聚烯殺真菌劑和非核糖體肽的協同組合和相關的使用方法

聚烯殺真菌劑和非核糖體肽的協同組合和相關的使用方法
【專利摘要】本發明包括包含聚烯殺真菌劑和至少一種脂肽的協同殺真菌組合的組合物和用這種組合物控制真菌病原體的方法。
【專利說明】聚烯殺真菌劑和非核糖體肽的協同組合和相關的使用方法
發明領域
[0001]本發明涉及聚烯殺真菌劑與抗生素非核糖體肽如兩親性環脂肽的協同組合，以改善兩種組分的殺真菌活性。
[0002]發明背景
[0003]殺真菌劑有許多用途，包括用于作物保護；作為食品、飼料和化妝品防腐劑；和應用于人和獸的藥物。作物減產、經食物傳播的疾病、以及人和動物的真菌感染成為發達和發展中國家共同的問題。因此，改善現有殺真菌劑(尤其是環保且對真菌耐受性發展不敏感的殺真菌劑)的效力是非常期待的。
[0004]聚烯殺真菌劑為已經在前述領域中應用的抗真菌抗生素。它們的獲得可通過發酵鏈霉菌屬物種，如納塔爾鏈霉菌(Streptomyces natalensis),其通常見于土壤中。聚烯殺真菌劑的活性可部分從它們通過與麥角固醇形成復合物而損傷細胞膜的能力推導出。大量的研究已經證實真菌對那他霉素的耐受性發展潛力非常低。另外，聚烯殺真菌劑具有可忽略的毒性，因為它們不影響哺乳動物細胞內存在的膽固醇。
[0005] 非核糖體肽，包括環狀兩親性脂肽如表面活性素類、伊枯草菌素類和芬枯草菌素類(fengycins)，其抗微生物性能是公認的并已經應用于作物保護領域。由于它們的作用方式，它們還在生物制藥及其它生物技術應用中有潛在用途。脂肽可通過各種土壤細菌的發酵獲得，包括枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)0脂肽,與聚烯殺真菌劑類似,通過破壞細胞膜殺死真菌。可以預見真菌對這些化合物的耐受性發展潛力非常低，因為它們直接作用于膜脂而不是直接作用于單點蛋白靶標。另外，脂肽對環境無害且對工人和消費者的危險低；事實上，用含有芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株處理的作物可在處理的當天收獲。 申請人:已經發現聚烯殺真菌劑和脂肽的組合會導致在抗微生物如真菌的效力上協同增強，而不僅僅是累加增強。不希望受任何理論的束縛， 申請人:假設本發明的脂肽和聚烯殺真菌劑以協同殺真菌的方式起作用，因為每種類型的化合物通過不同的作用方式破壞真菌的細胞膜。
[0006]發明概述
[0007]本發明提供一種低毒、低耐受性誘導、增效的殺真菌組合物，其包含比許多傳統合成殺真菌劑毒性小且以比各個化合物的施用率低的組分。該殺真菌組合物包含一種或多種聚烯殺真菌劑和至少一種脂肽的協同殺真菌組合。在一實施方案中，聚烯殺真菌劑為下列中的一種或多種:那他霉素(natamycin)、制霉菌素(nystatin)、兩性霉素B、金色制霉素、非律平和光明霉素(Iucenosomycin)和/或每種這些聚烯殺真菌劑的衍生物。在另一實施方案中，所述組合物包含一種以上的聚烯殺真菌劑。
[0008]該協同殺真菌組合中的脂肽組分可以是產脂肽微生物產生的發酵產物的一部分，可以是此種殺真菌的發酵產物的粗提取物，或者可以是由此種發酵產物純化或半純化。在其它實施方案中所述脂肽是合成或半合成的(即，母體脂肽由微生物獲得和衍生而來)。在一些實施方案中，產脂肽的微生物為芽孢桿菌屬物種細菌。在其它實施方案中其為鏈霉菌。在還有的其它實施方案中其為類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)物種細菌。[0009]在具體的實例中，產脂肽的細菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)或產一種或多種脂肽的任何其它芽孢桿菌屬物種。在又一實例中，由這樣的芽孢桿菌屬物種生產的脂肽選自下列族中的一種或多種:表面活性素型化合物、伊枯草菌素型化合物和芬枯草菌素型化合物。一些產生脂肽的芽孢桿菌屬物種描述于發明詳述中(例如，解淀粉芽孢桿菌、蠟質芽孢桿菌(cereus)、蘇云金芽孢桿菌(thuringiensis)、凝結芽孢桿菌(coagulans)、短小芽孢桿菌(pumilus)、地衣芽孢桿菌(Iicheniformis));其它將是本領域的技術人員已知的。在具體的實例中，產脂肽的細菌為枯草芽孢桿菌QST713。在一實施方案中，組合物包含聚烯殺真菌劑組分和含脂肽的發酵產物。在一實例中含脂肽的發酵產物得自芽孢桿菌屬物種細菌，如上面提及的那些。
[0010]在一些實施方案中本發明組合物的脂肽組分包含下列化合物中的一種或多種:表面活性素型化合物、芬枯草菌素型化合物、伊枯草菌素型化合物和fusaricidin類。適用于本發明的伊枯草菌素型化合物包括一種或多種下列化合物:芽孢菌霉素D、芽孢菌霉素F、芽孢菌霉素L、芽孢菌霉素LC (亦稱bacillopeptin)、抗霉枯草菌素、伊枯草菌素A、伊枯草菌素AL和伊枯草菌素C (后三種化合物本文中合稱伊枯草菌素類)。適用于本發明的芬枯草菌素型化合物為芬枯草菌素A、芬枯草菌素B、大側柏素(plipastatin)A、大側柏素B、大側柏素類(plipastatins)和阿瓜斯他汀類(agrastatins),如描述于美國專利6，291, 426中(后四種列舉的在本文中合稱大側柏素類)。適用于本發明的表面活性素型化合物為埃斯波素(esperin)、地衣素(Iichenysin)、帕米拉素(pumiIacidin)和表面活性素。在一具體的實施方案中，脂肽組分包括伊枯草菌素型化合物如伊枯草菌素As、抗霉枯草菌素和/或芽孢菌霉素、芬枯草菌素型化合物和表面活性素中的一種或多種。在另一實施方案中脂肽組分包括下列化合物中的至少兩種:伊枯草菌素類、芬枯草菌素型化合物和表面活性素類。
[0011]在一些實施方案中協同殺真菌組合包含聚烯殺真菌劑和一種或多種脂肽。在另一實施方案中協同殺真菌組合包含聚烯殺真菌劑和兩種或兩種以上的脂肽。所述脂肽可以來自下列化合物族中的一種或多種化合物:表面活性素型化合物、伊枯草菌素型化合物和/或芬枯草菌素型化合物。在一實例中，所述脂肽包含一種或多種伊枯草菌素類和/或一種或多種芬枯草菌素型化合物和`/或表面活性素。在一實施方案中，組合物的聚烯殺真菌劑組分為那他霉素或制霉菌素且脂肽組分包含伊枯草菌素類(A、B和/或C)、芽孢菌霉素、表面活性素、fusaricidin、和/或芬枯草菌素型化合物，或者各自單獨或組合。在一具體的實例中，脂肽由產脂肽的芽孢桿菌屬物種細菌的發酵產物半純化或純化。在該實施方案的還有的另一個實例中，聚烯殺真菌劑為那他霉素或其衍生物或者制霉菌素或其衍生物。
[0012]組合物中的聚烯殺真菌劑組分與脂肽組分的重量/重量比(例如，含脂肽的發酵液，含有脂肽的粗提取物；純化或半純化的脂肽提取物；或化學合成的或衍生的純脂肽)為約500:1至1:500。在一實施方案中，那他霉素或其衍生物或制霉菌素或其衍生物與包含一種或多種化合物的脂肽組分的重量/重量比為約500:1至約1:500，所述化合物選自一種或多種下述化合物族:表面活性素型化合物，伊枯草菌素型化合物，芬枯草菌素型化合物，和/或fusaricidin類。在一具體的實施方案中那他霉素或其衍生物或制霉菌素或其衍生物與脂肽組分的重量/重量比為約500:1至約1:500，所述脂肽組分包括伊枯草菌素型化合物、表面活性素型化合物和/或芬枯草菌素型化合物的組合。在一些實施方案中，那他霉素或其衍生物或制霉菌素或其衍生物與含有一種或多種伊枯草菌素型化合物的脂肽組分的重量/重量比為約500:1至約1:500，所述伊枯草菌素型化合物如伊枯草菌素As和/或芽孢菌霉素。在其它實施方案中，那他霉素或其衍生物或制霉菌素或其衍生物與含有芬枯草菌素型化合物的脂肽組分的重量/重量比為約500:1至約1:500。在還有其它的實施方案中那他霉素或其衍生物或制霉菌素或其衍生物與含有表面活性素型化合物如表面活性素的脂肽組分的重量/重量比為約500:1至約1:500。在一實施方案中，那他霉素或其衍生物或制霉菌素或其衍生物與得自發酵液的脂肽粗提取物的重量/重量比為約1:500至約500:1，其包括含有芬枯草菌素型化合物、伊枯草菌素型化合物和/或表面活性素型化合物的發酵液。在一些實施方案中聚烯殺真菌劑與脂肽組分的任何上述組合的重量/重量比為約100:1至約1:100 ;在其它實施方案中其為約10:1至約1:10 ;在還有的其它實施方案中其為約5:1至約1:5 ;還在其它實施方案中其為約2:1至約1:2 ;還在其它實施方案中其為約 1:1。
[0013]在一實施方案中，聚烯殺真菌劑組分為那他霉素或其衍生物或制霉菌素或其衍生物，且脂肽組分包括下列中的一種或多種:(i)伊枯草菌素，(ii)芽孢菌霉素，(iii)抗霉枯草菌素，(iv)埃斯波素，(V)地衣素，(vi)帕米拉素，(vii)表面活性素，(viii)芬枯草菌素A，(ix)芬枯草菌素B，(X)大側柏素A，(xi)大側柏素B，和/或(xii)阿瓜斯他汀。在前述實施方案的另一個實例中，組合物不包含表面活性素。在另一實施方案中，聚烯殺真菌劑組分為那他霉素或其衍生物或制霉菌素或其衍生物，且脂肽組分包括下列中的一種或多種:(i)伊枯草菌素，(ii)表面活性素，(iii)芬枯草菌素和/或(V)大側柏素。在該實施方案的另一個實例中，那他霉素或制霉菌素的衍生物與母體化合物比較具有相等或更好的殺真菌活性。
[0014]本發明的組合物用于各種真菌控制的應用。上述組合物可用于控制真菌的植物病原體、收獲后的真菌病原體、食品或飼料的真菌病原體和人真菌病原體。
[0015]在一實施方案中，任何上述組合物都可通過將組合物施加于植物、植物周圍的區域、或食用栽培蘑燕、蘑燕 菌絲體(mushroom spawn)或蘑燕基肥(compost)用于控制祀向病原體如鐮孢霉屬(Fusarium)物種、葡萄孢屬(Botrytis)物種、輪枝孢霉屬(Verticillium)物種、絲核菌屬(Rhizoctonia)物種、木霉屬(Trichoderma)物種和腐霉屬(Pythium)物種。在一實施方案中，用于控制此種病原體的本發明組合物的聚烯殺真菌劑組分為那他霉素或其衍生物。在另一個實施方案中其為制霉菌素或其衍生物。
[0016]在另一實施方案中，本發明的組合物用于控制收獲后病原體如青霉屬(Penicillium)、地霉屬(Geotrichum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、和刺盤抱屬(Colletotrichum)物種。在一實施方案中，用于控制此種病原體的組合物的聚烯殺真菌劑組分為那他霉素或其衍生物。在另一個實施方案中其為制霉菌素或其衍生物。
[0017]在另一實施方案中，本發明的組合物用于控制存在于食品或飼料的真菌病原體，如青霉屬物種、曲霉屬(Aspergillus)物種和鐮孢霉屬物種。在一實施方案中,用于控制此種病原體的組合物的聚烯殺真菌劑組分為那他霉素或其衍生物。在另一個實施方案中其為制霉菌素或其衍生物。在還有的另一實施方案中，脂肽組分為一種或多種脂肽的純化的提取物。
[0018]在另一實施方案中，本發明的組合物用于通過給受試者施用包含聚烯殺真菌劑和至少一種多肽的組合物來治療或預防受試者的真菌感染。在一實施方案中真菌感染由念珠菌(Candida)引起，用于組合物中的聚烯殺真菌劑為制霉菌素或其衍生物。在另一實施方案中真菌感染由念珠菌引起，且用在組合物中的聚烯殺真菌劑為那他霉素或其衍生物。在另一實施方案中真菌感染由鐮孢霉(Fusarium)或曲霉(Aspergillus)引起且可導致角膜感染。在這樣的實例中，用在組合物中的聚烯殺真菌劑組分為那他霉素或其衍生物。在組合物用于治療角膜感染另一個實例中，聚烯殺真菌劑組分為制霉菌素或其衍生物。在又一實例中所述組合物的脂肽組分為一種或多種脂肽的純化的提取物。
[0019]本發明還包括通過下述方法生產殺真菌組合物的方法:制備一種或多種聚烯殺真菌劑與一種或多種脂肽的組合，測試該組合抗靶向真菌的協同效力和生產包含該組合和載體的殺真菌組合物。在一實施方案中，一種或多種脂肽為芽孢桿菌屬物種細菌(如上面和在發明詳述中描述的那些)的發酵產物提取物或其一部分。在該實施方案的另一個實例中，在制備該組合產品之前，選擇產脂肽的細菌，如芽孢桿菌屬物種菌株或類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)物種菌株，用產脂肽的細菌生產含脂肽的發酵產物，此種發酵產物或其提取物用于制備組合產品。在一實例中，此種發酵產物將包括下列脂肽中的一種或多種:表面活性素型化合物、芬枯草菌素型化合物、伊枯草菌素型化合物和/或fusaricidin，在更具體的實例中，此種發酵產物將包括下列脂肽中的一種或多種:表面活性素、大側柏素、芬枯草菌素、伊枯草菌素和/或芽孢菌霉素。在另一實施方案中，在制備組合產品之前，針對抗靶向病原體的殺真菌活性篩選每一種聚烯殺真菌劑組分和脂肽組分，且只有至少具有一定殺真菌活性的聚烯殺真菌劑和脂肽組分將用于制備組合產品。在其它實施方案中，靶向真菌為植物病原體，如鐮孢霉屬、葡萄孢屬(Botrytis)和輪枝孢屬(Verticillium);收獲后病原體，如青霉屬和地霉屬(Geotrichum);食品或飼料的真菌病原體,如曲霉屬、鐮孢霉屬(Fusarium)和青霉屬；和人真菌病原體,如念珠菌屬、曲霉屬和鐮孢霉屬。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)也可作為念珠菌屬的模型用作為上述方法中的祀向病原體。在一實例中，受試的組合產品的聚烯殺真菌劑組分為那他霉素或其衍生物或制霉菌素和其衍生物。在另一個實例中，受試的脂肽為表面活性素型化合物、伊枯草菌素型化合物、芬枯草菌素型化合物和/或fusar icidin類的一種或多種。
[0020]附圖簡述
[0021]附圖1顯示與陰性對照(沒有進行處理)相比在(i)得自枯草芽孢桿菌QST713的脂肽粗提取物和那他霉素，(ii )單獨的脂肽，或(iii)單獨的那他霉素的存在下釀酒酵母的生長百分數。
[0022]圖2顯示與陰性對照相比在(i)脂肽的粗提取物，(ii)那他霉素，和(iii)脂肽和那他霉素的存在下擴展青霉(Penicillium expansum)的生長百分數。
[0023]圖3顯示與陰性對照相比在(i)那他霉素，(ii)脂肽粗提取物，(iii)各種半純化或純化脂肽，(iv)那他霉素和脂肽粗提取物的組合，和(V)那他霉素和各種半純化或純化脂肽或所有半純化或純化脂肽的組合的存在下擴展青霉的生長百分數。如圖中所用的，“N”指那他霉素；“脂肽粗品”指脂肽粗提取物；“I”指半純化伊枯草菌素型化合物；“F”指半純化芬枯草菌素型化合物；“S”指純化的表面活性素型化合物。
[0024]圖4顯示與陰性對照相比在(i)那他霉素，(ii)脂肽粗提取物，(iii)各種半純化或純化脂肽，(iv)那他霉素和脂肽粗提取物的組合，和(V)那他霉素和各種半純化或純化脂肽的組合的存在下白地霉(Geotrichum candidum)的生長百分數。如圖中所用的,“N”指那他霉素；“L”指脂肽粗提取物；“1”指半純化伊枯草菌素型化合物；“F”指半純化芬枯草菌素型化合物；“S”指純化的表面活性素型化合物。
[0025]圖5顯示與陰性對照相比在(i)制霉菌素，(ii)脂肽粗提取物，(iii)各種半純化或純化脂肽，(iv)制霉菌素和脂肽粗提取物的組合，和(V)制霉菌素和各種半純化或純化脂肽的組合的存在下白地霉的生長百分數。如圖中所用的，“Ny”指制霉素；“L”指脂肽粗提取物；“1”指半純化伊枯草菌素型化合物；“F”指半純化芬枯草菌素型化合物；“S”指純化的表面活性素型化合物。
[0026]圖6顯示與陰性對照相比在(i)那他霉素，(ii)脂肽粗提取物，(iii)各種半純化或純化脂肽，(iv)那他霉素和脂肽粗提取物的組合；和(0那他霉素和各種半純化或純化脂肽的組合的存在下柑橘采后酸腐病菌(Geotrichum citr1-aurantii)的生長百分數。如圖中所用的，“N”指那他霉素；“L”指脂肽粗提取物；“I”指半純化伊枯草菌素型化合物；“F”指半純化芬枯草菌素型化合物；“S”指純化的表面活性素型化合物。
[0027]圖7顯示與陰性對照相比在(i)制霉菌素，(ii)脂肽粗提取物，(iii)各種半純化或純化脂肽，(iv)制霉菌素脂肽粗提取物的組合，和(V)制霉菌素和各種半純化或純化脂肽的組合的存在下柑橘采后酸腐病菌的生長百分數。如圖中所用的，“Ny”指制霉素；“L”指脂肽粗提取物；“1”指半純化伊枯草菌素型化合物；“F”指半純化芬枯草菌素型化合物；“S”指純化的表面活性素型化合物。
[0028]圖8顯示與陰性對照相比在(i)那他霉素，(ii)脂肽粗提取物，(iii)各種半純化或純化脂肽，(iv)那他霉素和脂肽粗提取物的組合，和(V)那他霉素和各種半純化或純化脂肽的組合的存在下釀酒酵母的生長百分數。如圖中所用的，“N”指那他霉素；“L”指脂肽粗提取物；“1”指半純化伊枯草菌素型化合物；“F”指半純化芬枯草菌素型化合物；“S”指純化的表面活性素型化合物。
`[0029]圖9顯示與陰性對照相比在(i)制霉菌素，(ii)脂肽粗提取物，(iii)各種半純化或純化脂肽，(iv)制霉菌素和脂肽粗提取物的組合，和(V)制霉菌素和各種半純化或純化脂肽的組合的存在下釀酒酵母的生長百分數。如圖中所用的，“Ny”指制霉素；“L”指脂肽粗提取物；“1”指半純化伊枯草菌素型化合物；“F”指半純化芬枯草菌素型化合物；“S”指純化的表面活性素型化合物。
[0030]發明詳述
[0031]所有公開、專利和專利申請，包括其中的任何附圖和附件，均通過引用以這樣的程度并入本文，即如同各個公開或專利申請被特別地且各自地指明通過引用并入本文。
[0032]以下說明包括用于理解本發明的信息。不是承認本文中提供的任何信息都是先有技術或與本申請要求保護的發明有關、或任何特別地或含蓄地提及的公開都是先有技術。
[0033]本發明包括用于控制微生物病原體，如真菌、卵菌(oomycetes)和/或細菌的聚烯殺真菌劑與除酶之外的抗生素非核糖體肽的協同組合。
[0034]本發明的聚烯殺真菌劑為含大環內酯環的抗真菌抗生素，其中大環內酯環具有(i)剛性親脂性聚烯部分和柔性的、親水性羥基化部分和(ii)與大多數真菌細胞膜內的固醇，主要是麥角固醇的結合的能力。大環內酯環可具有12-40個碳、6-14個羥基基團，并可與碳水化合物連接或可不與碳水化合物連接。該環可與一種或多種糖如含五個或更多碳單元的單糖、脫氧糖、氨基糖等連接，其中所述糖含有附于環(包括氧化連接)的取代基。本發明的聚烯殺真菌劑可由一種鏈霉菌屬(Streptomyces)細菌獲得。此種殺真菌劑包括那他霉素、制霉菌素、兩性霉素B、金色制霉素、非律平和魯斯霉素以及它們的衍生物。衍生物的實例包括，例如美國專利5，606，038中描述的兩性霉素B衍生物，或制霉菌素衍生物/類似物如 fcuheim 等，ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, Nov.2004，pp.4120-4129 中描述的S44HP、NYST1068、和辛烯制霉菌素。衍生物為天然存在的母體分子的類似物或與母體分子相比保持至少一定殺真菌活性的由母體分子衍生的合成或半合成的化合物。在一些實施方案中，與母體分子相比衍生物具有至少相同的或更高的殺真菌活性。衍生物包括鹽類和溶劑合物及其它與母體分子相比溶解度增加的改進形式。
[0035]本發明的抗生素非核糖體肽(NRPs)為破壞細胞膜或細胞壁的非核糖體肽，不包括酶類。此種抗生素NRPs通過稱為非核糖體肽合成酶的大酶復合物、而不是通過核糖體合成。如本文中所使用的，術語“抗生素”，指能夠殺死或使微生物病原體，如真菌、卵菌和/或細菌的生長變慢。互聯網上提供了稱為Norine的非核糖體肽的數據庫，該數據庫描述于 Caboche, S.等，“N0RINE:A Database of Nonribosomal Peptides, ”Nucleic AcidsResearch, 36:D326-D331, (2008)中。本發明抗生素NRPs破壞細胞膜，包括細胞器膜、或細胞壁。膜或壁可通過各種方式來破壞，包括抑制細胞膜或細胞壁組分的合成；細胞膜組分的物理破壞，如通過磷脂膜的透化，其通過膜增溶或者通過滲透性干擾；或者與細胞膜中的小分子結合。
[0036]本發明破壞細胞壁的抗真菌的NRPs包括棘白菌素類，其為半合成的兩親性脂肽，由與易變構型(configured)的脂質側鏈連接的環六肽芯構成。棘白菌素類抑制1，3_β -葡聚糖的合成，I, 3-β -葡聚糖是子囊菌(ascomycete)細胞壁的主要多糖組分,維持細胞的滲透完整性并與細胞分裂和生長有關。棘白菌素類包括卡泊芬凈、米卡芬凈和阿尼芬凈。
[0037]本發明破壞細胞膜的抗真菌的NRPs還包括可從各種細菌包括芽孢桿菌屬物種、類芽孢桿菌屬物種和鏈霉菌屬物種中獲得的脂肽，如兩親性環肽。如本文中所用的術語“月旨肽”指兩親性環肽。
[0038]在一些實施方案中，這些兩親性環肽由六至十個與氨基或羥基脂肪酸連接的α -氨基酸構成，如芬枯草菌素型化合物、伊枯草菌素型化合物、表面活性素型化合物和fusaricidin類。所述伊枯草菌素型化合物由七個氨基酸構成并與β -氨基脂肪酸連接。脂肪酸鏈的長度可在C14至C17之間變化。這些化合物可由芽孢桿菌屬的各個種包括枯草芽孢桿菌(subtilis)和解淀粉芽孢桿菌(amyloliquefaciens)獲得。所述伊枯草菌素類和它們的變化形式描述于 Ongena, M.，等，“Bacillus Lipopeptides: VersatiIe Weaponsfor Plant Disease Biocontrol, ^Trends in Microbiology, 16 (3): 115-125, (2007)中。本發明的伊枯草菌素型化合物包括一種或多種下列化合物:芽孢菌霉素D、芽孢菌霉素F、芽孢菌霉素L、芽孢菌霉素LC (亦稱bacillopeptin)、抗霉枯草菌素、伊枯草菌素A、伊枯草菌素AL和伊枯草菌素C (后三種化合物本文中合稱伊枯草菌素類)。
[0039]芬枯草菌素型化合物由十個與羥基脂肪酸連接的氨基酸構成，其中羥基脂肪酸具有長度在 C14至C18之間變化的鏈。這些化合物可由芽孢桿菌屬的各個種包括枯草芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟質芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌獲得和從鏈霉菌屬物種獲得。芬枯草菌素型化合物描述于Ongena，上文中。適合于本申請中描述的組合物的芬枯草菌素型化合物包括 Kimura, et al., “SNA60_367_New Peptide Enzyme Inhibitorsagainst Aromatase, ” Journal of Antibiotics, 50 (6): 529-531，(1997)中描述的得自鏈霉菌屬物種的芬枯草菌素A、芬枯草菌素B、大側柏素A、大側柏素B、大側柏素類，和美國專利6，291，426中描述的阿瓜斯他汀類(所列的后四種本文中合稱大側柏素類)。[0040]表面活性素型化合物由七個與羥基脂肪酸連接的氨基酸構成，其中羥基脂肪酸具有長度在C13至C16之間變化的鏈。這些化合物可由芽孢桿菌屬的各個種獲得，包括枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。表面活性素族的化合物描述于Ongena，上文中。本發明的表面活性素型化合物包括一種或多種下列化合物:埃斯波素、地衣素、帕米拉素和表面活性素。
[0041]fusaricidin類由六個與15-胍基_3_羥基十五燒酸連接的氨基酸構成。fusaricidin類可從類芽孢桿菌屬物種，包括多粘類芽孢桿菌(polymyxa)中獲得。fusaricidin 家族化合物描述于 Choi, S-K,等，“Identification and FunctionalAnalysis of the Fusaricidin Biosynthetic Gene of Paenibacillus polymyxaE681,，，Biochemical and Biophysical Research Communications, 365:89-95，(2008)中。本發明的fusaricidin類包括一種或多種下列化合物:fusaricidinA_D和fusaricidinL1-F03、L1-F04、L1-F05、L1-F06、L1-F07 和 L1-F08。
[0042]某些細菌產生一種或多種脂肽，且已知各種脂肽的組合具有協同的殺真菌活性。在一實施方案中，組合物的脂肽組分含有由下列脂肽類別中的至少兩種脂肽的組合:表面活性素型化合物、伊枯草菌素型化合物、和芬枯草菌素型化合物。在另一實施方案中，組合含有兩種或兩種以上的下列化合物:伊枯草菌素As、大側柏素A和B、芬枯草菌素A和B和表面活性素。在另一實施方案中，組合含有一種或多種下列化合物:伊枯草菌素As、大側柏素A和B、芬枯草菌素A和B、表面活性素和阿瓜斯他汀。
[0043]本發明的脂肽通過一種或多種細菌，如上面描述的那些產生，或化學合成。如本文中所使用的術語“發酵液”，指微生物發酵后所得到的培養基，其中尤其包括微生物及其構成部分、未使用的原料底物、和在發酵過程中微生物產生的代謝物。如本文中所使用的術語“發酵固體物”，指濃縮和/或干燥了的發酵液。如本文中所使用的術語“發酵產物”，指發酵液和/或發酵固體物。如本文中所使用的術語“脂肽”，指屬于發酵產物一部分的脂肽和指純化至至少到某種程度的脂肽，為化學合成或生物產生。
[0044]培養細菌的方法是本領域公知的。常規的大規模微生物培養方法包括深層發酵、固態發酵、或液體表面培養。對于芽孢桿菌屬，在發酵即將結束時，當營養素耗盡時，細胞開始從生長期向孢子形成期過渡，使得發酵的最終產物主要為孢子、代謝產物和殘余發酵培養基。孢子形成是許多芽孢桿菌(Bacilli)自然生命周期的一部分，并通常從細胞對營養限制的響應開始。對于本發明，對發酵進行設定以獲得高水平的脂肽和促進孢子形成。
[0045]由發酵(即，發酵液)產生的培養基中的細菌細胞、孢子和代謝產物可直接使用或通過常規的工業方法，如離心法、正切流動過濾、濾床過濾(depth filtration)和蒸發濃縮(以制備發酵固體物)。在一些實施方案中，將濃縮的發酵固體物洗滌，例如，通過透析過濾(diafiltration)工藝洗漆，以除去殘留的發酵液和代謝產物。
[0046]發酵液或發酵固體物可在添加或不添加載體的情況下采用常規的干燥工藝或方法干燥，如噴霧干燥、冷凍干燥、盤式干燥、流化床干燥、滾筒干燥、或蒸發。所得到的干發酵固體物可進一步處理，如通過碾磨或制粒，以達到特定的粒度或物理形式。干燥后還可加入下文中描述的載體，視情況用于期望的使用方法。
[0047]細菌產生的脂肽可從細菌細胞中分離或從其它細菌組分中進一步純化且，在一些實施方案中相互分離。術語“無細胞的制劑”指通過本領域的技術人員公知的方式已經從其中除去或基本上除去細胞的發酵液。制造無細胞制劑的一些方法描述如下。無細胞的發酵液制劑可以本領域已知的任何方式獲得，如發酵液的萃取、離心和/或過濾。本領域的技術人員將理解所謂的無細胞制劑可能不是完全無細胞而是主要無細胞或基本上無細胞，依賴于所用的除細胞的技術(例如，離心的速度)。可對所得到的無細胞制劑干燥和/或與有助于在其特定的應用方面的組分一起配制。上面描述的用于發酵液的濃縮法和干燥技術也適用于無細胞制劑。
[0048]在一些實施方案中，在通過發酵液的離心制備無細胞制劑之后，代謝產物可經尺寸排阻過濾如包括LH-20、G10、和G15和G25的Sephadex樹脂純化，其中當脂肽在800道爾頓至1600道爾頓之間時，所述Sephadex樹脂能基于截止分子量，如低于約2000道爾頓、低于約1500道爾頓、低于約1000道爾頓等的分子量將代謝產物分組到不同的級分中。
[0049]如本文中所使用的術語“粗提取物”指發酵液的有機提取物，諸如乙酸乙酯提取物，其中該提取物富集脂肽。一種由細菌培養物獲得脂肽粗提取物的方法描述于實施例1中。
[0050]如本文中所使用的術語“半純化的”，指從發酵液中分離出來的約50%至約90%純的脂肽。如本文中所使用的術語“純化的”，指從發酵液中分離出來的約91%至約100%純的脂肽。本發明的脂肽可以是純化或半純化的。
[0051]在一實施方案中，本發明的脂肽由枯草芽孢桿菌QST713獲得或者枯草芽孢桿菌QST713的發酵產物用作組合物的含脂肽組分。枯草芽孢桿菌QST713、其突變體、其上清液、及其脂肽代謝產物、和它們 用于控制植物病原體和昆蟲的方法全部描述于美國專利6，060,051; 6，103，228; 6, 291，426; 6, 417，163 和 6，638，910 中。在這些專利中，菌株稱為 AQ713。枯草芽孢桿菌QST713已依據用于專利程序的微生物保藏的國際承認的布達佩斯條約的條款在1997年5月7日于NRRL以保藏號B21661保藏。本說明書中關于QST713的任何提及指枯草芽孢桿菌QST713。適用于本發明的枯草芽孢桿菌QST713的特定變異體(例如，枯草芽孢桿菌AQ30002和AQ30004，以保藏號NRRL B-50421和NRRL B-50455保藏)描述于美國專利申請13/330，576中。
[0052]在其它實施方案中，能產生脂肽的芽孢桿菌菌株用作本發明脂肽的來源。如上所述，發酵液或發酵液的提取物可用作本發明的協同殺真菌組合中的含脂肽組分。由QST713的發酵液獲得脂肽的方法描述于實施例中。通常由芽孢桿菌屬細菌的發酵液獲得脂肽，并且就脂肽的存在分析發酵液是本領域技術人員公知的，使得適合于本發明的其它菌株能容易被技術人員識別。產生各種脂肽的芽孢桿菌屬菌株描述于上文引用的Ongena綜述文章(Trends in Microbiology (2007)Vol.16，N0.3)中。許多其它文章描述了產脂肽的芽孢桿菌屬菌株和由此種菌株的發酵液提取脂肽的方法:參見；例如，Alvarez, F.，等，“The piant-associated Bacillus amyloliquefaciens strains MEP218andARP23capable of producing the cyclic lipopeptides iturin or surfactin andfengycin are effective in biocontrol of sclerotinia stem rot disease，，Journalof Applied Microbiology(2011) 112:159-174;Ongena, M.等，“Involvement offengycin—type lipopeptides in the multifaceted biocontrol potential ofBacillus subtilis，” Applied Microbiology Biotechnology (2005) 69:29-38 ；Wang, Y.，等，“Separation and extraction of antimicrobial lipopeptides produced byBacillus amyloliquefaciens ES_2with macroporous resin，，Eur.Food Res.Technol.(2010)231:189-196。
[0053]本發明的組合物可包含載體，其為加入到組合物中的惰性制劑成分以改善回收率、效力、或物理性能和/或有助于包裝和給藥，其中組合物包括含脂肽的發酵產物、脂肽的無細胞制劑或純化的、半純化的或粗品的脂肽提取物。此種載體可單獨或組合加入。
[0054]本發明的組合物可用于各種目的，包括作物的保護和收獲后水果、蔬菜和植物的保護；作為化妝品、加工食品、動物飼料、或木材的防腐劑；和用于藥物和獸醫的應用。依賴于具體的應用，將組合物與適宜的載體一起配制有助于它們的應用或施用。在一些實施方案中，載體為抗結塊劑、抗氧化劑、膨脹劑(bulking agents)、和/或保護劑。有用載體的實例包括多糖(淀粉、麥芽糖糊精、甲基纖維素、蛋白質、如乳清蛋白、肽、樹膠)，糖(乳糖、海藻糖、蔗糖)，脂質(卵磷脂、植物油、礦物油)，鹽(氯化鈉、碳酸鈣、枸櫞酸鈉)，硅酸鹽(粘土、無定形硅石、煙霧/沉淀硅石、硅酸鹽鹽類)，蠟，油，醇和表面活性劑。
[0055]用于動物飼料添加劑的適宜的載體列于American Feed ControlOfficials, Inc.' s Official Publication 中，每年公布一次。參見，例如 OfficialPublication of American Feed Control Officials,Sharon Krebs, editor, 2006版，ISBN1-878341-18-9。
[0056]用于藥物或獸醫應用的組合物與基于給藥方式而變化的藥學上可接受的載體相組合。
[0057]本發明的組合物可以以控制病原體的有效量應用于需要處理的場所。如本文中所使用的術語“控制”，指殺 死或抑制病原體的生長。在一實施方案中病原體為真菌。在另一實施方案中病原體為卵菌。
[0058]在一實施方案中，聚烯殺真菌劑和含脂肽的組分(例如純化或半純化的脂肽、粗提取物、發酵產物或化學合成或衍生化的產品)以1:1比例(w/w)應用。在另一實施方案中，聚烯殺真菌劑與含脂肽的成分的比例為約2: 1、約3: 1、約4: 1、約5: 1、約10: 1、約15: 1、約20:1、或約50:1。在另一實施方案中，聚烯殺真菌劑與含脂肽成分的比例為約1:2、約1:3、約 1:4、約 1:5、約 1:10、約 1:15、約 1:20、或約 1:50。
[0059]在一具體的實施方案中，聚烯殺真菌劑與包含一種或多種脂肽的含脂肽組分可在該組合物中以各種重量/重量(w/w)比提供。在一實施方案中，聚烯殺真菌劑與含脂肽成分的重量/重量比為約500:1至約1:500。在另一實施方案中，聚烯殺真菌劑與含脂肽成分的重量/重量比為約100:1至約1:100。在另一實施方案中，聚烯殺真菌劑與含脂肽成分的重量/重量比為約10:1至約1:10。在另一實施方案中，聚烯殺真菌劑與含脂肽成分的重量/重量比為約5:1至約1:5。在另一實施方案中，聚烯殺真菌劑與含脂肽成分的重量/重量比為約2:1至約1:2。在另一實施方案中，聚烯殺真菌劑與含脂肽成分的重量/重量比約1:1。
[0060]在一實施方案中，該組合物應用于植物或應用于食用栽培蘑菇。在植物應用中，組合物可應用于植物的任何部分，包括它的根、葉或果實，或應用于植物周圍的區域，包括植物周圍的土壤。在蘑菇應用中，組合物可應用于蘑菇或應用于蘑菇菌絲體或應用于蘑菇基肥。應用可在種植之前、種植時和/或種植后發生。示例性的靶向病原體為鐮孢霉屬物種、葡萄孢屬物種、輪枝孢霉屬物種、絲核菌屬物種、木霉屬物種(綠霉)、腐霉屬物種和疫霉屬(Phytophthora)物種。確定本發明組合物的施用量為本領域的技術人員公知。本發明的組合物將通常由0.005g/L至100g/L每種聚烯殺真菌劑和非核糖體蛋白，如脂肽，構成。在協同的組合物應用于植物、植物局部或應用于植物周圍的區域或應用于食用栽培蘑菇、蘑菇菌絲體或蘑菇基肥的一實施方案中，聚烯殺真菌劑組分為那他霉素或其衍生物。
[0061]在另一實施方案中場所為收獲后食品和收獲后非食用植物材料，如生物燃料的原料。如本文中所使用的，收獲后食品指從田地收獲以后但包裝之前的水果、蔬菜、谷粒、油菜籽、和任何其它食用植物和堅果。示例性的收獲后病原體包括但不限于:灰葡萄孢(Botrytis cinerea)(灰霉)、致病性刺盤孢屬物種如急尖炭疽刺盤孢菌(Colletotrichumacutatum)、Colletotrichum coccodes、t5蕉科炭疽刺盤抱菌(Colleotrichum musa)、和頭干狀炭疽刺盤孢菌(Colletotrichum capsici)、軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovorasubsp.carotovora)、白地霉、柑橘采后酸腐病菌(酸腐病)、Helminthosporium solani (馬鈴薯的銀腐病)、Monilinia fructicola (褐腐病)、青霉屬物種,包括指狀青霉(digitatum)(柑桔綠霉病)和擴展青霉(仁果類的青霉)、根霉屬(Rhizopus)物種(根霉腐爛或滲漏)、黑曲霉(黑霉)、根串珠霉(Thielaviopsis basicola)(胡蘿卜黑根腐病)、水果的毛霉菌腐爛(例如，梨上的梨形毛霉(Mucor piriformis))、和鏈格孢屬腐爛(主要影響胡蘿卜、西蘭花、馬鈴薯、胡椒、蘋果、獼猴桃、梨、榲梓(quinces)和西紅柿)。確定本發明組合物用于收獲后食品和收獲后非食用植物材料的施用量為本領域的技術人員公知。在一實施方案中在組合物應用于收獲后食品和收獲后非食用植物材料，如生物燃料的原料的情況下，聚烯殺真菌劑組分為那他霉素或其衍生物。
[0062]在另一實施方案中場所為食品或飼料。如本文中所使用的術語食品包括加工食品，如乳制品、面包、玉米餅、熟食店肉類、和焙烤食品；半加工的或微加工的食品如肉和切開的水果和蔬菜；和包裝的食品，如包裝的萵苣、菠菜及其它蔬菜。術語飼料包括經過加工的動物性飼料和青貯飼料。在此種應用中靶向病原體為誘導腐敗和產生真菌毒素的病原體。示例性的病原體為曲霉屬物種、青霉屬物種和鐮孢霉屬物種。確定本發明組合物的施用量為本領域的技術人員公知。劑量水平和推薦的應用方法詳述于許多參考文獻，包括Davidson, P.Michael,等，eds., Antimicrobials in Food,第三版，CRC Press2005,第 8章，第275-289頁。在其中本發明的協同組合物應用于食品或飼料的一個實施方案中，聚烯殺真菌劑組分為那他霉素或其衍生物。
[0063]在另一實施方案中場所為人或動物。在人和獸醫應用中，將組合物局部地應用于皮膚和粘膜以控制白色念珠菌和/或鐮孢霉屬物種。在一實施方案中，組合物用于預防或治療陰道感染，尤其是白色念珠菌引起的以及光滑念珠菌(C.glabrata)、近平滑念珠菌(C.parapsilosis)、吉利蒙念珠菌(C.guilliermondii)、和熱帶念珠菌(C.tropicalis)。在其中協同組合物應用于治療念珠菌屬的一個實施方案中聚烯殺真菌劑組分為制霉菌素。在人類中，本發明的組合物還可應用于指甲、頭皮和皮膚以控制皮膚真菌，如發癬菌屬(Trichophyton)、表皮癖菌屬(Epidermophyton)和小孢霉屬(Microsporum),其對局限于身體角化結構(皮膚、指甲和頭發)的各種疾病表現負責。在人類中，該組合物可以錠劑的形式施用，以治療口腔念珠菌病或口服施用以治療或預防腸念珠菌病。本發明的組合物還可用于治療曲霉和鐮孢霉角膜感染。在其中組合物用于治療角膜感染的一個實施方案中，組合物的聚烯殺真菌劑組分為那他霉素或其衍生物。確定本發明組合物的適宜的施藥量將屬于本領域技術人員的公知常識。
[0064]在一些實施方案中在應用或施用組合物之前對需要處理的場所進行鑒別。
[0065]在一實施方案中，組合物可包含一種或多種藥學上可接受的載體。藥學上可接受的載體可根據它們對各種劑型的適配性而變化。在一實施方案中，組合物可包含一種或多種局部組合物形式的藥學上可接受的載體。局部組合物可以是霜劑、凝膠、油、噴霧、粉末、糊劑、粘土(clay)的形式或任何本領域已知的用于將組合物施用于皮膚或受試者(人或動物)的其它形式、方式或方法。含在局部組合物中的可接受的載體可根據制劑的類型進行變化。例如，軟膏、糊劑、霜劑或凝膠劑制劑可包含動物和植物脂肪、蠟、石蠟、淀粉、西黃蓍膠、纖維素衍生物、聚二醇類、硅酮、斑脫土、硅土、滑石粉、氧化鋅或這些物質的混合物。 [0066]在一實施方案中，組合物可包含一種或多種作為口服組合物的藥學上可接受的載體。口服劑型可以是固體粉末、小膠囊、片劑、錠劑、丸劑、膠囊、軟凝膠或液體的形式，其可單獨或以與其它組分適當的組合形式施用。例如，本發明的組合物可作為容易給藥的實踐以一個或多個小膠囊或錠劑施用。在制備口服劑型的組合物中，任何常規介質都可以利用。至于液體制劑(例如，懸浮液、酏劑、和溶液)，可使用含有例如水、油、醇、矯味劑、防腐劑、著色劑等的介質。藥學上可接受的載體如淀粉、糖、稀釋劑、制粒劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑等可用于制備口服固體物(例如，粉末、小膠囊、丸劑、片劑、膠囊、和錠劑)。也可以運用控釋形式。由于它們易于施用，小膠囊、片劑、丸劑、和膠囊為最有利的口服劑量單位形式，在這種情況下使用固體載體。如果期望，片劑可以按標準技術包糖衣或腸溶包衣。所有這些藥物載體和制劑為本領域普通技術人員公知。參見例如，WADE&WALLER，HANDBOOK OFPHARMACEUTICAL EXCIPIENTS (第二版，1994)。
[0067]在本發明的具體實施方案中可包括軟凝膠劑型的組合物。軟凝膠為裝有溶液、懸浮液、或半固體糊劑的整塊的密封的軟明膠殼。軟凝膠主要用于容納液體，其中活性成分以溶解或懸浮的狀態存在。軟凝膠已經是公知的且使用了許多年和用于各種目的。由于軟凝膠具有完全不同于兩構件(two-piece)的硬殼膠囊性質，因此軟凝膠能保留液體填充物。軟凝膠通常用于以膠囊包裹液體媒介物(vehicle)或載體(carrier)中的消費物質,包括維生素、飲食補充劑、藥物等。軟凝膠是可提供優于傳統劑型如片劑、硬殼膠囊和液體的明顯優點的獨特的劑型。這些優點包括患者依從性和消費者偏好、改善的生物利用度、在許多情況下的產品開發速度、縮短的制造時間、由于活性成分較少暴露于氧而帶來的增強的藥物穩定性、優良的劑量均一性、和產品差異。
[0068]在一實施方案中，本發明的組合物和方法可具有令人愉快的或適口的味道。適口的味道可通過包含甜味劑和/或香料來實現。可包含在本發明組合物中的甜味劑，通過舉例說明和非限制性地包括，蔗糖、果糖、高果糖玉米糖漿、葡萄糖、糖精鈉、麥芽糖糊精、阿司帕坦、乙酰舒泛鉀、新橙皮苷雙氫查耳酮、三氯蔗糖、甘草酸單銨、及其它本領域普通技術人員已知的那些。
[0069]崩解劑也可包含在本發明的組合物中以促進溶出。崩解劑，包含滲透化劑和芯吸劑，能將水或唾液汲取到組合物中，促進從組合物的內部以及外部溶出。可用于本發明中的這種崩解劑、滲透化劑和/或芯吸劑，通過舉例說明和非限制性地包括，淀粉，如玉米淀粉，馬鈴薯淀粉，其預膠化和改性淀粉，纖維素試劑，如艾迪速(Ac-d1-sol )，蒙脫石粘土，交聯PVP,甜味劑，斑脫土，微晶纖維素，交聯羧甲纖維素鈉，藻酸鹽，淀粉羥基乙酸鈉，樹膠，如瓊月旨，瓜爾膠，刺槐豆(locust bean),卡拉牙膠,果膠,阿拉伯膠,黃原膠和西黃蓍膠、對含水溶劑具有高親和性的硅土，如膠體二氧化硅，沉淀二氧化硅，麥芽糖糊精，β -環糊精，聚合物，如卡波姆，和纖維素試劑，如羥甲基纖維素，羥丙基纖維素和羥丙基甲基纖維素。
[0070]除上面描述的那些之外，任何適當的填充劑和賦形劑都可用于制備本發明的組合物，只要它們符合本文中描述的目的。例如，粘合劑為用于制粒中導致粉粒粘附的物質。這種用于本發明中的合適的化合物，通過舉例說明和非限制性地包括，金合歡膠，可壓性糖，明膠，蔗糖及其衍生物，麥芽糖糊精，纖維素聚合物，如乙基纖維素，羥丙基纖維素，羥丙基甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉和甲基纖維素，丙烯酸類聚合物，如不溶性丙烯酸酯甲基丙烯酸銨共聚物，聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸共聚物，聚維酮，共聚維酮，聚乙烯醇類，藻酸，藻酸鈉，淀粉，預膠化淀粉，瓜爾豆膠，聚乙二醇及其它本領域普通技術人員已知的那些。
[0071]稀釋劑也可包含在本發明的組合物中以增進組合物的粒化。稀釋劑可，通過舉例說明和非限制性地包括，微晶纖維素，蔗糖，磷酸二鈣，淀粉，乳糖和小于13個碳原子的多元醇，如甘露醇，木糖醇，山梨醇，麥芽糖醇和藥學上可接受的氨基酸，如甘氨酸，和它們的混合物。
[0072]潤滑劑為用于組合物制劑中減少組合物壓制過程中的摩擦。可用于本發明中的潤滑劑，通過舉例說明和非限制性地包括，硬脂酸，硬脂酸鈣，硬脂酸鎂，硬脂酸鋅，滑石粉，礦物油和植物油，苯甲酸，聚(乙二醇)，山崳酸甘油酯，硬脂基富馬酸酯，及其它本領域普通技術人員已知的那些。
[0073]助流劑改善制 造過程中粉末混合物的流動和使組合物重量差異減到最小。可用于本發明中的助流劑，通過舉例說明和非限制性地包括，二氧化硅，膠態或煙霧硅石，硬脂酸鎂，硬脂酸鈣，硬脂酸，玉米淀粉，滑石粉及其它本領域普通技術人員已知的那些。
[0074]著色劑也可包含在本發明的組合物中。如本文中所用的，術語“著色劑”包括用于賦予制劑顏色的化合物。此種化合物，通過舉例說明和非限制性地包括，FD&C紅3，FD&C紅20，？0&(:黃6，？0&(:藍2，0 & C綠5，FD&C橙5，D & C紅8，焦糖，和氧化鐵，紅顏料及其它本領域普通技術人員已知的那些。著色劑還可包括顏料，染料，色調劑(tints)，二氧化鈦，天然著色劑，如葡萄皮提取物，甜菜紅粉，β胡蘿卜素，胭脂樹萃(annato),卡紅(carmine),姜黃，辣椒粉及其它本領域普通技術人員已知的那些。
[0075]含水注射懸浮液可含有增強懸浮液粘度的物質，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。另外，活性化合物的懸浮液可制成合適的油性注射懸浮液形式。適宜的親脂性溶劑或載體包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂質體。非脂質聚陽離子氨基聚合物也可用于遞送。
[0076]組合物可包含增溶劑以確保活性成分如殺真菌劑和/或脂肽良好的溶解和/或溶出。也加入增溶劑以提高殺真菌劑和/或脂肽和/或其它組分，如表面活性劑，的溶解度，或維持組合物在穩定的或均勻的溶液或分散液狀態。
[0077]適宜的增溶劑的實例包括但不限于下列:醇類和多元醇，如乙醇，異丙醇，丁醇，苯甲醇，乙二醇，丙二醇，丁二醇及其異構體，甘油，季戊四醇，山梨醇，甘露醇，卡必醇(transcutol)，二甲基異山梨醇，聚乙二醇，聚丙二醇，聚乙烯醇，羥丙基甲基纖維素及其它纖維素衍生物，環糊精和環糊精衍生物；平均分子量為約200至約6000的聚乙二醇的醚類，如四氫糠醇PEG醚(glycofuiOl)或甲氧基PEG ;酰胺類及其它含氮化合物如2-吡咯烷酮，2-哌啶酮，ε -己內酰胺，N-烷基吡咯烷酮，N-羥烷基吡咯烷酮，N-烷基哌啶酮，N-烷基己內酰胺，二甲基乙酰胺和聚乙烯吡咯烷酮；酯如丙酸乙酯，三丁基枸櫞酸酯，乙酰基枸櫞酸三乙酯，乙酰枸櫞酸三丁酯，枸櫞酸三乙酯，油酸乙酯，辛酸乙酯，丁酸乙酯，三醋精，丙二醇單乙酸酯，丙二醇雙乙酸酯，ε-己內酯及其異構體，δ-戊內酯及其異構體，β-丁內酯及其異構體；及其它本領域已知的增溶劑，如二甲基乙酰胺，二甲基異山梨醇，N-甲基吡咯烷酮，單辛精，二甘醇單乙醚和水。
[0078]也可使用增溶劑的混合物。實例包括但不限于，三醋精，枸櫞酸三乙酯，油酸乙酯，辛酸乙酯，二甲基乙酰胺，N-甲基吡咯烷酮，N-羥乙基吡咯烷酮，聚乙烯吡咯烷酮，羥丙基甲基纖維素，羥丙基環糊精，乙醇，聚乙二醇200-100，糖原質，卡必醇(transcutol)，丙二醇，和二甲基異山梨醇。在一些實施方案中，增溶劑包括山梨醇，甘油，三醋精，乙醇，PEG-400，糖原質和丙二醇。
[0079]可包含的增溶劑的量沒有特別地限制。所給定的增溶劑的量可限于生物可接受的量，其可由本領域技術人員容易確定。在一些情況下，包含遠遠超過生物可接受的量的增溶劑的量，例如，以使藥物的濃度達到最大可能是有利的，其中過量的增溶劑在將組合物提供給受試者之前采用常規的技術，如蒸餾或蒸發，除去。因此，如果存在，增溶劑可到達基于藥物、及其它賦形劑相加重量的約10%，25%，50%, 100%,或最高約200%重量的重量比。如果期望，也可使用極少量的增溶劑，如約5%、2%、1%或更少。典型地，增溶劑可以約1%至約100%的量存在，更典型地以約5%至約25%重量的量存在。
[0080] 以下實施例純粹為了本發明的示例性和非限制性的目的給出。
實施例
[0081]實施例1:脂肽和那他霉素抗釀酒酵母的協同效果
[0082]對脂肽和那他霉素組合的抗釀酒酵母效力進行測驗，釀酒酵母被公認為測試抗真菌活性的有機物模型且與念珠菌屬緊密相關。參見Smits, GJ,等,“Stress Tolerance inFungi To Kill a Spoilage Yeast,，，Current Opin Biotechnol., 16(2):225-30, (2005)和 Castrillo, JI,等，“Yeast as a Touchstone in Post-Genomic Research:Strategiesfor Integrative Analysis in Functional Genomics, ”J Biochem Mo IBiol.，37(1):93-106, (2004)。
[0083]所用的脂肽為由枯草芽孢桿菌QST713的發酵液部分純化的伊枯草菌素型化合物、大側柏素型化合物和表面活性素類的復合混合物。將含有Luria肉湯(LB)的種子瓶接種QST713菌株，并將這些燒瓶在30°C下過夜培養。第二天，將取自種子瓶的等分試樣接種到大豆基培養基中并使其生長直至孢子形成。將枯草芽孢桿菌QST713發酵液酸化至pH2并離心從上清液分離出固體物。脂肽集中在沉淀丸斑(pellet)中。輕輕倒出上清液并將沉淀丸斑用含水有機溶劑混合物(優選80/20乙腈/水)提取。脂肽集中在含水有機級份上。將混合物離心并移除上清液。將細胞沉淀丸斑用含水有機溶劑混合物(優選80/20乙腈/水)再提取兩次。將每次提取的上清液合并，并在真空中除去溶劑。干燥過的提取物含有在枯草芽孢桿菌QST713中發現的所有三個類別的脂肽的富集形式:伊枯草菌素型化合物，包括伊枯草菌素A2，伊枯草菌素A3、A4或A5，伊枯草菌素A6，伊枯草菌素A7 ;芬枯草菌素型化合物，包括大側柏素Al，大側柏素A2，大側柏素BI，大側柏素B2，阿瓜斯他汀A，阿瓜斯他汀B，芬枯草菌素A，芬枯草菌素B ;表面活性素Al、A2或A3，表面活性素BI或B2和表面活性素Cl或C2。可將干燥過的提取物再懸浮于含水有機溶劑混合物(優選80/20乙腈/水)中。
[0084]使釀酒酵母野生型菌株BY4742在下列物質的存在下生長在液體YPD中:(I)那他霉素(Haorui Pharma-Chem Inc), (2)上述脂肽提取物，(3)那他霉素+脂肽提取物，和4)不存在脂肽或那他霉素(對照)。在加入到液體培養物之前那他霉素的初濃度為Ippm且脂肽提取物的初濃度為15ppm。那他霉素在液體培養物中的終濃度為0.08ppm且脂肽提取物的終濃度為1.12ppm，使得含有二者的樣品中那他霉素與脂肽的重量/重量比為1:14。
[0085]含在30°C下生長16小時之后將那他霉素和/或脂肽的液體培養物的光密度(OD)與對照培養物的光密度進行比較。為了比較，將未處理的對照培養物的OD設置在100%并將處理過的培養物標準化至此值。
[0086]應用高英方程如下，以測定脂肽與那他霉素的協同作用。
[0087]高英方程式:Exp=X+[Y* (100-X) ] /100
[0088]如果Etjb^Exp,則存在協同效果
[0089]注:在上述方程式中Ελ、Exp, X和Y代表生長抑制。因此，X和Y通過從100減去處理過的板上的生長量來計算，如下所示。
[0090]Χ=100-77.8`9=22.11，Υ=100_93.87=6.13
[0091]Eob=100-8.51=91.49
[0092]Exp=22.11+ [6.13* (100-22.11) ]/100=26.88
[0093]Eob?Exp
[0094]結果還顯示于附圖1中。
[0095]實施例2:采用由商購可得的產品得到的脂肽測試那他霉素和脂肽抗釀酒酵母的協同效果
[0096]此研究，類似于實施例1的描述，采用由SERENADE?max殺真菌劑或SERENADE? Aso殺真菌劑獲得的脂肽的粗提取物作為起始點進行(而不是從未配制的枯草芽孢桿菌QST713的發酵液開始)。SERENADE?產品可商購獲得，它們的活性成分為枯草芽孢桿菌QST713。脂肽的粗提取物通過將SERENADE? Aso(或SERENADE? max，溶于水)酸化至PH2、離心并用有機溶劑混合物提取所得到的沉淀丸斑(pellet)來獲得。將所得到的脂肽與如上所述的那他霉素組合并測試該混合物的抗釀酒酵母活性。可預見與上面獲得的結果相同。
[0097]實施例3:那他霉素和脂肽的粗提取物抗擴展青霉的協同效果
[0098]研究(i)那他霉素(HaoruiPharma-Chem Inc.), (ii)得自枯草芽抱桿菌 QST713的脂肽粗提取物(按照實施例1中的描述制備)，和(iii)那他霉素和脂肽粗提取物的組合對擴展青霉的作用。在96孔板中進行液體真菌生長試驗以測定脂肽和那他霉素的組合在抑制真菌生長方面是否是協同作用。所有步驟都是無菌進行。
[0099]對于各96孔板，對每個孔進行三次獨立的添加。首先，加入100 μ I的馬鈴薯右旋糖肉湯W/100ppm氯霉素。然后補充25 μ I的各樣品(脂肽、那他霉素、或得自稀釋板的組合(combo))。最后，將50μ1的DI H2O加入到空白板中(該板意在作為空白用于OD參比)或者將50μ I的IO5真菌接種物加入到其各自板內的每個孔中。這樣，每個孔中脂肽的終濃度為1.1ppm且每個孔中那他霉素的終濃度為1.1ppmo然后將板蓋上蓋子并置于20°C下溫育3天。
[0100]對板進行評價并解釋數據
[0101]在溫育期之后，通過使用可在Wallac? Victor?軟件中找到的設置“micSettingsi600 (0.1s) ”米用PerkinElmer Victor板讀數器在600nm下的光密度對每個板內每個孔的生長情況進行評價。在樣品活性下降的情況下當在稀釋系列中出現渾濁的孔(部分生長)時還可用視覺粗略地評價結果。
[0102]在獲得每個孔的OD之后，通過下述計算測定相對生長:[(處理w/細菌)_(處理w/o細菌)/(稀釋劑對照w/細菌)-(稀釋劑對照w/o細菌)]X100。如果在600nm下的OD讀數的平均值和標準差遠遠高于非接種過的OD參比孔的范圍，則認為細菌生長的陽性對照孔是可接受的。(在未接種過的稀釋劑對照和接種過的稀釋劑對照孔的讀數之間必須存在很大的差別以確保獲得良好的生長)。
[0103]然后繪制該生長百分數相對測試過的用于稀釋的樣品的圖表并將最后的提供至少80%生長抑制的稀釋度作為最低抑制濃度(MIC)。
[0104]然后通過上面給出的高英方程式測定協同協同效果。
[0105]在本實施例中，1.1ppm脂肽的生長百分數為113%。1.1ppm那他霉素的生長百分數為102%。1.1ppm脂肽+1 .1ppm那他霉素的生長百分數為20.4%。
[0106]X=100-102.1
[0107]Y=100-112.9
[0108]Exp=-2.1+(-12.9(102.1))/100
[0109]Exp=-15.3
[0110]作為替代，對于100以上的生長百分數，舍去取整數為100。在我們的實施例中，這將使Exp=O
[0111]Eob=100-20.4
[0112]Eob=79.6
[0113]79.6?-15.3
[0114]Eob?Exp ;因此，觀察到協同效果，如附圖2所描述的。
[0115]實施例4:半純化和純化的大側柏素類、伊枯草菌素類和表面活性素類和那他霉素抗擴展青霉的協同效果
[0116]采用擴展青霉作為靶向病原體以(i)那他霉素和得自枯草芽孢桿菌QST713的脂肽粗提取物(按照以上所述獲得)和(ii)那他霉素和從枯草芽孢桿菌QST713獲得的半純化和純化的脂肽的組合進行類似于上面描述的那些的實驗，實驗如下。采用酸化之后用有機溶劑萃取從枯草芽孢桿菌QST713發酵液中沉淀和提取伊枯草菌素型化合物，包括伊枯草菌素As、和芬枯草菌素型化合物，包括大側柏素類(A，B和阿瓜斯他汀類)和芬枯草菌素類。通過反相色譜法再將這些脂肽純化和分離，得到約83%純的芬枯草菌素型化合物和約88%純的伊枯草菌素類。用有機溶劑提取表面活性素類然后采用尺寸排阻柱型色譜法再純化至95%的純度。采用高效液相色譜跟蹤測定每種脂肽類別的純度。
[0117]每個試驗孔中那他霉素的終濃度為2.23ppm ;每個孔中脂肽粗提取物的終濃度為2.23ppm ;每個孔中伊枯草菌素型化合物、表面活性素或芬枯草菌素型化合物的每種半純化或純化的脂肽提取物的終濃度為2.23ppm。因此，含有組合的孔中各組分的重量/重量比為1:1。
[0118]結果顯示在各種組合之間有協同效果，如圖3和表1中所示。表1顯示如上所述的采用高英方程式的協同效果計算。
[0119]表1
[0120]
【權利要求】
1.一種組合物，包含聚烯殺真菌劑和至少一種脂肽的協同殺真菌組合。
2.權利要求1的組合物，其中至少一種脂肽選自伊枯草菌素型化合物、表面活性素型化合物、芬枯草菌素型化合物和fusaricidin類。
3.權利要求1的組合物，其中所述至少一種脂肽為一種或多種伊枯草菌素型化合物。
4.權利要求1的組合物，其中所述至少一種脂肽為一種或多種芬枯草菌素型化合物。
5.權利要求1的組合物，其中所述至少一種脂肽為一種或多種表面活性素。
6.權利要求3的組合物，其中所述伊枯草菌素型化合物為伊枯草菌素A。
7.權利要求3的組合物，其中所述伊枯草菌素型化合物為芽孢菌霉素。
8.權利要求1的組合物，其中所述至少一種脂肽為fusaricidin。
9.權利要求1的組合物，包含至少兩種脂肽。
10.權利要求書9的組合物，其中所述至少兩種脂肽選自伊枯草菌素型化合物、表面活性素型化合物和芬枯草菌素型化合物。
11.權利要求10的組合物，其中所述至少兩種脂肽選自伊枯草菌素類、表面活性素類和芬枯草菌素型化合物。
12.權利要求1的 組合物，其中所述至少一種脂肽為含脂肽的發酵產物的一部分或含脂肽的發酵產物的提取物。
13.權利要求12的組合物，其中所述含脂肽的發酵產物得自芽孢桿菌屬(Bacillus)物種的細菌。
14.權利要求13的組合物，其中所述芽孢桿菌屬物種的細菌選自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或角軍淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
15.權利要求14的組合物，其中所述枯草芽孢桿菌選自枯草芽孢桿菌QST713及其變異體。
16.權利要求2的組合物，其中所述聚烯殺真菌劑為那他霉素或其衍生物。
17.權利要求2的組合物，其中所述聚烯殺真菌劑為制霉菌素或其衍生物。
18.權利要求2的組合物，其中所述聚烯殺真菌劑為兩性霉素B或其衍生物。
19.權利要求2的組合物，其中所述聚烯殺真菌劑為金色制霉素或其衍生物。
20.權利要求2的組合物，其中所述聚烯殺真菌劑為非律平或其衍生物。
21.權利要求2的組合物，其中所述聚烯殺真菌劑為光明霉素或其衍生物。
22.權利要求1的組合物，其中所述聚烯殺真菌劑和所述至少一種脂肽的重量/重量比為約500:1至約1:500。
23.權利要求1的組合物，其中所述聚烯殺真菌劑和所述至少一種脂肽的重量/重量比為約100:1至約1:100。
24.權利要求1的組合物，其中所述聚烯殺真菌劑和所述至少一種脂肽的重量/重量比為約10:1至約1:10。
25.權利要求1的組合物，其中所述聚烯殺真菌劑和所述至少一種脂肽的重量/重量比為約5:1至約1:5。
26.權利要求1的組合物，其中所述聚烯殺真菌劑和所述至少一種脂肽的重量/重量比為約2:1至約1:2。
27.權利要求1的組合物，其中所述聚烯殺真菌劑和所述至少一種脂肽的重量/重量比為約1:1。
28.—種控制真菌病原體的方法，包括將有效量的包含聚烯殺真菌劑和至少一種脂肽的協同組合的組合物施用于需要處理的場所。
29.權利要求28的方法，其中所述至少一種脂肽選自伊枯草菌素型化合物、表面活性素型化合物、芬枯草菌素型化合物和fusaricidin類。
30.權利要求29的方法，其中所述至少一種脂肽為一種或多種伊枯草菌素。
31.權利要求29的方法，其中所述至少一種脂肽為一種或多種表面活性素。
32.權利要求29的方法，其中所述至少一種脂肽為一種或多種芬枯草菌素型化合物。
33.權利要求29的方法，其中所述聚烯殺真菌劑為那他霉素或其衍生物。
34.權利要求29的方法，其中所述聚烯殺真菌劑為制霉菌素或其衍生物。
35.權利要求29的方法，其中所述聚烯殺真菌劑為兩性霉素B或其衍生物。
36.權利要求29的方法，其中所述聚烯殺真菌劑為金色制霉素或其衍生物。
37.權利要求29的方法，其中所述聚烯殺真菌劑為非律平或其衍生物。
38.權利要求29的方法，其中所述聚烯殺真菌劑為光明霉素或其衍生物。
39.權利要求28的方法，其中所述聚烯殺真菌劑和所述至少一種脂肽的重量/重量比為約500:1至約1:500。`
40.權利要求28的方法，其中所述聚烯殺真菌劑和所述至少一種脂肽的重量/重量比為約100:1至約1:100。
41.權利要求28的方法，其中所述聚烯殺真菌劑和所述至少一種脂肽的重量/重量比為約10:1至約1:10。
42.權利要求28的方法，其中所述聚烯殺真菌劑和所述至少一種脂肽的重量/重量比為約5:1至約1:5。
43.權利要求28的方法，其中所述聚烯殺真菌劑和所述至少一種脂肽的重量/重量比為約2:1至約1:2。
44.權利要求28的方法，其中所述聚烯殺真菌劑和所述至少一種脂肽的重量/重量比為約1:1。
45.權利要求28的方法，其中所述至少一種脂肽為含脂肽的發酵產物的一部分或含脂肽的發酵產物的提取物。
46.權利要求28的方法，其中所述含脂肽的發酵產物得自芽孢桿菌屬物種的細菌。
47.權利要求46的方法，其中所述芽孢桿菌屬為枯草芽孢桿菌QST713或其變異體。
48.權利要求28的方法，其中所述場所為收獲后的食物且真菌病原體為收獲后病原體。
49.權利要求48的方法,其中所述收獲后病原體為青霉屬(Penicillium)物種或地霉屬(Geotrichum)物種。
50.權利要求48或49的方法，其中所述聚烯殺真菌劑為那他霉素且所述至少一種脂肽選自伊枯草菌素型化合物、表面活性素型化合物和芬枯草菌素型化合物。
51.權利要求28的方法，其中所述場所為植物、根、種子或植物周圍的土壤，且真菌病原體為真菌植物病原體。
52.權利要求28的方法，其中所述場所為食物或飼料且聚烯殺真菌劑為那他霉素。
53.權利要求28的方法，其中所述場所為人或動物且其中真菌病原體為念珠菌屬(Candida)。
54.權利要求53的方法，其中所述聚烯殺真菌劑為制霉菌素。
55.權利要求28的方法，其中所述場所為人或動物，且其中真菌病原體為曲霉屬(Aspergillus)物種或鐮孢霉屬(Fusarium)物種,且其中聚烯殺真菌劑為那他霉素。
56.一種治療或預防受試者真菌感染的方法，該方法包括給受試者施用包含聚烯殺真菌劑和至少一種脂肽的協同組合的組合物。
57.權利要求56的方法，其中所述受試者為人或動物且真菌感染由念珠菌屬引起。
58.權利要求57的方法，其中所述聚烯殺真菌劑為制霉菌素。
59.權利要求56的方法，其中所述真菌感染由鐮孢霉屬物種或曲霉屬物種引起。
60.權利要求59的方法，其中所述聚烯殺真菌劑為那他霉素。
61.組合物，包含聚烯殺真菌劑和含脂肽的發酵產物。
62.權利要求61的組合物，其中所述含脂肽的發酵產物得自芽孢桿菌屬物種的細菌。
63.一種控制真菌病原體的方 法，包括將包含聚烯殺真菌劑和含脂肽的發酵產物的組合物施用于需要處理的場所。
【文檔編號】C07H17/08GK103732064SQ201280025177
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年5月23日 優先權日:2011年5月24日
【發明者】M·吉亞貝爾-戈雅, J·S·馬戈利斯 申請人:拜爾作物科學有限合伙公司