具有抗炎活性的基于人乳鐵蛋白的肽的制作方法
【專利摘要】本發明涉及新的肽及其用途，特別是用于治療和/或預防感染、炎癥、疼痛、傷口、傷疤和/或腫瘤。
【專利說明】具有抗炎活性的基于人乳鐵蛋白的肽
發明領域
[0001]本發明涉及新的肽及其用途，特別是用于治療和/或預防感染、炎癥、疼痛、傷口、疤痕和/或腫瘤。
[0002]發明背景
[0003]乳鐵蛋白是一種單鏈金屬結合糖蛋白，其分子量為77kDa。已經發現乳鐵蛋白的負責殺細菌性能的結構域是被稱為乳鐵蛋白肽的胃蛋白酶分解的片段(參見例如，BellamyW.,等人，Identification of the bactericidal domain of lactoferrin, Biochim.Biophys.Actall21:130-136,1992,和 Bellamy ff.,等人，Antibacterial spectrum oflactoferricin B, a potent bactericidal peptide derived from the N—terminalregion of bovine lactoferrin, J.Appl.Bact.73:472-479，1992)。
[0004]在許多類型的細胞上發現乳鐵蛋白受體，所述細胞包括單核細胞和巨噬細胞、凝集素刺激的人外周血淋巴細胞、刷狀緣細胞以及腫瘤細胞株。
[0005]幾個專利出版物描述了乳鐵蛋白在治療感染或炎癥中的可能的用途。在WO98/06425中，例如，公開了乳鐵蛋白和乳鐵蛋白肽可用于治療和預防感染、炎癥和腫瘤。
[0006]EP 629 347描述了一種抗微生物劑其包含(A)乳鐵蛋白水解產物和/或者從乳鐵蛋白衍生的一種或多種抗微生物肽，和(B) —種或多種化合物，所述化合物選自金屬螯合蛋白、生育酚、環糊精、甘油脂肪酸酯、醇、EDTA或其鹽、抗壞血酸或其鹽、檸檬酸或其鹽、多磷酸或其鹽、殼聚糖、半胱氨酸和膽酸作為其有效組分。該抗微生物劑意在用于產品處理，及其特別是用于安全處理例如食品和藥品。上述出版物所述試劑因此是一種新的防腐劑。在上述出版物中，給出了多個肽序列并且其中一些肽序列類似于本發明所述的肽，盡管存在多個重要的差異，所述差異進一步描述如下。
[0007]US 5，304, 633公開了從人和牛的乳鐵蛋白的水解產物中分離的抗微生物肽。特別公開了對應于人乳鐵蛋白的12至47位氨基酸和17至41位氨基酸的肽的分離。
[0008]JP 7145196描述了通過乳鐵蛋白水解制備抗生素肽。特別描述了對應于人乳鐵蛋白的17至41位氨基酸的肽的制備。
[0009]JP 8040925公開了包含乳鐵蛋白衍生肽的藥物組合物及其在治療角膜損傷特別是角膜炎中的用途。特別公開了對應于人乳鐵蛋白的17至41位、12至58位和19至38位
氨基酸的肽。
[0010]JP 7274970描述了抗細菌的乳鐵蛋白衍生肽的重組生產，特別公開了對應于人乳鐵蛋白的18至42位氨基酸的肽。
[0011]JP 8143468描述了乳鐵蛋白衍生肽及其作為抗潰瘍藥物的用途，特別公開了對應于人乳鐵蛋白的19至33位氨基酸的肽。
[0012]WO 00/01730描述了從人乳鐵蛋白衍生的肽及其治療感染和炎癥的用途。
[0013]EP I 228 097描述了從人乳鐵蛋白的緊鄰N末端衍生的肽及其作為微生物制劑的用途。
[0014]EP 1151009描述了包含對應于人乳鐵蛋白的35至50位氨基酸序列的肽，其具有抗微生物和/或內毒素中和活性。
[0015]WO 2006/047744描述了從人乳鐵蛋白的N端部分衍生的免疫調節肽，所述免疫調節肽包含至少33氨基酸并且在N端和C端替換為4個帶正電荷的氨基酸。
[0016]WO 2009/050279描述了突變的乳鐵蛋白肽及其抗微生物的活性。
[0017]WO 2009/062898描述了精氨酸替換的乳鐵蛋白肽及其抗微生物和抗炎的活性。
[0018]發明概述
[0019]本發明涉及具有改進的抗菌和/或抗炎活性的新的肽。根據本發明所述肽的設計基于氨基酸序列SEQ ID NO:1，其對應于成熟人乳鐵蛋白的氨13至30位氨基酸。
[0020]Q-P-E-A-T-K-C-F-Q-W-Q-R-N-M-R-K-V-R (SEQ ID NO:1)
[0021 ]本發明的第一個【具體實施方式】涉及肽，所述肽至少包含如下氨基酸序列
[0022]X1-X2-X3-W-X5-R-X7-X8-X9-K-X11-X12 (SEQ ID NO:2)
[0023]其中，
[0024]Xl 是 C、L、W、K 或 R
[0025]X2 是 C、 F、K、W 或 R
[0026]X3 是 L 或 R
[0027]X5 是 L、K 或 R
[0028]X7 是 N、S、A、L、W、K 或 R
[0029]X8 是 M、W 或 S
[0030]X9 是 R 或 V
[0031]Xll 是 V、A、H、L 或 R，以及
[0032]X12 是 R、L 或 W
[0033]以及上述肽的功能等效變體。
[0034]所述肽可優選地進一步在N-端包含氨基酸W或R-W。
[0035]所述肽可優選地進一步在C-端包含氨基酸R或R-L。
[0036]優選地，根據本發明第一個實施方式所述的肽至少包含如下氨基酸序列
[0037]X1-X2-X3-W-X5-R-X7-X8-X9-K-X11-X12 (SEQ ID NO:3)
[0038]其中
[0039]Xl 是 W、K 或 R
[0040]X2 是 C、K 或 R
[0041]X3 是 L 或 R
[0042]X5 是 L 或 R
[0043]X7 是 W 或 K
[0044]X8 是 M 或 W
[0045]X9 是 R 或 V
[0046]Xll 是 V、A 或 R，以及
[0047]X12 是 R 或 L
[0048]以及上述肽的功能等效變體。
[0049]所述肽可優選地進一步在N-端包含氨基酸W或R-W。
[0050]所述肽可優選地進一步在C-端包含氨基酸R或R-L。[0051 ]更優選地，根據本發明的第一個實施方式的肽選自包含氨基酸序列選自如下的氨基酸序列的肽
[0052]C-F-L-W-R-R-L-M-R-K-L-R (SEQ ID NO:74)
[0053]C-ff-L-ff-R-R-A-M-R-K-V-ff (SEQ ID NO:76)
[0054]L-R-L-ff-R-R-L-M-R-K-V-ff (SEQ ID NO:77)
[0055]R-R-L-ff-R-R-ff-M-R-K-V-L (SEQ ID NO:78) [0056]C-R-L-ff-R-R-R-M-R-K-V-ff (SEQ ID NO:79)
[0057]L-R-L-ff-R-R-S-M-R-K-V-ff (SEQ ID NO:81)
[0058]K-K-L-ff-R-R-ff-ff-R-K-V-L (SEQ ID NO:90)
[0059]R-W-C-K-L-W-R-R-L-M-R-K-V-R-R-L (SEQ ID NO:85)
[0060]R-W-C-F-L-W-R-R-L-M-R-K-H-R-R-L (SEQ ID NO:86)
[0061]ff-C-K-L-ff-R-R-L-M-R-K-V-R-R (SEQ ID NO:87)
[0062]ff-R-R-ff-L-R-K-S-V-K-R-L (SEQ ID NO:93)
[0063]ff-C-R-ff-L-R-K-M-V-K-A-L (SEQ ID NO:94)
[0064]W-R-R-W-L-R-K-M-V-K-R-L (SEQ ID NO:95)
[0065]以及上述肽的功能等效變體。
[0066]最優選地，根據本發明的第一個實施方式所述的肽選自如下肽
[0067]C-F-L-W-R-R-L-M-R-K-L-R (SEQ ID NO:74)
[0068]C-ff-L-ff-R-R-A-M-R-K-V-ff (SEQ ID NO:76)
[0069]L-R-L-ff-R-R-L-M-R-K-V-ff (SEQ ID NO:77)
[0070]R-R-L-ff-R-R-ff-M-R-K-V-L (SEQ ID NO:78)
[0071]C-R-L-ff-R-R-R-M-R-K-V-ff (SEQ ID NO:79)
[0072]L-R-L-ff-R-R-S-M-R-K-V-ff (SEQ ID NO:81)
[0073]K-K-L-ff-R-R-ff-ff-R-K-V-L (SEQ ID NO:90)
[0074]R-W-C-K-L-W-R-R-L-M-R-K-V-R-R-L (SEQ ID NO:85)
[0075]R-W-C-F-L-W-R-R-L-M-R-K-H-R-R-L (SEQ ID NO:86)
[0076]ff-C-K-L-ff-R-R-L-M-R-K-V-R-R (SEQ ID NO:87)
[0077]ff-R-R-ff-L-R-K-S-V-K-R-L (SEQ ID NO:93)
[0078]ff-C-R-ff-L-R-K-M-V-K-A-L (SEQ ID NO:94)
[0079]W-R-R-W-L-R-K-M-V-K-R-L (SEQ ID NO:95)
[0080]以及上述肽的功能等效變體。
[0081 ]本發明的第二個【具體實施方式】涉及肽，所述肽至少包含如下氨基酸序列
[0082]X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Q-W-X11-R-X13-L-R-K-V-X18(SEQ ID NO:4)
[0083]其中
[0084]Xl 是 Q、R 或 N
[0085]X2 是 S、R 或K
[0086]X3 是 E、R 或 L
[0087]X4 是 A、R 或 F
[0088]X5 是 T、K、R、H、Q 或 E[0089]X6 是 K、T 或 S
[0090]X7 是 R、F 或 L
[0091]X8 是 F、K 或 A
[0092]Xll 是 L、R 或 A
[0093]X13是N或Q，以及
[0094]X18 是 L、R 或 A
[0095]以及上述肽的功能等效變體。
[0096]所述肽可優選地進一步在N-端包含氨基酸K-R。
[0097]所述肽可優選地進一步在C-端包含氨基酸K-R、W-W或G-P。
[0098]優選地，根據本發明的第二個實施方式的肽包含至少如下氨基酸序列
[0099]X1-S-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Q-W-X11-R-N-L-R-K-V-X18 (SEQ ID NO:5)
[0100]其中
[0101]Xl 是 Q、R 或N
[0102]X3 是 E、R 或 L
[0103]X4 是 A、R 或F
[0104]X5 是 T、K、R、Q或E
[0105]X6 是 K、T 或 S
[0106]Χ7 是 R、F 或 L
[0107]X8 是 F、K 或 A
[0108]Xll 是 L、R 或 A，以及
[0109]X18 是 L、R 或 A
[0110]以及上述肽的功能等效變體。
[0111]所述肽可優選地進一步在N-端包含氨基酸K-R。
[0112]所述肽可優選地進一步在C-端包含氨基酸K-R、W-W或G-P。
[0113]更優選地，根據本發明的第二個實施方式的肽選自包含氨基酸序列選自如下的氨基酸序列的肽
【權利要求】
1.肽，其包含至少如下的氨基酸序列X1-X2-X3-W-X5-R-X7-X8-X9-K-X11-XI2(SEQ ID NO:2)其中Xl 是 C、L、W、K 或 RX2 是 C、K、W 或 RX3是L或RX5是L、K或RX7 是N、S、A、L、W、K 或 RX8是M、W或SX9是R或VXll是V、A、H、L或R，以及X12 是 R、L 或 W以及上述肽的功能等效變體。
2.根據權利要求1所述的肽，其包含至少如下的氨基酸序列X1-X2-X3-W-X5-R-X7-X8-X9-K-X11-XI2(SEQ ID NO:3)其中Xl是W、K或RX2是C、K或RX3是L或RX5是L或RX7是W或KX8是M或WX9是R或VXll是V、A或R，以及X12是R或L以及上述肽的功能等效變體。
3.根據權利要求1所述的肽，其包含選自如下氨基酸序列的至少一種氨基酸序列C-F-L-W-R-R-L-M-R-K-L-R (SEQ ID NO:74)C-ff-L-ff-R-R-A-M-R-K-V-ff (SEQ ID NO:76)L-R-L-ff-R-R-L-M-R-K-V-ff (SEQ ID NO:77)R-R-L-ff-R-R-ff-M-R-K-V-L (SEQ ID NO:78)C-R-L-ff-R-R-R-M-R-K-V-ff (SEQ ID NO:79)L-R-L-ff-R-R-S-M-R-K-V-ff (SEQ ID NO:81)K-K-L-ff-R-R-ff-ff-R-K-V-L (SEQ ID NO:90)R-ff-C-K-L-ff-R-R-L-M-R-K-V-R-R-L (SEQ ID NO:85)R-ff-C-F-L-ff-R-R-L-M-R-K-H-R-R-L (SEQ ID NO:86)ff-C-K-L-ff-R-R-L-M-R-K-V-R-R (SEQ ID NO:87)ff-R-R-ff-L-R-K-S-V-K-R-L (SEQ ID NO:93)ff-C-R-ff-L-R-K-M-V-K-A-L (SEQ ID NO:94)W-R-R-W-L-R-K-M-V-K-R-L (SEQ ID NO:95)和上述肽的功能等效變體。
4.根據權利要求1所述的肽，其選自如下肽C-F-L-W-R-R-L-M-R-K-L-R (SEQ ID NO:74)C-ff-L-ff-R-R-A-M-R-K-V-ff (SEQ ID NO:76)L-R-L-ff-R-R-L-M-R-K-V-ff (SEQ ID NO:77)R-R-L-ff-R-R-ff-M-R-K-V-L (SEQ ID NO:78)C-R-L-ff-R-R-R-M-R-K-V-ff (SEQ ID NO:79)L-R-L-ff-R-R-S-M-R-K-V-ff (SEQ ID NO:81)K-K-L-ff-R-R-ff-ff-R-K-V-L (SEQ ID NO:90)R-W-C-K-L-W-R-R-L-M-R-K-V-R-R-L (SEQ ID NO:85)R-W-C-F-L-W-R-R-L-M-R-K-H-R-R-L (SEQ ID NO:86)ff-C-K-L-ff-R-R-L-M-R-K-V-R-R (SEQ ID NO:87)ff-R-R-ff-L-R-K-S-V-K-R-L (SEQ ID NO:93)ff-C-R-ff-L-R-K-M-V-K-A-L (SEQ ID NO:94)W-R-R-W-L-R-K-M-V-K-R-L (SEQ ID NO:95)和上述肽的功能等效變體。
5.肽，其包含至少如下的氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Q-W-X11-R-XI3-L-R-K-V-XI8(SEQ ID NO:4)其中Xl是Q、R或NX2是S、R或KX3是E、R或LX4是A、R或FX5 是 T、K、R、H、Q 或EX6是K、T或SX7是R、F或LX8是F、K或AXll 是 L、R 或 AX13是N或Q，以及X18 是 L、R 或 A和上述肽的功能等效變體。
6.根據權利要求5所述的肽，其包含至少如下氨基酸序列X1-S-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Q-W-X11-R-N-L-R-K-V-X18 (SEQ ID NO:5) 其中Xl是Q、R或NX3是E、R或LX4是A、R或FX5 是 T、K、R、Q 或 EX6是K、T或SX7是R、F或LX8是F、K或AXll是L、R或A，以及X18 是 L、R 或 A和上述肽的功能等效變體。
7.根據權利要求5所述的肽，其包含選自如下氨基酸序列的至少一種氨基酸序列
8.根據權利要求5所述的肽，其選自如下肽
9.根據權利要求1到8中任一項所述的肽，其中羧基末端的自由COOH已轉化為C0NH2。
10.根據權利要求1到8中任一項所述的肽，其中氨基末端的自由NH2基團已轉化為酰胺 CH3COML
11.根據權利要求1到8中任一項所述的肽，其中氨基酸Cys，如果存在，已被乙酰胺基甲基半胱氨酸替換。
12.包含根據權利要求1到11中任一項所述的肽的藥物組合物。
13.包含根據權利要求12所述的藥物組合物，用于治療和/或預防感染、炎癥、腫瘤、疼痛、傷口和傷疤。
14.根據權利要求13所述的藥物組合物，用于治療、防治和/或預防的膿皰瘡、燒傷傷口、被感染的擦傷、被感染的撕裂傷、表皮脫落、丹毒、蜂窩組織炎、膿腫、癤、癰、被縫合固定的傷口、外科手術部位感染，二次感染皮膚病:特應性皮炎、銀屑病、過敏性接觸性皮炎、動物咬傷、導管相關感染。
15.根據權利要求12到14中任一項所述的藥物組合物，配制成用于口服施用、全身性施用、非腸道施用 、局部施用或外部施用。
16.包含根據權利要求1到11中任一項所述的肽的食品。
17.根據權利要求1到11中任一項所述的肽，用作藥劑。
18.根據權利要求1-11中任一項所述的肽，用于治療和/或預防感染、炎癥、腫瘤、疼痛、傷口和傷疤。
19.根據權利要求18所述的肽，配制成用于口服施用、全身性施用、非腸道施用、局部施用或外部施用。
【文檔編號】C07K14/79GK103459419SQ201280006526
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年1月25日 優先權日:2011年1月26日
【發明者】M·馬拉普, C·比約恩, V·舍斯特蘭德, B·瓦爾澤, B·斯文松 申請人:佩加馬公司