針對人IgG抗體的CH1結構域中表位的抗原結合蛋白的制作方法

針對人IgG抗體的CH1結構域中表位的抗原結合蛋白的制作方法
【專利摘要】本發明涉及用抗原結合蛋白純化包含人IgG-CH1結構域的分子的方法，所述抗原結合蛋白能結合包含在人IgG1、人IgG2、人IgG3和人IgG4的每一個的CH1結構域中的表位。本發明進一步涉及能用于本發明方法中的抗原結合蛋白。本發明的抗原結合蛋白的構架區優選相應于天然沒有輕鏈的抗體的那些構架區，例如可以在駱駝中發現的抗體。本發明進一步涉及編碼這種抗原結合蛋白的核酸，包含這種蛋白的免疫吸附材料，及這種免疫吸附材料從各種物質中純化含有IgG-CH1結構域的分子的用途。
【專利說明】針對人IgG抗體的CH1結構域中表位的抗原結合蛋白
發明領域
[0001] 本發明涉及生物化學及免疫學領域，特別是免疫親和性及抗體技術。本發明涉及用能結合人CHl結 構域的抗原結合蛋白捕獲包含人IgG-CHl結構域的靶分子的方法。本發明進一步涉及用于所述方法中的手段，包括衍生自駱駝(camelid)抗體的抗原結合蛋白，包含這種蛋白的免疫吸附材料及其生產手段和方法。
_2] 發明背景
[0003]哺乳動物IgG抗體和/或其Fab片段、特別是人和/或人源化IgG抗體和/或其Fab片段的高效、快速、節約和成本高效的純化是現有技術中深入研究的問題。隨著新的基于抗體藥物的出現，IgG和/或其Fab片段的純化在基于抗體藥物生產中變成更關鍵和昂貴的步驟，需要高純度。另外，這種治療性抗體必須保持它們的結合親和性及生物學活性，包括效應物功能。
[0004]為了純化所有4個亞類的人或人源化IgG，即人/人源化IgGl、IgG2、IgG3和IgG4，常用純化方法包括使用經典生化分離和純化技術如陰離子/陽離子交換、大小排阻/凝膠過濾、沉淀及應用特異性親和性配體。常用親和性配體是細菌衍生的蛋白A和蛋白G，單克隆抗體及駱駝抗體或者衍生自其中的結合片段，其結合4個亞類人或人源化IgG的一或多個亞類。
[0005]蛋白A結合人IgGl、人IgG2和人IgG4(Fc)的CH2-CH3界面，因此不能用于純化人IgG3，因此不能用于所有人IgG亞類。蛋白A顯示與VH3家族的一些人VH結構域結合，但是不與人 VHl 和 VH2 結合(Janssonet al (1998) FEMS Immunology and MedicalMicrobiology20:69-78)，因此蛋白A不能用作通用工具純化所有人IgG衍生的Fab片段。另外，蛋白A不能用于從由人IgG Fe-和Fab片段的混合物組成的原料樣品中選擇性捕獲人IgG衍生的Fab片段，因為其對IgG Fe結構域的結合反應性更突出。另外，基于Z結構域的蛋白A變體(如MabSelect Sure)缺少結合人VH3結構域的能力，因此不能用于Fab純化。
[0006]蛋白G是由C和G群鏈球菌表達的細菌表面蛋白。蛋白G以高親和性識別在人IgGl、IgG2、IgG3和IgG4抗體的Fe部分(Fe Y )上CH2和CH3結構域之間界面處的共同位點。另外，蛋白G顯示通過結合IgG的CHl結構域組合kappa同種型的CL結構域而結合IgG 抗體的 Fab 部分(Derrick and Wigley (1994) J.Mol.Biol.243:906-918)。蛋白 G 僅結合來自 IgGl、IgG3 和 IgG4 的 Fab,但是不結合 IgG2 的 Fab (Perosa et al (1997) Journalof Immunological Methods203:153-155)。對CHl的結合親和性顯著低于Fe部分上的其表位，這例如反映在必須使用低流速以使得有效純化人Fab片段(Proudfoot et al.(1992)Protein expression and purifications:368-373) ? 關于蛋白 G 在 CH2 和 CH3 結構域界面的結合，實驗數據表明發生誘導契合，其可以解釋洗脫所需的嚴苛條件，如在等于或低于ρΗ2.5 的洗脫 pH所不(PROTEUS, Protein G Antibody Purification Handbook ；Mini&Midispincolumns ；5September2005 ;Pro_Chem, Littleton, USA)。這些嚴苛條件可影響結合位點的構象，由此改變純化的IgG抗體的免疫功能(P.Gagnon, 1996, in Purification toolsfor monoclonal antibodies,published by Validated Biosystems,Inc5800N)。X-身寸線晶體測量示出通過結合蛋白A，CH2結構域可以朝CH3結構域縱向移位，其最終導致CH2結構域之間碳水化合物區域的部分旋轉及去穩定化。所述變形干擾隨后的蛋白質-蛋白質相互作用，這種相互作用是IgG發揮其效應物功能所需的。除了嚴苛洗脫條件對抗原結合能力的后果(特別是對于蛋白G)，這些二級作用有時干擾或改變抗體效應物功能及增加免疫球蛋白對蛋白酶解的易感性。如果人或人源化抗體用作治療目的，由變性導致的效應物功能的喪失改變折疊及純化步驟期間產生的化學修飾是非常不希望的。特別地，分子內及分子間硫橋的還原經常是純化和儲存期間產生的問題。
[0007]蛋白L經VL kappal、3和4結合人Fab,但是不結合VL kappa2及不結合lambda同種型的任何VL結構域。因此，蛋白L不結合全部人IgG衍生的Fab片段并且不是僅對IgG選擇性的。
[0008]作為人IgG結合蛋白如蛋白G的替代，在文獻中已描述一些小鼠單克隆抗體(Mab)能夠結合人 IgG 抗體的 Fe 結構域(Nelson PN, et al.Characterisation ofant1-1gG monoclonal antibody A57H by epitope mapping.Biochem Soc Transl997 ；25:373)。已鑒別一些共同Fe表位，例如:Mab G7C、JD312具有在CH2上的結合表位，氨基酸 290-KPREE-294。Mab PNF69C、PNFl IOA、PNF211C 具有在 CH2-CH3 上的結合表位，AA:338-KAKGQPR-344。Mab A57H 顯示在 CH3 上的結合表位，AA380-EWESNGQPE-388。與使用小鼠Mab或者來自其它非人物種的Mab相關的問題是Mab從基質釋放導致純化的制備物中的污染很難被除去。另外，Mab及其功能片段(Fab、Fab2)容易變性，對于分子的正確3D結構及重鏈和輕鏈排列所需的S-S橋容易被破壞，特別是在經常是釋放柱結合人IgG所需的嚴苛洗脫條件下。由于基于Mab的親 和性配體的弱點，柱容量快速降低，柱在洗脫后的再利用能力非常有限并且不適合連續操作。
[0009]代替EP-A-434317所述的(sc) Fv片段，如W02006 / 059904所述的衍生自天然缺乏輕鏈的抗體的抗體片段(VHH)也可以用于產生免疫吸附材料用于人IgG抗體的純化。應用這些VHH片段的優勢是它們是單結構域肽，甚至在更高溫度下也非常穩定。另外，VHH小，容易在節約成本的宿主生物體如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中生產。另外，由于這些VHH片段與人VH3結構域家族之間的序列相似性，預期與細菌表面蛋白如蛋白A和G相比免疫原性非常低。這些抗體在EP-A-656946中更詳細描述。
[0010]W02006 / 059904所述的氨基酸序列涉及結合kappa或lambda同種型的人抗體輕鏈的VHH片段，因此不能選擇性純化僅IgG同種型的抗體和/或Fab片段。另外，在例如表達人IgG抗體和/或其Fab片段的細胞系的上清中存在的過量輕鏈也會被所述配體捕獲。合成配體如 Fabsorbent? FlP HF(ProMetic BioSciences Ltd, Cambridge, UK)具有相同缺點。
[0011]W02009 / 011572所述的氨基酸序列涉及結合人IgG的Fe部分的VHH片段。因此它們不能純化不包含Fe結構域的人IgG的片段，如人IgG的F(ab’)2片段的Fab。
[0012]Carredano et al.描述了用于人Fab純化的合成親和性配體的開發,它們結合所有IgG-kappa類型抗體共有的保守腔(在IgG CHl和CL-kappa結構域之間形成的小袋)(Carredano et al.(2004)Protein Sciencel3:1476-1488)。盡管 IgG-CHl 被認為是在不同IgG Fab片段之間最保守的區域,但是Carredano et al.的結論是這個結構域對于產生好的結合親和性配體是不太合適的，因為其扁平結構(也在Derrick et al.如前中報道)。相反，選擇上述腔，因此沒有對包含lambda同種型輕鏈的人Fab片段的反應性。
[0013]因此，現有技術中已知的結合劑已被描述可以用于純化人IgG抗體和/或其Fab片段。但是這些結合劑(本身)無一能提供通用純化方法用于所有人IgG抗體和/或其Fab片段。因此，現有技術需要新的手段和方法以獲得捕獲和/或純化人或人源化IgGl、IgG2、IgG3和IgG4和/或其Fab片段的通用方法。
[0014]發明概沭
[0015]在第一方面，本發明涉及用于捕獲包含人IgG-CHl結構域的靶分子的方法，其中所述方法包括步驟:a)將包含靶分子的樣品與固定化于支持物上的包含抗原結合蛋白的免疫吸附材料接觸；及《使得靶分子通過特異性結合抗原結合蛋白而被免疫吸附材料捕獲；其中所述抗原結合蛋白能夠結合單表位，所述表位包含在人IgGl、人IgG2、人IgG3和人IgG4的每一個的CHl結構域中，其中所述抗原結合蛋白被具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VHH交叉阻斷(cross-blocked)或者其中所述抗原結合蛋白被具有SEQ IDNO:1-158任一氨基酸序列的VHH交叉阻斷，優選其中所述抗原結合蛋白包含免疫球蛋白衍生的可變結構域，所述可變結構域包含針對所述表位的完整抗原結合位點。
[0016]在一個優選實施方案中，所述抗原結合蛋白包含:a)可得自駱駝或鯊魚的抗體，所述抗體僅由重鏈組成并且天然缺少輕鏈；b)在a)中限定的抗體的可變結構域；或者c)可變結構域，其中在b)中限定的可變結構域的構架序列移植有得自其它來源的CDR。
[0017]在一個優選實施方案中，所述靶分子是選自下組的分子:人或人源化IgGl分子、人或人源化IgG2分子、人或人源化IgG3分子、人或人源化IgG4分子、人或人源化IgG Fab、人或人源化IgG F(ab’)2、單臂(one armed)人或人源化IgG抗體、單鏈人或人源化IgG抗體、IVIG及人或人源化IgG消化物。在一個優選實施方案中，所述人或人源化IgG消化物是木瓜蛋白酶或胃蛋白酶人IgG消化物。
[0018]或者或與早前的優選實施方案組合，在一個優選實施方案中，所述抗原結合蛋白結合CHl結構域的表位，所述表位包含一或多個氨基酸:在122位的苯丙氨酸，在127和128位的任一位置不是半胱氨酸或者是單個半胱氨酸，在156位的絲氨酸或賴氨酸和/或在216位的天冬酰胺或絲氨酸，其中所述氨基酸位置是基于Kabat編號。
[0019]或者或與早前的優選實施方案組合，在一個優選實施方案中，所述抗原結合蛋白是:a)抗體；b)包含完整抗原結合位點的抗體片段；c)沒有輕鏈的單結構域重鏈抗體；d)包含完整抗原結合位點的沒有輕鏈的單結構域重鏈抗體的片段；或者e)包含完整抗原結合位點的免疫球蛋白衍生的可變結構域。優選地，所述抗原結合蛋白是駱駝VHH或駱駝化VH0
[0020]在優選的實施方案中，本發明涉及純化靶分子的方法，所述方法包括在如前述實施方案限定的方法中用免疫吸附材料捕獲靶分子，其中所述方法進一步包括步驟:c)在降低靶分子與免疫吸附材料之間的親和性的條件下洗脫結合的靶分子，及任選地回收靶分子。在一個優選實施方案中，所述抗原結合蛋白不結合游離輕鏈，更優選不結合人抗體的游離輕鏈，更優選不結合人IgG的輕鏈。
[0021]在一個方面，本發明涉及純化包含人IgG-CHl結構域的Fab片段而不共純化游離輕鏈的方法，其中所述方法包括步驟:a)將包含靶分子和游離輕鏈的樣品與固定化于支持物上的包含抗原結合蛋白的免疫吸附材料接觸；b)使得靶分子通過特異性結合抗原結合蛋白而被免疫吸附材料捕獲；及(3)在降低靶分子與免疫吸附材料之間的親和性的條件下洗脫結合的靶分子，及任選地回收靶分子；其中所述抗原結合蛋白如前述任一實施方案限定。
[0022]在一個方面，本發明涉及從液體中吸附包含人IgG-CHl結構域的靶分子的體外方法，所述方法包括將免疫吸附材料與液體接觸的步驟，其中所述免疫吸附材料包含固定化于載體上的如前述任一實施方案限定的抗原結合蛋白，及其中優選抗原結合蛋白通過共價連接固定化于載體上。
[0023]在一個方面，本發明涉及前述任一實施方案限定的抗原結合蛋白。
[0024]在一個方面，本發明進一步涉及包含編碼本發明的抗原結合蛋白的核苷酸序列的核酸。
[0025]在一個方面，本發明進一步涉及包含本發明的核酸的宿主細胞。
[0026]在一個方面，本發明涉及產生本發明的抗原結合蛋白的方法，所述方法包括在有助于所述抗原結合蛋白表達的條件下培養本發明的宿主細胞的步驟。
[0027]在進一步的方面，本發明涉及包含本發明的抗原結合蛋白的免疫吸附材料。
[0028]在進一步的方面，本發明涉及本發明的抗原結合蛋白或本發明的免疫吸附材料用于檢測和/或純化包含人IgG-CHl結構域的靶分子的用途，優選用于體外檢測和/或體外純化包含人IgG-CHl結構域的靶分子的用途。在一個優選實施方案中，所述靶分子是選自下組的分子:人或人源化IgGl、人或人源化IgG2、人或人源化IgG3、人或人源化IgG4、人或人源化IgG Fab、人或人源化IgG F(ab’)2、單臂人或人源化IgG抗體、單鏈人或人源化IgG抗體、IVIG及人或人源化IgG消化物。在一個優選實施方案中，所述人IgG消化物是木瓜蛋白酶或胃蛋白酶人或人源化I gG消化物。在一個優選實施方案中，所述靶分子是人IgG或者人或人源化IgG Fab而無游離輕鏈的共結合。在一個優選實施方案中，所述靶分子是存在游離輕鏈的人IgG Fab。
[0029]發明描述
[0030]
[0031]“序列相同性”或“相同性”在本文定義為通過比較序列而確定的兩個或更多個氨基酸(多肽或蛋白質)序列或者兩個或更多個核酸(多核苷酸)序列之間的關系。在本領域中，“相同性"還指氨基酸或核酸序列之間的序列相關性程度，可以通過這種序列串之間的匹配而確定。兩個氨基酸序列之間的“相似性”是通過比較一個多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代物與第二個多肽的序列而確定。“相同性”和“相似性”可以容易地通過已知方法計算。術語“序列相同性”或“序列相似性”是指兩個(多)肽或兩個核苷酸序列當優選在(至少進行比較的最短序列的)整個長度上最佳排列對比時并且如通過程序Clustalffd.83)、GAP或BESTFIT使用默認參數使匹配數最大化及使缺口數最小化，共享至少一定百分比的序列相同性，如在本文它處定義。GAP使用Needleman and Wunsch全局對比算法在它們的整個長度上對比兩個序列，使匹配數最大化及缺口數最小化。一般地，使用GAP默認參數，缺口產生罰分=50。Clustalffd.83)使用blosum矩陣及默認設置(Gap開口罰分(opening penalty):10 ;Gap延長罰分(extension penalty):0.05)。用于序列相同性百分比的序列對比及評分可以使用計算機程序如GCG Wisconsin Package, Versionl0.3,得自 Accelrys Inc., 9685Scranton Road, San Diego, CA92121-3752USA 確定,或者使用開放來源軟件如程序“needle〃(使用全局Needleman Wunsch算法)或“water’’(使用局部Smith Waterman算法)于(核苷酸)/ 8 (蛋白質)和缺口延長罰分=3 (核苷酸)/ 2(蛋白質)而確定。對于核苷酸，使用的默認評分矩陣是nwsgapdna,對于蛋白質,默認評分矩陣是 Blosum62 (Henikoff&Henikoff，1992，PNAS89，915-919)。用于對比本發明的蛋白質序列的優選的多對比程序EmbossWIN version2.10.0，使用如上述GAP相同的參數，或者使用默認設置(對于“needle”及“water”以及對于蛋白質及DNA對比，默認Gap開口罰分是10.0，默認缺口延長罰分是0.5 ;默認評分矩陣對于蛋白質是Blossum62，對于DNA是DNAFulI)。當序列具有實質上不同的整體長度時，優選局部對比，如使用Smith Waterman算法的那些。或者，相似性或相同性百分比可以通過用例如FASTA、BLAST等算法對公共數據庫進行檢索而確定。[0032]抗體或免疫球蛋白(Ig)上下文中的“同種型”在本文用于定義已知為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的抗體同種型。“人IgG亞類”在本文用于指示IgGU IgG2、IgG3和IgG4。
[0033]“靜脈內免疫球蛋白”或“IVIG”是靜脈內施用的血液產品。其含有從超過1000個血液供體的血漿提取的混合IgG。IVIG用于治療免疫缺陷如X連鎖無丙種球蛋白血癥、低丙球蛋白血癥、特征為低抗體水平的獲得性免疫功能低下病癥、炎性及自身免疫疾病和急性感染。IVIG作為血漿蛋白替代治療(IgG)而給予具有降低或缺乏抗體產生能力的免疫缺陷患者。IVIG也由于各種其它病癥，如同種骨髓移植、慢性淋巴細胞白血病、特發性血小板減少性紫癜、peiatric HIV、原發性免疫缺陷、川崎病、慢性炎性脫髓鞘性多發性神經病、具有高抗體受體或具有ABO不相容供體的腎移植、孤獨癥、慢性疲勞綜合征、艱難梭菌(Clostridium difficile)結腸炎、皮肌炎和多肌炎、graves 眼病、guillain_Barr6 綜合征、肌營養不良和包涵體myuositis。
[0034]表位(也已知為“抗原決定簇”)定義為由抗原結合蛋白結合的靶分子的一部分。識別表位的抗原結合蛋白部分稱為互補位。蛋白質靶分子的表位基于它們的結構及與互補位的相互作用分為兩類:構象表位和線性表位。構象表位由靶分子氨基酸序列的不連續部分組成。這些表位基于靶分子的三維表面特征和形狀或三級結構而與互補位相互作用。相反，線性表位基于它們的一級結構與互補位相互作用。組成線性表位的氨基酸是來自靶分子的連續氨基酸序列。當抗原結合蛋白是抗體時，表位是用這個分子免疫個體脊椎動物宿主時引起免疫學應答的靶分子部分。通常其是發生結合抗體的靶分子的位點。表位優選天然存在于靶分子中。任選地，表位是已人工包括在靶分子中的序列。任選地，多個相同或不同表位被包括在靶分子中以便于其純化及檢測。
[0035]術語“特異性結合”或“結合”如本文用于指抗原結合蛋白和靶分子的相互作用時是指抗原結合蛋白識別靶分子及所述相互作用依賴于靶分子上特定結構(即抗原決定簇或表位)的存在；換句話說，抗原結合蛋白識別并結合特異性靶分子結構而非一般而言的蛋白質。可以結合特異性靶分子(抗原決定簇、表位、抗原或蛋白質)、可以特異性結合特異性靶分子(抗原決定簇、表位、抗原或蛋白質)、對特異性靶分子(抗原決定簇、表位、抗原或蛋白質)具有親和性和/或對特異性靶分子(抗原決定簇、表位、抗原或蛋白質)具有特異性的本發明的抗原結合蛋白可以被稱為“抗”或“針對”所述靶分子。術語“特異性”是指特定抗原結合蛋白分子可以結合的不同類型抗原或抗原決定簇的數目。抗原結合蛋白的特異性可以基于親和性和/或親合力(aviditV)確定。親和性由抗原與抗原結合蛋白解離的平衡常數(Kd)代表，是抗原決定簇與抗原結合蛋白上抗原結合位點之間的結合強度的測量。或者，親和性也可以表示為親和性常數(Ka)，其是I / KD。根據抗原結合蛋白和感興趣抗原的特異組合，親和性可以以已知方式確定。親合力在本文是指具有多個結合位點的靶分子與更大的結合劑復合物的結合強度，即多價結合的結合強度。親合力與抗原決定簇及其在抗原結合分子上的抗原結合位點之間的親和性以及抗原結合分子上存在的結合位點數相關。另一方面，親和性是指簡單的單價受體配體系統。
[0036]術語肽和多肽在本文同義使用，是指這類化合物而不限制大小。這個類別的最大成員稱為蛋白質。
[0037]發明詳沭
[0038]本發明人發現了一種用于選擇性捕獲和/或純化靶分子的新方法，所述靶分子包含人IgG-CHl結構域，包括人或人源化IgGl、IgG2、IgG3、IgG4抗體和/或其片段，其中所述方法包括一特定類別的抗原結合蛋白，用于摻入和/或附著于免疫吸附材料。用于本方法中的抗原結合蛋白優選通過結合存在于人IgGl、人IgG2、人IgG3和人IgG4每種的CHl結構域中的表位而起作用，因此不依賴于IgG-Fc結構域。用于本發明方法中的抗原結合蛋白優選結合僅存在于IgG同種型的抗體重鏈的CHl結構域上的獨特表位。另外，用于本發明方法中的抗原結合蛋白優選不結合除IgG之外的人重鏈抗體同種型，也不結合來自例如牛和豬的IgG抗體。更優選地，所述抗原結合蛋白顯示在溫和條件下(例如pH >3)有效的洗脫，即釋放靶分子。用于本發明方法中的抗原結合蛋白具有不依賴于輕鏈類型和VH亞類的特異性結合人IgG抗體和/或Fab (片段抗原結合)片段或其它包含4種人IgG亞類之一的人IgG-CHl結構域的片段所需的親和性和選擇性。通過選擇性結合人IgGl、人IgG2、人IgG3和人IgG4的CHl結構域，本發明的抗原結合蛋白可以用于捕獲和/或純化任何人IgG衍生的Fab片段而不依賴于其IgG亞類、輕鏈同種型及VH亞類。這種選擇性進一步導致明顯益處，即沒有對可能存在于源自例如重組表達系統和/或胃蛋白酶或木瓜蛋白酶處理的IgG消化產物的原料中的游離抗體輕鏈和/或IgG Fe片段的交叉結合。這種選擇性是獨特的，現有技術中已知的任何抗原結合蛋白均未證實這種選擇性。令人感興趣地，直至今日本發明人未發現任何人報道了特異于所有同種型的人IgG抗體的CHl結構域上的表位的抗原結合蛋白。
[0039]本發明提供了通用工具，用于同種型特異性捕獲和/或純化人IgG抗體和/或其Fab片段，不依賴于所述人IgG抗體或Fab片段的IgG亞類、輕鏈類型及VH亞類，由此例如不需要不同類型結合劑和/或方法以使得純化完整系列的人IgG抗體靶。
[0040]因此，本發明的抗原結合蛋白能夠選擇性捕獲和/或純化所有人IgG衍生的Fab片段，不顯示對可能存在于原料中的游離抗體輕鏈和/或IgG Fe片段的交叉反應性。現有技術中已知的結合劑無一能選擇性純化人IgG Fab而不顯示對游離輕鏈的交叉反應性(例如蛋白L、KappaSelect、FabSorbent)或對IgG Fe結構域的交叉反應性(例如蛋白A和G),這些結合劑自己也不能覆蓋純化衍生自所有4種`IgG亞類的所有類型的Fab片段。另外，由于蛋白A和G結合IgG Fe結構域,蛋白A和G不能用于從由人IgG Fe和Fab片段的混合物組成的原料樣品選擇性捕獲人IgG衍生的Fab片段。
[0041]因為本發明的結合劑顯示對所有4種不同人IgG亞類抗體的CHl結構域的相似的結合特征，其使得能在溫和洗脫條件下從例如人血漿衍生的原料樣品選擇性純化多克隆IgG而不改變起始材料的IgG亞類分布，在其中免疫吸附材料被過載情況中不依賴于臨界點(breakthrough)的百分比。
[0042]在第一個方面，本發明涉及捕獲包含人IgG-CHl結構域所示氨基酸序列的靶分子的方法。所示方法優選包括步驟:a)將包含靶分子的組合物與優選固定化于支持物上的包含本發明的抗原結合蛋白的免疫吸附材料接觸；及《使得靶分子通過特異結合抗原結合蛋白而用免疫吸附材料捕獲，優選在使得靶分子與免疫吸附材料中的抗原結合蛋白結合的條件下進行。我們現在首先描述本發明的抗原結合蛋白。
[0043]抗原結合蛋白
[0044]在第二個方面，本發明涉及特異性結合單表位的抗原結合蛋白，所述表位包含在人IgGl、人IgG2、人IgG3和IgG4每種的CHl結構域中。優選地，本發明的抗原結合蛋白能夠特異性結合人IgG的CHl結構域中存在的表位，所述表位也能特異性地被具有選自SEQID NO:1-158的氨基酸序列的一或多個VHH(參考VHH)結合。本發明抗原結合蛋白與也被至少一個參考VHH特異性結合的人IgG的CHl結構域中的表位的結合優選通過所述抗原結合蛋白交叉阻斷一或多個參考VHH(即SEQ ID NO:1-158的任一或多個)對該表位的結合的能力確定。
[0045]因此，本發明的優選的抗原結合蛋白具有交叉阻斷具有選自SEQ IDNO:1-158的氨基酸序列的一或多個VHH結合包含人CHl結構域的靶分子例如SED ID N0:28的能力。抗原結合蛋白交叉阻斷參考VHH的結合的能力在本文定義為當靶分子首先被抗原結合蛋白結合時其使參考VHH與包含人IgG的CHl結構域的合適靶分子的結合降低至少10%、20%、50 %、75 %、90 %、95 %、99 %、99.9 %或99.99 %的能力，或者反之亦然(即當靶分子首先被參考VHH結合時抗原結合蛋白的結合被降低)。
[0046]交叉阻斷的能力原則上可以用任何類型免疫測定確定，優選競爭性免疫測定，包括例如ELISA、固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭測定(參見 Stahli et al.，Methods in Enzymology9:242-253 (1983));固相直接生物素-抗生物素蛋白 EIA (參見 Kirkland et al.，J.1mmunol.137:3614-3619 (1986))；固相直接標記測定、固相直接標記夾心測定(參見Harlow and Lane, " Antibodies, ALaboratory Manual, " Cold Spring Harbor Press (1988));使用 I125標記的固相直接標記RIA (參見 Morel et al., Molec.1mmunol.25(1):7-15(1988));固相直接生物素-抗生物素蛋白 EIA (Cheung et al., Virologyl76:546-552 (1990));及直接標記 RIA (Moldenhaueret al., Scand.J.1mmunol.32:77-82(1990))。
[0047]典型地，這種測定涉及使用結合于固相表面的純化的靶分子、未標記的測試抗原結合蛋白及標記的參考VHH。競爭性抑制通過確定在測試抗原結合蛋白存在下結合于固相表面的標記的量而測量。通常測試抗原結合蛋白過量存在。合適的競爭性結合測定的例子例如如下所述。通過競爭測定鑒別的抗原結合蛋白(競爭抗原結合蛋白)包括與參考VHH結合相同表位的抗原結合蛋白及與相鄰表位結合的抗原結合蛋白，所述相鄰表位與由參考抗原結合蛋白結合的表位足夠近而發生立體位阻。合適的靶分子是包含人CHl結構域的任何靶分子，如下定義包括例如人IgG及其Fab片段。
[0048]例如，人們可以在例如夾心ELISA設置中使用參考抗IgG-CHl VHH片段和待確定的抗原結合蛋白確定是否兩個結合蛋白均能同時結合人IgGFab片段的CHl結構域。為此目的，參考抗IgG-CHl VHH片段優選包被在Maxisorp ELISA平板上并用在PBS中的2 %(w / V)奶粉(Protifar)封閉。作為對照，抗人Fab kappa輕鏈VHH片段(抗Fab-kappa)優選包被在無包被對照相鄰處。然后使多克隆人IgG Fab片段結合固定化VHH片段I小時(10 Ug/ ml Fab 于在 PBS 中的 I % (w / v)奶粉和 0.05% (v / v) Tween-20 中，100 μ I /孔)。在洗滌后，結合的人Fab片段用其交叉阻斷待確定的生物素化抗原結合蛋白或蛋白L(后者結合人Fab的VL-kappa結構域)檢測，隨后與HRPO綴合的鏈霉抗生物素蛋白保溫以用于檢測。
[0049]靶分子在本文中定義為由結合劑、優選本發明的抗原結合蛋白結合的分子。靶分子可以是需要捕獲、純化的蛋白質，或者需要從樣品中被移除的蛋白質，或者待檢測或鑒別的蛋白質。
[0050]在優選的實施方案中，本發明的抗原結合蛋白能選擇性結合包含人IgG-CHl結構域或其等位基因變體的靶分子。優選地，包含人IgG-CHl結構域的靶分子是選自下組的分子:人IgGl分子、人IgG2分子、人IgG3分子、人IgG4分子、人Fab、人F(ab’)2、單臂人抗體、單鏈人抗體、人源化IgGl分子、人源化IgG2分子、人源化IgG3分子、人源化IgG4分子、人源化Fab、人源化F(ab’)2、單臂人源化抗體、單鏈人源化抗體和IVIG。人源化抗體或抗體片段在本文應理解為嵌合抗體或抗體片段，其中一或多個恒定結構域的至少部分是人來源的，及其中一或多個CDR的至少部分不是人來源的。
[0051]本發明的抗原結合蛋白用于純化IVIG的優勢是保持亞類分布。本發明的抗原結合蛋白純化Fab的優勢是本發明的抗原結合蛋白不交叉結合游離輕鏈和Fe片段。在另一個實施方案，包含人IgG-CHl結構域的靶分子是重組蛋白質。所述重組蛋白質可以是融合蛋白或嵌合蛋白如人源化抗體。
[0052]代替或與前述實施方案組合，本發明的抗原結合蛋白能選擇性結合包含由SEQ IDNO:190-193任一氨基酸序列限定的人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的人IgG CHl結構域的革巴分子。在一個優選實施方案中，本發明的抗原結合蛋白能選擇性結合IgG CHl結構域的表位，所述表位由SEQ ID NO:194-200的任一氨基酸序列限定。在一個優選實施方案中，本發明的抗原結合蛋白不能選擇性結合IgG CHl結構域的表位，所述表位由SEQ ID NO =201-217的任一氨基酸序列限定。
[0053]本發明的抗原結合蛋白優選不結合人非IgG相關抗體同種型、人IgG的Fe結構域、人IgG的Fv結構域或者人IgG的游離輕鏈。特別地，蛋白G和蛋白A不是本發明的抗
原結合蛋白。[0054]在優選實施方案中，本發明的抗原結合蛋白結合IgG同種型的人IgGl、IgG2、IgG3和IgG4抗體重鏈的CHl結構域中存在的表位，其中與CHl結構域中的表位的結合對于4個人IgG亞類的每一個是相當于nM親和性，即對4個亞類的每一個的親和性的差異優選不超過一個數量級，更優選差異小于5、4、3或2倍。
[0055]在一個實施方案中，本發明的抗原結合蛋白不結合選自下組的IgG的至少一個CHl結構域:兔IgG、豬IgGl、豬IgG2、牛IgGl、牛IgG2、綿羊IgGl、山羊IgGl、駱駝IgGla、駱駝IgGlb、大鼠IgGl、大鼠IgG2a、大鼠IgG2b、大鼠IgG2c、小鼠IgGl、小鼠IgG2a、小鼠IgG2b和小鼠IgG3。[0056]人IgGl、A IgG2、人IgG3和/或人IgG4如本文所用可以是天然、完整(intact)或完全(complete)人IgGl、人IgG2、人IgG3和/或人IgG4。其也可以涵蓋人源化IgGl、IgG2、IgG3 和 / 或 IgG4。
[0057]優選地，抗原結合蛋白與靶分子例如人IgG的結合及后續靶分子的洗脫不影響靶分子的效應物功能，這可以在已知測定中確定。還優選的是抗原結合蛋白與靶分子例如人IgG的結合及后續靶分子的洗脫不降低、抑制或另外影響靶分子與其預定抗原的結合。
[0058]在一個優選實施方案中，本發明的抗原結合蛋白結合CHl結構域的表位，所述表位包含、涉及和/或者由一或多個氨基酸限定:在122位的苯丙氨酸，在127和128位的任一位置不是半胱氨酸或者是單個半胱氨酸，在156位的絲氨酸或賴氨酸和/或在216位的天冬酰胺或絲氨酸，其中所述氨基酸位置是基于Kabat編號(E.A.Kabat, T.T.Wu,
H.M.Perryj K.S.Gottesman and C.Foellerj Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest (5th Edition)，NIH Publication N0.91-3242, U.S.Department Of Health andHuman Services, Public Health Service, National Institutes of Health(1991))。由此得出結論，本發明的抗原結合蛋白結合的CHl結構域的表位特別在122位不包含酪氨酸殘基并且在156位不包含蘇氨酸殘基。更優選地，所述表位包含在156位的絲氨酸殘基及在216位的天冬酰胺殘基或者在156位的賴氨酸殘基及在216位的絲氨酸殘基。
[0059]由本發明的抗原結合蛋白識別的IgG抗體的CHl結構域上的表位與蛋白G識別的表位是不同的。例如，后者親和性配體不區分在122位具有Phe或Tyr殘基的CHl結構域，本發明的結合劑觀測到這種區分(其不結合在122位具有Tyr的CHl結構域)。
[0060]為測試潛在的抗原結合蛋白是否能特異性結合靶分子但不結合另一個分子如人IgG Fe片段、Fv片段和/或輕鏈，優選可以進行如實施例所述的ELISA和/或表面等離子共振分析。
[0061]在一個優選實施方 案中，本發明的抗原結合蛋白包含一或多個單結合結構域，其中單結合結構域不包含輕鏈及其中單結合結構域包含全抗原結合能力。優選地，本發明的抗原結合蛋白選自下組:包含重鏈及沒有輕鏈的抗體、其片段、affibody、單結構域抗體及其片段。本發明的抗原結合蛋白的例子是衍生自天然沒有輕鏈的駱駝或鯊魚僅重鏈抗體的VHH或者affibody。優選地,抗原結合蛋白是僅包含重鏈及天然沒有輕鏈的抗體或者其抗體片段。或者，(及也是優選的)本發明的抗原結合蛋白可以例如通過修飾如突變衍生自天然沒有輕鏈的抗體或者其片段。天然沒有輕鏈的抗體可以通過免疫駱駝(例如美洲駝羊、駱駝、單峰駱駝、雙峰駱駝、羊駝、駱馬和原駝)或鯊魚(見下述)而獲得。這些抗體僅包含重鏈并且沒有輕鏈。這些單結構域重鏈抗體的優勢是它們特別穩定、小并且容易在宿主生物體如釀酒酵母中生產。
[0062]因此，本發明的抗原結合蛋白優選包含免疫球蛋白衍生的可變結構域，其在一條單多肽鏈上包含針對靶分子上表位的完整抗原結合位點。這種抗原結合蛋白特別包括但不限于:
[0063]I)可得自駱駝和鯊魚的抗體，僅由重鏈組成及天然沒有輕鏈；
[0064]2)在I)中定義的抗體的可變結構域，通常稱為VHH結構域；
[0065]3)在I)中定義的抗體或2)中的結構域的工程化形式，例如“駱駝化”抗體，其中駱駝(或鯊魚)VHH結構域的構架序列用得自其它來源的⑶R移植；[0066]4)免疫球蛋白樣可變結構域的工程化形式，其中來自各種免疫球蛋白樣分子的構架序列與特異于給定靶分子的⑶R組合，例如如W004 / 108749所述。
[0067]在本發明的一個優選抗原結合蛋白中，包含全抗原結合能力的可變結構域的單多肽鏈優選具有被認為包含4個構架區或“FR”的氨基酸序列及結構，這些區域在本領域及在本文中分別被稱為“構架區I”或“FR1”、“構架區2”或“FR2”、“構架區3”或“FR3”和“構架區4”或“FR4”，所述構架區由3個互補決定區或“⑶R”間斷，所述互補決定區在本領域中分別被稱為“互補決定區I”或“⑶R1”、“互補決定區2”或“⑶R2”和“互補決定區3”或“CDR3”。這些構架區和互補決定區優選以順序FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (從氨基末端到羧基末端)可操作連接。
[0068]在具有全抗原結合能力的可變結構域中的氨基酸殘基總數可以在110-135范圍內，優選在115-129范圍內。但是，根據本發明具有全抗原結合能力的可變結構域不特別限制其長度和/或大小，只要該結構域滿足本文所述的進一步功能要求和/或其適合本文描述的目的。具有全抗原結合能力的可變結構域的氨基酸殘基根據Kabat et al.給出的 VH 結構域一般編號而編號(E.A.Kabat, T.T.Wu, H.M.Perry, K.S.Gottesman andC.Foeller, Sequences of Proteins of Immunological Interest(5th Edition), NIHPublication N0.91-3242, U.S.Department Of Health and Human Services, PublicHealth Service, National Institutes of Health (1991)),如適用于 Riechmann andMuyldermans (1999, J.Tmmunol.Methods231 (1-2):25-38,例如參見所述文獻圖 2)及Harmsen et al.(2000,Molecular Immunology37:579-590,例如參見所述文獻圖1)的來自駱駝的VHH結構域。
[0069]根據這個編號，在具有全抗原結合能力的可變結構域中:FR1包含1-26位的氨基酸殘基KDRl包含27-35位的氨基酸殘基；FR2包含36-49位的氨基酸殘基KDR2包含50-64位的氨基酸殘基；FR3包含65-94位的氨基酸殘基KDR3包含95-102位的氨基酸殘基；及最終，FR4包含103-113位的氨基酸殘基。
[0070]在這個方面，應注意，如本領域熟知的針對VH結構域及針對VHH結構域，在每個CDR中的氨基酸殘基總數可能變化并且可能不相應于由Kabat編號指示的氨基酸殘基總數。但是，基于構架區的保守氨基酸，本領域技術人員能夠針對那些具有非113個氨基酸的長度的具有全抗原結合能力的可變結構域根據Kabat定義排列各自構架區和互補決定區。其例子在圖1所示IgG-CHl的氨基酸序列中的互補決定區的定義中給出。對VH結構域的氨基酸殘基編號的其它方法是Chothia et al.描述的也可以類似方式適用于來自駱駝的VHH結構域和具有全抗原結合能力的可變結構域的方法(Nature342，877-883 (1989))，所謂的“AbM definition”及所謂的“contact definition”,或者 IMGT 編號系統(Leffanc etal.，1999, Nucl.Acids Res.27:209-212)。
[0071]或者或與先前實施方案組合，在一個優選實施方案中，抗原結合蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含4個構架區，FRl至FR4，及3個互補決定區，⑶Rl至⑶R3，它們以順序FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4可操縱連接，其中:a)CDRl具有選自SEQ IDNo:159-162的氨基酸序列或者與SEQ ID No:159-162有1、2、3、4、5或6個氨基酸殘基不同的氨基酸序列；b)CDR2具有選自SEQ ID No =163-181的氨基酸序列或者與SEQ ID No:163-181有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸殘基不同的氨基酸序列；及c)CDR3具有選自 SEQ ID No:182-185 的氨基酸序列或者與 SEQ ID No:182-185 有 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或10個氨基酸殘基不同的氨基酸序列；以及其中每個構架區與SEQ ID No:186-189任一個的構架氨基酸序列具有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100%的氨基酸相同性。或者，抗原結合蛋白中的至少一個CDR是選自上述a)、b)和c)定義的CDR中的CDR。
[0072]在一個優選實施方案中，⑶Rl具有SEQ ID NO: 159或160的氨基酸序列。或者或與先前優選的實施方案組合，在本發明一個優選實施方案中，CDR2具有選自SEQ ID NO:163-168、SEQ ID NO:176-181的氨基酸序列。或者或與先前優選的實施方案組合，在本發明一個優選實施方案中，CDR3具有選自SEQ ID NO:182、SEQ ID N0:183和SEQ ID NO:184的氨基酸序列。
[0073]在本發明的一個優選抗原結合蛋白中，具有全抗原結合能力的可變結構域的構架氨基酸序列優選與SEQ ID No:186-189任一個的構架氨基酸序列具有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100%的氨基酸相同性。
[0074]更優選地，在根據本發明的特異結合人IgG-CHl的可變結構域的單多肽鏈的FRl、FR2、FR3和FR4的每個位置(根據Kabat編號)存在的氨基酸殘基如表1_4所示的FRl、FR2、FR3和FR4。對于每個位置，在每個位置最頻繁存在的氨基酸殘基以粗體示出。在這些殘基以外，表1-4提供一些可以在天然發生的VHH結構域的FR1、FR2、FR3和FR4的每個位置存在的非限制性殘基(數據得自W02009 / 011572 ；PCT / NL2008 / 050460)。但是更優選地，具有全抗原結合能力的可變結構域的構架氨基酸殘基選自在特異性結合人IgG-CHl的抗原結合蛋白的SEQ ID勵:186-189任一個的氨基酸序列的？1?1、？1?2、？1?3和？1?4的每個位置(根據Kabat編號)存在的表1-4中的氨基酸殘基。對于每個位置，在每個位置最頻繁出現的氨基酸殘基在表1-4中以粗體指示。
[0075]因此，在本發明一個優選實施方案中，基于表1-4所述的位置上存在的氨基酸殘基，在本發明的抗原結合蛋白中的包`含全抗原結合能力的可變結構域的氨基酸序列可以具有結構:
[0076]FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0077]其中，FRl具有選自如下的氨基酸序列:
[0078]a)[1]QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAVSG[26](SEQ ID:186)；
[0079]b)與 a)中序列有至少 50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100%序列相同性的
氨基酸序列；和/或，
[0080]c)具有如表I定義的一或多個氨基酸取代的a)的氨基酸序列；
[0081]其中，FR2選自如下的氨基酸序列:
[0082]d)[36]WFRQTPGNEREFVA[49](SEQ ID:187)；
[0083]e)與 d)中序列有至少 50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100%序列相同性的
氨基酸序列；和/或
[0084]f)具有如表2定義的一或多個氨基酸取代的d)的氨基酸序列；
[0085]其中，FR3選自如下的氨基酸序列:
[0086]g) [65]GRFTISRDSGKNTVYLQMNNLKPEDTAVYYCAG[94](SEQ ID:188)；
[0087]h)與 g)中序列有至少 50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100%序列相同性的
氨基酸序列；和/或，[0088]i)具有如表3定義的一或多個氨基酸取代的g)的氨基酸序列；以及，
[0089]其中，FR4選自如下的氨基酸序列:
[0090]j)[103]WGQGTQVTVSS[113] (SEQ ID:189)；
[0091]k)與 j)中序列有至少 50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100%序列相同性的
氨基酸序列；和/或，
[0092]I)具有如表4定義的一或多個氨基酸取代的i)的氨基酸序列。
[0093]在一個替代優選實施方案中，本發明的抗原結合蛋白包含如圖1各行之一給出的⑶R1、⑶R2和⑶R3組合，其中構架區(FRl至FR4)可以是上述定義的任何構架區(FRl至FR4)，更優選是圖1中同一行的構架區。更優選地，本發明的抗原結合蛋白包含圖1各行之一給出的⑶R1XDR2和⑶R3組合，其中抗原結合蛋白具有與圖1同一行提供的全部氨基酸序列的序列具有至少90 、95、98、99或100%序列相同性的氨基酸序列。
[0094]在一個優選實施方案中，本發明的抗原結合蛋白包含與SEQ ID No:1_158的氨基酸序列的任一個具有至少85%、優選至少90%、更優選至少93、95、97、98、99或100%相同性的氨基酸序列，更優選其中抗原結合蛋白由與SEQ ID No:1-158的氨基酸序列的任一個具有至少90%、更優選至少93、95、97、98、99或100%相同性的氨基酸序列組成。
[0095]本發明的抗原結合蛋白是以希望的結合親和性(如本文定義)特異結合靶分子的成分。本發明的抗原結合蛋白優選是單特異性抗原結合蛋白。應理解包含單特異性抗原結合蛋白的組合物如本發明的免疫吸附材料是指具有均一抗原結合蛋白群的組合物。由此，單特異性抗原結合蛋白特異于單一表位。但是明確包括在本發明中的是免疫吸附材料可包含超過一種類型的單特異性抗原結合蛋白，每個由均勻群組成。但是通常在本發明上下文中，免疫吸附材料不包含超過4、6、8、10或20種不同的單特異性抗原結合蛋白。抗原結合蛋白通常是抗體或其片段，其中單特異性抗原結合蛋白由此是單克隆抗體或其片段，其可得自克隆的細胞系(例如雜交瘤)或者表達自克隆的編碼序列。術語單特異性抗原結合蛋白如本文所用由此排除多克隆抗體和抗血清。
[0096]典型地，本發明的抗原結合蛋白結合靶分子的解離常數(Kd)為大約10_5至10_12M或更低，優選為10_7至10_12M或更低，更優選為10_8至10_12M或更低，和/或結合親和性為至少IO-7M,優選至少IO-8M,更優選至少IO-9M,如至少10,、10'IO-12M或更多。任何大于10_4M(即小于ΙΟΟμΜ)的Kd值通常被認為是指示非特異性結合。優選地，本發明多肽以低于500ηΜ、優選低于200ηΜ、更優選低于ΙΟηΜ、如低于500pM的親和性結合希望的抗原。抗原結合蛋白與抗原或抗原決定簇的特異性結合可以以任何已知的合適方式確定，包括例如Scatchard分析和/或競爭結合測定，如放射免疫測定(RIA)、酶免疫測定(EIA)及夾心競爭測定以及本領域已知的其不同變體(也見上述)。在一個優選實施方案中，本發明的抗原結合蛋白以上述定義的親和性結合希望的抗原，而這個親和性與在溫和洗脫條件下抗原從抗原結合蛋白的有效釋放組合。
[0097]溫和洗脫條件在本文中應理解為這樣的條件，在所述條件下抗原活性和/或完整性(例如二級/三級結構)僅稍受影響(例如失活或變性低于10% )，優選抗原活性和/或完整性沒有可檢測的降低。這種溫和洗脫條件的例子包括例如本文下述的酸性條件，包括例如0.1M甘氨酸或0.02M檸檬酸PH3.0或ρΗ4.0，0.IM精氨酸ρΗ4.0或ρΗ5.0。在(近)中性PH的溫和洗脫條件的其它例子包括例如高離子強度，如條件等價于2Μ NaCl或2M MgC12(在例如20mM Tris pH8.0中)或者離液劑如乙二醇或丙二醇(40_60%，優選大約 50% (V / V)，在例如 20mM 咪唑，IOmM CaCl2,0.01 % Tween80，250mMNaCl 中，ρΗ7.0)。在ΡΗ3.0下釋放抗原的本發明抗原結合蛋白的例子包括具有本文上述定義的結構的抗原結合蛋白，其中:a)CDRl具有選自SEQ IDNo: 159-162的氨基酸序列或者與SEQ ID No =159-162有1、2、3、4、5或6個氨基酸殘基不同的氨基酸序列；b)CDR2具有選自SEQ ID No =163-181的氨基酸序列或者與SEQ ID No:163-181有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸殘基不同的氨基酸序列；及c)CDR3具有選自SEQ ID No =182-189的氨基酸序列或者與SEQ ID No:182-189有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸殘基不同的氨基酸序列。更優選地，所述抗原結合蛋白具有選自SEQ ID Nol-158的氨基酸序列。
[0098]結合人IgGl、人IgG2、人IgG3及人IgG4分子的CHl結構域的本發明的抗原結合蛋白是優選具有選自如下一或多種性質的抗原結合蛋白:a)抗原結合蛋白以至少10_7M、10_8M或10-9Μ的結合親和性結合人IgG分子,如實施例所述經BiaCore分析；b)抗原結合蛋白可表達得自酵母，表達水平為至少0.5、0.8、1.0g / L酵母培養物。
[0099]在一個實施方案中，本發明涉及特定形式的本發明抗原結合蛋白:多價抗原結合蛋白。所述多價抗原結合蛋白包含至少兩個本文上述定義的抗原結合蛋白的氨基酸序列。至少兩個抗原結合蛋白的氨基酸序列可以彼此不同或者它們可以相同，例如一個氨基酸序列的拷貝或重復。至少兩個抗原結合蛋白的氨基酸序列通常頭至尾融合，即最N-末端序列的C-末端融合于第二個序列的N-末端等等。至少兩個抗原結合蛋白的氨基酸序列可以直接連接融合或者經接頭或間隔基融合。本發明的多價抗原結合蛋白可以通過表達編碼多價蛋白的核苷酸序列而產生，其中兩個或更多個抗原結合蛋白的編碼序列可操縱連接在相同讀框中。本領域技術人員知道如何可操縱融合蛋白編碼序列。多價抗原結合蛋白的優勢是動力學結合能力改善，特別是如果多價抗原結合結構域例如用共價結合定向固定化于固體支持物上時。
[0100]本發明的抗原結合蛋白還包括修飾形式，其中氨基酸殘基用賴氨酸殘基取代以提高等電點(PD。是SEQ ID NO:1的修飾形式的這種抗原結合蛋白的例子如SEQ ID No:10，19，28，37，46，55，64和73所示。具有7以上pi的抗原結合蛋白比具有低于7的pi的抗原結合蛋白更容易純化，其中純 化例如是從一個來源如酵母發酵液經離子交換層析進行。
[0101]抗原結合蛋白的其它有利修飾形式是例如這樣的形式，其中抗原結合蛋白具有改良的穩定性，例如改良的苛性穩定性(caustic stability),改良的對變性劑的穩定性和/或改良的蛋白酶穩定性。是SEQ ID NO:28的修飾形式的這種抗原結合蛋白的例子如SEQID No:29-36，117-137所示。本領域技術人員知道一些氨基酸殘基對于多肽或蛋白質的穩定性是不利的。例如，在脫酰胺反應中，谷氨酰胺或天冬酰胺殘基的側鏈酰胺鍵水解形成游離羧酸。如 Bischoffet al (J.0fChrom B (1994)，622，261-278)所述，可以發生肽和蛋白質中的天冬酰胺(Asn，N)及谷氨酰胺(Gin，Q)殘基的非酶促脫酰胺，酰胺鍵的水解在堿性條件下顯著加速，特別是當例如天冬酰胺后面是甘氨酸(Gly，G)或絲氨酸(Ser，S)殘基時。在這個方面，天冬酰胺比相應位置的谷氨酰胺更易于脫酰胺。在Bischoffet al.中，提供了在肽或蛋白質序列內的展示較低不穩定天冬酰胺殘基的殘基組合及因此可以摻入例如基于通常存在的VHH序列中，-或者殘基的替代組合以增加堿穩定性。另外，Geiger etal (J.0f Biol Chem (1987) vol.262，n0.2，785-794)描述了除天冬酰胺殘基，天冬氨酸殘基(Asp,D)也可以是用于蛋白質的非酶促降解的熱點。在這個方面,Terashima et al (Anal.Biochem.(2007) ,368,49-60)描述了當甘氨酸(Gly,G)在天冬氨酸殘基的C-末端時,天冬氨酸(Asp，D)的異構化被加速，因此可以如上所述設想其它殘基組合以增加抗IgG-CHl抗原結合蛋白的穩定性 。
【權利要求】
1.捕獲包含人IgG-CHl結構域的靶分子的方法，其中所述方法包括步驟: a)將包含所述靶分子的樣品與固定化于支持物上的包含抗原結合蛋白的免疫吸附材料接觸；及， b)使得所述靶分子通過特異性結合所述抗原結合蛋白而被所述免疫吸附材料捕獲； 其中所述抗原結合蛋白能夠結合單一表位，所述表位包含在人IgGl、人IgG2、人IgG3和人IgG4的每一個的CHl結構域中，其中所述抗原結合蛋白被具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VHH交叉阻斷，及其中所述抗原結合蛋白包含免疫球蛋白衍生的可變結構域，所述可變結構域包含針對所述表位的完整抗原結合位點。
2.權利要求1的方法，其中所述抗原結合蛋白包含: a)可得自駱駝或鯊魚的抗體，所述抗體僅由重鏈組成并且天然沒有輕鏈； b)在a)中限定的抗體的可變結構域；或者， c)可變結構域，其中在b)中限定的可變結構域的構架序列移植了得自其它來源的CDR。
3.權利要求1或2 的方法，其中所述靶分子是選自下組的分子:人或人源化IgGl分子、人或人源化IgG2分子、人或人源化IgG3分子、人或人源化IgG4分子、人或人源化IgG Fab、人或人源化IgG F(ab’)2、單臂人或人源化IgG抗體、單鏈人或人源化IgG抗體、IVIG及人或人源化IgG消化物。
4.權利要求3的方法，其中所述人或人源化IgG消化物是木瓜蛋白酶或胃蛋白酶人IgG消化物。
5.前述任一項權利要求的方法，其中所述抗原結合蛋白結合所述CHl結構域的表位，所述表位包含如下的一或多個氨基酸:在122位的苯丙氨酸，在127和128位的任一位置不是半胱氨酸或者是單個半胱氨酸，在156位的絲氨酸或賴氨酸和/或在216位的天冬酰胺或絲氨酸，其中所述氨基酸位置是基于Kabat編號。
6.前述任一權利要求的方法，其中所述抗原結合蛋白是駱駝VHH或駱駝源化VH。
7.純化靶分子的方法，所述方法包括在權利要求1-6任一項定義的方法中用免疫吸附材料捕獲所述靶分子，其中所述方法進一步包括步驟: c)在降低所述靶分子與所述免疫吸附材料之間的親和性的條件下洗脫結合的靶分子，及任選地回收所述靶分子。
8.權利要求7的純化靶分子的方法，其中所述抗原結合蛋白不結合游離輕鏈。
9.純化包含人IgG-CHl結構域的Fab片段而不共純化游離輕鏈的方法，其中所述方法包括步驟: a)將包含所述靶分子和游離輕鏈的樣品與與固定化于支持物上的包含抗原結合蛋白的免疫吸附材料接觸； b)使得所述靶分子通過特異性結合所述抗原結合蛋白而被所述免疫吸附材料捕獲；及 c)在降低所述靶分子與所述免疫吸附材料之間的親和性的條件下洗脫結合的靶分子，及任選地回收所述靶分子； 其中所述抗原結合蛋白如權利要求1、2、5和6任一項所限定。
10.從液體中吸附包含人IgG-CHl結構域的靶分子的體外方法，所述方法包括將免疫吸附材料與所述液體接觸的步驟，其中所述免疫吸附材料包含固定化于載體上的權利要求.1、2、5和6任一項限定的抗原結合蛋白，及其中優選地所述抗原結合蛋白通過共價連接固定化于所述載體上。
11.權利要求1、2、5和6任一項限定的抗原結合蛋白。
12.包含編碼權利要求11的抗原結合蛋白的核苷酸序列的核酸。
13.包含權利要求12的核酸的宿主細胞。
14.產生權利要求11的抗原結合蛋白的方法，所述方法包括在有助于表達所述抗原結合蛋白的條件下培養權利要求12的宿主細胞的步驟。
15.包含權利要求11的抗原結合蛋白的免疫吸附材料。
16.權利要求11的抗原結合蛋白或權利要求15的免疫吸附材料用于體外檢測和/或體外純化包含人IgG-CHl結構域的靶分子的用途。
17.權利要求16的用途，其中所述靶分子是選自下組中的分子:人或人源化IgGl分子、人或人源化IgG2分子、人或人源化IgG3分子、人或人源化IgG4分子、人或人源化IgGFab、人或人源化 IgG F(ab’)2、單臂人或人源化IgG抗體、單鏈人或人源化IgG抗體、IVIG及人或人源化IgG消化物。
18.權利要求17的用途，其中所述人IgG消化物是木瓜蛋白酶或胃蛋白酶人或人源化IgG消化物。
19.權利要求17的用途，其中所述靶分子是沒有游離輕鏈共結合的人IgG或者人或人源化 IgG Fab0
【文檔編號】C07K1/22GK103459427SQ201280015886
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年1月31日 優先權日:2011年2月1日
【發明者】W·J·J·赫爾曼斯, S·布洛克蘭, M·A·范克斯特倫, J·M·霍勒弗特, F·J·M·德特默斯 申請人:Bac Ip私人有限公司