免疫球蛋白結合性新型多肽的制作方法

免疫球蛋白結合性新型多肽的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種新型多肽，其對免疫球蛋白顯示結合性，且對堿穩定性優異。本發明涉及包含序列編號1或2中記載的氨基酸序列的蛋白質。
【專利說明】免疫球蛋白結合性新型多肽
[0001]技術區域
[0002]本發明涉及新型多肽，其對免疫球蛋白顯示結合性，且化學穩定性優異。
【背景技術】
[0003]抗體具有與被稱為抗原的物質進行特異性結合的機能，及具有與其他生物體分子、細胞進行協同作用，將具有抗原的因子進行無毒化?除去的機能。所謂抗體，其為重視與所述抗原進行結合的這種機能而命名的名稱，作為物質被稱為“免疫球蛋白”。
[0004]與抗體中的恒定區(抗原結合部位以外)進行特異性結合的物質(配體)可以用于抗體的精制、檢測，通過與恒定區進行結合也會擴大其適應范圍，因此具有充分的產業化價值。作為代表性的與抗體中的恒定區進行特異性結合的配體，可以舉例蛋白A、蛋白G。
[0005]隨著抗體藥物、檢查診斷等抗體關聯產業的發展，對這些配體的化學穩定性的要求方面有所增加。特別是為了病毒等的失活，或者為了清洗固定化有配體的擔體(珠、芯片(Beads, chip)等)而使用堿，因此對于對堿具有高穩定性的配體的需求非常多。由于多肽型配體一般對堿的穩定性弱，因此一直在積極研究既能產生極為優異的結合特異性，同時又提高對堿的耐性的技術(非專利文獻1、2)。
[0006]作為提高與抗體進行結合的配體的堿耐性的技術，可以列舉通過將蛋白A的29位的Gly進行變異而 賦予堿耐性的技術(專利文獻1、2)，通過將Asn取代為其他的氨基酸而賦予堿耐性的技術(專利文獻3、4)，利用蛋白A的C結構域或者其變異體的技術(專利文獻5、6)。
[0007]現有技術文獻
[0008]專利文獻:
[0009]專利文獻1:特開昭62-190087號公報
[0010]專利文獻2:國際公開第2010/110288號手冊
[0011]專利文獻3:特表2002-527107號公報
[0012]專利文獻4:特表2005-538693號公報
[0013]專利文獻5:特開2006-304633號公報
[0014]專利文獻6:特表2010-504754號公報
[0015]非專利文獻:
[0016]非專利文獻1:Linhult M?等著，"PROTEINS:Structure, Function, andBioinformatics〃2004 年，第 55 卷，407-416 頁
[0017]非專利文獻2:Palmer B.等著，"Journal of Biotechnology", 2008 年，第 134卷，222-230 頁

【發明內容】

[0018]發明要解決的問題
[0019]本發明的目的是提供新型多肽，其對免疫球蛋白顯示結合性，且對堿的穩定性優[0020]解決問題的方法
[0021]本發明人等為了解決上述問題進行了深入研究，通過運用計算化學的手法和蛋白質工程學的手法，發明了與目前為止的技術開發中所得到的多肽的序列不同、且顯示了更優異的堿耐性的新型多肽，從而完成了本發明。
[0022]S卩，本發明涉及多肽，其含有以下氨基酸序列:
[0023]Rfx1X2EqqnafyE i lhx3pnlteeqrnx4f i Qx5Lx6X7X8PsvsreX9LaeaX10X1: Lndaqapx12
[0024](所述氨基酸序列中:
[0025]X1=D, E, N,或 Q
[0026]X2=E,或，R
[0027]X3=L, M,或 I
[0028]X4=A, E，F，R，Y，或 W
[0029]X5=D, E，H，I，L，Q，R，S，T，或 V
[0030]X6=H, I，或 R
[0031]X7=D, I,或 R
[0032]X8=D,或 E
[0033]X9=I, L,或 V
[0034]X10=R,或 Q
[0035]X11=H,或 R
[0036]X12=R, G,或 K)
[0037]且能與含有免疫球蛋白的Fe區域的蛋白質結合。
[0038]另外，本發明還涉及多肽，其含有以下氨基酸序列:
[0039]Z1Z2Z3Rfx1X2Eqqnafyeilhx3Pnlteeqrnx4Fiqx5Lx6X7X8Psvsrex9Laeax10X11LndaqaPX12
[0040](所述氨基酸序列中，
[0041]X1=D, E, N,或 Q
[0042]X2=E,或，R
[0043]X3=L, M,或 I
[0044]X4=A, E，F，R，Y，或 W
[0045]X5=D, E，H，I，L，Q，R，S，T，或 V
[0046]X6=H, I，或 R
[0047]X7=D, I，或 R
[0048]X8=D,或 E
[0049]X9=I, L,或 V
[0050]X10=R,或 Q
[0051]X11=H,或 R
[0052]X12=R, G,或 K
[0053]Z1 ?Z3=A, D, E, G, H, I, L, N，Q, R, S, T, V,或 Y)
[0054]且能與含有免疫球蛋白的Fe區域的蛋白質結合。
[0055]所述多肽優選為與以下氨基酸序列的序列同一性為90%以上:[0056]ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLRDDPSVSREILAEARRLNDAQAPG (序列編號
1)、或
[0057]ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLRDDPSVSREILAEARRLNDAQAPG (序列編號2)。
[0058]發明的效果
[0059]本發明的多肽具有特別是對堿穩定性優異的特征。即使在極為苛酷的堿性條件下，例如在0.1?1.0M氫氧化鈉(NaOH)中，在室溫下暴露數小時，也幾乎不會失去其與免疫球蛋白的結合性。
[0060]雖然已知有許多保留有與免疫球蛋白的結合性，且堿耐性優異的蛋白A變異體，但是本發明提供堿耐性顯示比上述蛋白A變異體顯著提高的新型肽。
[0061]例如，在用于蛋白質的確認的SDS-PAGE中，在堿條件下長時間暴露了的蛋白質，在一般情況下受到強烈的切斷、修飾，難以維持堿處理前的條帶的狀態(濃度、位置和條數)。但是，本發明中所得到的新型肽，即使在嚴酷的堿性條件下進行暴露后，也可以維持處理前的條帶的狀態，其可以承受的條件可以比公知的堿耐性蛋白A變異體更嚴酷。
[0062]附圖的簡單說明
[0063][圖1]顯示實施例3和比較例I的結果。其為堿處理(0、4、8和24小時)后，序列編號13?15的多肽的SDS-PAGE圖。
[0064][圖2]顯示實施例5和比較例2的結果。其為堿處理(0、4和24小時)后，序列編號38?46的多肽的SDS-PA GE圖。
[0065]發明的實施方式
[0066]在本說明書中，所謂“多肽”的用語，包含具有多肽結構的一切分子。由于本發明的多肽約由50個氨基酸組成，一般情況下，也可以被稱為“蛋白質”或者“(蛋白質的)結構域(Domain)”，基本上不與“多肽”進行區別。
[0067]就“含有免疫球蛋白的Fe區域的蛋白質”而言，其為包含免疫球蛋白分子、免疫球蛋白片段、和免疫球蛋白衍生物的表述。所謂“免疫球蛋白G衍生物”，其為對下列改變型人工蛋白質的總稱:例如，將人免疫球蛋白G的一部分結構域替換為其他生物種類的免疫球蛋白G的結構域并使其融合的嵌合型免疫球蛋白G、將人免疫球蛋白G的CDR(互不決定區，Complementarity Determining Regions)部分置換為其他生物種類抗體的⑶R部分并使其融合的人型化免疫球蛋白G、在Fe區域的糖鏈中加入了分子修飾的免疫球蛋白G、使人免疫球蛋白G的Fv區域與Fe區域進行了融合的人工免疫球蛋白G等。另外，在保持了 Fe區域的立體結構的基礎上，可以進一步實施修飾(片段化等)。因此，本發明中的“含有免疫球蛋白的Fe區域的蛋白質”，并不限定于將一般情況下被稱為Fe區域的區域沒有不足地全部包含在內的免疫球蛋白分子、及其衍生物。
[0068]本發明的新型多肽具有如下特征:含有以下氨基酸序列，能與包含免疫球蛋白的Fe區域的蛋白質結合。
[0069]Rfx1X2EqqnafyE i lhx3pnlteeqrnx4f i Qx5Lx6X7X8PsvsreX9LaeaX10X1: Lndaqapx12
[0070]X1=D, E, N,或 Q
[0071]X2=E,或，R
[0072]X3=L, M,或 I[0073]X4=A, E，F，R，Y，或 W
[0074]X5=D, E，H，I，L，Q，R，S，T，或 V
[0075]X6=H, I，或 R
[0076]X7=D, I，或 R
[0077]X8=D,或 E
[0078]X9=I, L,或 V
[0079]X10=R,或 Q
[0080]X11=H,或 R
[0081]X12=R, G,或 K
[0082]優選具有以下特征的多肽:含有以下氨基酸序列，能與包含免疫球蛋白的Fe區域的蛋白質結合。
[0083]Z1Z2Z3Rfx1X2Eqqnafyeilhx3Pnlteeqrnx4Fiqx5Lx6X7X8Psvsrex9Laeax10X11LndaqaPX12
[0084]X1=D, Ε, N,或 Q
[0085]X2=E,或，R
[0086]X3=L, Μ,或 I
[0087]X4=A, Ε，F，R，Y，或 W
[0088]X5=D, Ε，H，I，L，Q，R，S，Τ，或 V
[0089]X6=H, I，或 R
[0090]X7=D, I，或 R
[0091]X8=D,或 E
[0092]X9=I, L,或 V
[0093]X10=R,或 Q
[0094]X11=H,或 R
[0095]X12=R, G,或 K
[0096]Z1 ?Z3=A, D, Ε, G, H, I, L, N, Q, R, S，Τ, V,或 Y
[0097]進一步優選具有以下特征的多肽:與以下氨基酸序列的序列同一性為90%以上，能與包含免疫球蛋白的Fe區域的蛋白質結合。
[0098]ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLRDDPSVSREILAEARRLNDAQAPG (序列編號
1)、或
[0099]ADNRFNREQQNAF YEILHLPNLTEEQRNAFIQSLRDDPSVSREILAEARRLNDAQAPG (序列編號2)。
[0100]上述序列同一性更加優選為95%以上，特別優選98%以上。另外，即使為比本發明的多肽短的多肽，只要是含有本發明的多肽中的80%以上、優選90%以上的序列(范圍)的情況，都包括在本發明內。
[0101]多肽可以為上述氨基酸序列2個以上連接而成。進行連接的個數下限為2個以上，優選3個以上，進一步優選4個以上，更加優選5個以上，上限為20個以下，優選10個以下，進一步優選8個以下，更加優選6個以下。這些多聚體可以為均二聚體、均三聚體等均聚合物，其為由同一氨基酸序列組成的免疫球蛋白結合性多肽(結構域)之間的連接體。另外，也可以為雜二聚體、雜三聚體等雜聚合物，其為序列不同的多個種類的免疫球蛋白結合性多肽之間的連接體。
[0102]作為多肽的連接方法，可以列舉:不通過作為連接物(linker)的氨基酸殘基進行連接的方法，或者，以作為連接物的I個或多個氨基酸殘基進行連接的方法，但并不限于這些方法。作為連接物的氨基酸殘基的數目并無特別限制，優選是不使多肽的3次元立體結構不穩定的數目。
[0103]另外，本發明的多肽中也包括:將免疫球蛋白結合性多肽、或者2個以上免疫球蛋白結合性多肽連接而成的多肽作為I個構成成分，與機能不同的其他蛋白質進行融合所得到的融合蛋白質。作為融合蛋白質的示例，可以列舉融合了白蛋白、GST (谷胱甘肽-S-轉移酶)的蛋白質，但并不限于此。另外，也可以融合DNA適體等核酸、抗生物質等藥物、PEG(聚乙二醇)等聞分子。
[0104]本發明的多肽具有在堿性條件下化學穩定性優異的特征。所謂“堿性條件下”系指可以達到清洗或者殺菌目的的程度的堿性。更具體而言，相當于約0.05-1.0N的氫氧化鈉水溶液等，但并不限于此。所謂“化學穩定性”系指，對于氨基酸殘基的化學變化等化學修飾，及酰胺鍵的轉移、切斷等化學變性，多肽仍能保持其機能的性質。本發明中的所謂多肽的機能保持系指，保持與免疫球蛋白的Fe區域的結合活性(不受化學變性而保持親和性的多肽的比例)。“化學穩定性”越高，在堿性溶液浸泡處理后，與免疫球蛋白的Fe區域的結合活性降低的程度也會越小。另外，本說明書中的用語“耐堿性”也與“堿性條件下的化學穩定性”意義相同。
[0105]對包含免疫球蛋白的Fe區域的蛋白質的親和性，可以通過利用表面等離子體共振原理的Biacore系統(GE Healthcare Japan Coropration,通用電氣醫療集團日本有限公司制)等生物傳感器進行試驗，但并不限于此。作為檢測條件，只要可以檢測到本發明的多肽與免疫球蛋白的Fe區域結合了時的結合信號即可，通過在溫度20-40°C (—定溫度)下，pH6-8的中性條件下進行測定，可以容易地對其進行評價。
[0106]作為結合參數，可以使用例如親和常數(KA)、解離常數(Kd)(永田他著，《生體物質相互作用のリフルタィム解析実験法》，Springer-Verlag Tokyo, 1998年,第41頁)。本發明的多肽的對免疫球蛋白的Fe區域的親和常數可以通過如下實驗體系來計算:利用Biacore系統，將人IgG固定于傳感器芯片，在溫度25°C、pH7.4的條件下，通過流路添加各結構域變異體。關于本發明相關的蛋白質，可以選用對人IgG的未和常數(Ka)為1 X 105 (M1)Wl,進一步優選1 *106 (M—1)以上，更加優選1*lO7 (M—1)的蛋白質。
[0107]但是，計算堿處理后的殘留結合活性的時候，Ka或Kd不適合作為結合參數。這是因為，通過化學處理，1分子蛋白質的對免疫球蛋白的結合能不發生改變。作為計算堿處理后的蛋白質的殘留結合活性的方法，優選例如使用將蛋白質固定于傳感器芯片，在對蛋白質進行化學處理之前與之后，添加了同一濃度的免疫球蛋白時的結合信號的大小的方法，或者是使用理論上的最大結合容量(Rmax)的結合參數，但不限于此方法。例如，將免疫球蛋白固定化，添加化學處理前后的蛋白質的實驗體系中也是可以的。
[0108]堿性條件下的化學穩定性，不僅可以通過對免疫球蛋白的結合活性來決定，也可以以多肽自身的作為物質的穩定性來作為指標來決定。例如，可以通過電泳法對堿處理前后的多肽的電泳條帶進行比較，從而對堿性條件下的化學穩定性進行評價。具體而言，進行很常見的SDS-PAGE,通過光密度測定法(Densitometry)對條帶強度進行解析,據此可以比較化學穩定性。如果以通過光密度測定法進行了分析的條帶強度為基準，本發明的多肽在
0.5M氫氧化鈉水溶液中、25°C下靜置24小時后，與進行該處理之前比較,優選為50%以上，進一步優選60%以上，更加優選70%以上，特別優選80%以上。另外，如果以通過光密度測定法進行了分析的條帶強度為基準，本發明的多肽在0.5M氫氧化鈉水溶液中、25°C下靜置30小時后，與進行該處理之前比較，優選為30%以上，進一步優選40%以上，更加優選50%以上。
[0109]本發明的蛋白質可以通過將編碼蛋白質的氨基酸序列的DNA插入載體，培養包含該載體的轉化體來進行生產。
[0110]對于所述DNA而言，只要是翻譯其堿基序列所得到的氨基酸序列是構成該蛋白質的序列，可以為任意序列。所述DNA可以利用通常所使用的公知的方法，例如聚合酶鏈反應(以下，簡稱PCR)法來獲得。另外，也可以用公知的化學合成法來進行合成，此外，也可以通過DNA文庫來獲得。就構成該DNA的堿基序列而言，密碼子可以被簡并密碼子所替換，只要在進行翻譯時編碼同一蛋白質，則沒有必要與本來的堿基序列相同。
[0111]用于改變DNA的堿基序列的位點特異性突變的導入，可以通過重組DNA技術，PCR法等進行。即，通過重組DNA技術導入突變，可以通過盒式誘變法進行:例如，在編碼本發明的蛋白質的基因中，在希望導入突變的目標部位的兩側，存在適當的限制性內切酶識別序列的情況下，用所述限制性內切酶將所述限制性內切酶識別序列部分切斷，除去包含希望導入突變的部位的區域，然后，通過化學合成等，僅在目標部位插入導入有突變的DNA片段。另外，通過PCR的位點特異性突變的導入，可以通過雙引物法進行，例如，以編碼蛋白質的雙鏈質粒作為模板，使用含有與+鏈和一鏈互補的突變的2種合成寡核苷酸引物進行PCR。
[0112]還有，通過將編碼本發明單體蛋白質(I個結構域)的DNA以預定數目進行串聯連接，也可以制作編碼多聚體蛋白質的DNA。例如，編碼多聚體蛋白質的DNA的連接方法可以通過如下方法來進行:將合 適的限制性內切酶部位導入DNA序列，將通過限制性內切酶而片段化的雙鏈DNA通過DNA連接酶來進行連接。限制性內切酶部位可以為I種、也可以導入多個不同種類的限制性內切酶部位。
[0113]此外，在編碼多聚體蛋白質的DNA中，當編碼各個單體蛋白質的堿基序列相同的情況下，由于在轉化時有可能誘發宿主細胞內的DNA的同源重組，編碼相連接著的單體蛋白質的DNA的堿基序列間的序列同一性優選90%以下，進一步優選85%以下。
[0114]所述載體包含編碼所述蛋白質或編碼其部分氨基酸序列的堿基序列，以及在可與堿基序列作動連接的宿主中可以發揮作用的啟動子。通常，對上述蛋白質進行編碼的基因可以通過與適當的載體連接或插入其中來獲得。用于插入基因的載體只要能在宿主中進行自主復制即可，并沒有特別限制，可以使用質粒DNA、噬菌體DNA作為載體。例如，使用大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)作為宿主的情況下,可以列舉pQE系列載體(Qiagen公司生產)、PET系列載體(默克公司生產)、和pGEX系列載體(GE Healthcare,日本)的載體等。作為對短小芽孢桿菌屬(Brevibacillus)細菌的基因表達有用的質粒載體,可以列舉例如，作為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)載體所公知的pUBllO，或者pHY500 (特開平 2-31682 號公報)、pNY700 (特開平 4-278091 號公報)、pNU211R2L5 (特開平 7-170984 號公報)、PHT210 (特開平6-133782號公報)、另外還有作為大腸埃希氏桿菌與短小芽孢桿菌屬細菌的穿梭載體的PNCM02 (特開2002-238569號公報)等。
[0115]本發明的蛋白質可以作為與具有輔助蛋白質表達的作用、或者具有容易地進行精制的作用的公知蛋白質的融合蛋白質來獲得。作為該蛋白質的示例，可以列舉麥芽糖結合蛋白質(MBP)、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)等，但并不限于這些蛋白質。使用下述載體可以生產融合蛋白質，所述載體包含:編碼本發明的蛋白質的氨基酸序列的DNA，與編碼MBP或者GST等的DNA，二者是相連結的狀態。
[0116]轉化體可以通過將載體導入到成為宿主的細胞來獲得。作為載體到宿主的導入方法，可以列舉例如，使用鈣離子的方法、電穿孔法、原生質球法、醋酸鋰法、土壤桿菌感染法、粒子轟擊、或聚乙二醇法等，但并不限于此。另外，作為使所得到的基因的機能在宿主中進行表達的方法可以列舉:將本發明中所得到的基因組入基因組(染色體)的方法等。
[0117]關于成為宿主的細胞并無特別限制，便宜且大量進行生產方面，可以適當使用大腸埃希氏桿菌、枯草芽孢桿菌、以及短小芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬(Streptomyces)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)等細菌(真細菌)。
[0118]本發明的蛋白質也可以通過如下方法制造:將上述轉化細胞在培養基中進行培養，在培養菌體中(也包括菌體周質空間中)或者培養液中(菌體外)使本發明的蛋白質生成并蓄積，再從該培養物中獲得希望的蛋白質。
[0119]另外，本發明的蛋白質可以通過下述方法制造:將上述轉化細胞在培養基中進行培養，在培養菌體中(也包括菌體周質空間中)或者培養液中(菌體外)，使含有本發明的蛋白質的融合蛋白質生成并蓄積，從該培養物中獲得該融合蛋白質，通過合適的蛋白酶將該融合蛋白質切斷，采集希望的蛋白質。
[0120]轉化細胞的培 養按照宿主培養中所使用的通常方法來進行。只要可以高效高產量地生產該蛋白質，培養所使用的培養基并無特別限制。具體而言，可以使用葡萄糖、蔗糖、甘油、多聚蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白氨基酸等碳源和氮源。其他根據需要添加鉀鹽、鈉鹽、磷酸鹽、鎂鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽等無機鹽類。使用營養缺陷型宿主細胞的情況下可以添加生長所需的營養物質。另外，根據需要也可以添加青霉素、紅霉素、氯霉素、新霉素等抗生物質。
[0121]另外，為了抑制通過菌體內外所存在的宿主由來的蛋白酶而產生的該目的蛋白質的分解、低分子化，可以添加適當濃度地公知的各種蛋白酶抑制劑，即苯基甲烷磺酸氟(Phenylmethane sulfonyl fluoride, (PMSF)),苯甲脈(Benzamidine)，4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟(AEBSF)，抗痛素(Antipain),抑糜酶素(Chymostatin),亮肽酶素(Leupeptin),胃酶抑素 A (Pepstatin A),憐酸阿米酮(Phosphoramidon),抑妝酶(Aprotinin),乙二胺四乙酸(EDTA)，和/或其他市售蛋白酶抑制劑。
[0122]此外，為了使本發明的蛋白質進行正確折疊(Folding),可以利用例如GroEL/ES,、Hsp70/DNAK、Hsp90、Hspl04/ClpB等分子伴侶(例如用共表達，或者融合蛋白質化等手段，使其與本發明的蛋白質共存)。需要說明的是，以本發明的蛋白質的正確折疊為目的的情況下，可以在培養基中添加有助于正確折疊的添加劑，和在低溫下進行培養等手段，但并不限于此。
[0123]作為對以大腸埃希氏桿菌為宿主所得到的轉化細胞進行培養的培養基，可以列舉LB培養基(胰胨(triptone) 1%、酵母提取物0.5%,NaCl 1%)，或者2xYT培養基(胰胨1.6%、酵母提取物1.0%、NaCl0.5%)等。
[0124]作為對以短小芽孢桿菌屬細菌為宿主所得到的轉化體進行培養的培養基，可以列舉TM培養基(蛋白胨1%、肉提取物0.5%、酵母提取物0.2%、葡萄糖1%、pH7.0)，或者2SL培養基(蛋白胨4%、酵母提取物0.5%、葡萄糖2%、pH7.2)等。
[0125]另外，培養溫度為15?42°C，優選20?37°C，通過在通風攪拌條件、有氧下進行數小時?數日培養，使本發明的蛋白質在培養細胞內(包括周質空間內)或者培養溶液(細胞外)蓄積并進行回收。根據需要也可以切斷通風在厭氧下進行培養。
[0126]當重組蛋白質是分泌生產的情況下，在培養結束后，通過離心分離、過濾等一般分離方法，通過將培養細胞與含有分泌生產的蛋白質的上清進行分離，可以對所生產的重組蛋白質進行回收。
[0127]另外，在培養細胞內(包含周質空間內)進行蓄積的情況下，也可以通過下列方法進行:例如，通過將培養液離心分離、過濾等的方法采集菌體，接著通過超聲波破碎法、弗氏細胞壓碎法(French press)等將該菌體破碎,和/或添加表面活性劑等使其可溶來回收細胞內畜積生廣的蛋白質。
[0128]本發明的蛋白質的純化可以通過單獨或者適宜組合親和色譜法、陽離子或陰離子交換色譜法、凝膠過濾色譜等來進行。
[0129]所得到的純化物質為目標蛋白質的確認，可以通過通常的方法來進行，例如SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、N末端氨基酸序列分析、Western blotting等。
[0130]本發明的蛋白質也可以用使用了上述DNA的無細胞蛋白質合成系來制造。作為上述無細胞蛋白質合成系的示例，.舉例原核細胞由來、植物細胞由來、高等動物細胞由來的合成系。
[0131]本發明的蛋白質可以作為具有對免疫球蛋白親和性的特征的親和配體(Affinityligand)來利用。將該配體在由水不溶性的基材形成的擔體上進行固定化，可以得到親和分離基質(Affinity separation matrix)。
[0132]此處，所謂“親和配體”，系指抗原與抗體的結合所代表的、以特異的分子間的親和力為基礎、從某分子的集合中選擇性地捕集(結合)目標分子的物質(官能團)的用語，在本發明中，指對免疫球蛋白進行特異性結合的蛋白質。在本說明書中，在僅用“配體”書寫的情況下，也與“親和配體”意思相同。
[0133]作為用于使親和配體固定化、且由水不溶性的基材所形成的擔體，列舉玻璃珠、硅膠等無機擔體；由交聯聚乙烯醇、交聯聚丙烯酸酯、交聯聚丙烯酰胺、交聯聚苯乙烯等合成高分子、或結晶纖維素、交聯纖維素、交聯瓊脂糖、交聯葡聚糖等多糖類類所形成的有機擔體；進一步還有通過將上述物質進行組合所得到的有機-有機、有機-無機等復合擔體等。作為市售品，可以例示多孔纖維素凝膠如GCL2000、將亞甲基雙丙烯酰胺和烯丙基葡聚糖共有結合而交聯的Sephacryl S-1000、甲基丙烯酸酯系列的擔體如Toyopearl、瓊脂糖系的交聯擔體如Sepharose CL4B、和纖維素系的交聯擔體如Cellufine等。但是,水不溶性擔體并不僅限定于所例示的上述擔體。
[0134]另外，從該親和分離基質的使用目的和方法來看，水不溶性擔體最好為表面積大的，優選為具有多個適當大小的細孔的多孔質。作為擔體的形式，為任意可能的珠狀、塊狀(Monolith)、纖維狀、膜狀(含中空纖維)等，可以選自任意形式。[0135]關于配體的固定化方法，例如可以利用配體中所存在的氨基、羧基或巰基，在傳統的偶聯法中與擔體進行結合。作為偶聯法，列舉將擔體與溴化氰、環氧氯丙烷、二環氧甘油醚、甲苯磺酰氯、tresyl chloride、肼和高碘酸鈉等進行反應使擔體活性化(或在擔體表面導入反應性官能團)，再與作為配體而固定化的化合物進行偶聯反應的固定化方法，還有在擔體與作為配體而固定化的化合物所存在的體系中，加入如碳二亞胺類縮合試劑或者如戊二醛類的分子中具有多個官能團的試劑，通過縮合、交聯的固定化方法。另外，可以在配體與擔體間導入由多個原子形成的間隔分子，也可以將配體在擔體上直接固定化。此時，為了固定化，可以對本發明的蛋白質進行化學修飾，也可以加入對固定化有用的氨基酸殘基。作為對固定化有用的氨基酸，舉例側鏈上具有對固定化的化學反應有用的官能團的氨基酸，列舉例如側鏈上含有氨基的Lys、或側鏈上含有巰基的Cys。只要將本發明蛋白質作為配體而固定化的基質成功實現本發明蛋白質的效果，用于固定化的修飾、改變方法并無特別限制。
[0136]作為具體的固定化方法，通過配體中所存在的Lys的ε氨基，優選在傳統的偶聯法中與擔體進行共價結合的方法。由于本發明蛋白質有時不含有Lys，在該情況下，如上所述，優選在多肽中添加給予了對固定化有用的Lys的序列，并優選將給予了 Lys的序列在多肽的末端進行給予。就本發明中的“給予了 Lys的序列”而言，其為至少含有I個以上的Lys的序列，Lys的數優選為I?10個,進一步優選為I?5個,更加優選為I?3個。另外，存在多個Lys的情況下,每個Lys不需要連續(鄰接)起來。此外,關于末端給予了 Lys的序列的氨基酸殘基數，也無特別限制，即使為由I個Lys所形成的序列也可以。給予了 Lys的序列的氨基酸殘基數優選為I?20個，進一步優選為I?10個，更加優選為I?5個。就“給予末端”而言，基本上，其意思是對氨基酸序列的N末端或者C末端的給予。因此，可以通過突變本發明的多肽的末端來給予Lys。
[0137]就“含有免疫球蛋白的Fe區域的蛋白質”而言，其為含有本發明蛋白質所結合的Fe區域側的部位的蛋白質，不必為完全地含有Fe區域的蛋白質。
[0138]上述含有免疫球蛋白的Fe區域的蛋白質的純化法，可以通過比照使用已經作為市售品而存在的柱子的親和柱色譜純化法的步驟來達成。即，將含有包含免疫球蛋白的Fe區域的蛋白質的緩沖液調整為中性，然后使該溶液通過填充了親和分離基質的親和色譜柱，吸附包含免疫球蛋白的Fe區域的蛋白質。然后，用適量純粹的緩沖液通過親和色譜柱，洗凈柱子內部。在此時，所希望的含有免疫球蛋白的Fe區域的蛋白質被吸附于柱子內的本發明的親和分離基質中。接著，用調整為適當PH的酸性緩沖液(有時含有促進從該基質中的分離的物質)對柱子進行通液，通過洗脫所希望的含有免疫球蛋白的Fe區域的蛋白質，來達到高純度的純化。通過用完全不損害配體化合物或擔體的基材的機能程度的、適當的強酸性或強堿性的純粹的緩沖液(適當的變性劑，或有時為含有有機溶劑的溶液)進行洗滌，親和分離基質可以再利用。
實施例
[0139](實施例1)新型多肽的調制
[0140]將具有序列編號3和4中記載的核苷酸序列的寡核苷酸混合，使用BlendTaq(東洋紡織株式會社制)作為聚合酶，按照所附的操作規程(protocol)進行重疊(overlap)PCR反應。在瓊脂糖凝膠電泳中提取?純化PCR反應生成物的雙鏈DNA，通過限制性內切酶BamHI與HindIII (都為Takara Bio株式會社制)進行切斷。用同樣的方法，由具有序列編號5和6中記載的核苷酸序列的寡核苷酸，通過PCR反應得到目標雙鏈DNA，再通過限制性內切酶HindIII與EcoRI (Takara Bio株式會社制)進行切斷。
[0141]在質粒載體pGEX_2T (GE Healthcare Japan Coropration 制)的多克隆位點(Multiple cloning site)中的BamHI/EcoRI位點上，使上述2種雙鏈DNA進行亞克隆(Subcloning)。將進行了用限制性內切酶BamHI與EcoRI的切斷反應和用堿性磷酸酶(Takara Bio株式會社制)的脫磷酸化反應的載體pGEX_2T，與經上述2種限制性內切酶處理過的雙鏈DNA混合，使用Ligation High (東洋紡織株式會社制)，按照所附的操作規程進行連接反應(Ligation reaction)。需要說明的是,上述2種雙鏈DNA在HindIII切斷位點結合，在PGEX-2T中進行了亞克隆時，設計了序列編號3、4、5、6的DNA，以使得編碼序列編號I。使用含有編碼該序列編號I的DNA的pGEX-2T (連接反應液)，進行大腸埃希氏桿菌HBlOl細胞(Takara Bio株式會社制)的轉化，按照規定方法，擴增.提取質粒DNA。
[0142]以該表達質粒作為模板，(I)使用序列編號7和8的寡核苷酸引物進行PCR，用限制性內切酶PstI與cfrl3I (Takara Bio株式會社制)處理PCR反應純化產物，來調制插入用雙鏈DNA。另外，使用相同模板，(2)使用序列編號9和10的寡核苷酸引物進行PCR，用限制性內切酶cfrl3I與EcoRI處理PCR反應純化產物，來調制插入用雙鏈DNA。將上述2種插入用雙鏈DNA，與(3)經限制性內切酶(Pstl/EcoRI)處理和脫磷酸化處理了的短小芽孢桿菌(Brevibacillus)用表達載體pNK3260’(國際公開第2006/004067號冊子)進行混合，通過連接反應，構建了持有編碼多肽的DNA的表達質粒，所述多肽具有連接有序列編號I的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0143]另外，與上述同時進行，關于寡核苷酸引物，(I)中使用序列編號7和11、(2)中使用序列編號9和12，關于限制性內切酶，(I)中使用PstI與X hoi (Takara Bio株式會社制)，(2)中使用X hoi與EcoRI，從而構建了持有編碼多肽的DNA的表達質粒，所述多肽具有連接有序列編號2的氨基酸序.列的氨基酸序列。需要說明的是，從基因操作的情況出發，C末端(第2次重復的最后)的氨基酸殘基被取代為Lys，但是因為是C末端，不論有無取代，評價結果不變。
[0144]使用這些表達質粒，進行橋石短小芽孢桿菌(Brevibacillus.choshinensis)FY-1株的轉化。轉化是根據公知的方法使用電導入法實施(《Biosc1.Biotech.Biochem.》、1997年、61號、202-203頁)。需要說明的是橋石短小芽孢桿菌FY-1株為橋石短小芽孢桿菌HPD31-0K株(特開平6-296485號公報)中進行突變處理所得到的Phe.Tyr缺陷型株(Phe-and Tyr-requiring strain)。
[0145]將橋石短小芽孢桿菌FY-1重組菌，在含有60 μ g/mL的新霉素的5mL的3YC培養基(聚胨3%、酵母提取物0.2%、葡萄糖3%、硫酸鎂0.01%、硫酸鐵0.001%、氯化錳0.001%、氯化鋅0.0001%)中，30°C下振蕩培養3天。
[0146]通過離心處理培養物來分離菌體，從所得到的培養上清中，利用SP FastFlow柱(GE Healthcare Japan Coropration制)通過陽離子交換色譜法來純化目標多肽。具體為，對培養上清添加醋酸鈉使其最終濃度成為50mM，進一步加入鹽酸調整到pH4.0，將其加入到使用陽離子交換緩沖液A (50mMCH3C00H-CH3C00Na, pH4.0)所平衡化的SP Fast Flow柱中，用陽離子交換緩沖液A洗凈后，通過利用陽離子交換緩沖液A與陽離子交換緩沖液B(50mM CH3COOH-CH3COONa, IM NaCl, pH4.0)的梯度鹽濃度，分取出中途所洗脫的目標多肽。接著，用利用 DEAE Fast Flow 柱(GE Healthcare Japan Coropration 制)的陰離子交換色譜法，來純化目標多肽。具體為，所分取的目標蛋白質溶液用超純水進行透析，再將其加入到使用陰離子交換緩沖液A (50mM Tris-HCl,pH8.0)所平衡化的DEAE Fast Flow柱中，用陰離子交換緩沖液A洗凈后，通過利用陰離子交換緩沖液A與陰離子交換緩沖液B (50mMTris-HCl,0.3M NaCl，pH8.0)的梯度鹽濃度，分取出中途所洗脫出的目標多肽。所分取的目標多肽溶液再用超純水進行透析，將只含有目標多肽的水溶液作為最終純化樣品。需要說明的是，以上的通過使用柱子的色譜法所做的蛋白質純化，都是利用AKTAprime plus系統(GE Healthcare Japan Coropration 制)實施的。
[0147]將經以上步驟所調制的、在以后的實施例中所使用的、2種多肽的氨基酸序列，作為序列編號13 (序列編號I的2連接型)、序列編號14 (序列編號2的2連接型)表示。
[0148](實施例2)各種多肽與人IgG的親和性解析
[0149]使用利用表面等離子體共振的生物傳感器Biacore3000 (GE Healthcare JapanCoropration制),解析了實施例1中取得的各種多肽與免疫球蛋白的親和性。
[0150]將從人血衆中分尚的人免疫球蛋白G制劑(以后記作人IgG)在傳感器芯片上固定化，將各種蛋白質流于芯片上，檢測兩者的相互作用。人IgG對傳感器芯片CM5的固定化通過使用N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、和N-乙基-N’ - (3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)的胺偶聯法進行，封閉時使用乙醇胺(傳感器芯片和固定化用試劑都是GEHealthcare JapanCoropration 制)。作為人 IgG 溶液使用 Gamma guard (Baxter 公司制)，用標準緩沖液(20mM NaH2PO4-Na2HPO4,150mM NaCl、pH7.4)溶解使其成為1.0mg/mL進行調制。該人IgG溶液用固定化用 緩沖液(IOmMCH3COOH-CH3COONa、pH4.5)稀釋100倍。按照Biacore3000所附的操作規程，將人IgG固定于傳感器芯片上。另外，對于芯片上其他流通池，通過在用EDC/NHS活性化后進行將乙醇胺進行固定化處理，也準備了作為陰性對照的參考細胞。
[0151]使用電泳緩沖液(20mMNaH2PO4-Na2HPO4、150mM NaCl,0.005%Ρ_20、ρΗ7.4)，在10?IOOOnM的范圍下適宜調制(各個不同蛋白質濃度的溶液分別調制3種)實施例1中記載的方法所制造的各種多肽，將各個多肽溶液以流速20 μ L/min30秒添加到傳感器芯片上。在測定溫度25°C下，按順序觀測添加時(結合相、90秒間)和添加結束后(解離相、90秒間)的結合反應曲線。各個觀測結束后，添加40mM NaOH (15秒)使傳感器芯片再生。該操作的目的是去除傳感器芯片上殘留的添加蛋白質，確認固定化了的人IgG的結合活性幾乎完全恢復。對于所得到的結合反應曲線(減去參考細胞的結合反應曲線的結合反應曲線)，使用系統附屬軟件BIA evaluation中1:1的結合模型通過擬合分析,算出對人IgG的親和常數(KA=kon/koff)。
[0152]對序列編號I的多肽抗體的親和常數(Ka)是，序列編號13的多肽為2.1XlO8(M—1)，序列編號14的多肽為2.6X IO8 (M—1)。這可以說是對人免疫球蛋白具有充分的親和性的測定結果。
[0153](實施例3)通過SDS-PAGE解析的新型多肽的對堿的穩定性評價
[0154]對于實施例1中所取得的各種多肽，在堿性條件下進行一定時間的溫育處理后，通過比較SDS-PAGE上的條帶狀態來進行評價。
[0155]堿處理按照下面的方法進行。對于200 μ M的各種多肽，加入NaOH使最終濃度成為0.5M，25°C下溫育4、8、和24小時，通過對多肽溶液添加0.5M HCl (預先確認了 pH恢復至中性的一定容量)來中和，作為SDS-PAGE用樣品。堿處理前(處理后O小時)的SDS-PAGE用樣品，通過添加堿處理時加入的NaOH溶液和中和處理時加入的HCl溶液預先混合了的溶液來調制，從而使多肽濃度、溶液的組成相同。在電源搭載型min1-slab電泳槽pageRun中使用 15% 聚丙烯酰胺預制凝膠(Polyacrylamide precast gel) “e.PAGEL”(都為 ATTO 株式會社制)，按照附屬的手冊(定法)進行SDS-PAGE。利用染色.脫色處理后的電泳凝膠用圖像讀取裝置ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories株式會社制)使其電子圖像化,條帶解析(Densitometry)用附屬的 Quantity One Soft (Bio-Rad Laboratories 株式會社制)，按照手冊進行。圖1表示SDS-PAGE的電子圖像。
[0156]關于堿處理24小時后的條帶強度比(將堿處理前作為100%時的殘存率)，公知的高耐堿性多肽(比較例1、序列編號15、2連接型)為55.0%，與此相比，序列編號13的多肽為60.9%、序列編號14的多肽為91.6%ο
[0157]可知本發明中所得到的多肽即使在嚴酷的堿條件下也顯示優良的穩定性。特別地，序列編號14 (序列編號2為基礎)的多肽即使在0.5M Na0H、25°C下溫育4小時，條帶強度也幾乎不變化(99.8%)，因此，可以說是各種局面下實用性極高的多肽。
[0158](實施例4)新型多肽的調制
[0159]將含有實施例1中所取得的編碼序列編號I的DNA的pGEX_2T作為模板DNA，使用2種引物,實施Quick change法,取得了包含新突變的表達質粒。使用DNA聚合酶PfuTurbo和甲基化DNA (模板DNA)切割酶DpnI (都為Stratagene公司制)，按照Stratagene公司的操作規程實施Quick change法。用“序列編號16與17，或序列編號18與19、或序列編號20與21、或序列編 號22與23、序列編號24與25、序列編號26與27、序列編號28與29”這7個不同的引物組合，調制了導入新的突變的表達質粒。進一步地，將使用序列編號16與17的引物所調制的表達質粒作為模板DNA，用序列編號18與19的引物，也調制了再次導入突變的表達質粒。因此，重新調制了 8種表達質粒。
[0160]將上述表達質粒作為模板，使用實施例1中所記載的步驟(I)?(3)的方法，對于以下所示各個氨基酸序列(序列編號30?37)，取得了含有編碼4種多肽的DNA的表達質粒，所述4種多肽具有成為相同序列重復的氨基酸序列。
[0161]ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLRDDPSVSREILAEAQRLNDAQAPR (序列編號 30)
[0162]ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLIDDPSVSREILAEAQRLNDAQAPR (序列編號 31)
[0163]ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLIDDPSVSREILAEARRLNDAQAPR (序列編號 32)
[0164]ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLHDDPSVSREILAEARRLNDAQAPR (序列編號 33)
[0165]ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQELRDDPSVSREILAEARRLNDAQAPR (序列編號 34)
[0166]ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQLLRDDPSVSREILAEARRLNDAQAPR (序列編號 35)
[0167]ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQTLRDDPSVSREILAEARRLNDAQAPR (序列編號 36)
[0168]ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLRIDPSVSREILAEARRLNDAQAPR (序列編號 37)
[0169]各個多肽的氨基酸序列如序列編號38?45所示。需要說明的是，與實施例1同樣，C末端(第2次重復的最后)的氨基酸殘基被取代為Lys，但是因為是C末端，不論有無取代，評價結果不變。
[0170]使用上述表達質粒，用與實施例1同樣的方法使多肽表達、純化。
[0171](實施例5)通過SDS-PAGE解析的新型多肽的對堿的穩定性評價
[0172]關于實施例4中所取得的各種多肽，用與實施例3同樣的手法，在堿性條件下進行一定時間的溫育處理后，通過比較SDS-PAGE上的條帶狀態來進行評價。關于序列編號38?41的多肽，評價了溫育4小時和24小時后的穩定性。關于序列編號42?45的多肽，評價了溫育30小時后的穩定性。需要說明的是，作為參照，對于序列編號14的多肽也進行了同樣的操作。
[0173]圖2表示SDS-PAGE的電子圖像。關于從開始堿處理到24小時后的條帶強度比，序列編號38的多肽為73.4%、序列編號39的多肽為79.0%、序列編號40的多肽為85.6%、序列編號41的多肽為82.8%。同樣地，關于從開始堿處理到30小時后的條帶強度比，公知的耐堿性多肽(比較例2、序列編號46、2連接型)為23.1%，與此相比，序列編號14的多肽為45.1%、序列編號42的多肽為45.8%、序列編號43的多肽為43.8%、序列編號44的多肽為49.6%、序列編號45的多肽為65.0%。因此，可知上述多肽即使在嚴酷的堿條件下也顯示優良的穩定性。
[0174](比較例I)C-G29A.2d的調制和評價
[0175]C-G29A.2d為蛋白A的C結構域導入了突變G29A的等機能變異體，其為公知(專利文獻5)的耐堿性非常高的的多肽。將編碼該等機能變異體串聯連接而成的多肽(序列編號15)的DNA，在PCR中擴增，以使得能夠在Pstl/EcoRI位點切斷，然后在載體pNK3260’上進行亞克隆。與實施例1同樣的方法進行表達.純化，與實施例3同樣的方法進行耐堿性評價。
[0176](比較例2)C-G29A/S33 E.2d的調制和評價
[0177]在C-G29A中導入了突變S33E的多肽，為顯示與C-G29A同等的耐堿性的公知的多肽(國際公開第2011/118699號公報)。對于該序列串聯連接而成的多肽(序列編號46)，用與實施例1同樣的方法進行表達.純化，與實施例3同樣的方法進行耐堿性評價。
【權利要求】
1.一種多肽，其含有以下氨基酸序列，且能與含有免疫球蛋白的Fe區域的蛋白質結合:
Rfx1X2Eqqnafyeilhx3Pnlteeqrnx4Fiqx5Lx6X7X8Psvsrex9Laeax10X11LndaqaPX12
(在所述氨基酸序列中:
X1=D, E，N 或 Q
X2=E 或 R
X3=L, M 或 I
X4=A, E，F，R，Y 或 W
X5=D, E, H，I, L, Q，R，S，T 或 V
X6=H, I 或 R
X7=D,I 或 R
X8=D 或 E
X9=I, L 或 V
X10=R 或 Q
X11=H 或 R
X12=R, G 或 K)。
2.一種多肽，其含有以下氨基酸序列，且能與含有免疫球蛋白的Fe區域的蛋白質結合:
Z1Z2Z3Rfx1X2Eqqnafyeilhx3Pnlteeqrnx4Fiqx5Lx6X7X8Psvsrex9Laeax10X11LndaqaPX12
(在所述氨基酸序列中，
X1=D, E，N 或 Q
X2=E 或 R
X3=L, M 或 I
X4=A, E，F，R，Y 或 W
X5=D, E, H，I, L, Q，R，S，T 或 V
X6=H, I 或 R
X7=D,I 或 R
X8=D 或 E
X9=I, L 或 V
X10=R 或 Q
X11=H 或 R
X12=R, G 或 K
Z1 ?Z3=A, D, E, G, H，I, L, N，Q, R, S，T, V 或 Y)。
3.根據權利要求1或2中記載的多肽，其與以下氨基酸序列的序列同一性為90%以上: ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLRDDPSVSREILAEARRLNDAQAPG (序列號 I)、或 ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLRDDPSVSREILAEARRLNDAQAPR (序列號 2 )。
【文檔編號】C07K14/00GK103443120SQ201280015181
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2012年3月26日 優先權日:2011年3月25日
【發明者】吉田慎一, 村田大, 平良俊一 申請人:株式會社鐘化