新型肽的制作方法
【專利摘要】本發明的目的在于提供一種具有血管緊張素轉換酶抑制活性和/或成纖維細胞和膠原之間的粘接促進活性的新型物質，所述新型物質為一種由下述的式(I)：Xaa1-Asp-Leu-Asp-Val-Xaa2(SEQ?ID?NO：1)[其中，Xaa1及Xaa2可以存在或不存在，在存在的情況下，分別獨立地表示任意的氨基酸]的氨基酸序列構成的肽或者其衍生物、或它們的鹽。
【專利說明】新型肽
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種具有特定的氨基酸序列的新型肽或者其衍生物或它們的鹽。本發明的新型肽或者其衍生物或它們的鹽由于抑制血管緊張素轉換酶的活性，還促進細胞和膠原之間的粘接，因此可有益地利用。
【背景技術】
[0002]血管緊張素轉換酶抑制劑通常由于治療高血壓病及慢性心力衰竭而廣泛使用。血管緊張素轉換酶抑制劑在生物體內作用于升壓系的腎素-血管緊張素系統和降壓系的激肽釋放酶-激肽系統這兩者，通過血管的擴張等發揮降壓作用的方面是公知的。進而，還已知血管緊張素轉換酶抑制劑具有同時降低心臟的前負荷和后負荷，改善心血管動力學的作用。另外，近幾年，還報告有血管緊張素轉換酶抑制劑經由血管內皮細胞生長因子(VEGF)的產生而具有抑制細胞凋亡及促進內皮修復、血管新生的作用(非專利文獻I)。
[0003]迄今為止，作為血管緊張素轉換酶抑制劑，已知依拉普利及卡托普利等合成化合物，此外，已知有多個源自食品的蛋白酶分解物等。例如，添加了芝麻蛋白質分解物(專利文獻I)或長齒白齒耳菌提取物(7'' f /、U>)(專利文獻2)等的食品作為適于血壓高者的特定保健用食品等被實用化。
[0004]另一方面，在生物體的真皮內，成纖維細胞與細胞外基質中的膠原粘接成為增強?穩定膠原纖維束的格子狀的立體結構且保持肌膚的張力及彈性的一個原因。而且，可知若該成纖維細胞對膠原的粘接能力由于老化等原因而降低，則引起肌膚的張力及彈力的降低。進而，已知若成纖維細胞自身也未與膠原纖維粘接來抓住立足點，則其作用(例如，各種因子的產生等)變得遲鈍。根據如上所述的理由，探求促進成纖維細胞和膠原之間的粘接的成分。
`[0005]迄今為止，作為促進成纖維細胞和膠原之間的粘接的材料，已知有具有特定序列的妝(專利文獻3)等。
[0006]但是，希望開發一種更有用的具有血管緊張素轉換酶抑制活性和/或成纖維細胞和膠原之間的粘接促進活性的材料。而且，迄今為止，完全未知兼備血管緊張素轉換酶抑制活性及成纖維細胞和膠原之間的粘接促進活性這兩者的材料。
[0007]現有技術文獻
[0008]專利文獻
[0009]專利文獻1:日本特表2006-520809號公報
[0010]專利文獻2:日本特開2002-29995號公報
[0011]專利文獻3:美國專利申請公開第2004/0141939號說明書
[0012]非專利文獻
[0013]非專利文獻1:荒川博、Japanese Circulation Journal 第 64 卷，增刊 I,第 438頁，2000年
【發明內容】
[0014]發明要解決的問題
[0015]本發明是鑒于上述現有技術而完成的，其目的在于，提供一種具有高血管緊張素轉換酶抑制活性和/或成纖維細胞和膠原之間的粘接促進活性的更有用的材料，尤其是提供一種同時兼備血管緊張素轉換酶抑制活性和成纖維細胞對膠原的粘接促進活性這兩者，且對美容非常有用的新的材料。
[0016]用于解決問題的手段
[0017]本發明人等為了解決所述課題進行了潛心研究，結果發現，具有特定的氨基酸序列的短鏈肽可以發揮高血管緊張素轉換酶抑制活性，另外，還可以發揮成纖維細胞和膠原之間的粘接促進活性，以至完成了本發明。
[0018]S卩，本發明提供以下內容。
[0019][I] 一種由下述的式⑴的氨基酸序列構成的肽或者其衍生物、或它們的鹽，
[0020]Xaal-Asp-Leu- Asp-Val-Xaa2(SEQ ID NO:1)
[0021][其中，Xaa1及Xaa2可以存在或不存在，在存在的情況下，分別獨立地表示任意的
氨基酸]。
[0022][2]如[I]所述的肽或者其衍生物、或它們的鹽，其中，所述肽由Asp-Leu-Asp-Val-Phe(SEQ ID NO:2)、Arg-Asp-Leu-Asp-Val(SEQ ID NO:3)、或Arg-Asp-Leu-Asp-Val-Phe (SEQ ID NO:4)所不的氨基酸序列構成。
[0023][3] 一種組合物，其含有選自由[I]或[2]所述的肽及其衍生物、以及它們的鹽構成的組中的至少I種。
[0024][4] 一種組合物，其含有選自由[I]或[2]所述的肽及其衍生物、以及它們的鹽構成的組中的至少I種、和Leu-Asp-Val所示的肽及其衍生物、以及它們的鹽。
[0025][5]如[3]或[4]所述的組合物，其為美容組合物。
[0026][6]如[3]?[5]中任一項所述的組合物，其為外用組合物。
[0027][7]如[3]?[6]中任一項所述的組合物，其用于改善皮膚的膚色差、改善皮膚的皺紋及松弛，且恢復肌膚的張力及彈性。
[0028]本說明書包含作為本申請的優先權的基礎的日本專利申請2011-095945號的說明書和/或附圖中所記載的內容。
[0029]發明效果
[0030]本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽具有高血管緊張素轉換酶抑制活性。通過本發明，可提供一種可用作血管緊張素轉換酶抑制劑的新的材料。血管緊張素轉換酶抑制劑不僅作為高血壓病及慢性心力衰竭的治療用的醫藥有用，而且用于通過血壓降低作用來預防生活習慣病的食品等也可有益地使用。另外，血管緊張素轉換酶抑制活性由于具有末梢血管擴張作用及血管新生促進作用，因此，可以期待能夠有效地改善由于在薄皮膚下引起淤血(血液循環差)而產生的眼下方的青黑眼圈及嘴唇向青紫色的變色等的膚色差。
[0031]進而，本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽可有效地促進成纖維細胞與膠原粘接。因此，通過本發明，可提供一種能夠有效地防止起因于老化等的成纖維細胞和膠原之間的粘接能力降低、增強成纖維細胞和細胞外基質的結合、增加兩者的拉伸強度、緊致真皮、改善皮膚的皺紋及松弛、恢復肌膚的張力及彈性的新型材料。[0032]如上所述，本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽從通過血管緊張素轉換酶抑制活性來改善皮膚的膚色作用、和通過促進成纖維細胞和膠原之間的粘接來改善皮膚的皺紋?松弛的作用和恢復肌膚的張力?彈性作用這兩面考慮，可以期待能夠綜合性地解決美容問題，因此，可在用于美容的組合物中有益地使用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0033]圖1 是表不利用 DLDVF(Asp-Leu-Asp-Val-Phe)妝及RDLDV(Arg-Asp-Leu-Asp-Val)肽的混合物抑制血管緊張素轉換酶的圖；
[0034]圖2 是表示利用 DLDVF (Asp-Leu-Asp-Val-Phe)肽及RDLDVF(Arg-Asp-Leu-Asp-Val-Phe)肽的混合物抑制血管緊張素轉換酶的圖；
[0035]圖3 是表示利用 DLDVF (Asp-Leu-Asp-Val-Phe)肽及 LDV (Leu-Asp-Val)肽的混合物抑制血管緊張素轉換酶的圖。
【具體實施方式】
[0036]以下，對本發明詳細地說明。本說明書的全文中，只要沒有特別提及，單數形式的表述則應理解為也包含其復數形式的概念。另外，只要沒有特別提及，本說明書中所使用的術語則應理解為以本領域中通常使用的含義進行使用的。
[0037]本發明提供一種由下述的式⑴:
[0038]Xaal-Asp-Leu-Asp-Val-Xaa2(單字符簡寫=XiDlDVX SEQ ID NO:1)所示的氨基酸序列構成的肽、或者其衍生物或它們的鹽。
[0039]上述SEQ ID NOl中的Xaa1及Xaa2 (單字符簡寫=X1及X2)可以存在或不存在，在存在的情況下，分別獨立地表示任意的氨基酸。該氨基酸優選為a-氨基酸，更優選為遺傳編碼的 Ct-氨基酸。Xaa1 及 Xaa2 為從天然存在的 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、Ile> Leu> Met> Phe> Pro> Ser> Thr> Trp> Tyr> Lys 及 Val 構成的組中任意選擇的 a -氨基酸。優選為作為Arg或Phe的a -氨基酸,更優選Xaa1為Arg, Xaa2為Phe。Xaa1及Xaa2可以存在或不存在，但優選存在Xaa1及Xaa2中的至少一個。
[0040]如上所述的肽中，為了更可靠地得到高的本發明的效果，本發明的肽優選為Asp-Leu-Asp-Val-Phe (單字符簡寫:DLDVF、SEQ ID NO:2) >Arg-Asp-Leu-Asp-Val (單字符簡寫:RDLDV, SEQ ID NO:3)、 或 Arg-Asp-Leu-Asp-Val-Phe (單字符簡寫:RDLDVF, SEQ IDNO:4)。
[0041]在本說明書中中，“肽的衍生物”是指例如將肽乙酰化、棕櫚酰化、十四烷基化、酰胺化、丙烯酸化、丹酰化、生物素化、磷酸化、琥珀酰化、酰苯胺化、芐氧羰基化、甲酰化、硝基化、磺化、醛化、環狀化、糖基化、單甲基化、二甲基化、三甲基化、胍基化、脒化、馬來酰化、三
氟乙酰化、氨基甲酰化、三硝基苯基化、硝基環庚三烯酮化、或乙酰乙酰化而成的衍生物等。
[0042]在本說明書中，“鹽”是指肽或其衍生物的藥理學上可接受的任意的鹽(含有無機鹽及有機鹽)，例如可以舉出:肽或其衍生物的鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、銨鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、有機酸鹽(乙酸鹽、三氟乙酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、蘋果酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、丙酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、苦味酸鹽、苯磺酸鹽等)等，優選為銨鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽或三氟乙酸鹽，更優選為銨鹽、乙酸鹽或三氟乙酸鹽。[0043]本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽可以為水合物或非水合物。另外，本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽可以為溶劑化物或非溶劑化物。
[0044]本發明的肽可以通過該領域中公知的方法來制作。例如，本發明的肽可通過化學合成方法(例如，固相法(例如、Fmoc法)、液相法等)來合成，另外，也可以通過基因重組表達等方法來制作。另外，構成本發明的肽的氨基酸可以為L-型，也可以為D-型，但優選為L-型。
[0045]進而，本發明的肽可以通過如下操作來制備:通過蛋白酶處理等公知的方法從含有目標氨基酸序列的蛋白質的氨基酸序列中切出由目標氨基酸序列構成的肽。
[0046]本領域技術人員考慮蛋白酶的序列特異性等，為了從含有目標氨基酸序列的蛋白質的氨基酸序列中切出由目標氨基酸序列構成的肽，可適宜選擇適當的蛋白酶。另外，在用蛋白酶將蛋白質水解時使用的反應條件沒有特別限制，可由本領域技術人員根據技術常識適宜選擇而得到。利用蛋白酶的水解處理后，根據需要通過本領域中公知的方法進行精制，由此，可以精制目標肽。
[0047]如上所述，將天然的蛋白質用蛋白酶水解而得到的肽與用化學合成方法制造的情況相比，從成本方面考慮是有利的。進而，認為將天然的蛋白質用蛋白酶水解而得到的肽對于生物體是更安全的。因此，如上得到的肽可優選用于針對向生物體的適用要求更高的安全性的內服劑、食品、敏感肌膚用化妝品、飼料等。其中，食品是指包含含有飲用品的全部的飲食物。
[0048]本發明的肽的衍生物可以通過本領域中公知的任意的方法由本領域技術人員容易地制作而得到。
[0049]本發明的肽的鹽也可以通過本領域中公知的任意的方法由本領域技術人員容易地制作而得到。
[0050]本發明可使用具有上述的特定序列的肽或者其衍生物、或它們的鹽中的任一種，但為了更可靠地得到高的本申請效果，可優選使用肽或其鹽，特別優選使用肽。
[0051 ] 如上得到的本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽可抑制血管緊張素轉換酶的活性。通過抑制血管緊張素轉換酶的活性，在生物體內作用于升壓系的腎素-血管緊張素系統和降壓系的激肽釋放酶-激肽系統這兩者，并通過血管的擴張等來發揮降壓作用是公知的。因此，本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽可以為了預防和/或治療高血壓病及慢性心力衰竭、為了通過血壓降低作用來預防生活習慣病、或者為了改善膚色差(例如，眼下方的青黑眼圈或嘴唇向青紫色的變色等)而有益地使用。血管緊張素轉換酶抑制活性例如可以通過使用3-羥丁酰-Gly-Gly-Gly (3HB-GGG)作為底物并測定從該底物中切出的3-羥丁酸(3HB)來確定。若為本領域技術人員，則可以理解通過這樣的方法確認到血管緊張素轉換酶抑制活性的肽對高血壓病及慢性心力衰竭的預防和/或治療、通過血壓降低作用帶來的生活習慣病的預防、及膚色差(例如，眼下方的青黑眼圈或嘴唇向青紫色的變色等)的改善有效。
[0052]另外，上述的肽或者其衍生物、或它們的鹽可促進成纖維細胞和膠原之間的粘接。通過成纖維細胞在生物體的真皮內與細胞外基質中的膠原粘接，可增強成纖維細胞和細胞外基質的結合、增加兩者的拉伸強度、緊致真皮、保持肌膚的張力及彈性。因此，本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽也可為了改善起因于上述細胞和膠原之間的粘接能力降低的皮膚的皺紋及松弛或者為了使肌膚的張力及彈性恢復而有益地使用。成纖維細胞和膠原之間的粘接的促進作用例如可以通過如下操作測定:在用膠原涂布的培養用板中使用含有上述肽等的培養基培養皮膚成纖維細胞后，在未將板清洗、沖洗的情況下測量板上的膠原涂層上殘留的細胞。若為本領域技術人員，則可以理解通過這樣的方法可促進成纖維細胞和膠原之間的粘接的肽具有增強成纖維細胞和細胞外基質的結合、增加兩者的拉伸強度、緊致真皮、改善皮膚的皺紋及松弛、或者使肌膚的張力及彈性恢復的效果。
[0053]本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽可以組合2種以上進行使用。在使用2種以上的情況下，上述的血管緊張素轉換酶抑制活性協同地提高。因此，本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽在組合2種以上進行使用的情況下，在生物體內作用于升壓系的腎素-血管緊張素系統和降壓系的激肽釋放酶-激肽系統這兩者，并通過血管的擴張等協同地發揮降壓作用。其結果，為了預防和/或治療高血壓病及慢性心力衰竭、為了通過血壓降低作用來預防生活習慣病、或者為了改善膚色差(例如，眼下方的青黑眼圈及嘴唇向青紫色的變色等)，與單獨使用本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽的情況相比，可以更有效地使用組合本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽的2種以上而成的混合物。
[0054]作為本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽的組合，可以舉出:由X1DLDVX2 (SEQID NO:1)所示的氨基酸序列構成的肽、DLDVF(SEQ ID NO:2)、RDLDV(SEQ ID NO:3)、及RDLDVF(SEQ ID NO:4)所示的肽的2種、3種、4種或者其以上的任意的組合。組合為由X1DLDVX2 (SEQ ID NO:1)所示的氨基酸序列構成的肽彼此的組合，也包含X1和/或X2互相不同的彼此的組合。
[0055]例如可以舉出:組合DLDVF肽及RDLDV肽而成的混合物、組合DLDVF肽及RDLDVF肽而成的混合物。進而，即使組合由fDLDVXYSEQ ID NO:1)所示的氨基酸序列構成的肽、DLDVF(SEQ ID NO:2)、RDLDV(SEQ ID NO:3)、及 RDLDVF(SEQ ID NO:4)所示的肽和Leu-Asp-Val (LDV)所示的肽作為混合物使用，也發揮顯著的效果。例如可以舉出:組合DLDVF肽及LDV肽而成的混合物。
[0056]混合物的混合比沒有限定`，在使用2種的組合的情況下，一方的肽和另一方的肽的混合重量比為95:5?5:95，更優選為90:10?10:90，進一步優選為80:20?20:80，特別優選為75:25?25:75。例如只要將DLDVF肽及RDLDV肽以75:25?25:75的混合比混合即可，只要將DLDVF肽及RDLDVF肽以75:25?25:75的混合比混合即可，另外，只要將DLDVF肽及LDV肽以75:25?25:75的混合比混合即可。
[0057]在組合本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽的2種以上進行使用的情況下，例如血管緊張素轉換酶抑制活性與分別單獨使用的情況相比，在通過使用3-羥丁酰-Gly-Gly-Gly (3HB-GGG)作為底物并測定從該底物中切出的3-羥丁酸(3HB)來確定血管緊張素轉換酶活性時，IC50值可降低20%以上、優選可降低30%以上，進一步優選可降低40%以上，特別優選可降低50%以上。
[0058]本發明還提供一種含有上述肽或者其衍生物、或它們的鹽的組合物。在本發明中，在含有肽或者其衍生物、或它們的鹽的組合物的情況下，也包含含有肽或者其衍生物、或它們的鹽的2種以上的混合物的組合物。該組合物優選為美容組合物。該組合物由于含有具有上述的功能的肽或者其衍生物、或它們的鹽，因此，可以發揮美容效果。即，上述肽或者其衍生物、或它們的鹽具有抑制血管緊張素轉換酶的活性的作用及促進皮膚成纖維細胞和膠原之間的粘接的作用這兩方面作用。利用前者的作用，通過血管的擴張等發揮改善膚色差(例如，眼下方的青黑眼圈及嘴唇向青紫色的變色等)的效果，通過后者的作用，發揮緊致皮膚、改善皮膚的皺紋及松弛、或者恢復肌膚的張力及彈性的效果。兩者的效果互相結合，可以發揮顯著的美容效果。在本發明中，將美化面孔及體形(例如，美化肌膚等美容)作為目的而使用的組合物稱為美容組合物。
[0059]另外，本發明的組合物可優選用作醫藥組合物、化妝品組合物、食品組合物或飼料組合物。優選為用于美容的醫藥組合物、化妝料組合物、食品組合物及飼料組合物。進而，本發明的組合物可優選作為用于闡明與血管緊張素轉換酶抑制活性、成纖維細胞和膠原之間的粘接性相關生理狀態的研究試劑而使用。另外，本發明的組合物也可用作血管緊張素轉換酶抑制劑及成纖維細胞和膠原的粘接促進劑。
[0060]作為醫藥組合物，例如可以舉出:起因于人等哺乳動物中的血管緊張素轉換酶的活性的疾病的預防劑和/或治療劑等。具體而言，含有本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽的醫藥組合物例如可用作高血壓病和/或慢性心力衰竭的預防劑和/或治療劑、以及、膚色差癥狀(例如，眼下方的青黑眼圈及嘴唇向青紫色的變色等)的預防劑和/或治療劑。進而，含有本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽的醫藥組合物也可用作起因于人等哺乳動物中的成纖維細胞和膠原之間的粘接能力降低的疾病的預防劑和/或治療劑等。具體而言，含有本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽的醫藥組合物例如可用作起因于由于年齡增長等而產生的成纖維細胞和膠原之間的粘接能力降低的皮膚的皺紋或者松弛的預防劑和/或治療劑，可用作相對于起因于上述粘接能力降低的皮膚的張力或者彈力性降低的預防劑和/或治療劑、或者可用作肌膚的緊致劑等。
[0061]作為化妝品組合物，例如可以舉出:用于預防和/或改善起因于人等哺乳動物中的血管緊張素轉換酶的活性的狀態的化妝品。具體而言，含有本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽的化妝品組合物例如可作為用于預防和/或改善膚色差狀態(例如，眼下方的青黑眼圈及嘴唇向青紫色的變色等)的化妝品而使用。進而，含有本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽的化妝品組合物也可作為用于預防和/或改善起因于人等哺乳動物中的成纖維細胞和膠原之間的粘接能 力降低的狀態的化妝品而使用。具體而言，含有本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽的化妝品組合物例如可作為用于預防和/或改善起因于由于年齡增長等而產生的成纖維細胞和膠原之間的粘接能力降低的皮膚的皺紋或者松弛的化妝品，可作為用于預防和/或改善相對于起因于上述粘接能力降低的皮膚的張力或者彈力性的降低的化妝品、或者可作為用于肌膚的緊致的化妝品等而使用。
[0062]作為食品組合物，例如可以舉出:用于預防和/或改善起因于人等哺乳動物中的血管緊張素轉換酶的活性的狀態的食品。具體而言，含有本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽的食品組合物例如可以作為用于預防和/或改善高血壓病及慢性心力衰竭的食品、作為通過血壓降低作用來預防和/或改善生活習慣病的食品、或者作為預防和/或改善膚色差(例如，眼下方的青黑眼圈及嘴唇向青紫色的變色等)的食品有益地使用。進而，含有本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽的食品組合物也可作為用于預防和/或改善引起于人等哺乳動物中的成纖維細胞和膠原之間的粘接能力降低的狀態的食品而使用。具體而言，含有本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽的食品組合物例如可作為用于預防和/或改善起因于由于年齡增長等而產生的成纖維細胞和膠原之間的粘接能力降低的皮膚的皺紋或者松弛的食品、可作為用于預防和/或改善相對于起因于所述粘接能力降低的皮膚的張力或者彈力性的降低的食品、或者作為用于肌膚的緊致的食品等而使用。本發明的食品組合物包括健康食品、特定保健用食品、營養功能食品、健康輔助食品等。這些組合物包括美容健康食品。特定保健用食品是指在飲食生活中以特定的保健的目的進行攝取，通過該攝取可以期待該保健的目的的食品。這些食品在特定的實施方式中，可作為附加了用于如上所述的用途的標識的食品提供。即，可作為附加了用于美容的標識、具有美肌作用的標識、用于肌質改善的標識、用于膚色差的預防或改善的標識、用于顏色(例如，眼下方的青黑眼圈及嘴唇向青紫色變色等)的改善的標識、用于使皮膚的張力及彈性恢復的標識、用于皮膚的皺紋及松弛的預防或改善的標識、用于肌膚的緊致的標識、用于高血壓及慢性心力衰竭的預防或改善的標識、用于通過血壓降低作用來預防或改善生活習慣病的標識等表示的食品提供。
[0063]作為飼料組合物，例如可以舉出:起因于牛、豬、雞、羊、馬等家畜及狗、貓等寵物中的血管緊張素轉換酶活性的狀態的預防用和/或改善用的飼料、或者起因于成纖維細胞和膠原之間的粘接能力降低的狀態的預防用和/或改善用的飼料等。
[0064]上述的本發明的組合物中的上述肽或者其衍生物、或它們的鹽的含量也根據肽等的種類、組合物的劑型等而不同，從得到高的本申請效果的角度考慮，通常為0.00001?80重量％，優選為0.0001?70重量％，更優選為0.001?50重量％，進一步優選為0.001?20重量％，進一步更優選為0.01?10重量％，進一步更優選為0.05?10重量％，進一步更優選為0.1?10重量％。
[0065]含有本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽的組合物可以在實現本發明的目的范圍內適宜配制除上述肽或者其衍生物、或它們的鹽以外在制劑領域或食品領域等中通常使用的載體、基質、和/或添加劑等來制備。
[0066]作為載體，例如可組合使用I種或2種以上交聯乙烯基聚合物、脂質類等。
[0067]作為基質，例如可組合使用I種或2種以上水、油脂類、礦物油類、蠟類、脂肪酸類、硅酮油類、留醇類、酯類、金屬皂 類、醇等。
[0068]作為添加劑，例如可以組合使用I種或2種以上可溶化成分、乳化劑、油分、穩定化劑、增粘劑、防腐劑、結合劑、潤滑劑、分散劑、PH調節劑、保濕劑、紫外線吸收劑、絡合劑、經皮吸收促進劑、崩解劑、增塑劑、緩沖劑、氨基酸類、著色劑、香料等。
[0069]進而，為了根據需要附加進一步有用的作用，也可以在含有本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽的組合物中組合配制I種或2種以上其它的美白成分、抗炎癥成分、抗菌成分、細胞活化成分、收斂成分、粉刺改善成分、生物體成分合成促進成分、血液循環促進成分、保濕成分、抗老化成分等各種成分。
[0070]含有本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽的組合物可以為外用劑(包括供于外用的化妝品)、內服劑(包括經口攝取的食品及飼料)等任意的劑型，但為了相對于顏色(膚色差)及皮膚的皺紋、松弛、張力、彈力性、緊致等更直接地發揮高效果，可優選用作外用劑。
[0071]作為外用劑,例如能夠以液狀、乳液狀、霜狀、化妝水狀、膏狀、奶油狀、凝膠狀、片
狀(攜帶基質)、氣霧狀、噴霧狀等任意的形態使用。
[0072]作為化妝品，例如能夠以化妝水、乳液、霜、油、潤膚膏等基礎化妝品、還有粉底霜、腮紅、口紅等化妝的化妝品、進而洗面奶、清潔卸妝膏、沐浴露等清潔劑、入浴劑等任意的形態使用。
[0073]作為內服劑(包括食品及飼料)，例如能夠以片劑、丸劑、顆粒劑、細粒劑、散劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、干糖漿、液劑(包括飲品、懸浮劑、糖漿劑)、凝膠劑、脂質體劑、提取物、酊劑、檸檬水劑、果凍劑等任意的形態使用。
[0074]另外，含有本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽的食品組合物可以混合食品衛生上可接受的復合物加工成健康食品、功能性食品、特定保健用食品、營養輔助食品等進行利用。進而，在制成食品的情況下，也可以作為面包、面、家常菜、食肉加工食品(例如，火腿、香腸等)、水產加工食品、調味料(例如，調味汁等)、乳制品、點心(例如，餅干、糖果、果凍、冰激凌等)、湯、果汁等任意的通常的食品形態提供。在形成這樣的形態的情況下，本發明的肽或者其衍生物、或它們的鹽可依賴于目標食品的性質等，由本領域技術人員利用公知的方法適宜配制。
[0075]作為飼料，由于能夠以任意的形態使用，因此，沒有特別限定。
[0076]本發明還提供一種抑制血管緊張素轉換酶的活性的方法及促進成纖維細胞和膠原之間的粘接的方法，其特征在于，使用上述肽或者其衍生物、或它們的鹽、或者含有它們的上述組合物。
[0077]在該方法中，只要以抑制血管緊張素轉換酶的活性而得到期望的效果的有效量以上、或者促進成纖維細胞和膠原之間的粘接而得到期望的效果的有效量以上使用上述肽或者其衍生物、或它們的鹽、或者含有它們的上述組合物即可。
[0078]S卩，本發明的方法中的上述肽或者其衍生物、或它們的鹽的使用量通常在外用劑的情況下，優選相對于成人每人體重約50kg為約0.1yg?2g/天。另外，內服劑的情況下的當該使用量通常優選相對于成人每人體重約50kg為約0.001?IOOOOmg/天,更優選為約I?IOOOmg/天、進一步 優選為約I?IOOmg/天。
[0079]本發明的方法還可以含有將上述肽或者其衍生物、或它們的鹽或者含有它們的上述組合物應用于皮膚的工序。此時的上述肽或者其衍生物、或它們的鹽對皮膚的應用量優
選為約Ing?500 V- g/cm2、更優選為約0.01?50 y g/cm2,進一步優選為約0.1?10 y g/
2
cm o
[0080]上述肽或者其衍生物、或它們的鹽或者含有它們的外用劑可以通過涂布、噴霧等局部應用于皮膚。
[0081]本發明還提供一種用于抑制血管緊張素轉換酶的活性和/或用于促進成纖維細胞和膠原之間的粘接的組合物、優選用于制造可用作外用劑的組合物的上述肽或者其衍生物、或它們的鹽的使用。
[0082]上述肽或者其衍生物、或它們的鹽的使用量只要以成為上述組合物中的含量的方式使用即可。
[0083]本發明還提供一種用于抑制血管緊張素轉換酶的活性和/或用于促進成纖維細胞和膠原之間的粘接的上述肽或者其衍生物、或它們的鹽。
[0084]本發明包含對人等哺乳動物給藥上述組合物，通過血管的擴張等改善膚色差(例如，眼下方的青黑眼圈及嘴唇向青紫色的變色等)的方法，還包含緊致皮膚、改善皮膚的皺紋及松弛、或者使肌膚的張力及彈性恢復的方法。另外，本發明包含用于制造用于通過上述組合物的血管的擴張等來改善膚色差(例如，眼下方的青黑眼圈及嘴唇向青紫色的變色等)的藥劑、或用于緊致皮膚、改善皮膚的皺紋及松弛、或者使肌膚的張力及彈性恢復的藥劑的上述組合物的使用。進而，本發明包含用于通過血管的擴張等改善膚色差(例如、眼下方的青黑眼圈及嘴唇向青紫色的變色等)或用于緊致皮膚、改善皮膚的皺紋及松弛、或者使肌膚的張力及彈性恢復的上述組合物。
[0085]實施例
[0086]以下，基于實施例對本發明詳細地說明，本發明并不限定于這些實施例。
[0087]實施例1:肽的制備
[0088]1-1.DLDVF (Asp-Leu-Asp-Val-Phe)妝:
[0089](I)肽的合成:
[0090]使用肽自動合成裝置(島津制作所公司制:PSSM8)通過利用Fmoc法的固相合成法合成標題的肽。具體的步驟如下所述:首先，使Fmoc-Phe(1-Trt)-OH的C末端與固相合成用樹脂結合后，通過哌啶處理除去保護基(Fmoc)，接著，將該樹脂中和?清洗后，將Fmoc-Val-OH導入Phe 的N末端。接著,通過哌唳處理除去保護基(Fmoc),再次將該樹脂中和?清洗后，將Fmoc-Asp (OtBu)-OH導入Val的N末端。接著，通過哌啶處理除去保護基(Fmoc),再次將該樹脂中和?清洗后,將Fmoc-Leu-OH導入Asp的N末端。接著,通過哌唳處理除去保護基(Fmoc)，再次將該樹脂中和?清洗后，將Fmoc-Asp (OtBu) -OH導入Leu的N末端。接著，通過哌啶處理除去保護基(Fmoc)，從該樹脂中切出肽鏈。通過利用TFA (三氟乙酸)切斷Phe的Trt基和Asp的tBu基來進行脫保護。最后，通過分離HPLC除去未反應物來進行精制，由此得到DLDVF肽。
[0091](2)肽的純度檢測:
[0092]將得到的精制物附于分析用反相高效液相色譜[柱:Inertsil 0DS-3 (內徑:2.1_、長度:50mm) ,GL Sciences公司制；流動相:溶劑A(0.05%三氟乙酸)及溶劑B(0.05%三氟乙酸、100%乙腈)的梯度(0分鐘(溶劑B = 0%)?25分鐘(溶劑B = 50%));流速:0.2ml/分鐘；檢測法:波長220nm下的吸光度]，結果，在14.8分鐘顯示單一的尖銳的峰，純度為99.5%。
[0093]1-2.RDLDV(Arg-Asp-Leu-Asp-Val)妝:
[0094](I)肽的合成:
[0095]使用肽自動合成裝置(島津制作所公司制:PSSM8)通過利用Fmoc法的固相合成法合成標題的肽。具體的步驟如下所述:首先，使Fmoc-Val (1-Trt)-OH的C末端與固相合成用樹脂結合后，通過哌啶處理除去保護基(Fmoc)、接著，將該樹脂中和?清洗后，將Fmoc-Asp(OtBu)-OH導入Val的N末端。接著,通過哌唳處理除去保護基(Fmoc)、再次將該樹脂中和?清洗后,將Fmoc-Leu-OH導入Asp的N末端。接著,通過哌唳處理除去保護基(Fmoc)、再次將該樹脂中和?清洗后，將Fmoc-Asp (OtBu) -OH導入Leu的N末端。接著，通過哌唳處理除去保護基(Fmoc),再次將該樹脂中和?清洗后，將Fmoc-Arg(Pmc)-OH導入Asp的N末端。接著，通過哌啶處理除去保護基(Fmoc)，從該樹脂中切出肽鏈。通過利用TFA (三氟乙酸)切斷Val的Trt基和Asp的tBu基、Arg的Pmc基來進行脫保護。最后，用分離HPLC除去未反應物來進行精制，由此得到RDLDV。
[0096](2)肽的純度檢測[0097]將得到的精制物附于分析用反相高效液相色譜[柱=Inertsil 0DS-3 (內徑:2.1_、長度:50mm) ,GL Sciences公司制；流動相:溶劑A(0.05%三氟乙酸)及溶劑B(0.05%三氟乙酸、100%乙腈)的梯度(0分鐘(溶劑B = 0%)?30分鐘(溶劑B = 70%));流速:0.2ml/分鐘；檢測法:波長220nm下的吸光度]，結果在11.2分鐘顯示單一的尖銳的峰，純度為99.2%。
[0098]1-3.RDLDVF(Arg-Asp-Leu-Asp-Val-Phe)妝:
[0099](I)肽的合成:
[0100]使用肽自動合成裝置(島津制作所公司制:PSSM8)通過利用Fmoc法的固相合成法合成標題的肽。具體的步驟如下所述:首先，使Fmoc-Phe(1-Trt)-OH的C末端與固相合成用樹脂結合后，通過哌啶處理除去保護基(Fmoc)、接著，將該樹脂中和?清洗后，將Fmoc-Val-OH導入Phe的N末端。接著,通過哌唳處理除去保護基(Fmoc),再次將該樹脂中和?清洗后，將Fmoc-Asp(OtBu)-OH導入Val的N末端。接著,通過哌唳處理除去保護基(Fmoc)，再次將該樹脂中和?清洗后，將Fmoc-Leu-OH導入Asp的N末端。接著，通過哌唳處理除去保護基(Fmoc),再次將該樹脂中和?清洗后，將Fmoc-Asp (OtBu) -OH導入Leu的N末端。接著，通過哌啶處理除去保護基(Fmoc)，再次將該樹脂中和?清洗后，將Fmoc-Arg(Pmc)-OH導入Asp的N末端。接著,通過哌唳處理除去保護基(Fmoc),從該樹脂中切出肽鏈。通過利用TFA (三氟乙酸)切斷Phe的Trt基和Asp的tBu基、Arg的Pmc基來進行脫保護。最后，用分離HPLC除去未反應物來進行精制，由此得到RDLDVF。
[0101](2)肽的純度檢測:
[0102]將得到的精制物附于分析用反相高效液相色譜[柱=Inertsil 0DS-3 (內徑:
2.1_、長度:50mm) ,GL Sciences公司制；流動相:溶劑A(0.05%三氟乙酸)及溶劑B(0.05%三氟乙酸、100%乙腈)的梯度(0分鐘(溶劑B = 0%)?30分鐘(溶劑B = 70%));流速:0.2ml/分鐘；檢測法:波長220nm下的吸光度]，結果，在14.3分鐘顯示單一的尖銳的峰，純度為99.9%。
[0103]實施例2:血管緊張素轉換酶抑制活性的測定
[0104]使用上述實施例1中制備的各種肽進行血管緊張素轉換酶抑制活性的測定。
[0105]具體而言，以各肽濃度為lmg/mL的方式制備受試液,使用I倍、10倍、100倍、及1000倍稀釋液測定血管緊張素轉換酶抑制活性。血管緊張素轉換酶抑制活性通過如下操作進行評價:使用ACE Kit-WST試劑盒((株)同仁化學研究所制)利用酶法檢測從3-羥丁酰-Gly-Gly-Gly (3HB-GGG)中切出的3-羥丁酸(3HB)，用酶標儀測定450nm的吸光度。ACEKit-WST試劑盒按照附屬的方案使用。將其結果示于以下。
[0106][表 I]
[0107]
【權利要求】
1.一種由下述式(I)的氨基酸序列構成的肽或者其衍生物、或它們的鹽， Xaal-Asp-Leu-Asp-Val-Xaa2(SEQ ID NO:1) 其中，Xaa1及Xaa2可以存在或不存在，在存在的情況下，分別獨立地表示任意的氨基酸。
2.如權利要求1所述的肽或者其衍生物、或它們的鹽，其中，所述肽由Asp-Leu-Asp-Val-Phe (SEQ ID NO:2)、Arg-Asp-Leu-Asp-Val(SEQ ID NO:3)、或Arg-Asp-Leu-Asp-Val-Phe (SEQ ID NO:4)所不的氨基酸序列構成。
3.一種組合物，所述組合物含有選自由權利要求1或2所述的肽及其衍生物、以及它們的鹽構成的組中的至少I種。
4.一種組合物，所述組合物含有選自由權利要求1或2所述的肽及其衍生物、以及它們的鹽構成的組中的至少I種、和Leu-Asp-Val所示的肽及其衍生物、以及它們的鹽。
5.如權利要求3或4所述 的組合物，所述組合物為美容組合物。
【文檔編號】C07K7/06GK103443118SQ201280015380
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2012年4月19日 優先權日:2011年4月22日
【發明者】阿部正通, 熊澤益德, 松本康助 申請人:樂敦制藥株式會社