)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu(上述氨基酸序列中，X35表示Asn或Lys,X36表示Asp或Glu,X37表示Asn、His、或者Leu, X47 表示 Asp 或 Pro, X48 表示 Ala、Lys 或 Glu, X22 表示 Asp 或 His, X25 表示 Thr 或His, X32 表不 Gin 或 His, X40 表不 Asp 或 His, X42 表不 Glu 或 His, XII 表不 Thr 或 Arg,X17 表示 Thr 或 lie ;不過，同時 X35 是 Asn 或 Lys、X36 是 Asp 或 Glu、X37 是 Asn 或 Leu、X47 是 Asp 或 Pro、X48 是 Ala、Lys 或 Glu、X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gin、X40 是 Asp、父42是6111、乂11是1111'，并且排除乂17是11^的情況)。
8.權利要求1~6中任一項所述的蛋白質，其中構成多聚體的至少一個細胞膜外結構域突變體是以下的突變體蛋白質:是野生型蛋白G.B2結構域蛋白質的突變體蛋白質，由以下的(b)所示的氨基酸序列組成，或由在(b)所示的氨基酸序列中，缺失、取代、插入或附加1個或數個氨基酸殘基的氨基酸序列組成，其對免疫球蛋白G的Fc區域有結合活性，并且，相比野生型蛋白G.Β2結構域蛋白質，至少，其對免疫球蛋白G的Fab區域的結合活性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低:(b)ThrThrTyrLysLeuVallleAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu(上述氨基酸序列中，X35表示Asn或Lys,X36表示Asp或Glu,X37表示Asn、His、或者Leu, X47 表示 Asp 或 Pro, X48 表示 Ala、Lys 或 Glu, X22 表示 Asp 或 His, X25 表示 Thr 或His, X32 表不 Gin 或 His, X40 表不 Asp 或 His, X42 表不 Glu 或 His, Xll 表不 Thr 或 Arg,X17 表示 Thr 或 lie ;不過，同時 X35 是 Asn 或 Lys、X36 是 Asp 或 Glu、X37 是 Asn 或 His、X47 是 Asp 或 Pro、X48 是 Ala、Lys 或 Glu、X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gin、X40 是 Asp、父42是6111、乂11是1111'，并且排除乂17是11^的情況)。
9.權利要求1~6中任一項所述的蛋白質，其中構成多聚體的至少一個細胞膜外結構域突變體是以下的突變體蛋白質:是野生型蛋白G.B3結構域蛋白質的突變體蛋白質，由以下的(c)所示的氨基酸序列組成，或由在(c)所示的氨基酸序列中，1個或數個氨基酸殘基缺失、取代、插入或附加的氨基酸序列組成，其對免疫球蛋白G的Fc區域有結合活性，并且，相比野生型蛋白G.Β3結構域蛋白質，至少，其對免疫球蛋白G的Fab區域的結合活性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低:(c)ThrThrTyrLysLeuVallleAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyValTrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu(上述氨基酸序列中，X35表示Asn或Lys,X36表示Asp或Glu,X37表示Asn、His、或者Leu, X47 表示 Asp 或 Pro, X48 表示 Ala、Lys 或 Glu、X22 表示 Asp 或 His, X25 表示 Thr 或His, X32 表不 Gin 或 His, X40 表不 Asp 或 His, XII 表不 Thr 或 Arg, X17 表不 Thr 或 lie ；不過，同時 X35 是 Asn 或 Lys、X36 是 Asp 或 Glu、X37 是 Asn 或 His、X47 是 Asp 或 Pro、X48是 Ala、Lys 或 Glu、X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gin、X40 是 Asp、XII 是 Thr，并且排除X17是Thr的情況)。
10.權利要求1~6中任一項所述的蛋白質，其中構成多聚體的至少一個細胞膜外結構域突變體是以下的突變體蛋白質:是野生型蛋白G.B1結構域蛋白質的突變體蛋白質，由以下的(d)所示的氨基酸序列組成，或由在(d)所示的氨基酸序列中，缺失、取代、插入或附加1個或數個氨基酸殘基的氨基酸序列組成，對免疫球蛋白G的Fc區域有結合活性，并且相比野生型蛋白G.B1結構域蛋白質，對免疫球蛋白G的Fab區域的結合活性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低:(d)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu(上述氨基酸序列中，X22表示Asp或His, X25表示Thr或His, X32表示Gin或His,X40表示Asp或His, X42表示Glu或His, XII表示Thr或Arg, X17表示Thr或lie ;不過，同時 X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gin、X40 是 Asp、X42 是 Glu、XII 是 Thr,并且排除 X17是Thr的情況)。
11.權利要求1~6中任一項所述的蛋白質，其中構成多聚體的至少一個細胞膜外結構域突變體是以下的突變體蛋白質:是野生型蛋白G.B2結構域蛋白質的突變體蛋白質，由以下的(e)所示的氨基酸序列組成，或由在(e)所示的氨基酸序列中，缺失、取代、插入或附加1個或數個氨基酸殘基的氨基酸序列組成，對免疫球蛋白G的Fc區域有結合活性，并且相比野生型蛋白G.B2結構域蛋白質，對免疫球蛋白G的Fab區域的結合活性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低:(e)ThrThrTyrLysLeuVallleAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu(上述氨基酸序列中，X22表示Asp或His, X25表示Thr或His, X32表示Gin或His,X40表示Asp或His, X42表示Glu或His, XII表示Thr或Arg, X17表示Thr或lie ;不過，同時 X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gin、X40 是 Asp、X42 是 Glu、XII 是 Thr,并且排除 X17是Thr的情況)。
12.權利要求1~6中任一項所述的蛋白質，其中構成多聚體的至少一個細胞膜外結構域突變體是以下的突變體蛋白質:是野生型蛋白G.B3結構域蛋白質的突變體蛋白質，由以下的(f)所示的氨基酸序列組成，或由在(f)所示的氨基酸序列中，氨基酸殘基缺失、取代、插入或附加1個或數個的氨基酸序列組成，對免疫球蛋白G的Fc區域有結合活性，并且相比野生型蛋白G.B3結構域蛋白質，對免疫球蛋白G的Fab區域的結合活性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低:(f)ThrThrTyrLysLeuVallleAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyValTrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu(上述氨基酸序列中，X22表示Asp或His, X25表示Thr或His, X32表示Gin或His,X40表示Asp或His, XII表示Thr或Arg, X17表示Thr或lie ;不過，同時X22是Asp、X25是Thr、X32是Gin、X40是Asp、XII是Thr,并且排除X17是Thr的情況)。
13.權利要求1~6中任一項所述的蛋白質，其中構成多聚體的至少一個細胞膜外結構域突變體是以下的突變體蛋白質:是野生型蛋白G.B1結構域蛋白質的突變體蛋白質，由以下的(g)所示的氨基酸序列組成，或由在(g)所示的氨基酸序列中，缺失、取代、插入或附加1個或數個氨基酸殘基的氨基酸序列組成，對免疫球蛋白G的Fc區域有結合活性，并且，相比野生型蛋白G*B1結構域蛋白質，對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低:(g)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu(上述氨基酸序列中，X22表示Asp或His, X25表示Thr或His, X32表示Gin或His,X40 表示 Asp 或 His，X42 表示 Glu 或 His ;不過，同時 X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gin、X40是Asp，并且排除X42是Glu的情況)。
14. 權利要求1~6中任一項所述的蛋白質，其中構成多聚體的至少一個細胞膜外結構域突變體是以下的突變體蛋白質:是野生型蛋白G.B2結構域蛋白質的各突變體蛋白質，由以下的(h)所示的氨基酸序列組成，或由在(h)所示的氨基酸序列中，缺失、取代、插入或附加1個或數個氨基酸殘基的氨基酸序列組成，對免疫球蛋白G的Fc區域有結合活性，并且相比野生型蛋白G.B2結構域蛋白質，對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低:(h)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu(上述氨基酸序列中，X22表示Asp或His, X25表示Thr或His, X32表示Gin或His,X40 表示 Asp 或 His，X42 表示 Glu 或 His ;不過，同時 X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gin、X40是Asp，并且排除X42是Glu的情況)。
15.權利要求1~6中任一項所述的蛋白質，其中構成多聚體的至少一個細胞膜外結構域突變體是以下的突變體蛋白質:是野生型蛋白G.B3結構域蛋白質的各突變體蛋白質，由以下的(i)所示的氨基酸序列組成，或由在(i)所示的氨基酸序列中，缺失、取代、插入或附加1個或數個氨基酸殘基的氨基酸序列組成，對免疫球蛋白G的Fc區域有結合活性，并且相比野生型蛋白G.B3結構域蛋白質，對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低:(i)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyValTrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu (上述氨基酸序列中，X22表示Asp或His, X25表示Thr或His, X32表示Gin或His,X40表示Asp或His ;不過，同時X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln，并且排除X40是Asp的情況)。
16.權利要求1~6中任一項所述的蛋白質，其中構成多聚體的至少一個細胞膜外結構域突變體由SEQ ID NO: 13~20中任何一個所示的氨基酸序列組成，或由在該氨基酸序列中，缺失、取代、插入或附加1個或數個氨基酸殘基的氨基酸序列組成。
17.權利要求1~6中任一項所述的蛋白質，其中在構成三聚體的3個細胞膜外結構域突變體由SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列、或者該氨基酸序列中，缺失、取代、插入或附加1個或數個氨基酸殘基的氨基酸序列組成。
18.融合蛋白質，其由權利要求1~17中任一項所述的蛋白質的氨基酸序列和其他蛋白質的氨基酸序列連結而成的氨基酸序列組成。
19.核酸，其編碼權利要求1~18中任一項所述的蛋白質。
20.權利要求19所述的核酸，其中構成多聚體的細胞膜外結構域突變體是由SEQIDNO: 22~29中任何一個所示的堿基序列組成的核酸。
21.核酸，其與由與權利要求19或20所述的核酸的堿基序列互補的序列組成的核酸在嚴格的條件下雜交，編碼對免疫球蛋白G的Fc區域有結合活性，并且，相比由野生型蛋白G.Β結構域的串聯型多聚體組成的蛋白質，至少，對免疫球蛋白G的Fab區域的結合活性和/或對Fc區域在弱酸性區域的結合活性降低的蛋白質。
22.重組載體，其含有權利要求19~21中任一項所述的核酸。
23.轉化體，其被導入了權利要求22所述的重組載體。
24.固定化蛋白質，其特征在于，權利要求1~18中任一項所述的蛋白質被固定化在水不溶性的固相支持體上。
25.抗體、免疫球蛋白G或具有免疫球蛋白G的Fc區域的蛋白質的捕獲劑，其含權利要求1~18中任一項所述的蛋白質。
26.抗體、免疫球蛋白G或有免疫球蛋白G的Fc區域的蛋白質的捕獲劑，其含權利要求24所述的固定化蛋白質。
【文檔編號】C07K17/00GK103748221SQ201280038040
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2012年8月3日 優先權日:2011年8月4日
【發明者】本田真也, 松丸裕之, 渡邊秀樹, 吉田晝也 申請人:獨立行政法人產業技術綜合研究所, 株式會社大賽璐