抗α4β7抗體的制劑的制作方法

抗α4β7抗體的制劑的制作方法
【專利摘要】本發明描述包含非還原糖、抗α4β7抗體和至少一種氨基酸的混合物的抗體制劑。公開的制劑具有提高的穩定性、減少的聚集體形成，且可延遲其中抗α4β7抗體的降解或展現這些特性的任何組合。本發明進一步提供這些抗體制劑的一種易于遵循且在體內產生治療有效量的所述抗α4β7抗體的安全給藥方案。
【專利說明】抗Ct 4P 7抗體的制劑
[0001]相關申請
[0002]本申請要求2012年I月12日提交的美國臨時申請61 / 585，859、2011年10月24日提交的美國臨時申請61 / 550，545和2011年5月2日提交的美國臨時申請61 /481，533的權益。前述申請的全部內容據此以引用的方式并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申請含有已通過EFS網以ASCII格式提交且據此以全文引用的方式并入本文的序列表。2012年4月30日創建的所述ASCII拷貝名為92596615.txt且大小為17，024字節。
[0005]發明背景
[0006]生物技術的進步使得有可能使用重組DNA技術產生多種蛋白質用于醫藥應用。因為蛋白質比傳統有機和無機藥物更大且更復雜(即除復雜三維結構外還具有多個官能團)，所以配制所述蛋白質會造成特殊問題。為了使蛋白質保持生物活性，制劑必須保持蛋白質氨基酸的至少一個核心序列的構象完整性，同時保護蛋白質的多個官能團免遭降解。蛋白質可遭受缺乏穩定性，且單克隆和多克隆抗體特別可相對不穩定(參見例如Wang等，J.Pharm Sc1.96:1_26 (2007))。許多配制選項是可用的，但沒有一種方法或系統適于所有蛋白質。已報道待考慮的若干因素(參見例如Wang等)。
[0007]許多特征可影響蛋白質的穩定性。實際上，即使在純化抗體的情況下，抗體結構也可能是異質的，此進一步使配制所述系統復雜化。此外，包括于抗體制劑中的賦形劑優選使任何潛在免疫反應減至最小。
[0008]在抗體的情況下，保持構象完整性甚至更加重要。蛋白質的降解路徑可涉及化學不穩定性(即涉及通過鍵形成或裂解來修飾蛋白質，從而產生新化學實體的任何過程)或物理不穩定性(即蛋白質的更高級結構變化)。化學不穩定性以例如脫酰胺、異構化、水解、氧化、片段化、聚糖3消除或雙硫鍵互換(disulfide exchange)形式表現。物理不穩定性可由例如變性、聚集、沉淀或吸附造成。四種最常見蛋白質降解路徑是蛋白質片段化、聚集、脫酰胺和氧化。治療性蛋白質的化學或物理不穩定性的后果包括有效施用劑量減少、療法的安全性歸因于例如刺激或免疫反應性而降低以及歸因于存放期較短而使制造更頻繁。
[0009]冷凍干燥是一種通常用于保存蛋白質的技術；冷凍干燥用于從相關蛋白質制劑移除水。冷凍干燥或凍干是一種待干燥物質首先冷凍且接著通過在真空下升華而移除冰或冷凍溶劑所用的方法。賦形劑可包括于預凍干制劑中以在凍干過程期間穩定蛋白質和/或提高凍干蛋白質制劑的穩定性(Pikal M.,Biopharm.3 (9) 26-30 (1990)和 Arakawa 等 Pharm.Res.8(3):285—291(1991)) o
[0010]數個公布已大體上公開治療炎癥性腸病的各種方法，且提供用于施用旨在治療炎癥性腸病的藥劑的給藥方案。例如，W096 / 24673公開粘膜血管地址素(addressin)及對與因白細胞結合于表達MAdCAM的細胞所致的白細胞募集至胃腸道相關的疾病的治療。U.S.2005 / 0095238描述治療與白細胞浸潤粘膜組織相關的疾病的方法及向人施用有效量的對a 40 7整合素(integrin)具有結合特異性的人或人源化免疫球蛋白或抗原結合片段。U.S.2005 / 0095238進一步描述各種劑量(例如每千克體重0.15mg、約0.5mg、約1.0mg、約1.5mg或約2.0mg免疫球蛋白或片段)和劑量之間的各種間隔(7天、14天、21天、28天或30天)。然而，以上提及的專利和公布并未公開本文中描述且要求的抗a 4 P 7抗體的特定制劑或特定劑量和給藥方案。重要的是，以上提及的專利并未公開為本文中描述且要求的治療方法(由臨床試驗數據支持)提供的制劑、劑量和給藥方案。
[0011]本發明的抗體制劑可適用于抑制白細胞結合于表達MAdCAM的細胞且因此幫助治療患者的炎癥性腸病。因此，急需發現這些化合物的適合劑量和給藥時程，且急需開發在長時間段內以穩定及適宜形式產生穩態治療有效血液含量的抗體制劑的制劑，優選為靜脈內制劑。
[0012]發明概述
[0013]本發明是關于鑒定作為適用于配制抗a 40 7抗體制劑的賦形劑的非還原糖和至少一種氨基酸，所述制劑的不穩定性使其易經受脫酰胺、氧化、異構化和/或聚集。制劑會提高穩定性，減少聚集體形成且延遲其中抗體的降解。
[0014]因此,在第一方面,本發明是關于一種包含非還原糖、抗a 40 7抗體和至少一種游離氨基酸的混合物的穩定制劑，且非還原糖與抗a 40 7抗體的摩爾比(摩爾:摩爾)大于600:1。制劑可為液體制劑或干燥制劑(例如凍干制劑)。制劑也可含有緩沖劑。在一些實施方案中，非還原糖是甘露糖醇、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖或其任何組合。
[0015]在一些實施方案中，制劑的游離氨基酸為組氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸或其任何組合。制劑可包含 約50mM至約175mM之間的游離氨基酸。制劑可包含約IOOmM與約175mM之間的游離氨基酸。游離氨基酸與抗體的摩爾比可為至少250:1。
[0016]制劑也可含有表面活性劑。表面活性劑可為聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆(poloxamer)或其任何組合。
[0017]在一些方面，制劑可使抗a 40 7抗體的免疫原性減至最小。
[0018]例如呈干燥狀態的制劑可在40°C、75%相對濕度(RH)下穩定至少三個月。
[0019]在另一方面，將制劑凍干且其在凍干之前包含至少約5%至約10%抗a 40 7抗體。制劑可在凍干之前含有至少約6%抗a 40 7抗體。制劑可從凍干制劑復原(例如復原以構成穩定液體制劑)。
[0020]在另一方面,本發明是關于一種包含非還原糖、抗a 4 0 7抗體和至少一種游離氨基酸的混合物的穩定制劑，且非還原糖與抗a 4P 7抗體的摩爾比(摩爾:摩爾)大于600:I且游離氨基酸與抗a 4 P 7抗體的比率(摩爾:摩爾)大于250:1。
[0021]在另一方面，本發明是關于一種在水溶液中包含非還原糖、抗a 40 7抗體和至少一種游離氨基酸的穩定液體制劑，其中非還原糖與抗a 40 7抗體的摩爾比(摩爾:摩爾)大于600:1。在另一方面,本發明涉及一種包含至少約40mg / ml至約80mg / ml抗a 4 3 7抗體、至少約50—175mM—種或多種氨基酸和至少約6%至至少約10% (w / v)糖的液體制劑。液體制劑也可含有緩沖劑。在一些實施方案中，液體制劑也包含金屬螯合劑。在一些實施方案中，液體制劑也包含抗氧化劑。
[0022]在另一方面，本發明是關于一種包含至少約60mg / ml抗a 43 7抗體、至少約10% (w / v)非還原糖和至少約125mM —種或多種游離氨基酸的液體制劑。
[0023]在另一方面，本發明是關于一種包含至少約60mg / ml抗a 43 7抗體、至少約10% (w / v)非還原糖和至少約175mM —種或多種游離氨基酸的液體制劑。
[0024]在另一方面,本發明也關于一種包含非還原糖、抗a 4 0 7抗體、組氨酸、精氨酸和聚山梨醇酯80的混合物的干燥制劑，例如凍干制劑，其中所述制劑呈固體形式，且非還原糖與抗a 43 7抗體的摩爾比(摩爾:摩爾)大于600:1。
[0025]在另一方面，本發明是關于一種包含非還原糖、抗a 40 7抗體、組氨酸、精氨酸和聚山梨醇酯80的混合物的凍干制劑。在這個方面，非還原糖與抗a 40 7抗體的摩爾比(摩爾:摩爾)大于600:1。此外，制劑中精氨酸與抗a 43 7抗體的摩爾比(摩爾:摩爾)大于250:1。
[0026]在另一方面，本發明是關于一種制備本文所述的制劑的方法，所述方法包括在初級干燥期間維持產物溫度低于塌陷溫度。方法也可含有退火步驟。
[0027]在一個方面，本發明是關于一種治療罹患炎癥性腸病的人患者的方法，其中所述方法包括以下步驟:向罹患炎癥性腸病的患者施用對人a 40 7整合素具有結合特異性的人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段，其中人源化免疫球蛋白或抗原結合片段包含非人來源的抗原結合區和人來源抗體的至少一部分，其中根據以下給藥方案向患者施用人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段:(a)以靜脈內輸注形式施用300mg人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段的初始劑量；(b)隨后在初始劑量之后約兩周時，以靜脈內輸注形式施用300mg人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段的第二后續劑量；(c)隨后在初始劑量之后約六周時，以靜脈內輸注形式施用300mg人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段的第三后續劑量；
(d)隨后視需要在人源化抗體的第三后續劑量之后每四周或每八周，以靜脈內輸注形式施用300mg人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段的第四和后續劑量；其中給藥方案誘導患者的炎癥性腸病的臨床反應和/或臨床緩解；且此外，其中人源化免疫球蛋白或抗原結合片段對a 40 7復合物具有結合特異性，其中抗原結合區包含具有下述氨基酸序列的輕鏈可變區的三個互補決定區(⑶R1、⑶R2和⑶R3)以及重鏈可變區的三個互補決定區(⑶R1、CDR2 和 CDR3):輕鏈:CDR1SEQ ID NO:9、CDR2SEQ ID NO:10、CDR3SEQ ID NO:11 ;重鏈:CDR1SEQ ID NO:12、CDR2SEQ ID NO: 13、CDR3SEQ ID NO:14。
[0028]在另一方面，本發明是關于一種用于治療性治療炎癥性腸病的給藥方案，其中所述給藥方案包括以下步驟:向罹患炎癥性腸病的患者施用對人a 40 7整合素具有結合特異性的人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段，其中人源化免疫球蛋白或抗原結合片段包含非人來源的抗原結合區和人來源抗體的至少一部分，其中根據以下給藥方案向患者施用人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段:(a)以靜脈內輸注形式施用300mg人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段的初始劑量；(b)隨后在初始劑量之后約兩周時，以靜脈內輸注形式施用300mg人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段的第二后續劑量；(c)隨后在初始劑量之后約六周時，以靜脈內輸注形式施用300mg人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段的第三后續劑量；(d)隨后視需要在人源化抗體的第三后續劑量之后每四周或每八周，以靜脈內輸注形式施用300mg人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段的第四和后續劑量；其中給藥方案誘導患者的炎癥性腸病的臨床反應和/或臨床緩解；且此外，其中人源化免疫球蛋白或抗原結合片段對a 40 7復合物具有結合特異性，其中抗原結合區包含具有下述氨基酸序列的輕鏈可變區的三個互補決定區(CDR1、CDR2和CDR3)以及重鏈可變區的三個互補決定區(CDR1、CDR2 和 CDR3):輕鏈:CDRlSEQ ID NO:9、CDR2SEQ ID NO:10、CDR3SEQ ID NO:11 ;重鏈:CDRlSEQ ID NO:12、CDR2SEQ ID NO: 13、CDR3SEQ ID NO:14。
[0029]在一些方面，用抗a 40 7抗體制劑的治療方法、劑量或給藥方案可使抗a 40 7抗體的免疫原性減至最小。
[0030]患者可已對用免疫調節劑、腫瘤壞死因子-a (TNF-a)拮抗劑中的至少一者或其組合進行的治療缺乏足夠反應、喪失反應或不耐受。
[0031]炎癥性腸病可為克羅恩氏病(Crohn' s disease)或潰瘍性結腸炎。炎癥性腸病可為中度至重度活動性潰瘍性結腸炎。
[0032]給藥方案可使得罹患中度至重度活動性潰瘍性結腸炎的患者的粘膜愈合。
[0033]患者可能先前已接受用至少一種用于炎癥性腸病的皮質類固醇的治療。給藥方案可使得患者的皮質類固醇使用減少、消除或減少以及消除。 [0034]在一些方面，以約1.0mg / ml至約1.4mg / ml之間的濃度以某一最終劑型施用人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段。可以約1.2mg / ml的某一最終劑型施用人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段。人源化免疫球蛋白或抗原結合片段可在30分鐘內向患者施用。
[0035]人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段可從凍干制劑復原。
[0036]人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段可復原以構成穩定液體制劑。
[0037]在一些方面，給藥方案不改變接受所述治療的患者的腦脊髓液中的CD4與CD8比率。
[0038]患者可為65歲或65歲以上人士且不需要對給藥方案進行任何調整。
[0039]附圖簡述
[0040]圖1是對編碼人源化抗a 4 P 7免疫球蛋白的重鏈的核苷酸序列(SEQ ID NO: I)和重鏈的推導氨基酸序列(SEQ ID N0:2)的說明。核苷酸序列在重鏈的5'端處含有克隆位點(小寫)> Kozak序列(大寫，SEQ ID NO:1的核苷酸18-23)和前導序列(小寫，SEQ IDNO:1的核苷酸24-86)。核苷酸序列的開放閱讀框架是SEQ ID NO:1的核苷酸24—1433。
[0041]圖2是對編碼在本文中稱為維多珠單抗(vedolizumab)的人源化免疫球蛋白的輕鏈的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)和輕鏈的推導氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的說明。核苷酸序列在重鏈的5'端處含有克隆位點(小寫)、Kozak序列(大寫，SEQ ID NO:3的核苷酸18-23)和前導序列(小寫，SEQ ID NO:3的核苷酸24-80)。核苷酸序列的開放閱讀框架是SEQ ID NO:3 的核苷酸 24-737。
[0042]圖3是(A)在本文中稱為維多珠單抗的人源化免疫球蛋白的成熟人源化輕鏈(SEQID NO:4的氨基酸20-238)與(B)在本文中稱為LDP-02的人源化免疫球蛋白的成熟人源化輕鏈(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列比對。(關于LDP-02，參見W098 / 06248和Feagan等，N.Eng.J.Med.352 =2499-2507 (2005)。Feagan 等描述 LDP-02 的臨床研究，但在所述文章中，其將LDP-02稱為MLN02。)所述比對說明維多珠單抗與LDP-02的輕鏈氨基酸序列在成熟輕鏈的位置114和115處不同。
[0043]圖4是(A)同屬人K輕鏈恒定區(SEQ ID NO:6)與⑶同屬鼠k輕鏈恒定區(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列比對。氨基酸殘基Thr和Val (其存在于成熟維多珠單抗輕鏈的位置114和115處(SEQ ID NO:4的氨基酸133和134))存在于人k輕鏈的恒定區中，而氨基酸殘基Ala和Asp (其存在于成熟LDP-02輕鏈(SEQ ID NO:5)的位置114和115處)存在于小鼠K輕鏈的恒定區中。
[0044]圖5是載體pLKT0K38D (也稱為pT0K38MLN02_TV)的圖譜，所述載體編碼MLN02的人源化重鏈和人源化輕鏈，且適于在CHO細胞中產生維多珠單抗。(參見公開PLKT0K38的美國專利申請公布號2004 / 0033561A1。pLKT0K38D是pLKT0K38的變體，其中在圖譜上指示的限制位點側接編碼輕鏈可變區的序列。)
[0045]圖6A顯示單體百分比變化、聚集體百分比變化和抗a 40 7凍干制劑的主要同工型百分比變化的預測模型。模型基于對實施例1中呈現的數據的統計分析。中心線顯示預測模型的結果且外部線顯示預測模型的95%置信區間。圖6B顯示當輸入因子是pH、糖:蛋白質摩爾比和精氨酸:蛋白質摩爾比時，基于對來自表1-3的40°C數據的統計分析的替代性模型。中心線顯示預測模型的結果且外部線顯示預測模型的95%置信區間。[0046]圖7顯示(A)成熟人GM607’ CL抗體k輕鏈可變區和⑶人21 / 28’ CL重鏈可變區的氨基酸序列。
[0047]圖8是顯示固體和裝載量影響干燥時間的圖(線條中的數字代表干燥時間的分鐘數)。
[0048]圖9是顯示維多珠單抗相較于安慰劑對照不延遲實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的臨床癥狀發作的圖。那他珠單抗(natalizumab)相較于安慰劑對照顯著(p〈0.05)延遲EAE的臨床癥狀發作。
[0049]發明詳述
[0050]本發明是關于包含抗a 40 7抗體的制劑。制劑可為包含非還原糖、抗a 4 P 7抗體和一種或多種游離氨基酸的混合物，且非還原糖與抗a 4 P 7抗體的摩爾比大于600摩爾非還原糖:1摩爾抗a 40 7抗體。制劑可呈固體或液體形式。
[0051]定義
[0052]術語“醫藥制劑”是指一種含有呈使抗體的生物活性有效形式的抗a 40 7抗體，且不含有對將施用制劑的受試者具有不可接受毒性的其它組分的制劑。
[0053]“穩定”制劑為當儲存時其中的抗體實質上保持其物理穩定性和/或化學穩定性和/或其生物活性的制劑。在一個方面，制劑在儲存時實質上保持其物理和化學穩定性以及其生物活性。一般基于制劑的預期存放期選擇儲存期。用于測量蛋白質穩定性的各種分析技術在本領域中可用且例如綜述于Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301,Vincent Lee 編，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)和 Jones,A.Adv.DrugDelivery Rev.10:29-90(1993)中。
[0054]“脫酰胺”單克隆抗體是其一個或多個天冬酰胺或谷氨酰胺殘基已經衍生化為例如天冬氨酸或異天冬氨酸的單克隆抗體。
[0055]“易經受脫酰胺”的抗體是包含一個或多個已發現有脫酰胺傾向的殘基的抗體。
[0056]“易經受氧化”的抗體是包含一個或多個已發現有氧化傾向的殘基的抗體。
[0057]“易經受聚集”的抗體是已發現其與其它抗體分子聚集(尤其在冷凍、加熱、干燥、復原和/或攪拌時)的抗體。
[0058]“易經受片段化”的抗體是已發現例如在其鉸鏈區處裂解成兩個或更多個片段的抗體。
[0059]就“減少脫酰胺、氧化、聚集或片段化”而言，其旨在指相對于在不同pH下或在不同緩沖劑中配制的單克隆抗體，防止脫酰胺、聚集或片段化或減少脫酰胺、聚集或片段化的量(例如至 80%,60%,50%,40%,30%,20%^； 10% )。
[0060]“聚集體”、“SEC聚集體”或“可溶性聚集體”大于一個且小于或等于十個通過共價、離子或疏水性相互作用締合在一起以形成更大蛋白質體的抗體蛋白質和/或片段。
[0061]“不溶性聚集體”或“顆粒”大于十個通過共價、離子或疏水性相互作用締合在一起以形成更大蛋白質體的抗體蛋白質和/或片段。
[0062]如本文所用，單克隆抗體的“生物活性”是指抗體能夠結合于抗原且產生可在體外或在體內測量的可測量生物反應。所述活性可為拮抗性或促效性。
[0063]細胞表面分子“ a 43 7整合素”或“ a 4P 7”是a 4鏈(CD49D, ITGA4)與M連(ITGB7)的雜二聚體。各鏈可與替代性整合素鏈形成雜二聚體以形成a4h或aj7。人a4及基因(分別為 GenBank(National Center for Biotechnology Information,Bethesda, MD) RefSeq寄存編號NM_000885和NM_000889)由B和T淋巴細胞、特別是記憶⑶4+淋巴細胞表達。作為許多整合素的典型，a 40 7可以靜止或活化狀態存在。a 43 7的配體包括血管細胞粘著分子(VCAM)、纖維結合蛋白(fibronectin)和粘膜地址素(MAdCAM (例如 MAdCAM — I))。
[0064]如本文所用，“對a 43 7復合物具有結合特異性”的人免疫球蛋白或其抗原結合片段結合于a 4P 7,但不結合于a4Pl或aEB7。
[0065]如本文所用，“等張”制劑具有與人血液實質上相同的滲透壓。等張制劑將通常具有約250m0sm至350m0sm的滲透壓。可使用例如蒸氣壓或冰凍型滲壓計來測量等張性。
[0066]如本文所用，“緩沖劑”是指通過其酸堿共軛組分的作用抵抗pH變化的緩沖劑。緩沖劑可存在于本發明的液體或固體制劑中。緩沖劑將制劑的PH調節至約5.0至約7.5、約
5.5至約7.5、約6.0至約6.5，或pH約6.3。在一個方面，將控制pH在5.0至7.5范圍內的緩沖劑的實例包括乙酸鹽、丁二酸鹽、葡糖酸鹽、組氨酸、檸檬酸鹽、磷酸鹽、順丁烯二酸鹽、二甲基胂酸鹽、2-[N-嗎啉基]乙烷磺酸(MES)、雙(2-羥乙基)亞氨基三[羥甲基]甲烷(Bis-Tris)、N-[2-乙酰胺基]_2_亞氨基二乙酸(ADA)、甘氨酰甘氨酸和其它有機酸緩沖劑。在另一方面，本文中的緩沖劑是組氨酸或檸檬酸鹽。
[0067]“組氨酸緩沖液”是包含組氨酸離子的緩沖劑。組氨酸緩沖劑的實例包括組氨酸氯化物、組氨酸乙酸鹽、組氨酸磷酸鹽、組氨酸硫酸鹽溶液。組氨酸緩沖液或組氨酸鹽酸鹽緩沖液的pH在約pH5.5至6.5之間、在約pH6.1至6.5之間或是約pH6.3。
[0068]在本文中，“糖”是具有通式(CH2O)n的化合物及其衍生物，包括單糖、雙糖、三糖、多糖、糖醇、還原糖、非還原糖等。在一個方面，本文中的糖的實例包括葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、麥芽糖、聚葡萄糖、赤藻糖醇、甘油、阿拉伯糖醇、木糖醇(sylitol)、山梨糖醇、甘露糖醇、蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖、水蘇糖、麥芽糖、乳酮糖、麥芽酮糖、葡萄糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、異麥芽酮糖等。糖可為凍干保護劑。在另一方面，本文中的糖是非還原雙糖，如蔗糖。
[0069]在本文中，“表面活性劑”是指降低液體表面張力的試劑。表面活性劑可為非離子表面活性劑。在一個方面，本文中的表面活性劑的實例包括聚山梨醇酯(聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯，例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80) ；TRIT0N (叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇，非離子清潔劑，Dow Chemical C0., Midland MI的Union Carbide子公司);十二燒基硫酸納(SDS);月桂硫酸納；羊基糖昔納；月桂基橫基甜菜喊、肉Ii蓮基橫基甜菜喊、亞油烯基(Iinoleyl)磺基甜菜堿或硬脂酰基磺基甜菜堿；月桂基肌氨酸、肉豆蘧基肌氨酸、亞油烯基肌氨酸或硬脂酰基肌氨酸；亞油烯基甜菜堿、肉豆蘧基甜菜堿或鯨蠟基甜菜堿；月桂酰胺丙基甜菜堿、椰油酰胺丙基甜菜堿、亞油酰胺丙基甜菜堿、肉豆蘧酰胺丙基甜菜堿、棕櫚酰胺丙基(palmidopropyl)甜菜堿或異硬脂酰胺丙基甜菜堿(例如月桂酰胺丙基甜菜堿)；肉豆蘧酰胺丙基二甲胺、棕櫚酰胺丙基二甲胺或異硬脂酰胺丙基二甲胺；甲基椰油酰基牛磺酸鈉或甲基油烯基牛磺酸二鈉；脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯；以及M0NAQUAT系列(Mona Industries, Inc.,Paterson,N.J.);聚乙二酉享(PEG)、聚丙二醇(PPG)和聚氧乙烯與聚氧丙烯二醇的共聚物(例如泊洛尼克(Pluronic) /泊洛沙姆、PF68等)；等。在另一方面，表面活性劑是聚山梨醇酯80。
[0070]本文中的術語“抗體”以最廣泛意義使用且明確涵蓋全長單克隆抗體、免疫球蛋白、多克隆抗體、由至少兩種例如各自針對不同抗原或表位的全長抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)以及個別抗原結合片段(包括dAb、scFv、Fab、F(ab) / 2、Fab')，包括人、人源化和來自非人物種及重組抗原結合形式的抗體，如微型單功能抗體(monobody)和微型雙功能抗體。
[0071]根據設想抗體的近似分子量為約150，000道爾頓(dalton)來計算本文所述的抗a4^7抗體與其它賦形劑的摩爾量和摩爾比。實際抗體分子量可不為150，000道爾頓，視氨基酸組成或翻譯后修飾(例如如取決于用于表達抗體的細胞系)而定。實際抗體分子量可為150，000道爾頓的+ / -5%。
[0072]術語“人抗體”包括具有源于人生殖系免疫球蛋白序列的序列的抗體，如源于具有人免疫球蛋白基因的轉基因小鼠(例如XEN0M0USE基因工程改造小鼠(Abgenix，Fremont，
CA)、HUMAB-MOUSE?、K IRIN TC M0USETM轉染色體小鼠、KMMOUSE? (MEDAREX,
Princeton, NJ))、人噬菌體顯示庫、人骨髓瘤細胞或人B細胞的抗體。
[0073]本文所用的術語“單克隆抗體”是指由實質上均質抗體的群體獲得的抗體，即除可在產生單克隆抗體期間出現的可能變體(所述變體一般以少量存在)之外，構成所述群體的個別抗體相同和/或結合相同表位。與通常包括針對不同決定子(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑不同，各單克隆抗體針對抗原上的單一決定子。修飾語“單克隆”指示抗體是從實質上均質的抗體群體獲得的特性，且不應解釋為需要通過任何特定方法來產生所述抗體。例如，待根據本發明使用的單克隆抗體可通過最初由Kohler等，Nature,256 =495(1975)描述的雜交瘤方法制備，或可通過重組DNA方法(參見例如美國專利號4,816, 567)制備。“單克隆抗體”也可使用例如 Clackson 等，Nature, 352:624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222:581-597(1991)中描述的技術從噬菌體抗體庫分離。
[0074]本文中的單克隆抗體明確包括“嵌合”抗體，其中一部分重鏈和/或輕鏈與源于特定物種或屬于特定抗體類別或子類的抗體中的相應序列相同或同源，而所述鏈的剩余部分與源于另一物種或屬于另一抗體類別或子類的抗體中的相應序列相同或同源；以及所述抗體的片段，只要其展現所需生物活性即可(美國專利號4，816，567 ;和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA，81 =6851-6855 (1984))。本文中的相關嵌合抗體包括包含源于非人靈長類動物(例如舊世界猴(Old World Monkey)、猿(Ape)等)的可變域抗原結合序列和人恒定區序列的“靈長類化”抗體。[0075]在本發明的制劑中的所制備人源化免疫球蛋白的“抗原結合片段”至少包含抗a4^7抗體的重鏈和/或輕鏈的可變區。例如，維多珠單抗的抗原結合片段包含人源化輕鏈序列SEQ ID NO:4的氨基酸殘基20至131。所述抗原結合片段的實例包括在本領域中已知的人源化免疫球蛋白的Fab片段、Fab'片段、scFv和F(ab' )2片段。本發明的人源化免疫球蛋白的抗原結合片段可通過酶促裂解或通過重組技術來產生。例如，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶裂解可分別用于產生Fab或F (ab' ) 2片段。抗體也可使用已將一個或多個終止密碼子引入天然終止位點上游的抗體基因以多種截短形式產生。例如，編碼F(ab' )2片段的重鏈的重組構建體可經設計以包括編碼重鏈的CH1結構域和鉸鏈區的DNA序列。在一個方面，抗原結合片段抑制a 4 β7整合素結合于其一個或多個配體(例如粘膜地址素MAdCAM (例如MAdCAM — 1)、纖維結合蛋白)。
[0076]木瓜蛋白酶消化抗體會產生兩個稱為“Fab”片段的相同抗原結合片段，各自具有單一抗原結合位點；以及一剩余“Fe”片段，其名稱反映其能夠易于結晶。胃蛋白酶處理產生F(ab' )2片段，其具有兩個抗原結合位點且仍能夠交聯抗原。
[0077]“Fv”是由一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域呈非共價締合形式的二聚體組成的抗體片段。
[0078]Fab片段也含有輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CHl)。Fab'片段因在重鏈CHl結構域的羧基端添加少量殘基(包括一個或多個來自抗體鉸鏈區的半胱氨酸)而不同于Fab片段。Fab' -SH在本文中表示恒定域的半胱氨酸殘基攜帶至少一個游離硫醇基的Fab'。F(ab' )2抗體片段最初以之間具有鉸鏈半胱氨酸的Fab'片段對形式產生。也已知抗體片段的其它化學偶聯。
[0079]“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的Vh和\結構域，其中這些結構域存在于單一多肽鏈中。在一個方面，Fv多肽進一步在Vh結構域與'結構域之間包含使得scFv能夠形成為抗原結合所需的結構的多肽連接子。關于scFv的綜述,參見Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第 113 卷，Rosenburg 和 Moore 編，Springer-Verlag, New York,第 269 頁至第 315 頁(1994)。
[0080]術語“微型雙功能抗體”是指具有兩個抗原結合位點的小抗體片段，所述片段包含與同一多肽鏈(Vh-')中的可變輕域(')連接的可變重域(Vh)。通過使用過短而無法使同一鏈上兩個結構域之間配對的連接子，迫使所述結構域與另一鏈的互補結構域配對且產生兩個抗原結合位點。微型雙功能抗體更充分描述于例如EP404，097 ;W093 / 11161 ;和Hollinger 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 90:6444-6448 (1993)中。
[0081]“全長抗體”是包含抗原結合可變區以及輕鏈恒定域(CJ和重鏈恒定域Cm、Ch2及Ch0的抗體。恒定域可為天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列變體。在一個方面，全長抗體具有一種或多種效應功能。
[0082]本文中的“氨基酸序列變異”抗體是具有不同于主要種類抗體的氨基酸序列的抗體。通常，氨基酸序列變體將與主要種類抗體具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%同源性。氨基酸序列變體在主要種類抗體的氨基酸序列內或鄰近于主要種類抗體的氨基酸序列的某些位置處具有取代、缺失和/或添加，但仍保留抗原結合活性。抗體的恒定區序列的變異對抗原 結合活性的影響將比可變區的變異小。在可變區中，氨基酸序列變體將與主要種類抗體至少約90%同源、至少約95%同源、至少約97%同源、至少約98%同源或至少約99%同源。
[0083]“同源性”定義為在對準序列且必要時引入間隙以達成最大同源性百分比之后，在氨基酸序列變體中的相同殘基的百分比。用于比對的方法和計算機程序在本領域中是熟知的。
[0084]“治療性單克隆抗體”是用于人受試者療法的抗體。本文中公開的治療性單克隆抗體包括抗a 4 0 7抗體。
[0085]本文中的“糖基化變異”抗體是附接有一個或多個不同于一個或多個附接于主要種類抗體的碳水化合物部分的碳水化合物部分的抗體。本文中的糖基化變體的實例包括有Gl或G2寡糖結構而非GO寡糖結構附接于其Fe區的抗體，有一或兩種碳水化合物部分附接于其一個或兩個輕鏈的抗體；無碳水化合物附接于抗體的一個或兩個重鏈的抗體等；及糖
基化變化的組合。
[0086]抗體“效應功能”是指可歸因于抗體Fe區(天然序列Fe區或氨基酸序列變異Fe區)的那些生物活性。抗體效應功能的實例包括:Clq結合；補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC);吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)的下調等。
[0087]視全長抗體的重鏈的恒定域的氨基酸序列而定，可將全長抗體指定為不同“類別”。存在五種主要類別的全長抗體:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且這些類別中的若干種可進一步細分為“子類”(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。對應于抗體的不同類別的重鏈恒定域分別稱為a、S、e、Y和ii。不同類別的免疫球蛋白的亞單位結構和三維構型是熟知的。
[0088]來自任何脊椎動物物種的抗體的“輕鏈”可基于其恒定域的氨基酸序列指定為兩種明顯不同類型(稱為K及入)中的一者。
[0089]“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”和“ADCC”是指細胞介導的反應，其中表達Fe受體(FcR)的非特異性細胞毒性細胞(例如天然殺手(Natural Killer, NK)細胞、嗜中性白細胞和巨噬細胞)識別目標細胞上的結合抗體且隨后導致目標細胞溶解。用于介導ADCC的原代細胞(NK細胞)僅表達Fe ￥1?111，而單核細胞表達？(^1?1、FcyRII和FcyRIII。FcR 在造血細胞上的表達概述于 Ravetch 和 Kinet, Annu.Rev.TmmunoI 9:457-92 (1991)的第464頁上的表3中。為了評估相關分子的ADCC活性，可進行體外ADCC測定，如美國專利號5，500，362或5，821，337中所述的測定。適用于所述測定的效應細胞包括外周血液單核細胞(PBMC)和天然殺手(NK)細胞。或者或另外，可例如在如Clynes等，PNAS(USA)95:652-656 (1998)中公開的動物模型中體內評估相關分子的ADCC活性。
[0090]術語“Fe受體”或“FcR”用于描述結合于抗體Fe區的受體。在一個方面，FcR是天然序列人FcR。在另一方面,FcR為結合IgG抗體的受體(Y受體)且包括Fe yR1、Fc YRII及Fe Y RIII子類的受體，包括這些受體的對偶基因變體和可變剪接形式。FcyRII受體包括FcyRIIA( “活化受體”)和FcyRIIB( “抑制受體”)，所述受體具有主要在其細胞質域方面不同的類似氨基酸序列。活化受體Fe y RIIA在其細胞質域中含有免疫受體酪氨酸基活化基元(ITAM)。抑制受體Fe Y RIIB在其細胞質域中含有免疫受體酪氨酸基抑制基元(ITIM)。(參見 M.Daeron, An nu.Rev.1mmunol.15:203— 234 (1997)中的綜述)。FcR 綜述于 Ravetch 和 Kinet, Annu.Rev.1mmuno19:457-92(1991) ；Capel 等，Immunomethods4:25—34(1994);以及 de Haas 等，J.Lab.Clin.Med.126:33-41 (1995)中。本文中的術語“FcR”涵蓋其它FcR，包括將來待鑒定的FcR。所述術語也包括新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer 等，J.Tmmuno1.117:587 (1976)及 Kim 等，J.Tmmuno1.24:249 (1994))。
[0091]術語“高變區”當在本文中使用時是指抗體的負責抗原結合的氨基酸殘基。高變區通常包含來自“互補決定區”或“⑶R”的氨基酸殘基(例如輕鏈可變域中的殘基24-34 (LI)、50-56 (L2)和 89-97 (L3)以及重鏈可變域中的 31-35 (Hl)、50-65 (H2)和 95-102 (H3)；Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991))和 / 或來自“高變環”的那些殘基(例如輕鏈可變域中的殘基26-32(Ll)、50-52(L2)和91-96 (L3)以及重鏈可變域中的 26-32 (Hl) ,53—55 (H2)和 96-101 (H3) ；Chothia 和 Lesk J.Mol.Biol.196:901—917(1987))。“框架區”或“FR”殘基是除如本文定義的高變區殘基外的那些可變域殘基。可將高變區或其CDR從一個抗體鏈轉移至另一抗體鏈或至另一蛋白質以賦予所得(復合)抗體或結合蛋白以抗原結合特異性。
[0092]“人源化”形式的非人(例如嚙齒動物)抗體是含有源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。人源化抗體大部分是人免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自接受者的高變區的殘基經來自如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物的非人物種(供體抗體)的高變區的具有所需特異性、親和力和能力的殘基置換。在一些情況下，人免疫球蛋白的框架區(FR)殘基經相應非人殘基置換。此外，人源化抗體可包含未見于接受者抗體或供體抗體中的殘基。進行這些修飾以進一步提高抗體效能。一般而言，人源化抗體將包含實質上所有至少一個且通常兩個可變域，其中所有或實質上所有高變環都對應于非人免疫球蛋白的高變環，且所有或實質上所 有FR都是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含免疫球蛋白恒定區(Fe)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定區的至少一部分。更多細節參見 Jones 等，Nature321:522-525(1986) ;Riechmann 等，Nature332:323-329(1988);以及 Presta, Curr.0p.Struct.Biol.2:593.— 596 (1992)。
[0093]“親和力成熟”抗體是相較于不具有變化的親本抗體，在其一個或多個高變區中具有一個或多個導致抗體對抗原的親和力提高的變化的抗體。在一個方面，親和力成熟抗體將對目標抗原具有納摩爾或甚至皮摩爾親和力。親和力成熟抗體是通過本領域中已知的程序制備。Marks等，Bio / TechnologylO:779-783 (1992)描述通過VH和VL結構域改組達成親和力成熟。對CDR和/或框架殘基的隨機突變誘發由以下文獻描述:Barbas等，ProcNat.Acad.Sci, USA91:3809-3813(1994) ;Schier 等，Genel69:147-155 (1995) ;Yelton 等，J.1mmunol.155:1994-2004(1995) Jackson 等，J.1mmunol.154(7):3310-9(1995)；以及Hawkins 等，J.Mol.Biol.226:889-896 (1992)。
[0094]“分離的”抗體是已經鑒定且與其天然環境的組分分離和/或從其天然環境的組分回收的抗體。在某些實施方案中，抗體將:(1)被純化至如通過勞立法(Lowry method)所測定大于95重量％蛋白質且或者大于99重量(2)被純化至足以通過使用旋杯式測序儀獲得N端或內部氨基酸序列的至少15個殘基的程度；或(3)通過使用考馬斯藍(Coomassieblue)或銀染色法，在還原或非還原條件下進行SDS-PAGE被純化至均質。分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體，因為抗體的天然環境的至少一種組分將不存在。然而，通常將通過至少一個純化步驟來制備分離的抗體。[0095]“治療”是指治療性治療與防治性或預防性措施兩者。需要治療者包括已患有疾病者以及待預防疾病或其復發者。因此，本文中待治療的患者可已診斷為患有疾病或可能易患或易感疾病。術語“患者”和“受試者”在本文中可互換使用。
[0096]配制的抗體是實質上純凈的且宜為實質上均質的(即不含污染性蛋白質等)。“實質上純凈”抗體意謂以組合物中的蛋白質的總重量計，包含至少約90重量％、至少約95重量％或97重量％抗體的組合物。“實質上均質”抗體意謂包含蛋白質的組合物，其中以蛋白質的總重量計，至少約99重量％蛋白質是特定抗體，例如抗a 40 7抗體。
[0097]如本文關于潰瘍性結腸炎受試者所用的“臨床緩解”是指完全Mayo計分為2分或小于2分且無個別子計分大于I點。克羅恩氏病“臨床緩解”是指CDAI計分為150分或小于150分。
[0098]如本文關于潰瘍性結腸炎受試者所用的“臨床反應”是指完全Mayo計分降低3分或3分以上及從基線降低30% (或若在隨訪時未進行完全Mayo計分，則部分Mayo計分降低2分或2分以上及從基線降低25%或25%以上)，伴有直腸出血子計分降低I分或I分以上或絕對直腸出血計分降低I分或I分以下。如本文關于克羅恩氏病受試者所用的“臨床反應”是指CDAI計分從基線(第0周)降低70分或70分以上。[0099]如本文關于潰瘍性結腸炎受試者所用的“粘膜愈合”是指內窺鏡子計分為I分或I分以下。
[0100]如本文所用，“治療失敗”是指疾病惡化、需要急救藥物或手術介入來治療潰瘍性結腸炎或克羅恩氏病。急救藥物是為治療新型或未分型潰瘍性結腸炎或克羅恩氏病癥狀所需的任何新穎藥物或基線藥物劑量的任何增加(除用于控制慢性腹瀉的止瀉藥以外)。
[0101]制劑
[0102]如本文所述，已發現抗a 40 7抗體在呈具有過量(以摩爾計)非還原糖的干燥(例如凍干)制劑形式時高度穩定。具體而言，非還原糖與抗a 40 7抗體的比率(摩爾:摩爾)大于600:1的凍干制劑在本文中顯示穩定至少2年。
[0103]在第一方面，本發明提供一種穩定抗a 43 7抗體制劑。在一個方面,制劑包含緩沖劑、至少一種穩定劑和抗a4P7抗體。在一個方面,干燥制劑包含一種或多種非還原糖和抗a 43 7抗體，其中非還原糖與抗a 4P 7抗體的比率(摩爾:摩爾)大于600:1。制劑也包含一種或多種游離氨基酸。一種或多種氨基酸也可充當緩沖劑。在一個方面，一種或多種氨基酸可充當穩定劑。制劑可任選進一步包含至少一種表面活性劑。在一個實施方案中，制劑是干燥的，例如凍干的。制劑中的抗體可為全長抗體或其抗原結合片段，如Fab、Fv、scFv、Fab'或 F(ab' )2 片段。
[0104]制劑可含有任何所需非還原糖。在一個方面，可包括于制劑中的非還原糖包括例如甘露糖醇、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、聚葡萄糖、麥芽糖醇、乳糖醇、異麥芽酮糖、帕拉金糖醇(palatinit)及其組合。在另一方面，非還原糖是蔗糖、海藻糖、甘露糖醇和山梨糖醇。制劑中的非還原糖的絕對量不關鍵，但非還原糖與抗a 40 7抗體的比率(摩爾:摩爾)大于400:1。在另一方面，非還原糖與抗a 40 7抗體的比率(摩爾:摩爾)是至少約600:1、至少約625: 1、至少約650:1、至少約675: 1、至少約700:1、至少約750:1、至少約800:1、至少約1000:1、至少約1200:1、至少約1400:1、至少約1500:1、至少約1600:1、至少約1700:1、至少約1800:1、至少約1900:1或至少約2000:1。通常，合乎需要的是非還原糖以減少液體制劑中的可溶性聚集體形成(如發生在冷凍和解凍和/或干燥和復原時的聚集體形成)的量存在。非還原糖與抗0407抗體的比率(摩爾:摩爾)高于約730:1可能使得凍干狀態下的可溶性聚集體形成略微減少。糖:蛋白質重量比可大于1.5:1 (w / W)。在另一方面，液體(例如干燥前或復原后)制劑的非還原糖濃度在約IOmM至約IM范圍內，例如約60mM至約600mM、約IOOmM至約450mM、約200mM至約350mM、約250mM至約325mM、以及約275mM至約300mM。在另一方面，干燥(例如凍干)制劑中的非還原糖的量在約40%至約70% (基于干燥制劑的重量比(w / w))范圍內。在另一方面，干燥(例如凍干)制劑中的非還原糖的量在約40%至約60%、約45%至約55%范圍內或是約51% (w / W)。在其它方面，當干燥制劑中的蛋白質量是約31% (基于干燥制劑的重量比)或非還原糖與蛋白質的質量比大于約1.6:1時，干燥(例如凍干)制劑中的非還原糖的量大于約51% (基于干燥制劑的重量比)。在另一方面，蔗糖是用于制劑中的非還原糖。 [0105]制劑可含有任何所需游離氨基酸，其可呈L型、D型或這些形式的任何所需混合物。在一個方面，可包括于制劑中的游離氨基酸包括例如組氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、絲氨酸、賴氨酸、色氨酸、纈氨酸、半胱氨酸及其組合。一些氨基酸可例如通過氫鍵、鹽橋、抗氧化性質或疏水性相互作用或通過從蛋白質表面排除而在制造、干燥、凍干和/或儲存期間穩定化蛋白質免遭降解。氨基酸可充當張力調節劑或可用于降低制劑粘度。在另一方面，游離氨基酸(如組氨酸和精氨酸)可充當低溫保護劑和凍干保護劑，且當凍干為制劑的組分時不結晶。單獨或呈組合形式的游離氨基酸(如谷氨酸和組氨酸)可充當PH在5至7.5范圍內的水溶液中的緩沖劑。在另一方面，制劑含有組氨酸、或組氨酸和精氨酸。在另一方面，液體制劑的游離氨基酸濃度在約IOmM至約0.5M范圍內，例如約15mM至約300mM、約20mM至約200mM、或約25mM至約150mM、約50mM或約125mM。在另一方面，干燥(例如凍干)制劑中的組氨酸的量在約1%至約10% (基于干燥制劑的重量比)或約3%至約6% (w / w)范圍內。在一些實施方案中，當干燥制劑中的蛋白質量是約31% (基于干燥制劑的重量比)或組氨酸與蛋白質的質量比大于約0.15:1時，干燥(例如凍干)制劑中的組氨酸的量大于約4% (基于干燥制劑的重量比)。在另一方面，干燥(例如凍干)制劑中的精氨酸的量在約4%至約20% (基于干燥制劑的重量比)或約10%至約15% (w /w)范圍內。在一些實施方案中，當干燥制劑中的蛋白質量是約31% (基于干燥制劑的重量比)或精氨酸與蛋白質的質量比大于約0.4:1時，干燥(例如凍干)制劑中的精氨酸的量大于約13% (基于干燥制劑的重量比)。在氨基酸(如組氨酸和精氨酸)的組合的實施方案中，總氨基酸與抗體的摩爾比可為至少200:1、約200:1至約500:1、或至少400:1。
[0106]制劑可任選進一步含有至少一種表面活性劑。在一個方面，可包括于制劑中的表
面活性劑包括例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆(Pluronic?)及其組合。當存在
時，表面活性劑通常以減少例如在裝瓶、冷凍、干燥、凍干和/或復原期間不溶性抗體聚集體形成的量包括在內。例如干燥前(例如凍干)或復原后制劑中的表面活性劑濃度通常是約 0.0001%至約 1.0%、約 0.01%至約 0.1%，例如約 0.02%,0.03%,0.04%,0.05%,
0.06%,0.07%,0.08, %或0.09% (w / v)、0.05%至 0.07%或 0.06% (w / v)。例如干燥(例如凍干)制劑中的表面活性劑量通常是約0.01%至約3.0% (w / w)、約0.10%至約 1.0%，例如約 0.15%,0.20%,0.25%,0.30%,0.35%,0.40%或 0.50% (w / w)。在另一方面，表面活性劑:抗體摩爾比是約1:1。抗a4P7抗體可以任何所需量存在于制劑中，前提是非還原糖與抗a 43 7抗體的比率(摩爾:摩爾)大于約600:1。然而，制劑可含有高濃度的抗a4P7抗體。例如，液體制劑可包含至少約IOmg / ml、至少約20mg / ml、至少約30mg / ml、至少約40mg / ml、至少約50mg / ml、至少約60ml / ml、至少約70mg /ml、至少約 80mg / ml、至少約 90mg / ml、至少約 IOOmg / ml、約 40mg / ml 至約 80mg /ml抗a 40 7抗體、約60mg / ml抗a 4 0 7抗體。干燥制劑(例如凍干制劑)可含有至少約5重量％、至少約10重量％、至少約15重量％、至少約20重量％、至少約25重量％、至少約30重量％或約31重量％或約32重量％抗a 40 7抗體。
[0107]必要時，制劑可進一步包含金屬螯合劑和/或抗氧化劑以及其它藥學上可接受的賦形劑。適合金屬螯合劑包括例如甲胺、乙二胺、去鐵胺、曲恩汀(trientine)、組氨酸、蘋果酸鹽、膦酸酯化合物(例如依替膦酸(etidronic acid))、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)等。適合抗氧化劑包括例如檸檬酸、尿酸、抗壞血酸、硫辛酸、谷胱甘肽、生育酚、胡蘿卜素、西紅柿紅素、半胱氨酸等。
[0108]制劑可為液體或固體。液體制劑可為在適合水性溶劑(如水)或水性/有機混合物(如水醇混合物)中制備的水溶液或懸浮液。液體制劑的pH可介于約5.5與約7.5之間、約6.0與約7.0之間、或約6.0與約6.5之間，如為約6.0,6.1,6.2,6.3,6.4或6.5。液體制劑可冷藏(例如2°C至8°C )或冷凍(例如在-20°C或-80°C )以達成儲存。固體制劑可以任何適合方法制備且可例如呈例如餅或粉末形式。通過干燥如本文所述的液體制劑(例如通過凍干、噴霧干燥、以薄膜形式(例如對于經皮遞送)空氣干燥、混合成脂質乳液且對于口服遞送干燥成球形或對于經皮遞送干燥成薄膜)來制備固體制劑。當制劑為固體制劑時，制劑的水分含量可不超過約5%、不超過約4.5%、不超過約4%、不超過約3.5%、不超過約3%、不超過約2.5%、不超過約2%、不超過約1.5%、不超過約I %，或為實質上無水的。可將固體制劑溶解(即復原)于適合介質或溶劑中以變為適于施用的液體。適用于復原固體制劑的溶劑包括水、等張生理鹽水、緩沖液(例如磷酸鹽緩沖生理鹽水)、林格氏(Ringer/ s)(乳酸鹽或右旋糖)溶液、最低必需培養基、醇/水溶液、右旋糖溶液等。溶劑的量可導致治療性蛋白質濃度與干燥前濃度相比更高、相同或更低。在一個方面，復原的抗a 4 @ 7抗體濃度與干燥前液體制劑中的濃度相同。
[0109]制劑可為無菌的，且此可在制備制劑之前或之后根據本領域技術人員已知用于產生適于向人受試者施用的無菌醫藥制劑的程序來達成。制劑可例如在干燥之前和/或復原之后，通過經小孔隙過濾、通過無菌處理或通過暴露于紫外輻射以液體形式來滅菌。過濾器孔隙尺寸可為0.1 ii m或0.2 ii m以過濾微生物或為IOnm至20nm以過濾病毒顆粒。或者或另外，干燥制劑可例如通過暴露于Y福射來滅菌。在一個方面，抗a 43 7抗體液體制劑是通過在干燥之前過濾來滅菌。
[0110]在一個方面，制劑在儲存時是穩定的。在另一方面，制劑在以干燥狀態儲存時是穩定的。可通過評估制劑中的抗體在配制時以及在指示溫度下儲存之后的物理穩定性、化學穩定性和/或生物活性來測試穩定性。可以多種不同方法定性和/或定量評估液體制劑或復原干燥粉末的物理和/或化學穩定性(參見例如Analytical Techniques forBiopharmaceutical Development, Rodriguez-Diaz 等編，Informa Healthcare (2005)),包括評估聚集體形成(例如使用尺寸排阻(或凝膠過濾)色譜法(SEC)、基質輔助激光脫附離子化飛行時間質譜法(MALD1-TOF MS)、分析性超速離心、光散射(光子相關光譜法、動態光散射(DLS)、多角激光光散射(MALLS))、基于流動的顯微鏡成像、電子阻抗(庫爾特(coulter))計數、光遮蔽或其它液體顆粒計數系統、通過測量混濁度、通過密度梯度離心和/或通過目視檢查);通過使用陽離子交換色譜(也參見Vlasak和1nescu，Curr.Pharm.Biotechnol.9:468-481 (2008)以及 Harris 等，J.Chromatogr.BBiomed.Sc1.Appl.752:233—245 (2001))、等電聚焦(IEF)(例如毛細管技術(cIEF))或毛細管帶電泳評估電荷非均勻性；氨基端或羧基端序列分析；質譜分析；SDS-PAGE或SEC分析以比較片段化、完整和多聚(即二聚、三聚等)抗體；肽圖(例如胰蛋白酶或LYS-等)；評估抗體的生物活性或抗原結合功能等。可使用熟練從業者可用的多種技術來評估生物活性或抗原結合功能(例如抗a 4 P 7抗體與MAdCAM(例如MAdCAM — I)的結合或抑制表達a 4 P 7整合素的細胞與MAdCAM (例如MAdCAM — I)(例如固定MAdCAM (例如MAdCAM — I))的結合)(參見例如 Soler 等，J.Pharmacol.Exper.Ther.330:864-875 (2009))。
[0111]也可以多種不同方法定性和/或定量評估固態制劑的穩定性，所述方法包括直接測試，如通過X射線粉末衍射(XRPD)鑒定晶體結構；使用傅立葉轉換紅外光譜法(FourierTransform Infrared Spectroscopy, FT IR)評估固態下的抗體結構；以及使用差示掃描熱量測定(DSC，例如以評估變性)測量凍干固體中的熱轉變(熔融、玻璃化轉變等)；及間接測試，如通過卡爾費休(Karl Fisher)測試測量水分含量例如以外推通過水解所致的化學不穩定性的可能性。測量干燥制劑的水分含量可指示制劑將經受化學或物理降解的可能性，水分含量越高，降解越多。
[0112]可在選定溫度下 持續選定時期測量穩定性。在一個方面，干燥(例如凍干)制劑在約401^75% RH下穩定至少約2-4周、至少約2個月、至少約3個月、至少約6個月、至少約9個月、至少約12個月或至少約18個月。在另一方面，制劑(液體或干燥(例如凍干))在約5°C和/或25°C和60% RH下穩定至少約3個月、至少約6個月、至少約9個月、至少約12個月、至少約18個月、至少約24個月、至少約30個月、至少約36個月或至少約48個月。在另一方面，制劑(液體或干燥(例如凍干))在約_20°C下穩定至少約3個月、至少約6個月、至少約9個月、至少約12個月、至少約18個月、至少約24個月、至少約30個月、至少約36個月、至少約42個月或至少約48個月。此外，在一些實施方案中，液體制劑可在冷凍(例如至_80°C )和解凍之后，例如像在1、2或3個冷凍和解凍循環之后穩定。
[0113]不穩定性可包括以下任何一者或多者:聚集(例如非共價可溶性聚集(由疏水性或電荷相互作用引起)、共價可溶性聚集(例如二硫鍵重排/混雜)、不溶性聚集(由在液體/空氣和液體/固體界面處的蛋白質變性引起))、脫酰胺(例如Asn脫酰胺)、氧化(例如Met氧化)、異構化(例如Asp異構化)、變性、截斷/水解/片段化(例如鉸鏈區片段化)、丁二酰亞胺形成、N端延長、C端加工、糖基化差異等。
[0114]穩定制劑可促成抗a 40 7抗體的低免疫原性。免疫原性抗a 40 7抗體可導致人受試者或患者的人抗人抗體(HAHA)反應。對抗a 40 7抗體顯現HAHA反應的患者在治療時可具有不利事件(例如部位輸注反應)或可快速消除抗a40 7抗體，從而導致劑量低于治療所計劃的劑量。對抗a 40 7抗體治療的早期研究的報道(Feagen等(2005)N.Engl.J.Med.352 =2499-2507)指示截至第8周在44%治療患者中產生人抗人抗體。此研究中的抗體是以液體形式儲存且不含有任何聚山梨醇酯。
[0115]在一些實施方案中，相較于穩定性較小的制劑的HAHA結果，制劑可使HAHA陰性患者的比例增加至患者的至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %或至少90 %。
[0116]在一些實施方案中，抗a 40 7抗體制劑具有≤50%主要帶電荷同工型、≤55%主要帶電荷同工型或65%至70%主要帶電荷同工型。在其它方面，穩定抗a 40 7抗體制劑具有<45%酸性帶電荷同工型、<40%酸性帶電荷同工型、<30%酸性帶電荷同工型或22%至28%酸性同工型。在其它方面，穩定抗a 40 7抗體制劑具有<25%堿性同工型、<20%堿性同工型、< 15%堿性同工型、約5%堿性同工型或約10%堿性同工型。在一個方面，例如如通過CEX所測定，穩定抗a 4 P 7抗體制劑具有≤55 %主要同工型、< 30 %酸性同工型和/或≤20%堿性同工型。在另一方面，例如如通過cIEF所測定，穩定抗a 40 7抗體制劑具有≤50%主要同工型、〈45%酸性同工型和/或〈10%堿性同工型。
[0117]在一些方面，抗a 40 7抗體干燥固體制劑具有< 10%水分含量、< 5%水分含量或〈2.5%水分含量。復原所需時間< 60分鐘、< 50分鐘或< 40分鐘或< 30分鐘或< 20分鐘。
[0118]可通過SEC、MALD1-TOF MS、分析性超速離心、光散射(DLS或MALLS)或納米尺寸測量(如納米粒子徑跡分析NTA, NanoSight Ltd, Wiltshire, UK)來測量即液體制劑或復原后干燥制劑中的單體含量和/或聚集體含量(例如呈二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、低聚物和更高級聚集體形式)。可以許多方法達成聚集體的解析、表征和定量，所述方法包括例如通過較長管柱或通過連續附接第二或更多SEC管柱與初始分析SEC管柱串聯來增加SEC管柱分離的長度；用光散射補充SEC對單體的定量；或通過使用NTA。
[0119]在一個實施方案中，抗a 40 7抗體制劑具有>90%單體抗體、>95%單體抗體或97%至99%單體抗體。在另一實施方案中，抗a 40 7抗體制劑中的大部分物質的平均半徑(20nm、< 15nm、< IOnm,或為約5nm至約7nm。在一個方面，根據蛋白質分析,抗a 40 7抗體制劑具有> 80%量的重鏈加輕鏈。在一個方面，存在> 90%重鏈加輕鏈。在另一方面，抗a 40 7抗體制劑具有< 10%聚集體、< 5%聚集體、< 2.5%聚集體、< 1.5%聚集體、(1.0%聚集體或<0.5%聚集體。在另一方面，穩定抗a 40 7抗體制劑具有> 96%單體和/或<2.5%聚集體。在另一方面，穩定抗a 40 7抗體制劑具有約99%單體和/或約〈I %聚集體。
[0120]可通過光遮蔽(例如Hach Ultra Analytics (Grants Pass, OR)的液體顆粒計數系統(HIAC))、顯微法、庫爾特計數器或基于數字(例如基于流動)顯微鏡成像的系統(如 Brightwell (Ottawa, CA)的微流體(microfIuidics)成像(MFI)或 Fluid ImagingTechnologies (Yarmouth, ME)的FLOWCAM? Image顆粒分析儀)來測量即復原制劑中的例如聚集體或未溶解賦形劑的粒度。在一個方面，抗a 40 7抗體制劑中的粒度是約30 V- m、約25 V- m、約10 u m、約5 u m、約2iim或Iiim或Iiim以下。應將抗體制劑中的顆粒的量減至最少。在一個方面，在一個劑量中，抗a 4 P 7抗體制劑具有小于6000個直徑> IOum的顆粒以及小于600個直徑≤25 ii m的顆粒(美國藥典(U.S.Pharmacopoeia)第788章，光遮蔽計數法；一半那些量是通過顯微鏡定量法測定)。在另一方面，例如通過MFI測量，在一個劑量的抗a 40 7抗體制劑(例如復原制劑)中，每毫升的顆粒量是每毫升約500個至約2000個或約1000個至約3000個2-10 iim顆粒、每毫升約50個至約350個≤10 y m顆粒和每毫升約O個至約50個≥25 i! m顆粒。
[0121]在一個實施方案中，抗a 40 7抗體制劑的結合親和力是參考標準抗a 40 7抗體的約60%至約140%。在一個方面，本文所述的制劑中的抗a 40 7抗體以參考標準的約80%至約120%的值結合于例如于細胞上的a4P7(W098 / 06248或美國專利號7，147,851)。在另一實施方案中，抗a 40 7抗體制劑能夠抑制表達a 40 7整合素的細胞與MAdCAM(例如MAdCAM — I) (MAdCAM-1g嵌合體)的結合至少50%或至少60% (參見美國專利申請公布號20070122404，也參考標準實施例)。
[0122]如上所指示，在本文中明確涵蓋將制劑冷凍。因此，可測試制劑在冷凍和解凍時的穩定性。因此，液體制劑中的抗體在冷凍和解凍制劑時可為穩定的，例如抗體在一個、兩個、三個、四個、五個或五個以上冷凍/解凍循環之后可為穩定的。
[0123]在一些實施方案中，制劑是包含至少約50mg / ml至約IOOmg / ml抗a4P7抗體、緩沖劑(例如組氨酸)和至少約9% (w / w)非還原糖(例如蔗糖、海藻糖或甘露糖醇)的液體制劑。在一個實施方案中，制劑包含至少約50至約80mg / ml、約60mg / ml抗a 43 7抗體、緩沖劑(例如組氨酸)、游離氨基酸(例如精氨酸)和至少約9%或10% (w /w)非還原糖(例如蔗糖、海藻糖或甘露糖醇)。
[0124]在另一實施方案中，制劑包含至少約60mg / ml抗a 4P 7抗體、緩沖劑(例如組氨酸)、游離氨基酸(例如精氨酸)和至少約10% (w / w)非還原糖(例如蔗糖、海藻糖或甘露糖醇)。在所述實施方案中，緩沖劑濃度是約15至約75mM、約25至約65mM、或約50mM。游離氨基酸濃度是約50至約250mM、約75至約200mM、約100至約150mM或約125mM。
[0125]在一個實施方案中，制劑是包含非還原糖、抗a 40 7抗體、組氨酸、精氨酸和聚山梨醇酯80的混合物的干燥固體制劑(例如凍干制劑)，且非還原糖與抗a 40 7抗體的摩爾比(摩爾:摩爾)大于600:1。
[0126]在另一實施方案中，制劑是包含非還原糖、抗a 40 7抗體、組氨酸、精氨酸和聚山梨醇酯80的混合物的干燥固體非晶制劑(例如凍干制劑)，且非還原糖與抗a 40 7抗體的摩爾比(摩爾:摩爾)大于600:1。
[0127]在一個實施方案中，制劑是包含非還原糖、抗a 40 7抗體、組氨酸、精氨酸和聚山梨醇酯80的凍干制劑，且制劑中非還原糖與抗a 40 7抗體的摩爾比(摩爾:摩爾)大于600:1。
[0128]在一個實施方案中，制劑是包含非還原糖、抗a 40 7抗體、組氨酸、精氨酸和聚山梨醇酯80的凍干制劑，其中制劑中非還原糖與抗a 4P 7抗體的摩爾比(摩爾:摩爾)大于600:1且制劑中精氨酸與抗a 43 7抗體的摩爾比(摩爾:摩爾)大于250:1。
[0129]在一個實施方案中，制劑是液體制劑且包含至少約60mg / ml抗a 40 7抗體、至少約10% (w / V)非還原糖和至少約125mM—種或多種游離氨基酸。
[0130]在一個實施方案中，制劑是液體制劑且包含至少約60mg / ml抗a 40 7抗體、至少約10% (w / V)非還原糖和至少約175mM—種或多種游離氨基酸。 [0131]在一個實施方案中，制劑是液體制劑且包含約60mg / ml至約80mg / ml之間的抗a 4 0 7抗體、緩沖劑和至少約10% (w / w)糖。
[0132]在一個實施方案中，制劑是液體制劑且包含約60mg / ml至約80mg / ml之間的抗a 4 0 7抗體、組氨酸和至少約10% (w / w)鹿糖。[0133]在一個實施方案中，將制劑凍干且以單次劑量形式儲存于一個小瓶中。小瓶合乎需要地儲存于約2-8°C下直至將其向有需要的受試者施用。小瓶可例如是20cc或50cc小瓶(例如用于60mg / ml劑量)。小瓶可含有至少約120mg、至少約180mg、至少約240mg、至少約300mg、至少約360mg、至少約540mg或至少約900mg抗a 40 7抗體。在一個方面，小瓶含有約300mg抗a 4 P 7抗體。
[0134]—種或多種其它藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑(如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,第 21 版，Hendrickson, R.編(2005)中所述者)可包括于制劑中，只要其不會不利影響制劑的所需特征即可。可接受的載體、賦形劑或穩定劑在所用劑量和濃度下對接受者無毒且包括其它緩沖劑；共溶劑；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；螯合劑，如EDTA ;金屬復合物(例如Zn-蛋白質復合物)；生物可降解聚合物，如聚酯；防腐劑；和/或成鹽反離子，如鈉。a 4 g 7抗體
[0135]適用于制劑中的抗a 40 7抗體包括來自任何所需來源的抗體，如完全人抗體、鼠抗體、兔抗體等；及任何所需工程改造抗體，如嵌合抗體、人源化抗體等。這些類型抗體的任一者的抗原結合片段(如Fab、Fv、scFv'Fab'和F(ab' )2片段)也適用于制劑中。
[0136]抗a 4 P 7抗體可結合于a 4鏈(例如人源化MAb21.6 (Bendig等，美國專利號5，840，299))、P 7鏈(例如FIB504或人源化衍生物(例如Fong等，美國專利號7，528，236))上的表位，或結合于由a 4鏈與P 7鏈締合所形成的組合表位。在一個方面，抗體結合a 40 7復合物上的組合表位,但不結合a 4鏈或P 7鏈上的表位，除非所述鏈彼此締合。a4整合素與(67整合素的締合可例如通過引入存在于一起構成表位的兩個鏈上的鄰近殘基或通過構象暴露一個鏈(例如a4整合素鏈或37整合素鏈)上的在不存在適當整合素搭配物或不存在整合素活化下不可達成抗體結合的表位結合位點來產生組合表位。在另一方面，抗a407抗體結合a4整合素鏈與(67整合素鏈兩者，且因此對于a 4 P 7整合素復合物具有特異性。所述抗體可例如結合a 4 P 7但不結合a 4 3 I且/或不結合a#7。在另一方面，抗a 4P 7抗體與Act — I抗體結合于相同或實質上相同表位(Lazarovits, A.1.等，J.Tmmuno1.,133(4): 1857-1862 (1984) ；Schweighoffer等，J.1mmunol.,151 (2):717-729,1993 ；Bednarczyk 等，J.Biol.Chem.，269 (11):8348—8354，1994)。產生鼠Act — I單克隆抗體的鼠ACT — I雜交瘤細胞系是根據2001年8月22日的布達佩斯條約(Budapest Treaty)的規定，以 Millennium Pharmaceuticals, Inc.，40Landsdowne Street, Cambridge, Mass.02139, U.S.A.名義以寄存編號 PTA-3663 存放于美國菌種保存中心(American Type Culture Collection), 10801University Boulevard,Manassas，Va.20110-2209，U.S.A.。在另一方面，抗a 4 P 7抗體是使用美國專利申請公布號2010 / 0254975中提供的⑶R的人抗體或a 40 7結合蛋白。
[0137]在一個方面，抗a 40 7抗體抑制a 40 7與其一個或多個配體(例如粘膜地址素(例如MAdCAM(例如MAdCAM — I))、纖維結合蛋白和/或血管地址素(VCAM))結合。靈長類動物MAdCAM描述于PCT公布W096 / 24673中，所述公布的全部教義以引用的方式并入本文。在另一方面，抗a 4 P 7抗體抑制a 4 P 7與MAdCAM(例如MAdCAM — I)和/或纖維結合蛋白結合而不抑制結合VCAM。
[0138]在一個方面，適用于制劑中的抗a 43 7抗體是小鼠Act — I抗體的人源化形式。適于制備人源化抗體的方法在本領域中是熟知的。一般而言，人源化抗a 40 7抗體將含有包含小鼠Act-1抗體的3個重鏈互補決定區(CDR，CDRl, SEQ ID NO:8、CDR2，SEQ ID NO:9和⑶R3，SEQ ID NO:10)和適合人重鏈框架區的重鏈；且也含有包含小鼠Act-1抗體的3個輕鏈 CDR(CDR1，SEQ ID NO:11、CDR2, SEQ ID NO:12 及 CDR3，SEQ ID NO:13)和適合人輕鏈框架區的輕鏈。人源化Act — I抗體可含有具有或不具有氨基酸取代的任何適合人框架區，包括共有框架區。例如，一個或多個框架氨基酸可經另一氨基酸(如小鼠Act— I抗體中相應位置處的氨基酸)置換。若存在，則人恒定區或其部分可源于人抗體(包括對偶基因變體)的K或:V輕鏈 和/或Y (例如Y 1、Y 2、Y 3、Y 4)、i1、a (例如a 1、a 2)、6或e重鏈。可選擇特定恒定區(例如IgGl)、其變體或部分以調整效應功能。例如，可將突變恒定區(變體)并入融合蛋白中以使與Fe受體的結合和/或固定補體的能力減至最小(參見例如 Winter 等，GB2, 209，757B ;Morrison 等，W089 / 07142 ;Morgan 等，W094 /29351，1994年12月22日)。Act-1抗體的人源化形式描述于PCT公布號W098 / 06248和W007 / 61679中，其各自的全部教義以引用的方式并入本文。
[0139]在另一方面，適用于制劑中的抗a 40 7人源化抗體包含包括SEQ ID NO:2的氨基酸20至140的重鏈可變區；和包括SEQ ID NO:4的氨基酸20至131或SEQ ID NO:5的氨基酸21至132的輕鏈可變區。若需要，則可存在適合人恒定區。例如，人源化抗a 40 7抗體可包含包括SEQ ID NO:2的氨基酸20至470的重鏈和包括SEQ ID NO:5的氨基酸21至239的輕鏈。在另一實施例中，人源化抗a 40 7抗體可包含包括SEQ ID NO:2的氨基酸20至470的重鏈和包括SEQ ID NO:4的氨基酸20至238的輕鏈。圖4顯示比較人抗體與鼠抗體的同屬輕鏈比對。所述比對說明兩個小鼠殘基轉換為人殘基的維多珠單抗(例如化學文摘社(Chemical Abstract Service, CAS,美國化學學會(American Chemical Society))登記編號943609-66-3)的人源化輕鏈比LDP-02的輕鏈(圖3)更類人。此外，LDP-02具有輕微疏水性、可撓性丙氨酸114和親水性位點(天冬氨酸115)，其在維多珠單抗中置換為輕微親水性的含羥基蘇氨酸114和疏水性的可能面向內部的纈氨酸115殘基。
[0140]抗體序列的其它取代可為例如重鏈和輕鏈框架區的突變，如SEQ ID N0:14的殘基2上的異亮氨酸突變為纈氨酸；SEQ ID NO:14的殘基4上的甲硫氨酸突變為纈氨酸；SEQ IDNO:15的殘基24上的丙氨酸突變為甘氨酸；SEQ ID NO:15的殘基38處的精氨酸突變為賴氨酸；SEQ ID NO:15的殘基40處的丙氨酸突變為精氨酸；SEQ ID NO:15的殘基48上的甲硫氨酸突變為異亮氨酸；SEQ ID NO:15的殘基69上的異亮氨酸突變為亮氨酸；SEQ ID NO:15的殘基71上的精氨酸突變為纈氨酸；SEQ ID NO:15的殘基73上的蘇氨酸突變為異亮氨酸；或其任何組合；及用小鼠Act — I抗體的CDR(CDR1，SEQ ID NO:8、CDR2，SEQ ID NO:9和CDR3，SEQ ID NO:10)置換重鏈CDR ;以及用小鼠Act—I抗體的輕鏈CDR(CDR1，SEQ IDNO:11、CDR2，SEQ ID NO:12 和 CDR3, SEQ ID NO:13)置換輕鏈 CDR。
[0141]在一些實施方案中，用于制劑中的抗a 43 7人源化抗體包含與SEQ ID NO:2的氨基酸20至140具有約95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的重鏈可變區，以及與SEQ ID NO:4的氨基酸20至131或SEQ ID NO:5的氨基酸21至132具有約95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的輕鏈可變區。可使用缺省參數，使用適合序列比對算法(如Lasergene系統(DNASTAR, Inc., Madison, ffis.))測定氨基酸序列一致性。在一個實施方案中，用于制劑中的抗a 40 7抗體是維多珠單抗(CAS，美國化學學會，登記編號943609—66—3)。[0142]其它a 40 7抗體也可用于本文所述的制劑和給藥方案中。例如，以全文引用的方式并入本文的US2010 / 0254975 (Amgen, Inc.)中描述的a 4 P 7抗體適用于治療個體的炎癥性腸病的制劑和方法中。
[0143]抗a 40 7抗體可通過在活細胞(例如培養的細胞)中表達編碼各鏈的核酸序列來產生。可利用多種宿主-表達載體系統來表達本發明的抗體分子。所述宿主-表達系統表示藉此相關編碼序列可產生且隨后純化的載體，但也表示當用適當核苷酸編碼序列轉化或轉染時可原位表達抗a 40 7抗體的細胞。這些系統包括但不限于微生物，如用含有抗體編碼序列的重組噬菌體DNA、質粒DNA或粘質粒DNA表達載體轉化的細菌(例如大腸桿菌(E.coil)、枯草桿菌(B.subtilis));用含有抗體編碼序列的重組酵母表達載體轉化的酵母(例如酵母(Saccharomyces)、畢赤酵母(Pichia));用含有抗體編碼序列的重組病毒表達載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；用重組病毒表達載體(例如花椰菜嵌紋病毒CaMV、煙草嵌紋病毒TMV)感染或用含有抗體編碼序列的重組質粒表達載體(例如Ti質粒)轉化的植物細胞系統；或具有含有源自哺乳動物細胞的基因組(例如金屬硫蛋白啟動子)或哺乳動物病毒(例如腺病毒晚期啟動子、痘瘡病毒7.5K啟動子)的啟動子的重組表達構建體的哺乳動物細胞系統(例如COS、CHO、BHK、293、3T3、NSO細胞)。例如，與載體(如來自人巨大細胞病毒的主要中早期基因啟動子元件)聯合的哺乳動物細胞(如中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cell, CHO))是抗體的有效表達系統(Foecking等，Gene45: 101 (1986) ;Cockett 等，Bio / Technology8:2 (1990))。[0144]在細菌系統中，許多表達載體宜視所表達的抗體分子的預期用途來選擇。例如，當待產生大量所述蛋白質以產生抗體分子的醫藥組合物時，指導表達高含量的易于純化的融合蛋白產物的載體可為合乎需要的。所述載體包括但不限于大腸桿菌表達載體pUR278 (Ruther等，EMBO J.2:1791 (1983))，其中抗體編碼序列可個別地與lac Z編碼區同框連接至載體中以便產生融合蛋白；pIN載體(Inouye和Inouye, Nucleic Acids Res.13:3101-3109(1985) ；Van Heeke 和 Schuster，J.Biol.Chem.24:5503-5509 (1989))等。pGEX載體也可用于以與谷胱甘肽S-轉移酶(GST)的融合蛋白形式表達外來多肽。一般而言，所述融合蛋白是可溶性的，且可易于通過吸附及結合于基質谷胱甘肽-瓊脂糖珠粒，隨后在游離谷胱甘肽存在下洗脫而從溶解細胞純化。PGEX載體經設計以包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位點以便可從GST部分釋放克隆的目標基因產物。
[0145]在一昆蟲系統中，使用加洲苜猜夜蛾核多角體病毒(Autographa califomicanuclear polyhedrosis virus, AcNPV)作為表達外來基因的載體。病毒生長于草地粘蟲(Spodoptera frugiperda)細胞中。可將抗體編碼序列個別地克隆至病毒的非必需區域(例如多角體蛋白基因)中且置于AcNPV啟動子(例如多角體蛋白啟動子)的控制下。
[0146]在哺乳動物宿主細胞中，可利用許多基于病毒的表達系統。在使用腺病毒作為表達載體的情況下，相關抗體編碼序列可連接至腺病毒轉錄/翻譯控制復合物(例如晚期啟動子和三聯前導序列)。隨后可通過體外或體內重組將此嵌合基因插入腺病毒基因組中。插入病毒基因組的非必需區域(例如區域El或E3)中將產生活的且能夠在受感染宿主中表達抗體分子的重組病毒(例如參見Logan和Shenk, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:355一359(1984))。也可需要特定起始信號來有效翻譯插入的抗體編碼序列。這些信號包括ATG起始密碼子和鄰近序列。此外，起始密碼子必須與所需編碼序列的閱讀框架同相以確保翻譯全部插入物。這些外源翻譯控制信號和起始密碼子可具有多種來源，天然與合成兩者均可。可通過包括適當轉錄增強子元件、轉錄終止子等來增強表達效率(參見Bittner等，Methods in Enzymol.153:51-544(1987))。
[0147]此外，可選擇調節插入序列的表達或以所需特定方式修飾并加工基因產物的宿主細胞株。對蛋白質廣物的所述修飾(例如糖基化)和加工(例如裂解)就蛋白質功能而目可為重要的。不同宿主細胞具有翻譯后加工和修飾蛋白質和基因產物的特征性及特定機制。可選擇適當細胞系或宿主系統以確保對表達的外來蛋白質進行適當修飾和加工。為此目的，可使用具有用于適當加工初級轉錄物、糖基化及磷酸化基因產物的細胞機制的真核宿主細胞。所述哺乳動物宿主細胞包括但不限于中國倉鼠卵巢(CHO)、NSO、HeLa、VERY、幼小倉鼠腎(BHK)、猴腎(C0S)、MDCK、293、3T3、WI38、人肝細胞癌細胞(例如H印G2)、乳癌細胞系(例如像BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D)以及正常乳腺細胞系(例如像CRL7030和 Hs578Bst)。
[0148]不同細胞類型的糖基化機制可產生糖基化組成不同于另一細胞類型或無糖基化(如在細菌細胞的情況下)的抗體。在一個方面，用于產生抗a 40 7抗體的細胞類型是哺乳動物細胞，如NSO或CHO細胞。在一個方面，哺乳動物細胞可包含缺失細胞代謝中涉及的酶，且相關外源基因可例如在用于例如通過轉化或轉染引入細胞中的構建體或載體中可操作地連接于置換酶。具有外源基因的構建體或載體賦予宿有構建體或載體的細胞以選擇優勢，從而促進產生由外源基因編碼的多肽。在一個實施方案中，CHO細胞是DG44細胞(Chasin和Urlaub (1980) PNAS USA77:4216)，其包含缺失或不活化二氫葉酸還原酶基因。在另一實施方案中，CHO細胞是CHO Kl細胞，其包含缺失或不活化谷氨酰胺合成酶基因(參見例如美國專利號5，122，464或5，827，739)。
[0149]固體制劑
[0150]本發明的固體制 劑通常通過干燥液體制劑來制備。可使用任何適合干燥方法，如凍干或噴霧干燥。凍干涉及通常在將用于儲存、運送和分配制劑的容器(例如小瓶)中冷凍液體制劑(參見例如 Gatlin 和 Nail, Protein Purification Process Engineering,Roger G.Harrison 編,Marcel Dekker Inc.，317-367 (1994))。一旦冷凍制劑，即降低大氣壓且調節溫度以允許例如通過升華移除冷凍溶劑。凍干過程的此步驟有時稱為初級干燥。若需要，則隨后可升高溫度以通過蒸發移除仍結合于干燥制劑的任何溶劑。凍干過程的此步驟有時稱為二級干燥。當制劑已達到所需干燥程度時，結束干燥過程且密封容器。最終固體制劑有時稱為“凍干制劑”或“餅”。凍干過程可使用任何適合設備來進行。適合凍干設備可從許多商業來源(例如SP Scientific, Stone Ridge, NY)獲得。
[0151]可使用多種適合裝置干燥液體制劑以產生固體(例如凍干)制劑。一般而言，本領域技術人員使用含有擱板的密封室制備凍干制劑，在所述擱板上置放含待干燥液體制劑的小瓶。可控制擱板的溫度以及冷卻和加熱速率，也可控制腔室內壓力。應了解，本文所論述的各種過程參數是指使用此類型裝置進行的過程。若需要，則普通技術人員可輕易使本文所述的參數適于其它類型的干燥裝置。
[0152]普通技術人員可輕易測定適用于初級和二級干燥的溫度和真空量。一般而言，制劑于約_30°C或小于-30°C的溫度(如-40°C或-50°C )下冷凍。冷卻速率可影響基質中冰晶的量和尺寸。初級干燥通常在比冷凍溫度高約10°C、約20°C、約30 V、約40 V或約50 V的溫度下進行。在一個方面，可設定初級干燥條件以維持抗a 40 7抗體低于制劑的玻璃化轉變溫度或塌陷溫度。高于塌陷溫度時，非晶冷凍基質可流動(塌陷)，從而導致蛋白質分子可能不被剛性固體基質所包圍，且蛋白質分子可在塌陷基質中不穩定。此外，若發生塌陷，則制劑可難以充分干燥。制劑中產生的較高水分量可導致蛋白質降解率較高及在凍干產物的質量削弱至不可接受水平之前其可儲存的時間量減少。在一個方面，選擇擱板溫度和腔室壓力以在初級干燥期間維持產物溫度低于塌陷溫度。冷凍制劑的玻璃化轉變溫度可通過本領域中已知的方法(例如通過差示掃描熱量測定(DSC))來測量。塌陷溫度可通過本領域中已知的方法(例如冷凍干燥顯微法)來測量。非還原糖與蛋白質的比率(摩爾:摩爾)和其它制劑組分的量將影響玻璃化轉變溫度和塌陷溫度。在一些實施方案中，a4^7抗體制劑的玻璃化轉變溫度是約_35°C至約-10°C、約_35°C至約_25°C、或約-35 °C至約-29°C。在另一實施方案中，a 40 7抗體制劑的玻璃化轉變溫度是約-29°C。在一些實施方案中，a4^7抗體制劑的玻璃化轉變溫度是約_30°C、約-31°C、約_32°C、約-33 °C、約-34°C、約_35°C或約_36°C。在一些實施方案中，a 4 P 7抗體制劑的塌陷溫度是約_30°C至約(TC、約-28°C至約-25°C、或約-20°C至約-10°C。在另一實施方案中，a4P7抗體制劑的塌陷溫度是約_26°C。在不希望受任何特定理論束縛下，向上勻變速率越快，產物的塌陷溫度越高。初級干燥步驟可移除至少50%、至少60%、至少70%或70%以上的溶劑。在一個方面，初級干燥步驟從抗a 40 7抗體制劑移除大于80%的溶劑。
[0153]初級干燥取決于擱板溫度和壓力。可憑經驗確定在不同過程參數下進行凍干的初級干燥條件。初級干燥也可基于產物溫度進行數學建模。傳質和傳熱方程(Milton，等(1997) PDA J ofPharm Sci & Tech, 51:7-16)與對Rp和Kv的了解相結合允許了解輸入變量(包括過程輸入變量(如擱板溫度和壓力))與用Rp值獲取的制劑變量的組合和相互作用。這些模型可有助于基于塌陷溫度和設備能力對產物溫度的限制來確定待用于高效過程的參數。
【權利要求】
1.一種包含非還原糖、抗a 40 7抗體和至少一種游離氨基酸的混合物的穩定制劑，其中所述制劑呈固體形式，且非還原糖與抗a 40 7抗體的摩爾比(摩爾:摩爾)大于600:1。
2.如權利要求1所述的制劑，其中所述制劑進一步包含緩沖劑。
3.如權利要求1所述的制劑，其中所述非還原糖選自由甘露糖醇、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖及其組合組成的組。
4.如權利要求1所述的制劑，其中所述游離氨基酸選自由組氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸及其組合組成的組。
5.如權利要求1所述的制劑，其中所述制劑進一步包含表面活性劑。
6.如權利要求5所述的制劑，其中所述表面活性劑選自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆(poloxamer)及其組合組成的組。
7.如權利要求1所述的制劑，其中所述制劑是凍干的且在凍干之前包含至少約5%至約10%抗a 43 7抗體。
8.如權利要求1所述的制劑，其中所述制劑在凍干之前包含至少約6%抗a40 7抗體。
9.如權利要求1所述的制劑，其中所述制劑包含約IOOmM與約175mM之間的游離氨基酸。
10.如權利要求1所述的制劑，其中所述制劑是液體制劑。`
11.如權利要求1所述的制劑，其中所述制劑是干燥制劑。
12.如權利要求1所述的制劑，其中所述制劑在40°C、75%RH下穩定至少三個月。
13.—種在水溶液中包含非還原糖、抗a 40 7抗體和至少一種游離氨基酸的穩定液體制劑，其中非還原糖與抗a 43 7抗體的摩爾比(摩爾:摩爾)大于600:1。
14.如權利要求13所述的液體制劑，其中所述制劑進一步包含緩沖劑。
15.如權利要求13所述的液體制劑，其中所述非還原糖選自由甘露糖醇、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖及其組合組成的組。
16.如權利要求13所述的液體制劑，其中所述氨基酸選自由組氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸及其組合組成的組。
17.如權利要求13所述的液體制劑，其中所述制劑進一步包含表面活性劑。
18.如權利要求17所述的液體制劑，其中所述表面活性劑選自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆及其組合組成的組。
19.如權利要求13所述的液體制劑，其中所述制劑的pH在約5.5與約7.5之間。
20.如權利要求13所述的液體制劑，其中所述制劑的pH在約6.0與約6.5之間。
21.如權利要求13所述的液體制劑,其中所述制劑包含至少約60mg/ ml至約80mg /ml抗a 4 3 7抗體。
22.如權利要求13所述的液體制劑，其中所述制劑包含至少約60mg/ ml抗a 4 P 7抗體。
23.一種包含至少約60mg / ml至約80mg / ml抗a 4 P 7抗體、緩沖劑和至少約10%(w / w)糖的穩定制劑,其中所述制劑是液體制劑。
24.如權利要求23所述的制劑，其中所述緩沖劑是組氨酸緩沖劑。
25.如權利要求23所述的制劑，其中所述糖是蔗糖。
26.—種包含至少約60mg / ml抗a 4P 7抗體和至少約10% (w / w)非還原糖的穩定制劑，其中所述制劑是凍干的。
27.如權利要求26所述的制劑，其中所述制劑進一步包含聚山梨醇酯80。
28.如權利要求26所述的制劑，其中所述非還原糖是蔗糖。
29.一種包含非還原糖、抗a 40 7抗體、組氨酸、精氨酸和聚山梨醇酯80的混合物的穩定制劑，其中所述制劑呈固體形式，且非還原糖與抗a 40 7抗體的摩爾比(摩爾:摩爾)大于600:1。
30.如權利要求13至25中任一項所述的制劑，其中所述制劑進一步包含金屬螯合劑。
31.如權利要求13至25中任一項所述的制劑，其中所述制劑進一步包含抗氧化劑。
32.如權利要求1至31中任一項所述的制劑，其中所述抗體是維多珠單抗。
33.一種制備如權利要求1至32中任一項所述的制劑的方法，所述方法包括在初級干燥期間維持產物溫度低于塌陷溫度。
34.如權利要求33所述的方法，其進一步包括退火步驟。
35.一種測定凍干制劑的質量的方法，所述方法包括檢查所述制劑的外觀；測定復原時間；測定水分含量；測定存在的聚集體的百分比；測定存在的片段的百分比；以及測定氧化/脫酰胺水平。
36.如權利要求35所述的方法，其進一步包括測定所述制劑的生物活性和效力。
37.一種治療罹患炎癥性腸病的人患者的方法，其中所述方法包括以下步驟: 向罹患炎癥性腸病的患者施用對人a 40 7整合素具有結合特異性的人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段， 其中根據以下給藥方案向所述患者施用所述人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段: a.以靜脈內輸注形式施用300mg所述人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段的初始劑量; b.隨后在所述初始劑量之后約兩周時，以靜脈內輸注形式施用300mg所述人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段的第二后續劑量； c.隨后在所述初始劑量之后約六周時，以靜脈內輸注形式施用300mg所述人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段的第三后續劑量； d.隨后視需要在所述人源化抗體的所述第三后續劑量之后每四周或每八周，以靜脈內輸注形式施用300mg所述人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段的第四和后續劑量； 其中所述給藥方案誘導所述患者的所述炎癥性腸病的臨床反應和臨床緩解；且進一步，其中所述人源化免疫球蛋白或抗原結合片段包含非人來源的抗原結合區和人來源抗體的至少一部分，其中所述人源化免疫球蛋白或抗原結合片段對a 40 7復合物具有結合特異性，其中所述抗原結合區包含以下CDR: 輕鏈:CDR1SEQ ID NO:9 CDR2SEQ ID NO:10 CDR3SEQ ID NO:11 重鏈:CDR1SEQ ID NO:12 CDR2SEQ ID NO:13 CDR3SEQ ID NO:14。
38.如權利要求37所述的方法，其中所述患者對用免疫調節劑、腫瘤壞死因子-a拮抗劑中的至少一者或其組合進行的治療缺乏足夠反應、喪失反應或不耐受。
39.如權利要求37所述的方法,其中炎癥性腸病是克羅恩氏病(Crohn's disease)或潰瘍性結腸炎。
40.如權利要求39所述的方法，其中所述炎癥性腸病是潰瘍性結腸炎。
41.如權利要求39所述的方法，其中所述炎癥性腸病是中度至重度活動性潰瘍性結腸炎。
42.如權利要求41所述的方法，其中所述給藥方案使得罹患中度至重度活動性潰瘍性結腸炎的患者的粘I吳愈合。
43.如權利要求37所述的方法，其中所述給藥方案使得所述患者的皮質類固醇使用減少、消除或減少以及消除。
44.如權利要求37所述的方法，其中所述患者先前接受至少一種用于所述炎癥性腸病的皮質類固醇的治療。
45.如權利要求37所述的方法，其中以約l.0mg/ mL至約1.4mg / mL之間的濃度以某一最終劑型施用所述人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段。
46.如權利要求45所述的方法，其中以約1.2mg / mL以某一最終劑型施用所述人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段。
47.如權利要求37所述的方法，其中在約30分鐘內向所述患者施用所述人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段。
48.如權利要求45所述的方法，其中從凍干制劑復原所述人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段。
49.如權利要求45所述的方法，進一步，其中復原所述人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段以構成穩定液體制劑。
50.如權利要求37所述的方法，其中所述給藥方案不改變接受所述治療的患者的腦脊髓液中的⑶4與⑶8比率。
51.一種用于治療性治療炎癥性腸病的給藥方案，其中所述方法包括以下步驟: 向罹患炎癥性腸病的患者施用對人a 40 7整合素具有結合特異性的人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段， 其中根據以下給藥方案向所述患者施用所述人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段: a.以靜脈內輸注形式施用300mg所述人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段的初始劑量; b.隨后在所述初始劑量之后約兩周時，以靜脈內輸注形式施用300mg所述人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段的第二后續劑量； c.隨后在所述初始劑量之后約六周時，以靜脈內輸注形式施用300mg所述人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段的第三后續劑量； d.隨后視需要在所述人源化抗體的所述第三后續劑量之后每四周或每八周，以靜脈內輸注形式施用300mg所述人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段的第四和后續劑量； 其中所述給藥方案誘導所述患者的所述炎癥性腸病的臨床反應和臨床緩解；且 進一步，其中所述人源化免疫球蛋白或抗原結合片段包含非人來源的抗原結合區和人來源抗體的至少一部分，其中所述人源化免疫球蛋白或抗原結合片段對a 40 7復合物具有結合特異性，其中所述抗原結合區包含下述互補決定區(CDR): 輕鏈:CDRlSEQ ID NO:9
CDR2SEQ ID NO:10
CDR3SEQ ID NO:11 重鏈:CDRlSEQ ID NO:12
CDR2SEQ ID NO:13
CDR3SEQ ID NO:14。
52.如權利要求51所述的給藥方案，其中所述患者對用免疫調節劑、腫瘤壞死因子-a拮抗劑中的至少一者或其組合進行的治療缺乏足夠反應、喪失反應或不耐受。
53.如權利要求51所述的給藥方案，其中炎癥性腸病是克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎。
54.如權利要求52所述的給藥方案，其中所述炎癥性腸病是潰瘍性結腸炎。
55.如權利要求54所述的給藥方案，其中所述炎癥性腸病是中度至重度活動性潰瘍性結腸炎。
56.如權利要 求55所述的給藥方案，其中所述給藥方案使得罹患中度至重度活動性潰瘍性結腸炎的患者的粘膜愈合。
57.如權利要求51所述的給藥方案，其中所述給藥方案使得所述患者的皮質類固醇使用減少、消除或減少以及消除。
58.如權利要求51所述的給藥方案，其中所述患者先前接受至少一種用于所述炎癥性腸病的皮質類固醇的治療。
59.如權利要求51所述的給藥方案,其中以約l.0mg/ mL至約1.4mg / mL之間的濃度以某一最終劑型施用所述人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段。
60.如權利要求59所述的給藥方案,其中以約1.2mg / mL以某一最終劑型施用所述人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段。
61.如權利要求51所述的給藥方案，其中在約30分鐘內向所述患者施用所述人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段。
62.如權利要求61所述的方法，其中從凍干制劑復原所述人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段。
63.如權利要求61所述的給藥方案，進一步，其中復原所述人源化免疫球蛋白或其抗原結合片段以構成穩定液體制劑。
64.如權利要求51所述的給藥方案，其中所述給藥方案不改變接受所述治療的患者的腦脊髓液中的⑶4與⑶8比率。
65.如權利要求51所述的方法，其中所述患者是65歲或65歲以上人士，且進一步，其中所述患者不需要對所述給藥方案進行任何調整。
66.如權利要求51所述的給藥方案，其中所述患者是65歲或65歲以上人士，且進一步，其中所述患者不需要對所述給藥方案進行任何調整。
67.如權利要求1所述的制劑，其中所述游離氨基酸與抗體摩爾比是至少250:1。
68.如權利要求13所述的制劑，其中所述游離氨基酸與抗體摩爾比是至少250:1。
【文檔編號】C07K16/28GK103608071SQ201280030450
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2012年5月2日 優先權日:2011年5月2日
【發明者】威洛·迪爾盧茲奧, 諾貝爾·T·張, 喬納德·M·沃爾高, 維斯阿納桑·帕拉尼阿帕安, 杰森·布朗, 歐文·H·福克斯, 凱瑟琳·肖爾茨 申請人:米倫紐姆醫藥公司