衍生自人bplp蛋白的肽、編碼所述肽的多核苷酸和針對所述肽的抗體的制作方法

專利名稱：衍生自人bplp蛋白的肽、編碼所述肽的多核苷酸和針對所述肽的抗體的制作方法
衍生自人BPLP蛋白的肽、編碼所述肽的多核苷酸和針對所述肽的抗體本申請是申請日為2005年03月18日的申請號為200580015689.4標題為“衍生自人BPLP蛋白的肽、編碼所述肽的多核苷酸和針對所述肽的抗體”的申請的分案申請本發明涉及BPLP蛋白所衍生的作為新的金屬外肽酶抑制劑的肽。本發明也涉及編碼所述肽的多核苷酸以及涉及針對所述肽的抗體。此外，本發明涉及人BPLP蛋白、其所衍生的肽及其模擬物、編碼人BPLP蛋白或其所衍生的肽的多核苷酸以及針對BPLP蛋白或其所衍生的肽的抗體的診斷性和治療性的用途。在基因組研究中，已經鑒定出了一種主要在成熟大鼠的頜下腺(SMG)和前列腺中表達的受雄激素調節的基因(Rosinsk1-Chupin等，1988和歐洲專利0394424)。基因編碼前體蛋白頜下腺大鼠:蛋白(submandibular rai^protein, SMR1),其生成了三種結構上相關的肽，通過與成對堿 性氨基酸轉化酶(pairedbasic amino acid-converting enzyme)對前體蛋白中的多個堿性位點的裂解可以在體內選擇性地生成所述肽(Rougeot等，1994)。在后基因組和生命組學的研究中，已經發現了為哺乳動物體內存在進行細胞間聯絡的激素信使(即從SMRl前激素原所生成的最終的成熟肽，現在稱作為Sialorphin (序列QHNPR))提供證據的分子及功能基礎。因此，在雄鼠中，Sialorphin是一種外分泌的和內分泌的肽信號，它的表達受活化作用的雄激素的調控，并且其的分泌是受應答于環境應激的雄激素介導的應答所誘發的(Rougeot等，1997)。在性成熟的雄鼠中，事實是應答于環境急性應激而急性地分泌受雄激素調節的Sialorphin，這就形成了一種假說，即該信號傳導介質可能在一些與生殖有關的生理和行為整合中起到了一定的作用。因此，相同的作者研究了 Sialorphin在雄性性行為模式方面所誘導的影響，其包括發動交配、插入和射精的頻率及潛伏期、以及社會-性(socio-sexual)的交互作用。所獲得的數據顯示Sialorphin具有在與生理循環水平相關的劑量上調控雄鼠的交配模式的能力，即以劑量依賴性模式實現了對性行為的雙重的促進/抑制作用，雖然在所有的劑量上都能刺激表觀的性喚醒或沖動。因此，提出了受內源性雄激素調節的Sialorphin有助于調控作用于適當的雄鼠性應答的刺激和抑制機制之間的平衡，這依據于背景情況。國際專利申請WO 01/00221描述了 SMRl的成熟產物用于治療人際關系和行為障礙性疾病的用途，所述疾病包括性障礙。此外，這些作者發現SMRl成熟產物識別器官上的特異的靶向位點，這與礦物質離子濃度緊密相關。國際專利申請WO 98/37100描述了 SMRl的成熟產物用于預防或治療與人體內的或動物體內的金屬離子失衡相關的疾病的用途。作為對應激性背景的應答，Sialorphin被急性釋放、快速分布并被其全身性的膜相關祀點持續地攝取(Rougeot等，1997)。作者已經證實Sialorphin在體內所結合的主要細胞表面分子是膜錨定的金屬外-內肽酶NEP (神經內肽酶、Mprilysin EC 3.4.24.11)、或腦啡肽酶(Rougeot et 1.，2003)。此外，Sialorphin表現出是NEP活性的體外的生理拮抗劑；在利用可溶性的純化的腎NEP和人工的產熒光的DGNPA(Dansyl-Gly-(pN02)Phe- β Ala)作為底物的體外檢測法中所測定到的NEP和Sialorphin之間的直接的相互作用為Sialorphin抑制NEP活性(Sialorphin的IC50為0.6 μ M)提供了直接證據。Sialorphin是至今在嚙齒類動物中所鑒定到的第一個NEP-腦啡肽酶活性的生理抑制劑(Rougeot等，2003和歐洲專利申請EP 1216707)。NEP位于神經組織和全身組織的細胞表面，其中它起到了作為外酶的重要功能，即催化大量神經肽和調節肽的分泌后加工或代謝。NEP的主要的生理相關底物是腦啡肽、P物質和心房利鈉肽(ANP)。這些哺乳動物信號肽主要涉及中樞性和周圍性痛覺、炎癥現象、動脈張力和礦物質穩態的調節。從生理的以及生理病理的和治療的觀點看，它們的生理重要性以及NEP外酶在調控其功能效力中的關鍵作用使得通過內源性抑制物來研究并獲知它們的可能的保護作用是重要的。通過使用不同的分子和行為藥物學的模型，作者已經顯示出生理介質Sialorphin在體外能阻止脊髓和腎臟的NEP降解其兩種生理相關底物(P物質和甲硫氨酸腦啡肽)。Sialorphin抑制P物質降解的IC5tl值為0.4-1 μ Μ,并具有源自神經組織(脊髓)或源自全身組織(腎臟、骨、牙齒、胎盤、前列腺、GSM、腸)的膜結合性NEP的競爭性抑制物的作用。在體內，靜脈內Sialorphin在兩種損傷誘導的急性和張力性疼痛的行為鼠模型(針刺痛覺測試(機械性痛覺)和福爾馬林測試(化學性痛覺))中都能引發出了強的抗傷害應答。Sialorphin所誘導的鎮痛作用要求激活μ和δ阿片受體，這與腦啡肽能轉運過程中要涉及到內源性阿片受體相一致。事實上，這些受體參與了內源性阿片能信號例如腦啡肽(NEP和氨肽酶APN可以滅活這些腦啡肽)以及外源性阿片例如嗎啡(主要與μ阿片受體相互作用)的轉運。結論是，Sialorphin通過在體內抑制外-腦啡肽酶而保護了在傷害性刺激之后所釋放出的內源性腦啡肽，并因此強化了它們的鎮痛作用。另外，內源性阿片系統(具體地是S-阿片介導的途徑)也與抑郁行為的發生有關，例如通過使用分析絕望行為的模型(強迫游泳試驗)，作者表明Sialorphin在雄鼠中展示出了明顯的抗抑郁活性。Sialorphin是至今在哺乳動物中所鑒定出的NEP活性的第一個天然的具有全身活性的調節劑。此外 ，還提供了它作為損害后痛覺的新的生理調控劑、以及可能作為假定的新的抗傷害劑和抗抑郁劑的新型治療分子的前體的證據(Rougeot等，2003,EP I, 343，519和EP 1,343,520)。Sialorphin的強鎮痛作用與其完全阻止了腦啡肽降解酶對腦啡肽的滅活有關。在體內，兩種外肽酶NEP和APN都以極高的效率(在數秒鐘內)滅活腦啡肽。與此相一致的是，第一個開發出的合成抑制劑僅僅是NEP特異的(例如Thiorphan)或者是APN特異的(例如Bestatin)抑制劑。它們只表現出不明顯的或弱的抗傷害作用。因此,大鼠Sialorphin是NEP和APN金屬外肽酶NEP和APN的生理的雙重抑制劑，此外，這個對應激有著適應性應答的內分泌性信號信使是鼠痛覺的強抑制劑，并且它的鎮痛作用比合成的雙重ΝΕΡ/ΑΡΝ抑制劑(例如Kelatorphan，通過造型方法所開發出的抑制劑)的鎮痛作用更強。所以，從特異性和生物可利用性上看，Sialorphin非常適合于其靶點的構象的和分布的特征，因此從一體化的觀點看，它是更為有效的。結合這些觀察，從功能性的和生理病理的以及治療的觀點看，鼠Sialorphin所調節的功能的生物學重要性使得研究和鑒定出人體內的鼠Sialorphin的內源性功能類似物是非常關鍵的。Sialorphin是唯--種在哺乳動物中所能鑒定出的膜結合的腦啡肽酶活性的生理性具有全身活性的調節劑。這就提出了在人體唾液和血液中是否存在著這樣的內源性NEP-外肽酶的抑制劑。利用高敏感性和特異性的放射免疫檢測法在男性人體唾液中檢測到了無免疫反應性的QHNPR肽(Sialorphin) (Rougeot等，1994)。但是,綜合的數據使得我們推測在人體內(特別是在人唾液內)存在著抑制NEP外肽酶活性的低分子量物質(^ 3000Da) 0盡管沒有生化表征出這種(這些)唾液組分，但是在這種(這些)人腦啡肽降解外酶的抑制物的唾液生成上觀察到了性別相關的差異(Marini and Roda，2000)。令人驚訝的是，這種情況非常類似于發明者在雄鼠中所鑒定到的情況，其中頜下腺和唾液分別代表著Sialorphin的主要合成和分泌的部位。編碼Sialorphin的SMR1前體的基因屬于多基因家族，在人體中已經鑒定出了該家族的成員。但是，在人體中還沒有發現與鼠SMRl基因(編碼SMRl的VCSA1)同源的人類基因stricto sensu (cDNA克隆和人基因組分析)。此外,存在著鼠Sialorphin抗膜錨定的人NEP (人前列腺細胞株(LNCaP)所表達的)的抑制效力，但是比在抗嚙齒類動物NEP (鼠、兔)所獲得的效力要低約10倍。考慮到鼠和人NEP具有相當高的氨基酸序列的類似性(約85%)的事實，鼠Sialorphin和NEP外酶之間的功能相互作用中的表觀選擇性至少是令人驚訝的。另外，編碼鼠Sialorphin的前體(SMRl)的基因所屬的多基因家族中的人類基因的特征顯示出在人體內存在著該家族的一些基因，其中已經表征出了三種基因即基因hPB、hPBI和BPLP，它們簇集在相同的染色體區域(即第4號染色體的ql3_21區)(Isemura，2000)(Isemura and Saitoh, 1997)(Dickinson and Thiesse, 1996)。本發明者現在已經鑒定出了新的肽，其被認為是SMRl-五肽Sialorphin的功能性的人類類似物。本發明者所收集到的大量數據都支持新肽(序列QRFSR)源自BPLP蛋白(“堿性富腦氨酸淚液蛋白(Basic Prolin-rich Lacrimal Protein)”)。

從Dickinson 等(Dickinson and Thiesse, 1996)所克隆并表征到的 cDNA 中可以預測出編碼201個氨基酸(具有潛在的分泌信號肽)的多肽序列的人類基因BPLP。人淚腺和頜下腺都表達基因BPLP。在所附的序列表中，SEQ IDN0.1表示編碼BPLP的cDNA序列，SEQ ID N0.2表示BPLP的氨基酸序列。本發明者依據對來自SMRl前體的鼠Sialorphin的成熟加工處理可以確定分泌型BPLP蛋白的最保守的N末端區(大鼠、小鼠和人之間)中的共同位點。例如，這些共同位點被確定為具有信號肽酶所需序列的區域中的信號肽裂解位點，以及在具有R-R鍵的成對堿性殘基上的共同位點被識別為成對堿性氨基酸轉化酶的加
工處理信號。在這些共同位點上，本發明者已經找到了結構上與大鼠QHNPRSialorphin緊密相關的序列QRFSR。合成該肽，并分析了其抑制生理性NEP底物(即P物質)的降解的能力。然后該肽被鑒定為Sialorphin的人類的功能類似物。本發明將人BPLP蛋白衍生的肽作為新的金屬外肽酶的抑制劑。更具體地，本發明涉及BPLP蛋白的成熟產物，特別是QRFSR肽以及其肽衍生物和模擬物，所述肽及其衍生物和模擬物能增強神經內分泌肽信使的作用，所述信使控制疼痛的傳遞(例如腦啡肽)、健康和/或Na/Pi/Ca/H20的主要的穩態交換(例如利鈉肽)。
本發明也涉及編碼所述肽和肽衍生物的多核苷酸，以及涉及針對所述肽或其肽衍生物的抗體。此外，本發明涉及人BPLP蛋白、人BPLP蛋白衍生的肽、和其肽衍生物及模擬物的診斷性和治療性用途，以及編碼人BPLP蛋白、人BPLP蛋白衍生的肽和其肽衍生物及模擬物的多核苷酸以及針對人BPLP蛋白、人BPLP蛋白衍生的肽和其肽衍生物的抗體的診斷性和治療性用途。應當明白本發明的肽、蛋白、或核酸是分離的或純化的形式。當指的是蛋白或肽(包括抗體)或核苷酸序列時，“純化的和分離的”意味著所指示的分子基本上不和其它的生物分子一起存在。術語“純化的”在此優選地表示存在至少75%重量的相同類型的生物分子,更優選地至少85%重量、仍更優選地至少95%重量、以及最優選地至少98%重量。“分離的”或“純化的”編碼特殊多肽的核酸分子指的是基本上不含其它不編碼目標多肽的核酸分子的核酸分子。但是，所述分子可以包括一些不會負面地影響組合物的基本特征的附加堿基或部分。肽對于本發明的目的，“肽”是一種由經肽鍵彼此線性排列連接的氨基酸殘基的線性陣列所構成的分子。這些線性陣列可以任選地是環狀的，即例如通過化學鍵可以連接線性肽的末端或肽內的氨基酸的側鏈。本發明的這些肽可以包括從約3個到約500個氨基酸，優選地從約3個到100個氨基酸，以及更優選地從約3個到約50個氨基酸，特別是從約3個到15個氨基酸，并且還可以包括二級、三級或四級結構以及與其它肽或其他非肽分子的分子間結合。這些分子間的結合可以是通過，但不限于，共價鍵(例如通過二硫鍵)、或通過螯合、靜電相互作用、疏水性相互作用、氫鍵、離子偶極相互作用、或上述的任何組合。在這些肽中，通過N末端的環化/去環化，可以互換Glp和Gin。本發明的一個目的是肽，其衍生自人BPLP蛋白，并且對金屬外肽酶具有調節活性，特別是抑制活性。“衍生自人BPLP蛋白”表示其包括BPLP蛋白片段、或基本上由BPLP蛋白片段構成、或由BPLP蛋白片段構成。在優選的實施方式中，所述肽是由3到約150個氨基酸構成。最優選地，所述肽是由少于100個氨基酸構成。具體地，本發明的一個目標是BPLP蛋白的成熟產物及其肽衍生物。更具體地，本發明涉及肽，所述肽是堿性富脯氨酸淚液蛋白(BPLP)的成熟產物或所述成熟產物的肽衍生物，其中肽或肽衍生物表現出對金屬外肽酶(優選地是NEP和/或APN，以及更優選地是NEP)的抑制性能。“成熟產物”是經天然成熟酶或激素原轉化酶或相關的單個或成對堿性氨基酸裂解酶(例如furin、PC轉化酶或例如PACE4(Seidah，1995))對BPLP蛋白前體的裂解所得到的肽。本發明的肽包括“肽衍生物”。“肽衍生物”是具有對親本肽的氨基酸取代的肽，優選地具有對親本肽的一個到兩個氨基酸取代，特別是當所述親本肽含有少于15個氨基酸，以及優選地含有少于10個氨基酸，但是其仍保留了親本肽的結合特異性和/或生理學活性。 “保留親本肽的結合特異性”在此表示能與單克隆的或多克隆的能與BPLP成熟產物中的一種或BPLP成熟產物受體結合的抗體結合，其親和力至少是作為BPLP成熟產物的一種肽的親和力的十分之一，更優選地至少是一半，以及更優選地至少相同。優選地在標準的競爭性結合免疫檢測條件下實施對這些親和力的測定。“保留親本肽的生理學活性”表示保留了任一 BPLP成熟產物結合并調控金屬外肽酶(具體地是NEP和/或APN，更具體地是NEP)，據此優化局部的和全身的疼痛、炎癥、抗抑郁、和/或對應激的離子內環境穩態應答的能力。在本說明書的下文中，更詳細地描述了對是否調控了這些活性的測定。本發明的肽包括肽或肽衍生物，其包括序列Xl-X2-Arg-Phe-Ser_Arg、基本上由序列 Xl-X2-Arg-Phe-Ser_Arg 構成、或由序列 Xl-X2-Arg-Phe-Ser_Arg 構成。其中,Xl 代表 H原子或Tyr氨基酸，X2代表Gln或Glp (當Xl是H時)，或者X2代表Gln (當Xl是Tyr或Cys時)。當本發明的肽包括或基本上由序列Xl-X2-Arg-Phe-Ser-Arg構成時,所述序列是本發明的肽的C末端部分。本發明的優選的肽包括序列QRFSR，基本上由序列QRFSR構成，或由序列QRFSR構成。更具體地，本發明的肽是由序列QRFSR(SEQ ID N0.3)構成的肽。本發明的另一種 肽是由序列YQRFSR(SEQ ID N0.4)構成的肽。本發明的仍另一種肽是由序列CQRFSR構成的肽。在全文中，Glp是焦谷氨酸；Tyr或Y是酪氨酸；Gln或Q是谷氨酰胺；Arg或R是精氨酸；Phe或F是苯丙氨酸；Ser或S是絲氨酸；Cys或C是半胱氨酸。通過在液相或固相中的經所需整合的不同氨基酸殘基的連續連接(在液相中從N末端到C末端，或者在固相中從C末端到N末端)的肽合成，用常用方式制備出了本發明的肽，其中用常用基團預先封閉了 N末端和反應性側鏈。對于固相合成而言，具體地可以使用Merrifield所述的技術。或者，也可以使用Houbenweyl在1974年所述的技術。更多的細節可以參考WO 98/37100。利用遺傳工程方法也可以獲得本發明的肽。優選的模擬物(包括肽模擬物)保留了如上所述的親本肽(包括肽衍生物)的結合特異性和/或生理學活性。“模擬物”在此是模擬了天然肽的一些性能(優選地是其結合特異性和生理學活性)的分子。通過對本發明的肽的結構修飾獲得了優選的模擬物，優選地使用非天然的氨基酸、D氨基酸取代L氨基酸、構象限制、電子等排取代、環化作用、或其它修飾。其它優選的修飾包括，但不限于那些其中用非酰胺鍵取代一個或多個酰胺鍵、和/或其中用不同的化學部分取代一個或多個氨基酸側鏈、或其中用保護基團保護了 N末端、C末端中的一個或多個末端或一個或多個側鏈，和/或其中往氨基酸鏈中引入雙鍵和/或環狀作用和/或立體特異性以增加剛性和/或結合親和力的修飾。
根據本發明的肽所靶向的金屬外肽酶的結合區的晶體結構，用計算機輔助藥物設計開發系統也可以得到模擬物(Oefner等(2000) ; Gomeni等(2001) ; Jones等(2002);Kan (2002))ο仍其它優選的修飾包括那些打算增強對酶降解的抗性、提高特別是神經和性腺組織的生物利用度以及更普遍地改善藥物代謝動力學性能的修飾，其特別包括:一通過親脂醇的酯化作用(COOH)或通過酰胺化作用(COOH)和/或乙酰化作用(NH2)或在NH2末端添加羧烷基或芳香族的疏水鏈保護NH2和COOH親水基團；— CO-NH酰胺鍵的反向倒位異構體或酰胺功能團的甲基化作用(或酮亞甲基、甲氧基、輕乙稀基)；— L氨基酸對D氨基酸的取代。所有的這些變體在本領域都是已知的。因此，給定在此所述的肽序列，本領域人員能設計并生成具有與這些性能類似的或更優越的結合特征和/或生理學活性的模擬物(見例如，Horwell 等，(1996)、Liskamp 等，(1994)、Gante 等，(1994)、Seebach 等，(1996))。術語“BPLP肽”在此指的是本發明的BPLP蛋白、衍生于BPLP的肽、BPLP成熟肽、和肽衍生物及模擬物(包括肽模擬物)。本發明 也涉及分子復合物，其包括:一金屬外肽酶受體、特別是NEP受體或APN受體、特別是NEP受體的BPLP蛋白或其成熟產物(例如QRFSR)的結合位點；-BPLP蛋白或其成熟產物，例如QRFSR。核酸、表達方法和檢測方法當考慮到遺傳密碼的簡并性時，編碼如上定義的肽(包括肽衍生物)的核酸(也稱作多核苷酸)例如DNA或RNA分子也是本發明的一部分。因此，本發明提供了編碼衍生自人BPLP蛋白的肽及其肽衍生物的核酸。具體地，本發明提供了編碼肽的核酸，所述肽包括如上定義的序列Xl-X2-Arg-Phe-Ser~Arg> 基本上由序列 Xl-X2-Arg-Phe-Ser-Arg 構成、或由序列
Xl-X2-Arg-Phe-Ser_Arg構成。當本發明的肽包括或基本上由序列Xl-X2-Arg-Phe-Ser_Arg構成時，所述序列是本發明的肽的C末端部分。在優選的實施方式中，本發明提供了編碼肽的核酸，所述肽包括序列QRFSR、或基本上由序列QRFSR構成、或由序列QRFSR構成。在最優選的實施方式中，本發明提供了編碼QRFSR的核酸或編碼YQRFSR的核酸。本發明的核酸包括在標準的雜交條件(優選地為高嚴格性條件)下可雜交于任一上述序列或其互補序列的序列。當單鏈形式的核酸分子能在合適的溫度和溶液離子強度的條件(見SambiOOk等，1989)下與其它核酸分子退火在一起時，認為核酸分子“可雜交于”另一種核酸分子。溫度和離子強度的條件確定了雜交的“嚴格性”。對于初篩同源核酸，可以使用對應于Tm(解鏈溫度)為55°C的低嚴格的雜交條件，例如是5xSSC、0.1%SDS、0.25%奶粉、以及沒有甲酰胺；或者是30%甲酰胺、5x SCC、0.5%SDS。中等嚴格的雜交條件對應于更高的Tm，例如40%甲酰胺和5x或6x SSC0高嚴格的雜交條件對應于最高的Tm，例如50%甲酰胺、5x或6x SCC0SCC是0.15M NaCl、0.015M檸檬酸鈉。雜交還需要兩種核酸含有互補序列，盡管依賴于雜交的嚴格性，堿基之間的錯配是可能的。雜交核酸的合適的嚴格性依賴于核酸的長度以及互補的程度，變異在本領域是公知的。兩個核苷酸序列之間的相似性或同源性的程度更大，具有這些序列的核酸分子的雜交的Tm值就更高。核酸雜交的相對穩定性(對應于更高的Tm)依照下面的次序減低:RNA: RNA、DNA: RNA、DNA:DNA。對于長度超過100個核苷酸的雜交，已經得到了計算Tm的公式(見SambiOOk等，見上，9.50-9.51)。對于更短核酸(即寡核苷酸)的雜交，錯配的位點變得更為重要，并且寡核苷酸的長度決定了其特異性(見SambiOOk等，見上，11.7-11.8)。可雜交核酸的最小長度為至少約10個核苷酸，優選地至少約15個核苷酸。在特異的實施方式中，術語“標準雜交條件”指的是Tm為55V，并使用上面所設定的條件。在優選的實施方式中，Tm是60°C。在更優選的實施方式中，Tm是65°C。在特異的實施方式中，“高嚴格性”指的是在68°C、0.2x SSC下，在42°C、50%甲酰胺、4x SSC下，或者在賦予等價于那些在這兩種條件下所觀察到雜交水平的條件下的雜交和/或洗滌條件。本發明還涉及用于克隆和/或表達的包括本發明的核酸序列的載體，以及涉及包括本發明的核酸或所述載體的宿主細胞，即其中轉移了其中至少一種載體的宿主細胞。本發明的表達載體包括編碼本發明的肽(包括肽衍生物)或蛋白的核酸序列，所述核酸序列與容許其表達的元件可操縱地連接。所述載體優選含有啟動子序列，用于啟動和終止翻譯的信號、以及調節翻譯的合適區域。其在宿主細胞內的插入可以是臨時的或穩定的。所述載體也可以含有用于分泌所翻譯蛋白的特異信號。根據宿主細胞可以選擇出這些不同的信號，并且可以將其插入到在所選宿主細胞內能自我復制的載體內，或插入到可以整合到所述宿主的基因組內的載體內。宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞，包括但不限于細菌、酵母菌、植物細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞，包括商品化可獲得的細胞株。宿主細胞的優選實例是COS-UHEK細胞、293細胞或CHO細胞。本發明的一個目的也是用于生成重組BPLP肽的方法，其中用所述表達載體轉染所述宿主細胞，并且在容許 BPLP肽表達的條件下培養所述宿主細胞。利用任何標準技術例如電穿孔或磷酸I丐沉淀或脂染 可以進行對宿主細胞的轉染。然后用熟知的純化方法可以收集并純化蛋白或肽:用方法例如HPLC色譜法、特異抗體的免疫親和技術等可以從裂解液或細胞提取液、從培養基的上清液中純化出重組肽或蛋白。本發明還涉及體外預測和/或診斷的方法，其中用本發明的核酸序列或衍生于此的探針或引物檢測異常合成，包括異常的高合成或低合成，或BPLP基因水平上的遺傳異
堂
巾O本發明因此提供了用于預測和/或診斷涉及BPLP或它的任一成熟產物的產生的改變的病變，所述方法包括檢測測試對象的生物學樣品中的BPLP基因或其轉錄物的質量和/或數量的異常。術語“預測”指的是確定或確認發生疾病或病變的可能性。本發明更具體地涉及檢測BPLP基因的異常的方法，其包括以下步驟:一在容許生物學樣品中所含的DNA與引物雜交的條件下，將含有DNA的生物學樣品與容許擴增全部或部分BPLP基因的特異的寡核苷酸接觸，其中已經使得樣品中所含的DNA成為可接近的，適當時是可雜交的；
一擴增所述DNA ;一檢測擴增產物；一將所得到的擴增產物與用正常對照的生物學樣品所得到的擴增產物進行比較，據此檢測出BPLP基因中的可能的異常。本發明的方法也被應用于檢測BPLP基因的轉錄物中的異常，通過例如用RT-PCR擴增出生物學樣品中所含由的mRNA。因此，本發明的另一個目的是用于檢測BPLP轉錄物中的異常的方法，如先前所定義的，其包括步驟:一從生物學樣品中所含的mRNA中生成cDNA ；一在容許引物與所述cDNA雜交的條件下，將所述cDNA與容許擴增所有或部分BPLP基因的轉錄物的特異寡核苷酸接觸；—擴增所述cDNA；一檢測擴增產物；一將所得到的擴增產物與用正常對照的生物學樣品所得到的擴增產物進行比較，據此檢測出BPLP基因轉錄物中的可能的異常。從生物學樣品中所獲得的擴增產物與從正常生物學樣品中所獲得的擴增產物之間的這種比較是定量的比較和/或定性的比較。在后一種情況中，例如通過特異探針雜交、通過測序或通過限制性 位點分析可以實施比較。本領域技術人員非常清楚地知道用于分析生物學樣品所含有的DNA以及用于診斷遺傳疾病的方法。可以得到多種進行基因型分析的策略。優選地，可以用DGGE方法(變性梯度凝膠電泳)、或SSCP方法(單鏈構象多態性)檢測BPLP基因中的異常。優選地，緊跟在這些方法之后的是直接測序。可以優先用RT-PCR法檢測BPLP轉錄物中的異常，因為它能觀察到剪切突變例如外顯子跳躍或隱含位點的激活所造成的混亂剪切的后果。同樣，在該方法之后的是直接測序。最近開發的利用DNA芯片的技術也可以被優先地應用于檢測BPLP基因中的異常。用于檢測BPLP基因或其轉錄物中的異常的這些方法特別適用于鑒定造成無功能的BPLP蛋白或成熟產物的突變，以及優先地適用于體外預測和/或診斷疾病，其中所述疾病涉及BPLP基因。這些疾病的實例是在“治療應用”章節中所引用的疾病。抗體和檢測方法本發明還提供了特異地針對(即特異性識別)BPLP蛋白的抗體。本發明還提供了特異地針對(即特異性識別)上面所述的肽(包括肽衍生物)的抗體。因此，本發明提供了針對衍生自人BPLP蛋白的肽及其肽衍生物的抗體。更具體地，本發明提供了針對肽的抗體，所述肽包括如上定義的序列Xl-X2-Arg-Phe-Ser~Arg> 基本上由序列 Xl-X2-Arg-Phe-Ser-Arg 構成、或由序列Xl-X2-Arg-Phe-Ser_Arg構成。當本發明的肽包括或基本上由序列Xl-X2-Arg-Phe-Ser_Arg構成時，所述序列是本發明的肽的C末端部分。在優選的實施方式中，本發明提供了針對(即特異性識別)肽的抗體，所述肽包括序列QRFSR、或基本上由序列QRFSR構成、或由序列QRFSR構成。在最優選的實施方式中，本發明提供了針對(即特異性識別)QRFSR的抗體或針對(即特異性識別)YQRFSR的抗體或針對(即特異性識別)CQRFSR的抗體。不同形式的術語“抗體”在此指的是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫學活性部分，即含有抗體結合位點或互補位的分子。示例的抗體分子是完整的免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的一部分，包括本領域已知的部分例如 Fab、Fab’、F (ab，)2 和 F (V)。抑制BPLP成熟產物或其肽衍生物與其受體的相互作用的抗體是特別有用的。雖然可以使用多克隆抗體，但是優選地使用單克隆抗體，因為它們在長期的使用中具有更高的可重復性。用于生成多克隆抗體的方法也是公知的。一般地，通過給新西蘭白兔皮下施用本發明的蛋白或肽(包括綴合肽)可以生成這些抗體，所述白兔先前已經被放血以便獲得免疫前血清。可以在十個不同的部位或者至少5個不同的部位，注射每個部位總體積為50 μ I的抗原。然后在首次注射后5周，給兔子放血，并且根據免疫應答的質量，每6周給兔子皮下施用比初次注射的最大量低5倍濃度的相同抗原進行定期強化3次。然后在強化后的每10天收集血清樣品。然后利用相應的捕獲抗體的抗原，通過親和色譜法從血清中回收多克隆抗體° 在 Ε.Harlow, et.al.，editors, Antibodies: A Laboratory Manual, ColdSpringHarbor Laboratory, New York(1988)中闡述了這種用于生成多克隆抗體的方法和其它方法。不同語法形式的“單克隆抗體”指的是僅含有一種能與特殊表位免疫反應的抗體結合位點的一群抗體分子。單克隆抗體因此常常表現出與其所免疫反應的任一表位的單一的結合親和力。單克隆抗體因此可以含有具有多個抗體結合位點的抗體分子，每個結合位點免疫特異于不同的表位(即雙特異的單克隆抗體)。用于制備單克隆抗體的實驗室方法在本領域是公知的(見，例如Harlow等，見上)。通過免疫哺乳動物例如小鼠、鼠、兔、山羊、人等可以制備針對純化BPLP蛋白、BPLP成熟產物或其肽衍生物(包括 綴合的BPLP肽)的單克隆抗體(Mab)。分離出免疫哺乳動物體內的產抗體的細胞，并將其與骨髓瘤或異骨髓瘤細胞融合，以便生成雜交細胞(雜交瘤)。產單克隆抗體的雜交瘤細胞被當作所需單克隆抗體的來源。雖然用雜交瘤培養可以生成Mab，但是本發明并不受此限制。也預期的是通過表達從雜交瘤中克隆到的核酸所產生的Mab的用途。即，表達雜交瘤所分泌的分子的核酸可以被轉移到另一種細胞株內，以生成轉化體。轉化體在基因型上不同于最初的雜交瘤，但是它也能生成本發明的抗體分子，包括整個抗體分子的免疫活性片段，其對應于雜交瘤所分泌的分子。另外，文獻提供了形成嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體等基于基礎的免疫反應性抗體片段的變體的方法。所有的這些都被認為是在本發明的范圍之內，并被作為一種類型，闡述并要求了抗體的特異性，無論本領域人員所能構建出的精確的變異結構。本發明還涉及一種用于體外診斷、預測或確定病變的進展的方法，所述病變涉及BPLP或它的任一成熟產物的產生的改變(即產生比對照對象減少或增加)。方法包括檢測或定量測試對象的生物學樣品中的BPLP蛋白或其成熟產物(特別是QRFSR)，并將其與對照對象的生物學樣品中的相同物質進行比較。這些病變的實例是在“治療性應用”章節中所提到的疾病。“生物學樣品”是對象的一種液體，包括血清、血液、脊髓液、腦脊液、尿液、乳汁、唾液或組織提取物，或者是組織或器官活檢例如腦、脊髓、骨組織、腎臟、前列腺、胎盤、牙組織、胃的腺體粘膜、腸、唾液腺組織、乳腺等。“對象”或“患者”是脊椎動物，例如哺乳動物，優選地是人，不論其年齡、性別和一般狀況。也包括兒童和嬰兒。測試對象可以沒有癥狀，可以被認為可能發生疾病或病變。也可以測試被懷疑患有靶疾病的對象或者已經顯示出疾病或病變的癥狀的對象。“對照對象”可以是健康對象或沒有任何表觀疾病的對象，所述疾病可以涉及BPLP蛋白或其成熟產物中的一種。為了確定涉及BPLP或其成熟產物中的一種的病變的進展，測試對象的BPLP蛋白或其成熟產物的表達以及通過例如在數周之后第二次測試對象來監視藥物的療效或病變的播散都是特別有用的。對于第二個測試結果與第一次測試結果比較，以及一般也就是與在“健康”對象中所得到的結果的比較的情況。“對照對象”指的是相同的測試對象或者指的是“健康對象”。術語“診斷”指的是確定或確認對象體內的疾病或病變。術語“預測(prognosis) ”指的是確定或確認生成疾病或病變的可能性。通過檢測BPLP蛋白或其成熟產物可以確定“BPLP蛋白或其成熟產物的表達或產
生”。 這些檢測方法包括將生物學樣品與能選擇性地與樣品中所含有的BPLP蛋白或其成熟產物(特別是QRFSR)相互作用的結合伴侶接觸。結合伴侶通常是抗體，其可以是多克隆或單克隆抗體，優選地是單克隆抗體。用于生產如上所述的基于治療的抗體的方法也可以被輕易地適用于生成能用于本發明的診斷或預測方法中的抗體。例如，通過將生物學樣品與特異性識別BPLP蛋白的抗體或者特異性識別其成熟產物(特別是QRFSR)的抗體一起孵育可以檢測出BPLP蛋白或它的任一成熟產物、或蛋白的成熟形式或成熟產物的存在或產生，例如使用標準的電泳或液體的或固體的免疫診斷技術，其包括免疫檢測法例如競爭型、直接反應型、或三明治型檢測法。這些檢測法包括，但不限于Western印跡法、凝集試驗、酶標記的和介導的免疫檢測法例如ELISA、生物素/抗生物素蛋白型檢測法、放射免疫檢測法例如利用放射性碘標記的或氚標記的BPLP蛋白或它的任一成熟產物(特別是QRFSR)的免疫檢測法、免疫電泳、免疫沉淀等。反應通常包括顯示標記例如熒光、化學發光、放射性、酶標記或染料分子、或其它用于檢測抗原和與之反應的抗體之間的復合物的形成的方法。前面所提及的檢測法通常涉及將未結合的BPLP蛋白或它的未結合的成熟產物(特別是未結合的QRFSR)與和固定于固相中的特異抗體相結合的BPLP蛋白或成熟產物(特別是QRFSR)分離開。可以用于本發明實踐的固相支持物包括支持物例如硝基纖維素(例如膜或微量滴定孔形式)、聚氯乙烯(例如片或微量孔)、聚苯乙烯乳膠(例如珠或微量滴定板)、聚偏二氟乙烯、重氮化紙、尼龍膜、活化珠、磁反應珠等等。因此，在一個特殊的實施方式中，用本領域人員已知的方法，利用第二種結合物可以從生物學樣品中容易地檢測出結合BPLP蛋白或其成熟產物(特別是QRFSR)的存在，所述第二種結合物包括另一種抗體，所述抗體被綴合于可檢測的酶標記例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或尿素酶。然后用合適的酶底物生成可檢測信號例如發色的或產熒光的信號。在其它的相關實施方式中，利用本領域人員已知的方法可以實施競爭型ELISA技術。
為了實施上面所述的免疫檢測法，可以提供具有合適的說明書和其它試劑的包括上面所述的檢測試劑(包括抗體)的試劑盒。根據所用的具體的免疫檢測法，試劑盒也可以含有合適的標記物和其它包裝好的試劑和材料(例如洗滌緩沖液等)。利用這些試劑盒可以實施上面所述的標準的免疫檢測法。基因治療根據本發明，通過修飾(即增加或減少)患者細胞中的以及從中所釋放出的BPLP蛋白、其成熟產物的量，或者表達及可能釋放出如上面所定義的肽(包括肽衍生物)可以實現對膜金屬外肽酶的調控。通過用BPLP表達載體或表達BPLP蛋白、BPLP成熟產物或如上定義的肽(包括肽衍生物)的載體(例如裸DNA或病毒載體的形式)可以實現患者細胞內的以及從中可能釋放出的BPLP蛋白或成熟產物的量的增加、表達及可能釋放出如上面所定義的肽(包括肽衍生物)優選地，本發明的核酸形成了載體的一部分。這些載體是包括與序列可操縱地連接的編碼序列的核酸，所述序列控制了載體所轉染的細胞內的蛋白或肽的表達。這樣一種載體的應用使得它可能提高核酸向對象細胞內(特別是所處理的細胞內)的轉移，并且能增加核酸在所述細胞內的穩定性，這使得獲得持久的治療作用成為可能。此外,可能將一些核酸序列弓I入到相同的載體內，這也增加了治療的療效。所用的載體可以是不同來源的，只要它能轉化動物細胞(優選地是人類細胞)。在本發明的一個優選的實施方式中，所用的病毒載體可以選自腺病毒、逆轉錄病毒、腺相關病毒(AAV)、慢病毒、皰疹病毒、巨細胞病毒(CMV)、痘苗病毒等。在文獻中已經描述了整合了異源核酸序列的源自腺病毒、逆轉錄病毒或AAV、HIV衍生的逆轉錄病毒載體的載體。本發明因此也涉及任一重組病毒，其包括被插入到其基因組內的編碼BPLP蛋白、BPLP成熟產物或如上所定義的肽(包括肽衍生物)的核酸序列。
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優選地，本發明的重組病毒是缺陷病毒，其至少缺乏在感染細胞內復制所述病毒所必需的序列。特別優選地施用整合于腺病毒、AAV或缺陷重組逆轉錄病毒內形式的本發明的核酸序列。在1995年10月出版的國際專利文獻WO 95/28494中描述了靶向基因轉運。或者，通過脂染可以將在體內引入載體。在過去的十年間，已經增加了脂質體在體外包裝和轉染核酸方面中的應用。在本發明的“藥物組合物”章節也提供了關于脂質體的信息。在體內弓I入裸DNA質粒形式的載體也是可能的。用本領域已知的方法可以將用于基因治療的裸DNA載體引入到所述的宿主細胞內，例如轉染、電穿孔、微注射、轉導、細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀、Lipofectamine' 、使用基因槍、或使用DNA載體轉運體。藥物組合物可以將BPLP-肽(即指的是BPLP蛋白、衍生于BPLP的肽、成熟產物、如上定義的肽、包括肽衍生物和模擬物)或編碼這些BPLP-肽的核酸以及針對所述BPLP-肽的抗體與藥用可接受的載體一起制劑成藥物組合物。例如，藥物組合物適合于局部、口服、舌下、腸夕卜、鼻內、肌肉內、皮下、經皮或經眼給藥等。
本發明的一個主題也是包括所述BPLP-肽或其模擬物的聚合物的藥物組合物。優選地，核酸形成了表達所述核酸的載體的一部分。優選地，藥物組合物含有可被藥用地用于能被注射的劑型中的載體。合適的藥物組合物具體地是等張的、無菌的、鹽溶液(磷酸氫一鈉或二鈉、氯化鈉、鉀、鈣或鎂等或這些鹽的混合物)、或干的(特別是凍干的)組合物，在這種情況中，需要加入無菌水或生理鹽水以便容許形成可注射溶液。能用于施用的BPLP-肽、抗體或核酸的劑量可以作為不同參數的函數，特別是作為所用的施用模式、相關病理、或所需治療的持續時間的函數。為了制備用于肽治療的藥物組合物，可以將有效量的BPLP-肽溶解或分散于藥用可接受的載體或水介質中。 下面提供了藥物配方的實例。藥物組合物包括藥用可接受的載體或水介質中的有效量的BPLP-肽、核酸或抗體。“藥用的”或“藥用可接受的”指的是當按需施用給動物(包括人)時不會產生不良的、過敏的或其它不利的反應的分子實體和組合物。“藥用可接受的載體”在此包括任何的和所有的溶劑、分散介質、涂層劑、抗細菌劑和抗真菌劑、等張劑和延遲吸收劑等。這些介質和試劑作為藥用活性物的用途在本領域是已知的。本發明預期了除任何與活性組分不相兼容的常用介質或試劑外的試劑在藥物組合物中的應用。可以將輔助的活性組分整合到組合物內。適用于注射用途的藥物形式包括無菌的水溶液或分散相，制劑包括芝麻油、花生油或水性丙二醇、以及臨時制備無菌注射溶液或分散相的無菌粉末。在所有情況中，制劑必須是無菌的，必須被液體化到出現容易注射器化的程度。它在生產和儲存的條件下必須是穩定的，并且可以被抗微生物例如細菌和真菌污染地保藏。可以在與表面活性劑例如羥丙纖維素適當混合的水中制備出作為游離堿或藥用可接受的鹽的活性化合物的溶液。也可以在甘油、液態聚乙二醇、和其混合物以及油中制備出分散相。在一般的儲存和應用條件下，這些制劑含有防止微生物生長的防腐劑。載體也可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液態聚乙二醇等)、其合適混合物、以及植物油的溶劑或分散媒介。通過使用涂層(例如卵磷脂)、通過保持所需的顆粒大小(對于分散相而言)以及通過使用表面活性劑可以保持合適的流動性。用各種抗細菌劑和抗真菌劑例如尼泊金、三氯叔丁醇、苯酚、山梨糖醇酐、硫柳汞等可以預防微生物的行為。在多種情況中，優選地包括等張劑例如蔗糖或氯化鈉。通過在組合物中使用延遲吸收劑例如單硬脂酸鋁和凝膠可以延長注射組合物的吸收。通過在合適的溶劑中整合所需量的活性化合物以及各種上面所列的其它組分，以及隨后的過濾消毒可以制備出無菌的注射溶液。通過將各種無菌的活性組分整合到含有基本的分散介質以及所需的上面所列的其他組分的無菌載體內可以制備出分散相。對于用于制備無菌的注射溶液的無菌粉末而言，優選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術，其生成了活性組分加上前面的它的無菌過濾溶液中的任一附加的所需組分的粉末。在配制之后，可以以與劑量制劑相適合的方式以及以治療有效的量施用溶液。可以容易地施用各種劑量形式的制劑，例如上面所述的注射溶液類型，但是也可以采用藥物釋放膠囊等。對于水溶液的腸外施用，例如如果需要，應當將溶液適當地緩沖化，并且首先用足夠的鹽或葡萄糖使得液態稀釋劑成為等張溶液。這些特殊的水溶液特別適合于靜脈內、肌肉內、皮下和腹腔內給藥。在這種情況中，可以采用的無菌的水介質對于與本說明書相關的領域中的熟練人員是已知的。例如，可以將I個劑量溶解于Iml等張的NaCl溶液中，并且可以將其加入到IOOOml皮下灌注液中或者注射到輸注的目標位置上，(見，例如“Remington，sPharmaceutical Sciences”, 15 版，第 1035 到 1038 頁和第 1570 到 1580 頁)。根據所治療的對象的病變，必然會發生劑量上的一些變異。無論如何，負責給藥的人將為個體對象確定合適的劑量。相關的BPLP-肽可以被制劑成治療混和物，每個劑量包括約0.0001到100毫克、或約0.001到0.1毫克、或約0.1到1.0或甚至約Img到IOmg或甚至約10到lOOmg。也可以施用多個劑量。優選的劑量是從約0.1 μ g/kg到約lmg/kg,更優選地從I μ g/kg到約100 μ g/kg,以及最優選地從約10 μ g/kg到100 μ g/kg。除了用于腸外給藥(例如靜脈內或肌肉內注射)的劑型，其他藥用可接受的形式包括例如用于口服給藥的片劑或其他固體、脂質體劑型、緩釋膠囊、或任何其他常用的形式包括乳膏。預期了其他的給藥途徑，包括鼻溶液或噴霧劑、氣霧劑或吸入劑、或陰道或直腸栓劑以及陰道栓劑或乳膏、以及長效轉運聚合物。在某些實施方式中，預期了脂質體和/或毫微粒用于將BPLP-肽試劑以及核酸載體或抗體引入到宿主細胞內的用途。本發明也涉及上面所定義的藥物組合物，其包括與BPLP-肽協同作用的第二種藥劑。治療性應用上面所述的BPLP-肽、抗所述BPLP-肽的抗體或編碼所述BPLP-肽的核酸能用于預防或治療疾病或病癥，其中尋求對膜金屬外肽酶活性的調控，更具體地是對膜-鋅金屬肽酶(例如NEP和APN)的活性的調控。天然的NEP底物主要是肽激素:腦啡肽、P物質、緩激肽、血管緊張素II和心房利鈉肽，它們在控制中樞性和周圍性痛覺、炎癥現象、礦物質交換和/或動脈張力方面都起到T關鍵作用(Roques等，1993)。更具體地，神經內肽酶NEP 24-11分布于哺乳動物的神經組織和周圍組織中，在周圍組織中，其主要分布在腎臟和胎盤。在這些組織中，細胞表面的金屬肽酶NEP參與了神經肽、全身性免疫調節肽和肽激素的分泌后加工和代謝。通過控制循環的或分泌的調節肽的活性水平，NEP調控了它們的生理性受體介導的作用。因此，膜錨定的NEP參與調控了下面物質的活性:強的血管活性肽例如P物質、緩激肽(BK)、心房利鈉肽(ANP)、和血管緊張素II (AU);強的炎性/免疫調節肽例如P物質和BK和fMet-Leu-Phe (fMLP);強的阿片類神經肽例如Met和Leu-腦啡肽(Enk)以及強的礦物質交換和液體穩態調節肽例如ANP、C型利鈉肽(CNP)和B型利鈉肽(BNP)。但是，僅僅在強烈釋放出這些肽或者其中刺激觸發了肽的釋放的這些區域內，通 過NEP誘導的形成/降解可以改變這些肽的水平。從一體化的觀點看，NEP生物學活性是控制涉及動脈張力調節、炎癥顯像和水-礦物質穩態、以及控制疼痛加工處理的肽能形態的活性水平。從臨床觀點上看，這證實了 NEP是各種疾病狀態中的一種重要的藥物靶點的事實。例如，通過抑制NEP，據此增加了中樞性或周圍性內源性阿片的作用的水平和持續時間，就可以獲得鎮痛作用或抗抑郁作用。或者通過抑制內源性AII的形成和P物質、BK和ANP滅活，就可以獲得抗高血壓、利鈉和利尿的藥物。通過使用NEP抑制劑來修飾內源性肽的濃度的主要優點是僅僅在天然效應物所刺激的受體上才會誘導藥理作用，并且它主要依賴于在環境、行為和病理生理的應激狀態之后所發生的天然效應物的張力或刺激誘發的釋放(Roques等，1993)。除了 NEP以外的哺乳動物膜金屬肽酶的實例是ECE(內皮素轉化酶)(特別是ECEl和ECE2)、紅細胞細胞表面受體抗原KELL和與X連鎖的低磷酸鹽血癥性佝僂病相關的PEX基因的產物、以及ACE (血管緊張素轉化酶)和APN(氨肽酶N)。對ACE和/或ECE的抑制在治療高血壓和預防及治療動脈粥樣硬化方面有著重要應用。對APN聯合NEP的抑制在治療疼痛和抑郁癥方面有著重要應用。對相關膜金屬肽酶的抑制在治療腫瘤(如卵巢、直結腸、腦、肺、胰腺、胃和黑色素癌)、減少轉移、動脈粥樣硬化和/或高血壓的發生率方面有著治療作用。對相關膜金屬肽酶的抑制在疼痛控制方面也有治療作用。對急性疼痛的這些抗傷害作用是鎮痛作用，但是對慢性炎性疼痛例如關節炎或炎性腸病也有作用。此外，對細菌或病毒金屬肽酶的抑制預期具有抗感染作用。金屬肽酶在病原體對宿主組織的侵襲以及免疫和炎性過程方面都起到了重要作用，例如化膿性鏈球菌、銅綠假單胞菌、牙齦卟啉單胞菌和嗜肺性軍團菌。此外，細菌金屬肽酶(特別是鋅金屬肽酶)在蛋白裂解性毒素所引起的疾病方面有著重要作用，所述毒 素例如是炭疽桿菌的毒素(炭疽致死因子)和破傷風及肉毒菌的神經毒素。其他金屬肽酶在各種感染例如HIV所引起的感染方面起到了重要作用(FR2707169)。J.Potempa和J.Travis可能發現了蛋白酶抑制劑在治療細菌或病毒性在疾病中的重要性。在Turner 等，2001、Kenny 等，1977、Kenny 等，1987、Beaumont 等，1996 中闡述
了金屬肽酶的各種作用。本發明的一個目的是上面所述的治療性肽或核酸作為鎮痛劑或抗抑郁劑的用途，其通過抑制周圍的、脊髓和/或脊髓上水平中的NEP和APN，據此增加了中樞性或周圍性內源性阿片(包括腦啡肽)的作用的水平及持續時間。本發明預期了對疼痛的預防或治療，特別是急性和慢性疼痛、內臟炎性及神經性疼痛。對任何水-礦物質失衡的預防或治療也是本發明的目標。在靶向疾病中，可以包括由水-礦物質失衡所引起的骨、牙、腎臟、甲狀旁腺、胰腺、腸、胃粘膜、前列腺和唾液腺疾病。具體地，疾病可以選自高或低甲狀旁腺血癥、骨質疏松、胰腺炎、頜下腺結石、腎結石和骨營養不良。
對人際關系及行為障礙性疾病的預防或治療也是相關的。在W002/051434中描述了各種精神疾病。具體地,本發明涉及任何選自以下的疾病:回避障礙(avoidance disorder)、感知減退障礙(decreased awareness disorder)、孤獨癥、兒童多動癥(attentiondeficithyperactivity disorder)、Hospitalism、人際關系功能障礙以及與外界的關系障礙(impaired interpersonal functioning and relationship to the externalworld)、精神分裂樣人格障礙、精神分裂癥、對環境的興趣降低(decreasedinterest inenviixmment)、與性相關的社交活動障礙、和性行為障礙(包括早瀉和性欲亢進)構成。所尋求的疾病(其中調控膜金屬肽酶的疾病)也包括高血壓、動脈粥樣硬化、腫瘤、炎性關節炎和腸病。也包括對感染 的治療。特別是，在J.Potempa和Travis中可以發現蛋白酶抑制劑在治療細菌和病毒性疾病中的重要性。上面所述的BPLP-肽、抗體或核酸也能用于控制免疫-炎癥應答。如上定義的BPLP-肽、抗體或核酸也能用作為利鈉劑或利尿劑。本發明的另一個目的是上面所定義的肽或核酸作為治療藥物濫用(主要是嗎啡類藥物濫用)中的替代品的用途。事實上，研究已經表明藥物濫用的易感性以及獎賞(reward)和藥物依賴性的發生至少部分是內源性阿片系統的先前存在的或誘導的改變和/或缺陷的結果。在這個方面，利用能增強內源性腦啡肽的作用的BPLP-肽或核酸將減少因阻斷慢性嗎啡或海洛因給藥所產生的各種副作用(藥物撤退的軀體體征)。根據本發明，需要減少BPLP-肽對NEP的抑制作用，例如通過使用抗BPLP蛋白或肽的抗體。這種NEP活性的增強在治療神經退行性疾病例如與淀粉樣變性病相關的疾病或病癥方面是特別有利的。事實上，已經顯示合成抑制劑如Neprilysin(神經內肽酶,NEP或腦啡肽)的抑制劑增加了淀粉樣蛋白β水平(Newell等，2003)。Leissring等，2003還報道了 N印rilysin在神經元中的轉基因的過度表達顯著地降低了 Αβ水平，延遲或完全阻止了淀粉樣蛋白斑的形成以及與之相關的細胞病理，并且解救了在淀粉樣蛋白前體蛋白轉基因小鼠中所具有的早死現象。當在疾病所影響的組織中或其鄰近部位發現了淀粉樣蛋白的沉積或淀粉樣蛋白斑時，或者疾病的特征是不可溶性的或可成為不可溶性的蛋白的過量產生時，認為疾病或病癥與淀粉樣變有關。淀粉樣蛋白斑通過已知的或未知的機制可以直接地或間接地引發病理作用。淀粉樣變疾病的實例包括但不限于全身疾病例如慢性炎性病、多發性骨髓瘤、巨球蛋白血癥、家族性淀粉樣變多神經病(Portuguese)和心肌病變(Danish)、全身性老年型淀粉樣變、家族性淀粉樣變多發腎臟病變(1wa)、家族性淀粉樣變(Finnish)、Gerstmann-Straussler-Scheinker綜合征、伴蕁麻疫和耳聾的家族性淀粉樣變神經病(Muckle-Wells綜合征)、甲狀腺髓樣癌、孤立性心房淀粉樣變、和血液透析相關的淀粉樣變(HAA)、和神經退行性疾病。術語“神經退行性疾病”指的是神經系統的疾病或病癥，具體地涉及到腦部，其表現未腦或神經功能不全的癥狀特征，例如短期或長期的記憶遺忘或缺陷、癡呆、認知功能缺陷、平衡和協調問題、情緒和行為缺陷。本發明更具體地涉及與淀粉樣變相關的神經退行性疾病。當從表現出這些癥狀的對象的腦組織的組織病理(活檢)樣品中發現淀粉樣蛋白斑形成時，就認為這些疾病是“與淀粉樣變相關”。因為從活體對象中取得腦的活檢標本(特別是人腦)非常苦難，或者根據就不可能，癥狀或神經退行性疾病的癥狀與淀粉樣變的相關性常常依據于不同于活檢樣品中存在淀粉樣蛋白沉積例如蛋白斑或纖維的標準。
在本發明的特異的實施方式中，神經退行性疾病是阿耳茨海默病(AD)。在其他的實施方式中，疾病可能是罕見的Swedish病，特征是淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)中鄰近APP的PAP部分的氨基末端的兩個KM到NL突變。另一個這種疾病是伴有淀粉樣變的遺傳性腦出血(HCHA或HCHWA)-荷蘭型。本領域已知的以及在本發明的范圍之內的其他這種疾病包括，但不限于散發性大腦淀粉樣血管病、遺傳性大腦淀粉樣血管病、Down綜合征、關島的帕金森-癡呆、以及年齡相關的無癥狀的淀粉樣變血管病。在另一個方面，神經退行性疾病是亞急性海綿狀腦病，例如但不限于瘋羊病、Creutzfeldt-Jakob病、Gerstmann-Straussler病、庫魯病、長耳鹿和麋鹿的慢性廢用性疾病、牛的牛海綿狀腦病、以及貂的可傳染性腦病。本發明還涉及調控內源性BPLP蛋白或成熟產物(例如QRFSR)和膜金屬肽酶之間的相互作用的藥物在制備用于預防或治療疾病的治療性組合物的用途，在所述疾病中，需要調控所述膜金屬肽酶的活性。篩選方法下面描述了容許本領域技術人員選擇并純化出與相同的靶點結合并具有BPLP蛋白或其成熟產物(例如QRFSR肽)的激動劑或拮抗劑的生物學活性的候選化合物的方法。候選組合物可以是蛋白、肽、激素、抗體或合成組合物，它可以是肽或非肽分子，例如用常規的有機化學方法所能合成的任一化合物。本發明提供了一種用于在體外篩選化合物的結合NEP上的結合BPLP蛋白或其成熟產物(例如QRFSR肽)的結合位點的能力的方法，其包括以下步驟:a)在存在BPLP蛋白或其成熟產物(例如QRFSR肽)、或任一保留了 BPLP蛋白或其成熟產物(例如YQRFSR肽)的結合特異性或生理學活性的肽時，將候選化合物與表達NEP的細胞孵育；b)確定候選化合物與BPLP蛋白或其成熟產物(例如QRFSR肽)或保留了 BPLP蛋白或其成熟產物(例如YQRFSR肽)的結合特異性或生理學活性的肽競爭性結合NEP的能力。通常在4°C到25°C或37 °C進行候選化合物的結合檢測。表達NEP的細胞可以是細胞培養物例如融合的單層的靶細胞培養物、或靶向器官標本或組織樣品(例如冰凍切片、切片、膜制品或粗勻漿液)，其含有NEP上的結合BPLP蛋白或其成熟產物(例如QRFSR肽)的結合位點。在本發明的篩選方法中所用的優選的組織樣品是哺乳動物脊髓的膜制品或切片，它是已知的適用于NEP活性測定的組織。在本發明的篩選方法中所用的其他優選的組織樣品是已知富含NEP肽酶和/或作為BPLP蛋白或其成熟產物(例如QRFSR肽)的靶點的所有周圍組織制備物。例如，可以使用哺乳動物腎臟的外髓、胎盤、睪丸、前列腺和骨、例如，這些方法可以應用于小鼠、大鼠或人來源的組織和/或細胞或經金屬外肽酶cDNA(特別是NEP cDNA，特別是人NEP cDNA)所轉染的細胞株。例如用放射性的(32P、35S、3H、125I等)或非放射性的標記(異羥基洋地黃毒甙元、CyDye-銪、螢光素等)優選地標記BPLP蛋白或其成熟產物(或保留了 BPLP蛋白或其成熟產物的結合特異性或生理學活性的肽)。然后在能發生特異性結合的條件下，將其與表達NEP的細胞孵育一段足以發生特異性結合的時間。然后定量在不同濃度的所述候選化合物(例如從10,到10_5M)時的與細胞特異性結合的標記。因此，本發明還提供了用于篩選與NEP上的結合BPLP蛋白或其成熟產物的結合位點特異性結合的化合物的方法，其包括以下步驟:a)制備含有NEP上的結合BPLP蛋白或其成熟產物的結合位點的細胞培養物或器官標本或組織樣品(例如冰凍切片或切片或膜制品或粗勻漿液)；b)加入待測試的候選化合物，以測試其與半飽和濃度的標記蛋白或其成熟產物(或保留了 BPLP蛋白或其成 熟產物的結合特異性或生理學活性的肽)的競爭性；c)在存在候選化合物時，在能發生特異性結合的條件下，將步驟a)的細胞培養物、器官標本或組織樣品孵育一段足以發生特異性結合的時間；d)定量在不同濃度(從10,到10_5M)的候選化合物時的與細胞培養物、器官標本或組織樣品特異性結合的標記。在所述的上面的方法中，半飽和濃度是標記的BPLP蛋白或其成熟產物(例如QRFSR肽)(或保留了 BPLP蛋白或其成熟產物的結合特異性或生理學活性的肽)與50%NEP結合位點結合時的濃度。該方法也容許確定候選化合物與BPLP蛋白或其成熟產物(例如QRFSR肽)的親和力(或保留了 BPLP蛋白或其成熟產物的結合特異性或生理學活性的肽)相比較的相對親和力。本發明的另一個目的是一種用于確定與NEP上的結合BPLP蛋白或其成熟產物(或保留了 BPLP蛋白或其成熟產物的結合特異性或生理學活性的肽)的結合位點特異性結合的配體化合物的相對親和力的方法，所述方法包括上面用于每種候選化合物的方法中的步驟a)、b)、c)和d)，以及還包括步驟e)比較在步驟d)中所定量的每種候選混和物與其他一種候選化合物的親和力。本發明的另一個目的是一種用于確定與NEP上的結合BPLP蛋白或其成熟產物的結合位點特異性結合的化合物的親和力的方法，其包括以下步驟:a)制備含有NEP上的結合BPLP蛋白或其成熟產物的結合位點的細胞培養物或器官標本或組織樣品(例如冰凍切片或切片或膜制品或粗勻漿液)；b)加入先前已經標記了放射性或非放射性標記的候選化合物；c)在存在標記的候選化合物時，在能發生特異性結合的條件下，孵育步驟a)的細胞培養物、器官標本或組織樣品一段足以發生特異性結合的時間；和d)定量在不同濃度(從10,到10_5M)的候選化合物時的與細胞培養物、器官標本或組織樣品特異性結合的標記。例如用放射性的(32P、35S、3H、125I等)或非放射性的標記(異羥基洋地黃毒甙元、CyDye-銪、螢光素等)優選地標記候選化合物。然后在能發生特異性結合的條件下，將其與表達NEP的細胞孵育一段足以發生特異性結合的時間。還可以比較所定量的每種候選化合物與其他一種候選化合物的親和力，使得確定與NEP上的結合BPLP蛋白或其成熟產物(例如QRFSR肽)結合位點特異性結合的候選化合物的相對親和力。本發明還提供了一種在體外篩選化合物作為BPLP蛋白或其成熟產物對NEP活性的激動劑或拮抗劑的能力的方法，所述方法包括步驟:a)在存在(i)BPLP蛋白或其成熟產物(例如QRFSR肽)、或任一保留了 BPLP蛋白或其成熟產物(例如YQRFSR肽)的結合特異性或生理學活性的肽和(ii)NEP底物時，將候選化合物與表達NEP的細胞孵育；b)確定NEP對NEP底物的內切蛋白酶解作用，其中如果存在候選化合物時的內切蛋白酶解與不存在候選化合物時的內切蛋白酶解相比是增加的，說明所述化合物具有拮抗劑活性；而如果存在候選化合物時的內切蛋白酶解與不存在候選化合物時的內切蛋白酶解相比是減少的，說明所述化合物具有激動劑活性。BPLP蛋白或其成熟產物的激動劑在此是一種具有抑制金屬外肽酶活性(特別是NEP或APN活性)的能 力的分子。BPLP蛋白或其成熟產物的拮抗劑在此是一種具有增加金屬外肽酶活性(特別是NEP或APN活性)的能力的分子。此外，在確定該候選化合物所誘導的代謝改變中，可以評價候選化合物的激動劑或拮抗劑活性，所述代謝改變是例如作為經蛋白激酶或腺苷酸環化酶的傳導信號的結果的初級或二級信使代謝的合成和/或釋放、以及G家族蛋白的活化。在具體的實施方式中，本發明也涉及一種篩選作為BPLP蛋白或其成熟產物的激動劑的化合物的方法，其包括以下步驟:a)制備含有NEP上的結合BPLP蛋白或其成熟產物的結合位點的細胞培養物或器官標本或組織樣品(例如冰凍切片或切片或膜制品或粗勻漿液)；b)孵育步驟a)中的細胞培養物、器官標本和組織樣品(濃度為容許在存在候選化合物時能檢測到NEP酶活性(優選為地從10,到10_5M))、半飽和濃度的BPLP蛋白或其成熟產物(或任一保留了 BPLP蛋白或其成熟產物的結合特異性或生理學活性的肽)和NEP底物一段足以在初始速度條件下發生NEP底物的內切蛋白酶解的時間；c)分別通過測定在存在或不存在候選化合物以及在存在或不存在BPLP蛋白或其成熟產物或保留了 BPLP蛋白或其成熟產物的結合特異性或生理學活性的肽時NEP底物內切蛋白酶解的水平，以便定量步驟a)中的生物學材料中所具有的NEP活性。在所述的上面的方法中，半飽和濃度是造成NEP底物的降解減少一半的BPLP蛋白或其成熟產物的濃度。本發明的另一個目的包括一種篩選作為BPLP蛋白或其成熟產物的拮抗劑的化合物的方法，其包括以下步驟:a)制備含有NEP上的結合BPLP蛋白或其成熟產物的結合位點的細胞培養物或器官標本或組織樣品(例如冰凍切片或切片或膜制品或粗勻漿液)；b)孵育步驟a)中的細胞培養物、器官標本和組織樣品(濃度為容許在存在次最大濃度的BPLP蛋白或其成熟產物(或或任一保留了 BPLP蛋白或其成熟產物的結合特異性或生理學活性的肽)時，在初始速度條件下檢測到NEP酶活性的濃度)、NEP底物和候選化合物一段足以在初始速度條件下發生NEP底物的內切蛋白酶解的時間；c)分別通過測定在存在或不存在候選化合物以及在存在或不存在BPLP蛋白或其成熟產物或保留了 BPLP蛋白或其成熟產物的結合特異性或生理學活性的肽時的NEP底物內切蛋白酶解的水平，以便定量出步驟a)中的生物學材料中所具有的NEP活性。在所述的上面方法的優選的實施方式中，次最大濃度是造成底物降解減少至少50%或優選地至少75%的肽的濃度。下面的實施例和附圖舉例說明了本發明，其不限制本發明的范圍。


圖1顯示了 3H-YQRFSR標記物加入到對應于2.5ml人唾液的2.5ml唾液甲醇-酸提取物中所得到的代表性的陽離子交換HPLC譜。主要的放射性峰的回收率被測定為75-84% (點狀欄)。圖2顯示了從7ml人唾液中獲得的唾液甲醇-酸提取物的代表性的陽離子交換HPLC譜。分析了各個級分的抑制人外-內肽酶活性對P物質的內切蛋白酶解的能力(LNCaP細胞株)。圖3是主要HPLC-EC活性13-14級分的代表性的反相HPLC譜(點狀欄)。分析了該級分抑制人外-內肽酶活性內切蛋白酶解P物質的能力(LNCaP細胞株)。圖4是主要HPLC-RP活性級分的代表性的反相HPLC譜(點狀欄)。分析了該級分抑制人外-內肽酶活性內切蛋白酶解P物質的能力(黑欄)，以及它們在274nm處的吸光度(黑線)。圖5顯示了 BPLP -QRFSR肽對人外-內肽酶活性降解P物質的影響(LNCaP細胞株)，QRFSR肽的有效濃度范圍是從I到25 μ M，半最大濃度為11 μ Μ。圖6顯示了 hBPLP-QRFSR肽的YQRFSR衍生物對人外-內肽酶活性降解P物質的影響(LNCaP細胞株)，YQRFSR肽的有效濃度范圍是從5到50 μ Μ，半最大濃度為30 μ Μ。
圖7顯示了 hBPLP-QRFSR肽的YQRFSR衍生物對鼠NEP外-內肽酶活性降解P物質的影響(腎臟組織)，YQRFSR肽的有效濃度范圍是從5到75 μ Μ,半最大濃度為38 μ Μ。圖8是對YQRFSR肽的RP-HPLC色譜分析。YQRFSR肽(175 μ Μ)在體外不受人細胞表面內肽酶的代謝，同時它抑制了 70%的人外內肽酶所介導的P物質的內切蛋白酶解。RP-HPLC色譜特征發現:1/YQRFSR肽不受含有NEP的人細胞膜的代謝，回收了 93%的完整肽，在沒有代謝膜時，回收了 94%。2/在相同的試驗條件下，YQRFSR肽抑制了 70%的這些人細胞膜對P物質的內切蛋
白酶解。圖9顯示了 QRFSR肽對重組人NEP降解P物質的抑制作用。QRFSR肽對可溶性重組人NEP活性的濃度依賴性的抑制作用，以及QRFSR肽對可溶性重組hDPPIV活性對P物質的內切蛋白酶解沒有作用。圖10顯示了 QRFSR肽對細胞表面人APN降解APN合成底物的抑制作用。QRFSR肽濃度依賴性地抑制了細胞表面的HEK-hAPN對Ala-pNA顯色底物的降解。
圖11顯示了 QRFSR肽對細胞表面人NEP降解NEP合成底物的抑制作用。QRFSR肽濃度依賴性地抑制了細胞表面的HEK-hAPN對Mca-BK2產熒光底物的降解。圖12顯示了 YQRFSR肽在體內對鼠花費在舔爪(經福爾馬林注射過的后爪)上的時間的影響。平均值土 SEM。圖13顯示了 YQRFSR肽在體內對后爪注射福爾馬林之后的痛性痙攣的次數的影響。平均值土 SEM。圖14顯示了 YQRFSR肽在體內對在注射福爾馬林后60分鐘后的痛性痙攣指數的影響。QRFSR衍生肽所誘導的鎮痛作用需要激活內源性阿片受體。
實施例本研究被設計用于搜索天然的金屬外肽酶(特別是NEP和/或APN)的抑制物，特別是在人體唾液分泌物中。對該產物的檢測和分離的策略是依據于對唾液低分子量組分的分離，該組分抑制了表達膜錨定人NEP的人體細胞對NEP敏感性底物的內切蛋白酶解。本發明者已經開發出了功能檢測(表達NEP的LNCaP和HEK人類細胞的膜制品)和分子分離(HPLC色譜系統)的模型，其被用于通過序列分析人體中的天然的內源性NEP外肽酶抑制物即鼠Sialorphin的內源性的唾液功能類似物所進行的鑒定。實施例1:人體唾液制劑建立了臨床研究方案，其為巴斯德研究院的“centre de recherche VaccinaleetBiomedicale”，編號為2045，該研究方案獲得了 CCPPRB委員會(PARIS-C0CHIN)的同意，并得到了 10名健康男性志愿者的人體唾液，該研究開始于2003年5月，繼續進行于2003年10月。將唾液收集到先前冷卻的含有抑肽酶(1000KIU/ml) ,Pefabloc (0.4mM)和HCl (0.1N)(終濃度)的“miCTosorp”管內，預期該培養基能抑制蛋白裂解活性。因此，將唾液樣品儲存于_80°C，直到進行 甲醇提取操作。實施例2 =NEP抑制的材料和試驗模型1-人外肽酶NEP和APN的來源:已經描述了一些表達NEP和金屬外肽酶家族的其它成員的人細胞株，其中這些細胞株是成骨細胞細胞株MG-63 (骨肉瘤)、滋養細胞細胞株BeWo (胎盤絨毛膜癌)、前列腺上皮細胞株LNCaP (腺癌)、和腸細胞細胞株Caco-2 (直結腸癌)。首先開發出給定培養基中的用于細胞藥理學分析的培養條件。其次，本發明者已經用Northern印跡和免疫細胞化學分子確定LNCaP和BeWo是唯一能在給定的培養條件下(即含有胰島素、轉鐵蛋白和硒的RPMLGIBC0)以及分別在DHT (二氫睪酮)和forskolin的誘導之后能表達NEP (ARNm和細胞表面蛋白)的細胞株。最后，在靜態孵育源自這些細胞的膜制品的試驗模型中，本發明者已經確定了容許在初始速度測定的條件(即IOOpM/分鐘/μ g LNCaP細胞膜蛋白)下分析人NEP介導的對P物質的內切蛋白酶解的參數(比BeWo的特異活性低10倍)。在存在特異的合成NEP抑制物(例如thiorphan)時，抑制了 LNCaP膜活性(500nM達到了 62%的最大抑制力)。相反的，分別阻斷氨肽酶(APN、APB)和血管緊張素轉化酶(ACE)活性的bestatin(25 μ Μ)和卡托普利(10 μ Μ)不能抑制細胞表面外肽酶對P物質的水解，因此說明在試驗條件下，P物質的細胞外降解主要是由位于這些細胞表面上的NEP內肽酶活性所引起的。
另外，也已經開發出了利用經人NEP cDNA或人APN cDNA (HEK細胞不表達這些金屬外肽酶)轉染的HEK細胞的膜制品或可溶性重組人NEP或可溶性重組人DPP IV ( 二肽基氨基肽酶IV)(沒有N末端的胞漿和跨膜片段)的體外模型。2-底物和抑制劑在體外，通過在體外測 定下面的合成及天然底物的降解可以檢測出人細胞膜的膜氨基-和內-外肽酶活性:a/合成的特異的產熒光的或顯色的底物:— Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K (Dnp) - OH 和 / 或 Suc-A-A-F-Amc (NEP) (R&Dsystemsand Bachem)—Ac-A-Amc 或Ala-pNA(APN)(Bachem)b/生理底物:—修飾的氚標記的P 物質[(3，4 ) Pro2-Sar9-Met (O2) 11J -P 物質(DuPont-ΝΕΝ)和天然的 P 物質:R-P-K-P-Q-Q-F-F-G-L-M(NEP-DPPIV-ACE) (Peninsula-Biovalley)；—天然的甲硫氨酸腦啡妝:Y-G-G-F-M(NEP-APN)(Peninsula-Biovalley)在存在或不存在不同的可獲得的選擇性的合成肽酶抑制劑時，用細胞膜肽酶測定這些底物的水解可以檢測出肽檢測法的特異性:—Thiorphan, Phosphoramidon(NEP)(Sigma and Roche)—Bestatin, Amastatin(APN)(Calbiochem)— DPPIV 抑制劑(DPPIV) (Calbiochem)—Captopril(ACE) (Sigma)3-肽酶活性的測定根據對鼠Sialorphin的功能表征中所開發及建立出的方案測定外肽酶活性(Rougeot等，2003)。簡單地，對于膜制品，將細胞在4°C下勻漿于10份體積(體積/重量)的50mM Tris/HCl (緩沖于pH 7.I)中。在IOOOxg和5°C下進行第一次離心5分鐘，以便去除細胞碎片和沉淀物中的細胞核。在IOOOOOx g和5°C下進行第二次離心30分鐘，以便濃縮沉淀物中的膜級分，將其在冷Tris/HCl緩沖液中輕輕地洗滌三次，重懸于新鮮緩沖液內，取樣并將其儲存于_80°C，直到被用作酶源。利用以牛血清白蛋白(BSA)作為標準物的Bio-RadDC蛋白檢測法進行蛋白測定。在存在或不存在特異性抑制劑時，通過監測初始速度測定值條件下的代謝率測定出底物的水解。將抑制物加入到預孵育培養基中。標準的反應混合物包括終體積為200 μ L50mM Tris-HCl (pH值6.5-7.2)內的細胞膜。在預孵育10分鐘之后，加入底物，并在25°C的持續搖晃水箱中進行消化20分鐘。通過冷卻到4°C并加入HCl (終濃度為0.3N)來終止反應。然后離心反應管(4700 X g，4°C，15分鐘)，并測定出剩余的完整底物及其代謝物。對于天然底物(P物質和Met-腦啡肽)的應用，根據它們的不同的疏水特征分離并定量出反應產物:—用C-18Sep_Pakcartridges (Waters)分析放射性標記的P物質的水解。用H20-0.1%TFA以及25%甲醇-0.1%TFA(每種4ml)洗脫分離出3H代謝物。用75-100%甲醇-0.l%TFA(4ml)洗脫出完整的氚標記的底物。一用RP-HPLC結合分光光度計分析Met-腦啡肽的水解(C-18LUNAcolumn，AIT)。用線性梯度為0.1%TFA的水溶液到0.1%TFA的100%乙腈溶液(lml/min)洗脫30分鐘，可以分離出兩種Met-腦啡肽代謝物(YGG:5.8±0.2 ；FM:12.8±0.I分鐘滯留時間)和完整底物(YGGFM:18.8±0.2分鐘)。通過監測在264nm(L3000Merck)處的柱流出物可以檢測它們的身份和相對數量(峰高)。一也用放射免疫檢測法(RIA)定量處初始Met-腦啡肽底物的缺失。檢測使用抗Met-腦啡肽抗血清(Gros等，1978)和1251-Met-腦啡肽(80TBq/mmol，NEN);它可檢測出微摩爾濃度的Tyr-Gly-Gly和Phe-Met代謝物終的納摩爾濃度的Met-腦啡肽。用液閃光譜法可以測定出每個級分的放射性強度。對于合成底物的應用，可以用多孔熒光分光光度計直接分析出現熒光信號(強度和偏振)的動力學；信號的強度直接與反應期間所形成的代謝物的量成比例。實施例3:人唾液純化和色譜法人唾液組分的提取及純化方案類似與為分子表征大鼠唾液中的Sialorphin所開發和建立的方案(Rougeot等，1994)，分析了提取物和色譜級分抑制含NEP的人細胞膜對生理底物P物質的水解的能力。提取并純化作為腦啡肽活性的強調節劑的人唾液組分。簡單地，在4°C下凍融之后，根據下面的方案處理唾液樣品:一甲醇-酸提取方案:4°C下提取甲醇-酸中的的分子量組份；將I體積的唾液加入到4體積的含有0.1%四氟乙酸(TFA)溶液的甲醇中。第一步要實現去除高分子量的蛋白(包括降解酶)，所述蛋白分別在酸和甲醇介質中被滅活和沉淀，并容許溶解小分子量的唾液成分(10 ( Kda)。快速地渦旋甲醇混合物，并在12000g和4°C下離心15分鐘，經在-110°C下凍干從上清液中去除甲醇。

-HPLC陽離子交換色譜法(HPLC-EC):將甲醇提取的唾液溶解于溶劑A (即IOmM醋酸銨，pH值為4.3)中，并將其注射到HEMA-1EC B10-1000羧甲基柱(Alltech)中。根據它們的陽離子特征，分別用兩步線性梯度10-500mM和500-900mM醋酸銨(pH值4.7)(流速為lml/min)洗脫并分離出組分。收集2ml級分，并在凍干后測試其抑制人外肽酶活性(LNCaP)的能力。如圖1所示，利用加入到代表性唾液樣品中的內在標準物(氚標記的肽:3H-YQRFSR)評價提取和連續色譜的質量和回收率；加入到對應于2.5ml人體唾液所提取到的樣品中的標記物的回收率是75-84%。對甲醇提取的唾液的HPLC陽離子交換色譜法(圖2，對應于7ml人體唾液的唾液提取物的代表性色譜)清楚地顯示出存在著兩種主要的分子唾液組分，其被洗脫于第一步的醋酸銨梯度值(10-500mM)，滯留時間分別為26-28分鐘和36-38分鐘，該組分抑制了 90%的人膜結合肽酶對P物質的內切蛋白酶解(圖2中可見的兩個滯留時間為6和48分鐘的活性峰分別對應于洗脫液和柱的總體積)。— HPLC反相色譜法(RP-HPLC)。將先前HPLC-EC的活性級分溶解于溶劑A
中，并將其注射到Synergi Max-RP柱(Phenomenex)內。用線性梯度1-99%溶劑B[乙腈-TFA的體積比為100-0.1]洗脫樣品組分。收集Iml級分，并在凍干后分析其抑制細胞表面的人外肽酶活性(LNCaP)的能力。內標記物的回收率為61%。RP-HPLC(圖3)對從先前HPLC-EC的13-14級分(滯留時間為26-28分鐘)中所分離到的活性分子形式的分離顯示出存在兩種主要的抑制人外肽酶活性的分子群，并且其被洗脫于乙腈梯度值內，滯留時間分別為23-25和28-30分鐘。將這些級分在經線性梯度1-99%溶劑B[100%甲醇-0.1%TFA]洗脫的synergiMax-RP-HPLC柱中進行進一步的純化。在I分鐘的間隔內，將柱洗脫液收集于microsorb管內，并在凍干后測試這些級分的抑制抑制NEP的活性。如圖4所示，分離出了滯留時間分別為20-21以及29-30分鐘的兩種抑制人外肽酶對P物質的內切蛋白酶解的形式，并且確定了它們的氨基酸序列。一Ciphergen蛋白芯片和氨基酸序列分析。利用Applied Biosystems肽測序儀(plate-forme d' Analyse et deMicros quen age des Prot ines, Institut Pasteur),通過自動化的Edman降解進行N末端的序列分析。從最后的RP-HPLC中在滯留時間為10分鐘時所洗脫下的分子形式(級分20)對應于690和769.5Da分子量，并且對應于下面的5個氨基酸殘基的序列:QRFSR。在26分鐘滯留時間所洗脫下的級分(級分28)分別對應于兩種分子組分622_666Da和6495Da ;對最高分子量的氨基酸的測定顯不它對應于唾液的堿性富脯氨酸的多肽序列，是人的61個氨基酸序列的PRP-E (Isemura等，1982)。通過與大鼠唾液Sialorphin的類比,這些數據為人唾液Sialorphin樣肽的存在提供了直接證據，所述肽是五肽QRFSR，其在結構與功能上都與大鼠的五肽QHNPR非常接近，并且被分泌到人唾液分泌物內。它們支持了 QRFSR是前體蛋白經蛋白裂解加工處理后的成熟產物，加工的方式類似于SMRl和肽激素前體的成熟途徑。此外，至于QHNPR大鼠肽，所分泌的QRFSR肽似乎以不同的形式蓄積于人唾液分泌物內，其中游離形式可能包括乙酸鹽形式，以及復合形式包括了與唾液PRP-E的高疏水性的相互作用。實施例4 =QRFSR肽的合成和測試合成QRFSR肽，并在人LNCaP細胞膜靜態孵育物的試驗模型中，體外分析QRFSR抑制生理的NEP底物(P物質)的降解的能力。QRFSR肽抑制了人前列腺上皮細胞表面上所表達的NEP介導的對P物質的細胞外的內切蛋白酶解。QRFSR的有效濃度為I到25 μ Μ，半最大(IC50)濃度為11 μ M(圖5)。令人驚訝的是，在所觀察的鼠Sialorphin對人NEP活性的抑制作用不同的是，人QRFSR肽對鼠腎臟`NEP活性的抑制作用比對人細胞表面NEP活性的抑制作用至少低10倍。衍生肽YQRFSR (被合成用于開發抗體和免疫檢測測定系統中的氚標記的以及免疫原性的綴合物)明顯地表現出對人和鼠外-內肽酶活性的相似的抑制作用(圖6和7)。表:天然的和衍生的人及鼠肽對人和鼠外內肽酶活性的抑制能力
外內肽酶來自I人類細胞 I大鼠組織
QHNPR_4 到 40 μ M 0.4 到 4 μ M
QMP—未確定 _>50μΜ
QRFSR^ 2.5 到 25 Γ 彡 ΙΟΟμ M
YQRFSR — 5 到 50 μ M~ 5-75 μ M qEpR' ^ 90 μ M ^ 未確定
QRGPRGPI >90 μ M | 未確定除了可能成熟于hPB基因產物的QRGPR肽(20_90 μ Μ)對LNCaP人細胞膜所誘導的P物質內切蛋白酶解沒有影響外，該結果使得本發明者推測天然NEP抑制物五肽中的三個中心氨基酸(常見的是Q-N末端和R-C末端)是它們與NEP外內肽酶的功能性相互作用的親和力和/或特異性的決定性信號。此外，除了鼠和人NEP之間的強的初級氨基酸類似性(#85%)之外，本發明者觀察到了兩種天然抑制物五肽(分別是鼠QHNPR和人QRFSR)的功能性相互作用的相對特異性。所有的這些結果都為存在兩種外酶的二級及三級結構的構象特異性提供了證據，對Sialorphin或其衍生物與人NEP所形成的二元復合物的晶體結構的測定，容許進一步了解這些天然抑制物的結合模式。本發明者利用氚標記的3H-YQRFSR肽在成熟雄鼠體內建立了鼠Sialorphin的這種人類功能性肽模擬物的藥物動力學和藥效學的參數(生物分布-生物利用度-清除率)，以及確定了它在體內和體外的代謝機制和轉化(圖8)。RP-HPLC色譜特征發現:一 YQRFSR肽不受含NEP的人細胞膜的代謝，事實上，回收了 93%完整肽，而沒有代謝膜時，回收了 94% ；一在相同的試驗條件下，YQRFSR肽抑制了 70%的這些人細胞膜對P物質的內切蛋
白酶解。因此，YQRFSR能用于研究BPLP成熟產物在急性疼痛(例如針刺疼痛試驗和福爾馬林試驗)的鼠行為模型中的鎮痛活性，這些模型已經被用于研究Sialorphin在體內的功能特征(Rougeot等,2003)。

實施例5:在體外進一步表征QRFSR肽通過在利用純化的可溶性人NEP和人DPPIV (沒有N末端的胞漿和跨膜片段)的體外酶檢測法中測定P物質(SP)的內切蛋白酶解，可以評價QRFSR肽的抑制特異性。利用選擇性的重組hNEP檢測法，建立了人QRFSR肽與hNEP的分子相互作用，這給肽抑制hNEP活性提供了直接證據，如圖9所示，QRFSR肽阻止了 90%的NEP介導的SP的內切蛋白酶解，它的抑制力確實是濃度依賴性的(r2=0.99，η = 18)，范圍從5到50 μ Μ，半最大濃度是29± I μ Μ。相反，25到50 μ M的QRFSR肽都不能阻止重組hDPPIV對SP的降解，說明QRFSR肽在體外對分解代謝SP的細胞表面外酶的抑制力僅僅是因為它們與NEP外肽酶的特異的相互作用。此外，從監視SP的體外代謝的研究中，顯示出QRFSR肽和鼠QHNPR-Sialorphin —樣都不能完全地阻止脊髓的SP滅活外肽酶對內源性SP的降解，因此在體內不能完全阻止SP介導的傷害作用。外肽酶(NEP和APN)在體內以驚人的效率(在數秒鐘內)滅活腦啡肽。因為NEP和APN在腦啡肽滅活中的互補作用，僅僅合成的NEPAPN合成抑制物可以在不同的疼痛模型中誘導出抗傷害應答。因此，在利用選擇性地表達人膜錨定的NEP或APN的重組HEK人類細胞的膜制品的酶檢測法中，評價了 QRFSR肽的抑制特異性。在實驗室中開發出了這些轉染的細胞模型。通過測定人工的特異性產熒光底物的降解可以在體外檢測出人細胞膜的膜氨基-和內-外肽酶活性，所用的 NEP 底物是 Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K- (Dnp) -OH(Mca_BK2)以及 APN 底物是Ala-pNA。利用選擇性的膜錨定hNEP檢測法，本發明者發現QRFSR肽對NEP對Mca_BK2的內切蛋白酶解的抑制作用是濃度依賴性的(r2=0.88，n=29個測定點)，以及有效劑量范圍是從5到50 μ M0利用選擇性的膜錨定的hAPN檢測法，本發明者已經證實QRFSR肽抑制了hAPN對Ala-pNA的降解，有效劑量是10到90 μ M (r2=0.93，n=22個測定點)(見圖10和11)。表1:QRFSR在體外和體內對NEP和APN外酶活性的抑制作用(IC5tl)的總結。
權利要求
1.一種肽，其是堿性富脯氨酸淚液蛋白(BPLP)的成熟產物或所述成熟產物的肽衍生物，其中所述肽或肽衍生物: (i)包括序列 Xl-X2-Arg-Phe-Ser-Arg,其中: -Xl代表H原子或Cys氨基酸； -當Xl是H時X2代表Glp ;或者當Xl是Cys時X2代表Gln， 其中所述序列Xl-X2-Arg-Phe-Ser-Arg是所述肽的C末端部分；和 ( )表現出對金屬外肽酶的調控性能。
2.權利要求1的肽，其中所述肽表現出對金屬外肽酶的抑制性能。
3.權利要求1或2的肽，其中所述金屬外肽酶是NEP或APN。
4.權利要求1-3任一項的肽,其由序列Xl-X2-Arg-Phe-Ser-Arg組成,其中: -Xl代表H原子或Cys氨基酸； -當Xl是H時X2代表Glp ;或者當Xl是Cys時X2代表Gin。
5.權利要求4的肽，其由序列CQRFSR組成。
6.權利要求4的肽，其由序列GlpQRFSR組成。
7.編碼權利要求1-6中任一項的肽的核酸。
8.用于克隆和/或表達的載體，所述載體包含編碼權利要求1-6中任一項的肽的核酸。`
9.包含編碼權利要求1-6中任一項的肽的核酸或權利要求8的載體的宿主細胞。
10.特異性識別肽的抗體，所述肽是堿性富脯氨酸淚液蛋白(BPLP)的成熟產物或所述成熟產物的肽衍生物，其中所述肽包含序列Xl-X2-Arg-Phe-Ser-Arg，其中: -Xl代表H原子或Tyr氨基酸或Cys氨基酸； -當Xl是H時X2代表Gln或Glp ;或者當Xl是Tyr或Cys時X2代表Gln， 其中所述序列Xl-X2-Arg-Phe-Ser-Arg是所述肽的C末端部分。
11.權利要求10的抗體,其中所述肽由序列Xl-X2-Arg-Phe-Ser-Arg組成,其中: -Xl代表H原子或Tyr氨基酸或Cys氨基酸； -當Xl是H時X2代表Gln或Glp ;或者當Xl是Tyr或Cys時X2代表Gln。
12.權利要求10的抗體，其中所述肽包含序列QRFSR、YQRFSR、GlpQRFSR或CQRFSR。
13.權利要求12的抗體，其中所述肽由序列QRFSR組成。
14.權利要求12的抗體，其中所述肽由序列YQRFSR組成。
15.權利要求12的抗體，其中所述肽由序列GlpQRFSR組成。
16.權利要求12的抗體，其中所述肽由序列CQRFSR組成。
17.一種用于抑制NEP或APN的藥物組合物，其包含權利要求1-6任一項的肽，以及藥用可接受的載體。
18.—種藥物組合物，其包含編碼權利要求1-6任一項的肽的核酸，或者表達所述核酸的載體。
19.肽在制備用于預防或治療疾病的藥物中的用途，其中在所述疾病中需要調控膜金屬肽酶的活性，其中所述肽是堿性富脯氨酸淚液蛋白(BPLP)的成熟產物或所述成熟產物的肽衍生物，其中所述肽包含序列Xl-X2-Arg-Phe-Ser-Arg,其中: -Xl代表H原子或Tyr氨基酸或Cys氨基酸； -當Xl是H時X2代表Gln或Glp ;或者當Xl是Tyr或Cys時X2代表Gln，其中所述序列Xl-X2-Arg-Phe-Ser-Arg是所述肽的C末端部分。
20.權利要求19的用途，其中所述調控是抑制膜金屬肽酶的活性。
21.權利要求19或20的用途，其中所述金屬肽酶是膜鋅金屬肽酶。
22.權利要求19或20的用途，其中所述金屬肽酶是NEP或APN。
23.權利要求19-22任一項的用途，用于制備預防或治療疼痛的藥物。
24.權利要求23的用途，其中所述疼痛是慢性疼痛、急性疼痛、內臟炎性疼痛或神經性疼痛。
25.權利要求19-22任一項的用途，用于制備預防或治療水-礦物質失衡的藥物。
26.權利要求25的用途，用于預防或治療水-礦物質失衡所引起的骨、牙、腎臟、甲狀旁腺、胰腺、腸、胃粘膜、前列腺、和唾液腺疾病。
27.權利要求26的用途，其中所述疾病選自甲狀旁腺亢進癥或減低癥、骨質疏松癥、胰腺炎、頜下腺結石、腎結石和骨營養不良。
28.權利要求19-22任一項的用途，用于制備預防或治療人際關系及行為障礙性疾病的藥物。
29.權利要求28的用途，其中所述疾病選自回避障礙、感知減退障礙、孤獨癥、兒童多動癥、Hospitalism、人際關系功能障礙以及與外界的關系障礙、精神分裂樣人格障礙、精神分裂癥、對環境的興趣降低、與性相關的社交活動障礙、和性行為障礙。
30.權利要求28的用途，其中所述疾病是抑郁疾病。
31.權利要求19-22任一項的用途，其中所述疾病是炎性關節炎。
32.權利要求19-22任一項的用途，其中所述肽或肽衍生物作為利鈉劑。
33.權利要求19-22任一項的用途，其中所述肽或肽衍生物作為利尿劑。
34.權利要求19-22任一項的用途，其中所述疾病是動脈粥樣硬化。
35.權利要求19-22任一項的用途，其中所述疾病是腫瘤。
36.權利要求19-22任一項的用途，其中所述疾病是炎性腸病。
37.權利要求19-22任一項的用途，其中所述疾病是感染。
38.權利要求19-22任一項的用途，用于制備控制免疫炎癥應答的藥物。
39.權利要求19-22任一項的用途，其中所述疾病是神經退行性疾病。
40.權利要求19-22任一項的用途，其中所述疾病是與淀粉樣變相關的神經退行性疾病。
41.編碼權利要求1-6任一項的肽或肽衍生物的核酸在制備用于預防或治療權利要求19-40任一項所定義的疾病的藥物中的用途。
42.一種用于檢測BPLP或其成熟產物的產生的改變的體外方法，所述方法包括在測試對象的生物學樣品中對BPLP蛋白或其成熟產物進行檢測或定量，并將BPLP蛋白或其成熟產物的產生與對照對象的生物學樣品中的相同物質的產生進行比較。
43.權利要求42的方法，其中通過將生物學樣品與在權利要求10-16任一項所定義的抗體接觸來檢測BPLP或其任何成熟產物的產生。
44.一種用于檢測BPLP或其成熟產物的產生的改變的體外方法，所述方法包括在測試對象的生物學樣品中檢測BPLP基因或其轉錄物的數量和/或質量上的異常。
45.一種用于篩選化合物結合至NEP上的BPLP蛋白或其成熟產物的結合位點的能力的體外方法，其包括以下步驟: a)在存在BPLP蛋白或其成熟產物、或存在任一保留了BPLP蛋白或其成熟產物的結合特異性或生理學活性的肽的情況下，將候選化合物與表達NEP的細胞一起孵育； b)確定候選化合物與BPLP蛋白或其成熟產物、或者與保留了BPLP蛋白或其成熟產物的結合特異性或生理學活性的肽，競爭性結合NEP的能力。
46.權利要求45的方法，其包括以下步驟: a)制備含有NEP上BPLP蛋白或其成熟產物的結合位點的細胞培養物或器官標本或組織樣品； b)加入待測試的候選化合物，與半飽和濃度的標記的BPLP蛋白或其成熟產物、或者與保留了 BPLP蛋白或其成熟產物的結合特異性或生理學活性的肽競爭； c)在存在候選化合物的情況下，并在能發生特異性結合的條件下，將步驟a)的細胞培養物、器官標本或組織樣品孵育足以發生特異性結合的時間； d)在存在不同濃度的候選化合物的情況下，對與細胞培養物、器官標本或組織樣品特異性結合的標記進行定量。
47.一種用于確定與NEP上的BPLP蛋白或其成熟產物結合位點特異性結合的化合物的親和力的方法，其包括以下步驟: a)制備含有NEP上的BPLP蛋白或其成熟產物結合位點的細胞培養物或器官標本或組織樣品； b)加入先前已經標記了放射性或非放射性標記的候選化合物； c)在存在標記的候選化合物的情況下，并在能發生特異性結合的條件下，孵育步驟a)的細胞培養物、器官標本或組織樣品足以發生特異性結合的時間；和 d)在存在不同濃度的標記的候選化合物情況下對與細胞培養物、器官標本或組織樣品特異性結合的標記進行定量。
48.一種用于篩選化合物作為BPLP蛋白或其成熟產物對NEP活性的激動劑或拮抗劑的能力的體外方法，所述方法包括步驟: a)在存在(i)BPLP蛋白或其成熟產物、或任意保留了BPLP蛋白或其成熟產物的結合特異性或生理學活性的肽、和(ii)NEP底物的情況下，將候選化合物與表達NEP的細胞進行孵育； b)確定NEP對NEP底物的內切蛋白酶解作用，其中如果存在候選化合物時的內切蛋白酶解與不存在候選化合物時的內切蛋白酶解相比是增加的，則表明所述化合物具有拮抗劑活性；而如果存在候選化合物時的內切蛋白酶解與不存在候選化合物時的內切蛋白酶解相比是減少的，則表明所述化合物具有激動劑活性。
49.權利要求47的方法，用于篩選作為BPLP蛋白或其成熟產物的激動劑的化合物，其包括以下步驟: a)制備含有NEP的BPLP蛋白或其成熟產物結合位點的細胞培養物或器官標本或組織樣品； b)在存在i)候選化合物、ii)半飽和濃度的BPLP蛋白或其成熟產物或任意保留了BPLP蛋白或其成熟產物的結合特異性或生理學活性的肽、和iii)NEP底物的情況下，孵育步驟a)的細胞培養物、器官標本或組織樣品，所述細胞培養物、器官標本和組織樣品的濃度使得可對NEP酶活性進行檢測，孵育的時間為足以在初始速度條件下發生NEP底物的內切蛋白酶解的時間； c)通過分別測定在存在或不存在候選化合物以及在存在或不存在BPLP蛋白或其成熟產物或保留了 BPLP蛋白或其成熟產物的結合特異性或生理學活性的肽時的NEP底物內切蛋白酶解的水平而對步驟a)的生物學材料中所存在的NEP活性進行定量。
50.權利要求48的方法，用于篩選作為BPLP蛋白或其成熟產物的拮抗劑的化合物，其包括以下步驟: a)制備含有NEP的BPLP蛋白或其成熟產物結合位點的細胞培養物或器官標本或組織樣品； b)在存在次最大濃度的BPLP蛋白或其成熟產物或任意保留了BPLP蛋白或其成熟產物的結合特異性或生理學 活性的肽、NEP底物和候選化合物的情況下，孵育步驟a)的細胞培養物、器官標本或組織樣品，所述細胞培養物、器官標本和組織樣品的濃度使得可在初始速度條件下對NEP酶活性進行檢測，孵育的時間為足以在初始速度條件下發生NEP底物的內切蛋白酶解的時間； c)通過分別測定在存在或不存在候選化合物以及在存在或不存在BPLP蛋白或其成熟產物或保留了 BPLP蛋白或其成熟產物的結合特異性或生理學活性的肽時的NEP底物內切蛋白酶解的水平而對步驟a)的生物學材料中所存在的NEP活性進行定量。
全文摘要
本發明涉及一種肽，所述肽是堿性富脯氨酸淚液蛋白(BPLP)的成熟產物或所述成熟產物的肽衍生物或模擬物，其中所述肽或其肽衍生物或模擬物表現出對金屬外肽酶(特別是NEP和/或APN)的抑制性能。本發明也涉及編碼所述肽的多核苷酸以及涉及針對所述肽的抗體。此外，本發明涉及人BPLP蛋白及其所衍生的抑制肽、編碼人BPLP蛋白或其所衍生的肽的多核苷酸以及針對BPLP蛋白或其所衍生的肽的抗體的診斷性及治療性的用途。
文檔編號C07K14/47GK103183726SQ201210566978
公開日2013年7月3日 申請日期2005年3月18日 優先權日2004年3月19日
發明者卡特琳·魯若, 讓-弗朗索瓦·休奧米, 馬里-諾埃勒·尤恩格霍爾, 安妮·維內爾, 埃弗利娜·杜富爾 申請人:巴斯德研究院