專利名稱：混雜地結合于人類白細胞抗原(hla)ii類分子的腫瘤相關肽的制作方法
混雜地結合于人類白細胞抗原(HLA) I I類分子的腫瘤相關肽描述本發明涉及免疫治療方法，及用于免疫治療方法中的分子與細胞。特別的是，本發明涉及腫瘤的免疫治療方法。本發明更進一步涉及T輔助細胞肽的抗原表位-其單獨或與其它癌癥細胞相關肽結合而作為疫苗組合物的活性藥物成分，所述活性藥物成分刺激抗腫瘤的免疫反應。尤其是，本發明涉及衍生自人類腫瘤細胞系上的人類白細胞抗原(HLA)II類分子的49種新型肽序列，所述肽序列可用于引發抗腫瘤免疫反應的疫苗組合物中。本文此處所提及所有參考文獻均以參考的方式以其全文并入本文。
背景技術：
免疫反應的誘發是依賴被宿主免疫系統視為外來物的抗原存在。癌癥相關抗原的發現已使得藉宿主免疫系統反應干擾腫瘤生長成為可能。目前利用不同的機制控制包括免疫系統的體液的與細胞的抗癌免疫機制正被研究。細胞性免疫反應的特異性成份可以特異性識別與摧毀癌癥細胞。由癌細胞浸潤的細胞群中或由周邊血液分離出的細胞毒性T細胞暗示著這些細胞在自然抗癌免疫反應中起重要作用(Cheever et al. ,Annals N. Y. Acad. Sc1. 1993690:101—112)。特別是 CD8-陽性T細胞(TCD8+)，它可識別I類主要組織相容性復合體(MHC Class I)-所攜帶來自細胞質蛋白質的通常為8至10個殘基的肽，在前述免疫反應中扮演重要角色。人類的主要組織相容性復合體分子(MHC)又被稱為人類白細胞抗原(HLA)。有兩種主要組織相容性復合體分子(MHC) =MHC I類分子(MHC class I),可于大多數呈現經由降解內源性蛋白質與較大肽的有核細胞中發現。MHC II類分子(MHC classII)僅于專職抗原提呈 細胞(APC)，提呈被APC經內吞作用所得外來蛋白質的肽，并被后續處理。肽與MHC I類分子的復合物可被CD8陽性的細胞毒性T細胞所識別，肽與MHC II類分子的復合物可被CD4陽性的輔助性T細胞所識別。CD4陽性的輔助性T細胞在指導抗癌T細胞反應的有效功能上扮演重要角色，因此，腫瘤相關抗原(TAA)衍生的CD4陽性的T細胞抗原表位的鑒別可能對于開發誘發抗癌免疫反應的藥學產品有極大的重要性(Kobayashi, H.，R. Omiya, M.Ruiz, E. Huarte, P. Sarobe, J. J. Lasarte, M. Herraiz, B. Sangro, J. Prieto, F.Borras-Cuestaj and E. Celis. 2002.1dentification of an antigenic epitopefor helper T lymphocytesfrom carcinoembryonic antigen. Clin. CancerRes. 8: 3219-3225.，Gnjatic，S.，D. Atanackovic, E. Jager, M. Matsuo, A. Selvakumar, N.K. Altorki, R. G. Makij B. Dupont, G. Ritter, Y. T. Chen, A. Knuth，and L. J. Old. 2003.Survey of naturalIy occurring CD4+T_cell responses against NY-ESO-1incancer patients : Correlation with antibody responses. Proc. Natl.Acad.Sc1.U. S. A. 100(15) :8862-7)。在如小鼠等哺乳動物模式中顯示，即便無細胞毒性T細胞(亦即CD8陽性T細胞)，⑶4陽性T細胞仍可藉由分泌INF-Y抑制血管生成而足以抑制腫瘤形成(Qin, Z. and T. Blankenstein. 2000. CD4+T-cell-mediated tumor rejection involvesinhibition of angiogenesis that isdependent on IFN gamma receptor expression bynonhematopoietic cells.1mmunity. 12:677-686)。此外，CD4 陽性 T 細胞識別的由人類白細胞抗原II類分子所提呈的腫瘤相關抗原肽能夠通過抗體(Ab)反應的誘導來對抗腫瘤的發展(Kennedy, R. C. , M. H. Shearer, A. M. Watts, and R. K. Bright. 2003. CD4+T lymphocytesplay a critical role in antibodyproduction and tumor immunity against simianvirus 401arge tumorantigen. Cancer Res. 63:1040-1045)。相對于腫瘤相關妝結合于人類白細胞抗原I分子，至今僅有少數TAA的人類白細胞抗原II類配體(ligand)被描述(www. cancerimmunity. org, www. syfpeith1. de) 因為 HLA II 的組成性表達多局限于免疫系統的細胞(Mach, B. , V. Steimle, E. Martinez-Soria, and ff. Reith. 1996. Regulationof MHC class II genes: lessons from a disease. Annu. Rev.1mmunol. 14:301-331),所以直接由原始腫瘤分離出可與人類白細胞抗原II結合的肽被認為是不可能的。因此，許多將抗原靶向APC的人類白細胞抗原II類處理途徑的策略已經被發掘，例如將感興趣的抗原與APC —起培育，以致抗原被吸收、處理與提呈(Chaux, P.，V. Vantomme, V.Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A. M. Eggermont, T. Boon, and B. P. vander Bruggen. 1999.1dentification of MAGE-3epitopes presented by HLA-DRmoleculesto CD4(+)T lymphocytes. J. Exp. Med. 189:767-778),或將能編碼感興趣的抗原的基因或微基因轉染細胞，以及融合入不變鏈-此不變鏈可介導抗原轉移位置至溶酶體的MHC II類處理及裝配的隔室(MIIC)。肽必須與MHC分子結合才能引發(產生)細胞免疫反應。這個過程是有賴于MHC分子的等位基因與肽氨基酸序列的特異多態性。結合于MHC I類分子的肽通常有8至10個殘基長度且具有兩個保守性殘基(“錨”)可與MHC分子上相對應的結合槽交互作用。當無炎癥反應時，MHC II類分子的表達主要局限于免疫系統的細胞，特別是專職的抗原呈現細胞(APc)jn:單核細胞、單核細胞衍生細胞、巨噬細胞與樹突細胞。
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可為特異抗腫瘤的細胞毒性T淋巴細胞所識別的抗原，亦即它們的抗原表位，可以是來自所有各類蛋白質的分子，例如酶、受體、轉錄因子等等。更近一步，舉例來說，腫瘤相關抗原如突變基因、不同的開放閱讀框(open reading frames),或蛋白質剪接的產物(Vigneron N，Stroobant V, Chapiro J, Ooms A, Degiovanni G, Morel S，van der BruggenP，Boon T, Van den Eynde BJ. An antigenic peptideproduced by peptide splicing inthe proteasome. Science. 2004Apr 23; 304 (5670) : 587-90.)可只存在于腫瘤細胞。另一類重要的癌癥相關抗原是組織特異的結構，如表達于不同種類的腫瘤細胞或于睪丸正常組織的CT (癌睪丸)抗原。各樣的腫瘤相關抗原已經被發現。更甚者，更多的研究力量致力于發現其它癌癥相關基因。某些類的腫瘤相關抗原，在本領域被稱為腫瘤特異性抗原，是組織特異的。相關例子包含，但不限于，黑色素細胞瘤的酪胺酸酶，前列腺癌的PSA與PSMA以及淋巴瘤的bcr與abl的染色體互換。然而許多腫瘤相關抗原在多種不同腫瘤所發現，且有些如致癌基因的蛋白質產物以及/或抑癌基因(抑癌基因如此篇評論腎癌Linehan WM, Walther MM, ZbarB.The genetic basis of cancer ofthe kidney. J Urol. 2003Dec;170(6Pt I):2163-72)是真正導致轉型的因素，而這幾乎發生在所有種類的腫瘤。例如，控制細胞成長與分化的正常細胞蛋白質，如p53(本身是腫瘤抑制基因的例子)、raS、C-met、myC、pRB、VHL與HER-2/neu等,可因這些基因產物的過度表達累積突變而使他們具致癌性(McCartey等人CancerResearch 199815:582601-5 ;Disis 等人 Ciba Found. Symp. 1994187:198-211)。在許多癌癥中，這些突變蛋白質可作為腫瘤特異免疫反應的靶標。為了讓細胞毒性T細胞能將這些蛋白質識別為腫瘤特異抗原并用于治療，必須符合特殊的需求。抗原必須主要表達于腫瘤細胞而非正常健康的組織或是相對少量。更近一步的條件，各自的抗原不只是表達于單一種類腫瘤，且要以高濃度形式表達(如每個細胞的份數)。最基本的是抗原氨基酸序列上需有抗原表位，因為這種來自一腫瘤相關抗原肽(“產生免疫反應的肽”)應該會引發活體中或離體中的T細胞反應。直到目前，已有許多策略描述將標的抗原送入II類處理通路中。將抗原呈現細胞與感興趣的抗原一起孵育以使之被帶入細胞并處理是可能的(Chaux, P. , Vantomme, V.
，Stroobant, V.，Thielemans, K.，Corthals, J.，Luiten, R.，Eggermont, A. M.，Boon, T. &vander, B. P. (1999) J. Exp. Med. 189,767-778)。其他方法使用包含分解微粒的標的序列的融合蛋白。這種融合蛋白表現于抗原呈現細胞，可將抗原帶至II類處理隔室(Marks，M.S. , Roche, P. A. , van Donselaar, E. , Woodruff, L. , Peters, P. J. &Bonifacino, J. S. (1995)J. Cell Biol. 131, 351-369, Rodriguez, F. , Harkins, S. , Redwine, J. M. , de Pereda, J.M. &ffhitton, J. L. (2001) J. Virol. 75，10421-10430)。T輔助細胞在指揮細胞毒性T細胞的抗癌免疫反應中扮演重要角色。啟動THl形式的T輔助細胞反應其T輔助細胞的抗原表位支持著CD8陽性毒殺T細胞的功能，這包含直接針對在細胞表面表現腫瘤相關肽與MHC分子復合體的腫瘤細胞的毒殺功能。以此方式，不管是單獨存在或與其他腫瘤相關肽結合的腫瘤相關T輔助細胞的肽抗原表位，可作為疫苗的活性藥物成分以刺激抗腫瘤的免疫反應產生。發展腫瘤疫苗的主要難題是找出新的腫瘤相關抗原，并對由該抗原所得到的可引發免反應且可被CD4陽性的CTL所識別的T輔助細胞的抗原表位定性。因此，本發明的目標就是為此種肽提供新的氨基酸序列，該肽具有與MHC II類分子結合的能力。依據本發明，其目標藉由提供選自至少包含附件所列序列群的SEQ ID No.1至SEQ IDNo. 49序列的腫瘤相關肽，這些肽具有結合至人類主要組織相容性復合體(MHC)I類分子的能力，只要該肽不是完整的人類腫瘤相關多肽。于本發明中，本發明人展示直接由哺乳類腫瘤分離并定性可結合于HLA II類II類分子上的肽是可能的，尤其是實體瘤，如腎細胞癌與結腸癌。本發明提供源自于與腫瘤生成相關抗原的肽，以及與HLA II類分子結合后足以觸發人類白細胞(尤其是淋巴細胞，特別是T淋巴細胞中可介導THl免疫反應的CD4陽性的T淋巴細胞)的免疫反應。該類源自于與腫瘤生成相關抗原的肽，尤其是指具有蛋白質水解、血管生成、細胞生長、細胞周期調控、細胞分裂、轉錄調控、轉譯調控，或組織侵入(如來自基質金屬蛋白酶-7的腫瘤相關肽(MMP7;SEQID No.1)以及胰島素樣生長因子結合蛋白3(IGFBP3;SEQ ID No. 25)等功能的腫瘤相關抗原。本發明人于本發明中亦提供確實的證據，指出腫瘤相關肽充分的與HLA II類分子混雜地結合，特別是那些遺 傳上由人類基因組HLA DR所在所產出的HLA II類分子，可以引發由人類CD4陽性的T淋巴細胞介導的免疫反應。由人類外周血液分離出CD4陽性的T淋巴細胞，顯示該類肽是適于觸發人類免疫系統的T細胞反應對抗腫瘤細胞肽譜中所選的肽。因為肽可以化學方式合成而作為具制藥活性的成分，本發明人的發明所提供的肽可作為免疫療法，尤其是癌癥免疫療法。為了由TAA鑒定出HLA II類分子以發展以肽為基礎的免疫療法，本發明人試圖直接由實體瘤切片分離出HLA-DR呈現的肽，該實體瘤特別是指腎細胞癌(RCC)-此類癌細胞已經被報導可表達 II 類分子(Gastl, G. , T. Ebert, C. L. Finstad, J. Sheinfeld, A.Gomahr, ff. Aulitzky, and N. H. Bander. 1996. Major histocompatibility complex class
Iand class IIexpression in renal cell carcinoma and modulation by interferongamma. J. Urol. 155:361-367)。即便大多數腫瘤細胞是II類分子陰性，以目前發展中的質譜儀的敏感水平應可提供足以由少數腫瘤細胞中、或是由可能交叉呈現TAA的浸潤的白細胞中、或是由成長的腫瘤外圍的基質細胞鑒定出II類分子。聚焦于RCC的原因是要以展示以下的技術證明概念每年世上約150，000人被診斷摧患RCC,此疾病具相當高的死亡率，造成每年約78，000人死亡(Pavlovich, C.P. and L. S. Schmidt. 2004. Searching for the hereditarycauses of renal—cellcarcinoma. Nat. Rev. Cancer 4:381-393)。若被診斷出有轉移現象，則一年的存活率降至約 60%(Jemal, A. , R. C. Tiwari, T. Murray, A. Ghafoor, A. Samuels, E. Ward, E.J. Feuer, and M. J. Thun. 2 004. Cancerstatistics, 2004. CA Cancer J. Clin. 54:8-29),此指標預告著未達成的醫療需求。因為RCC似乎是一種可引發免疫反應的腫瘤(OliverRTD,Mehta A,Barnett MJ. A phase 2study of surveillance in patients withmetastatic renalcell carcinoma and assessment of response of such patientsto therapy onprogression. Mol Biother. 1988;1:14-20. Gleave M, Elhilali M, FrodetY, et al.1nterferon gamma-1b compared with placebo in metastatic renalce 11 carcinoma. NEngl J Med. 1998; 338:1265),這由對腫瘤反應與浸潤腫瘤的CTL可顯示(Finke, J. H. , P. Rayman, J. Alexander, M. Edinger, R. R. Tubbs, R. Connelly, E. Pontes, andR. Bukowsk1. 1990. Characterization of thecytolytic activity of CD4-positive andCD8-positive tumor-1nfiltratinglymphocytes in human renal cell carcinoma.Cancer Res. 50:2363-2370)，為發展以肽為基礎的抗腫瘤疫苗的臨床試驗已經開始(ffierecky J, MuellerM, Brossart P.Dendritic cell-based cancer immunotherapytargeting MUC-1. Cancer Immunol Immunother. 2005Apr 28)。然而，由于缺乏來自 TAA 的輔助T細胞的抗原表位，分子定義疫苗通常包含肽，而其功能僅止于HLAI類分子的配合體。在引導至本發明的研究工作中，本發明人由10個RCC樣本、3個結腸直腸癌(CCA)以及I個移型細胞癌(TCC，尿路移行細胞癌)中可分離出HLA II類分子配合體。只有由此方式所鑒定出的來自TAA所選的配合體有一致的能力1.源自已知腫瘤相關抗原2.可結合至最常見HLA II類DR等位基因-HLA DRB1*0101 ;與3.有與其它大部分HLA II類配合體區分開來的特性，因為該配合體符合可混雜地結合至來自至少兩種不同等位基因的HLA DR分子的一級氨基酸序列的條件。如下述以來自MMP7 (SEQ ID No.1)肽的范例所示，這些混雜地與HLA DR結合的腫瘤相關肽被發現可被⑶4陽性T細胞所識別。
本發明的第一觀點為提供肽，該肽包含一根據由SEQ ID No.1至SEQ ID No. 49或其中任一的變化的氨基酸序列，只要該衍生的氨基酸序列(亦即，任一在連接ID位置所列的全長序列(登錄號參見以下所附表一)非衍生自完整的人類多肽。如以下所述，以本發明為基礎的該肽已經全數被鑒定出可為帶有MHC II類分子細胞(RCC)所呈現。因此，這些特殊的肽與其它包含這種序列(亦即，衍生的肽)的肽將即有可能引發一專一性的T細胞免疫反應，雖然這些反應程度可能會因肽的不同而有所差異。這些差異，可能是由于如該肽的突變(參見以下)所造成。本領域技術人員清楚地了解用以鑒定哪一種肽引起何種程度反應的方法，尤其是本文所提及的參考資料及其相關文獻。更好的是，依據本發明基本上包含依據任一由SEQ ID No.1至SEQID No. 49或其變異的氨基酸序列的肽。“基本上包含”應指依據本發明的肽，除了含任一 SEQ ID No.1至SEQ ID No. 49或其變異的序列，包含多余的N端與/或C端延伸的氨基酸，該延伸的氨基酸并不必須是弓I發免疫反應的核心肽序列(包含結合部位并作為引發免疫反應的T輔助細胞的抗原表位)的部分組成。然而，這些延伸的氨基酸對于提供一個將依據本發明的肽有效導入至細胞是重要的。于本發明的一個實施例中，本發明的肽包含衍生自NCB1、GenBank登錄號X00497 (Strubin, M. , Mach, B. and Long, E. 0. Thecomplete sequence of the mRNA forthe HLA-DR-associated invariant chainreveals a polypeptide with an unusualtransmembrane polarity EMBO J. 3 (4)，869-872 (1984))的 HLA-DR 抗原相關不變鏈(28頁，于其下“Ii”)的N端的80個氨基酸。藉由一個所給的氨基酸序列“變體”，本發明人是指如一或兩個氨基酸基的側鏈被改變(如以其他自然介存在的氨基酸基或其他側鏈取代)而使這肽基本上仍可像含所給的氨基酸序列的肽一樣 結合于HLA分子。例如，肽可被修改而如果沒改善但至少保留與適當的MHC分子(如HLA-A)交互作用或結合的能力，而使之至少保留產生活化CTL的能力，該活化的CTL可辨別并毒殺表現攜帶發明者所定義的氨基酸序列的多肽的細胞。某些HLA-A結合肽的位置，如以下描述可于資料庫取得，是典型的固定殘基，這些殘基形成一符合HLA結合槽結合部位的核心序列。那些非必須與T細胞受體反應的氨基酸殘基可以用其它氨基酸取代而修改，引進這些氨基酸基本上不會影響T細胞反應，并且不會去除結合至相關MHC分子的能力。因此除了先前提及本發明的肽外，還可以是任何包含這些鞍基酸序列或序列的一部分或其它所提及該肽的變異(本發明人所指包含寡肽與多肽)。不僅已知由MHC II類呈現的肽是由一個含HLA特異氨基酸功能域的“核心序列”，而且該肽任意的N端與/或C端延伸并不干擾核心序列的功能(亦即，被認為與肽和T細胞間的反應無關)。N端與/或C端延伸可以分別是介于I至10個氨基酸長度。因此，一個本發明中理想的肽全長介于9至100個氨基酸，優選介于9至30個氨基酸。這些肽可直接裝載于MHC II類分子或此序列可依據以下所述方法被克隆至載體。這些肽來自于細胞內處理較大肽的終產物，較長的肽亦可使用。本發明的肽可以是各種長度。按一般來說他們的分子量少于100000，優選是少于50000，更優選是少于10000且一般約是5000。以氨基酸殘基數目而言，本發明的肽可以是少于1000殘基，優選的是少于500個殘基，更好是少于100個殘基。如果一肽有多于12個氨基酸殘基直接用在結合于MHC分子，優選的是這些鄰近HLA核心結合序列殘基實質上不影響此肽特異地結合在MHC分子的結合槽或影響呈現肽予細胞毒性T細胞。然而，就如先前所言，較大的肽會被使用是可理解的，特別是由一多核苷酸所轉譯，因為這些較大的肽可被適當的抗原呈現細胞所降解。MHC配合體、功能域、變異的肽范例以及某些N端與/或C端延伸的范例，可以是如衍生自網站http://syfpeith1. bm1-heidelberg. com/的SYFPEITHI數據庫以及該網站所引用的參考文獻。至于不限定的范例，如在該數據庫中某些針對HLA-DR的肽為K HKVYACEVTHQG L S S，此為衍生自 Ig K 鏈的 188-203 位置(Kovats et al. Eur JImmunol. 1997Apr; 27 (4) :1014-21) ；K V Q WKV DN ALQS G N S，此為衍生自 Ig k 鏈的 145-159 位置(Kovats et al. Eur J Immunol. 1997Apr; 27 (4) :1014-21) L P R L I A FTSEHSH F 為衍牛自 GAD65270-283位置(Endl et al. J Clin Invest. 1997Mayl5; 99 (I0) :2405-15)，或F FRMVISNPA ATHQDIDFL I 為衍生自 GAD65556-575 位置(Endl et al. J Clin Invest. 1997Mayl5; 99 (10) : 2405-15)。此外，肽還可以為衍生自抗原的突變序列，如此例ATGFKQSSKA LQRPVA S，此為衍生自bcr-abl 210kD融合蛋白(ten Bosch et al. Blood. 1996Nov I; 88 (9) :3522-7) ；G Y K V LV L N P SV A A T,此為衍生自 HCV-1NS328-41 位置(Di印older etal. J Virol. 1997Aug; 71 (8) :6011-9);或￡R K Q N P D I VI Q Y M D DL Y V G，此為衍生自 HIV-1 (HXB2) RT 326-345 位置(van derBurg etal. J Immunol. 1999Jan I; 162 (I) : 152-60)。所有”錨”的氨基酸(參見 Friede etal.,Biochim Biophys Act a. 1996Jun 7;1316 (2):85—101;Sette etal. JImmunol. 1993Sep15;151 (6):3163-70. ;Hammer et al. Cell. 1993Jull6;74(I):197-203. , and Hammer etal. J Exp Med. 1995Mayl; 181 (5) : 1847-55。針對 HLA-DR4 的例子)已經以粗體字標示，而預測的核心序列則于其下畫線(以底線)標示。以上全部所敘述的肽囊括于所敘述的氨基酸序列的“變異”。發明人在此所提及的“肽”，不只包含由肽鍵(-C0-NH-)所連接的氨基酸殘基而成的分子，也包含肽鍵反轉的分子。此種連接順序顛倒-改變構型的胺肽模擬物可以此領域已知的方法制造，例如在此篇列入本發明參考數據的論文所描述(Meziere et al (1997)J.1mmunol. 159，3230-3237)。該方法包含制造有變異的偽肽，這些變異包含骨干，且不是側鏈的方向。Meziere等人(1997)展示，這些偽肽至少對MHCII類分子與T細胞反應是有效的。此種連接順序顛倒-改變構型的肽，包含NH-CO鍵而非CO-NH肽鍵，較能抵抗蛋白質分解。一般來說，本發明的肽，如果由抗原呈現細胞所表達，可以被處理產生一可結合至適當的MHC分子的片段，可被適當的細胞呈現而引發適當的T細胞反應。從這肽所產生的片段也可以是本發明的肽。方便地，本發明的肽包含一部分帶有所給的氨基酸序列或部分或變異，以及一個多出的部分符合一些值得有的的特性。例如，這多出的部分，包含一多出的T細胞抗原表位(不管是否如第一個T細胞抗原表位一樣得自同一多肽)，或者它可能包含一攜帶蛋白或肽。因此，在一實施例中本發明的肽為一截短的人類蛋白或一蛋白質片段與其它多肽部分的融合蛋白，如果這些人類蛋白質包含一或多個本發明的肽序列。
在一個優選實施例中，本發明的肽包含本發明的氨基酸序列以及至少一延伸的T細胞抗原表位，其中這T細胞抗原表位是足以促使針對此種型態腫瘤的T細胞反應且該腫瘤異常地表達一腫瘤相關抗原。因此，本發明的肽包含一所謂“在線的珠子”(beads on astring)的多肽可作為疫苗。由下所述將可了解在某些本發明肽的應用中可被直接使用(亦即，他們并非于病人細胞中或者是在給予病人的細胞由多核苷酸表達所產生)；這些應用中優選的肽是包含少于100或50個氨基酸殘基。本發明優選的肽是全長介于9至30個氨基酸殘基。本發明肽的優選例子是可以結合到HLA-DR。特別優選的例子是可特異地結合至HLA-DRB 1*0101 的肽。本發明的另一觀點，相似于如前述針對MHC II類分子的狀況，本發明的肽可用以誘發MHC I類分子特異的T細胞反應。本發明的優選MHC I類分子特異的肽全長介于9至16，最好是9至12個氨基酸。需知道的是，該類肽可以較長的肽使用(例如用于疫苗)，類似于MHC II類肽。方法用于鑒定具有一針對HLA I類分子的某些HLA特異氨基酸功能域的MHC I類特異“核心序列”已為本領域技術人員所知并預測，例如以計算機軟件 PAProC(http://www. un1-tuebingen. de/uni/kxi/)與 SYFPEITHI(http://www.syfpeith1. de)。本發明的肽對使用于免疫治療方法中特別有效，該免疫治療方法是用標識與毒殺異常地表達本發明肽為基礎的多肽的細胞。因為這些特殊的肽包含可結合至HLA-DR之所給予的氨基酸序列，優選的是本發明的肽是結合至HLA-DR并且當此HLA-DR-肽復合體存在于一適當的抗原呈現細胞表面，可以誘使CTL的產生，而該CTL識別細胞異常表達包含所給予的氨基酸序列的多肽。于本發明的一實施例中，本發明的肽包含衍生自NCB1、GenBank登錄號X00497的HLA-DR抗原相關不變鏈(28頁，于其下“Ii”)的N端的80個氨基酸(亦可參見下文)。
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此處所提的“異常表達”包含以下解釋這些多肽相較于正常表達量是過度的，或是在腫瘤所取出的組織該基因是不表達，但卻在腫瘤表達。此處所言的“過度表達”是指這些多肽表達量至少是正常組織的1. 2倍；優選的是正常組織的2倍，更優選是5或10倍。肽(至少是那些在氨基酸殘基間包含肽鍵)可以Fmoc-聚酰胺形式作固相合成這已由Lu等人(1981)于J. Org. Chem. 46，3433與該文參考數據中揭示。暫時的N-端胺基組的防護可由9_荷甲氧羰基(9_f luorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) group)所達成。以20%呱啶溶在二甲基甲酰胺中重復切除此對堿敏感的防護組。側鏈的功能可以其丁醚(butyl ethers)衍生物(在此指絲氨酸、蘇氨酸與酪氨酸)、丁酯(butyl esters)衍生物(在此指麩氨酸、天門冬氨酸)、叔丁氧輕基(butyloxycarbonyl)衍生物(在此指離氨酸、組氨酸)、三苯基(trityl)衍生物(在此指半胱氨酸)、4_甲氧基-2，3，6三甲基苯硫酷(4-methoxy-2, 3, 6-trimethylbenzenesulphonyl)衍生物(在此指精氨酸)衍生物保護。在此麩胺酰與天門冬氫酉先是C端的殘基,是以4，4’ - 二甲基(4，4’ -dimethoxybenzhydryl)組作為保護側鏈胺基功能而制造出。此處固相支撐是基于以三單體的二烯-丙烯酰胺(dimethylacryIamide)(骨架單體)、二丙烯酸乙烯(bisacryloylethylene diamine)(橫向連接)與丙烯酰基肌氨酸烯酸酯(acryloylsarcosine methyl ester)(功能性試劑)所組成的聚二烯-丙烯酰胺(polydimethyl-acrylamide)多聚體。對酸敏感的4_輕甲基-苯氧乙酸(4-hydroxymethyl-phenoxyacetic acid)的衍生物被用于作為切開肽與樹酯間連接的試劑。除麩氨酸、天門冬氨酸是以反式N，N'-二環己基碳化二亞胺/1-羥基苯并三唑(N,N-dieyelohexy 1-carbodiimide/lhydroxybenzotriazoIe)介導的稱合方法加入，其它所有氨基酸衍生物是以其本身對稱的無水衍生物被加入。所有耦合與去防護反應是以苯并戊三酮(ninhydrin)、三硝基苯橫酸(trinitrobenzene sulphonic acid)或卩引哚醌(isotin)測試方法監測。完成合成后，肽是施以95%三氟醋酸(trifluoroacetic acid)與包含50%清除剤混和伴隨除去側練保護組由樹酯上被切下。常用清除剤有乙二硫醇(ethandithiol)、酹(phenol)、苯甲醚(anisole)與水，真正的選擇是基于要合成的肽的氨基酸組成。一固相與液相合并的合成方法是可能的(例如可參見Bruckdorfer T, Marder 0, AlbericioF.From productionof peptides in milligram amounts for research to mult1-tonsquantities fordrugs ofthe future. Curr Pharm Biotechnol. 2004Feb; 5 (I) : 29-43 與該文的參考數據)。三氟醋酸以抽氣的方式去除，接著以二乙烯乙醚(diethyl ether)產生粗制的肽粉末。任何存在的清除劑可以簡單萃取步驟去除，在這步驟以低壓凍干以使液相的天然的肽完全無清除劑。合成肽所需的試劑一般可由Calbiochem-Novabiochem(UK)Ltd, Nottingham NG72QJ，UK 購得。
純化可受任何一個或組合技術所影響，這些技術如分子大小排斥層析、離子交換層析、疏水色譜法以及(通常)使用氰甲烷/水密度分離的逆相高效能液相層析。肽的分析，可使用薄層層析法、逆相高效能液相層析、酸水解后的氨基酸分析、與快速原子轟擊質譜分析，以及MALDI與ES1-Q-TOF質譜分析。本發明更進一步觀點提供一可編碼本發明肽的核苷酸(如多核苷酸)。此多核苷酸可為DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA或以上的組合，且多核苷酸本身可含或不含內含子-只要其本身可編碼這些肽。當然，只有包含天然的肽鍵的天然氨基酸殘基的多肽才可能由多核苷酸編碼出。本發明更進一步觀點提供一可表達本發明的多肽的表達載體。許多方法被發展以可操作地連接多核苷酸(特別是DNA)到載體，如藉由互補的且有黏合力的終端。舉例來說，一大片互補的共聚物可以加到欲插入載體DNA中的DNA片段上。此載體DNA與此DNA片段隨后以互補的共聚物拖曳端的氫鍵合而形成重組DNA分子。合成的連接子(linker)包含一或多個限制酶區，這提供另一方法以連接DNA至載體。如先前所提及，這個以內核酸酶限制切除而產生的DNA片段，經噬菌體T4DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶處理，這兩種酶以其3’ -5’的外切活性去除3’單股終端，并以其聚合酶活性填補嵌壁式的3’端。這些步驟的組合形成鈍端的DNA片段。鈍端片段與大量的連接子(linker) —起在催化連接鈍端的酶(如噬菌體T4DNA連接酶)存在下反應。如此，此反應的產物是DNA片段在其終端帶有連接子序列的多聚體。這些DNA片段隨即以一可產生與這些DNA片段兼容的互補終端的酶切開。合成的連接子包含不同的限制酶切除位置可由許多如InternationalBiotechnologies Inc. (New Haven, CN, USA.)供貨商購得。一優選方式修飾可編碼本發明多肽的DNA是使用由Saiki等人于1988年Science239，487-491所提出的聚合酶鏈反應。此方法可用于將DNA導入適當載體，如藉由操縱適當的限制酶切除位置、或以此領域已知其它有用方式技術修改DNA。在此法中用酶擴大的DNA其緊接的鄰近兩個特殊的啟動子已被囊括于擴大的DNA中。該特殊引子可包含限制性內切酶識別位置，以此領域已知方法利用該限制性內切酶識別位置可將引子導入表達載體。此DNA(或在此例中的反轉錄載體，RNA)于適當宿主中表達以產生包含本發明組合的多肽。因此，由此DNA譯碼所得的包含本發明組合的多肽可用于已知的技術，以此處所提及的技術觀點作適當的修正，以構造一個表達載體，此載體隨后用于使一適當宿主細胞轉型以表達及產出本發明的多肽。這些技術包含在以下專利所提及于1984年四月三日授予Rutter等人的美國專利編號4，440, 859、于1985年七月二十三日授予Weissman等人的美國專利編號4，530，901、于1986年四月十五日授予Crowl等人的美國專利編號4，582，800、于1987年六月三十日授予Mark等人的美國專利編號4，677，063、于1987年七月七日授予Goeddel等人的美國專利編號4，678, 751、于1987年^ 月三日授予Itakura等人的美國專利編號4，704，362、于1987年十二月一日授予Murray等人的美國專利編號4，710，463、于1988年七月十二日授予Toole等人的美國專利編號4，757，006、于1988年八月二十三日授予Goeddel等人的美國專利編號4，766，075、于1989年三月七日授予Stalker等人的美國專利編號4，810，648，以上所提各專利均為本文參考數據。此DNA(或在此例中的反轉錄載體，RNA)解碼所得的包含本發明組合的多肽可接在許多不同DNA序列而導入適當宿主。此伴隨DNA是依宿主、或依將DNA導入宿主的方式而定，不論是否需要基因體外的維護或插入。—般說來，DNA是以適當方向與正確開放讀架插入一表達載體中而表達,如質體。如果需要，此DNA可以串接至可被所用宿主所識別的適當轉錄與翻譯調控核酸序列，雖然這些控制是可在一般載體中發現。此載體隨后以標準技術被導入宿主。因此，選出被轉型的宿主細胞是必要的。一種選擇的技術是導入一段DNA序列至表達載體，以適當的控制元素能在轉型細胞中表達出可 選擇的特征如對抗生素的抗藥性。另一種方法，這種可選擇的特征可在另一表達載體，可與前述載體一同轉型宿主細胞。以被重組DNA轉型的宿主細胞將會以本文所提的技術觀點、以此領域所熟知的技術在適當狀況下培養足夠時間，以使表達肽隨后并取得。許多已知表達載體包含細菌(大腸桿菌與枯草桿菌)、酵母菌(如Saccharomycescerevisiae)、絲狀菌(如Aspergillus)、植物細胞、動物細胞、與昆蟲細胞。優選的可使用RCC 或 Awells 細胞。啟動子是一由DNA序列所形成的控制基因表達要素，RNA多聚酶可以結合在其上使轉錄開始進行。兼容于示范細菌宿主的啟動子序列通常以質體載體方式提供，此質體載體包含便利的限制酶切除區以插入本發明的DNA序列。典型的原核載體質體包含 BioradLaboratories(Richmond, CA, USA)的 pUC18、pUC19、pBR322 與 pBR329,與Pharmacia(Piscataway, NJ, USA)的 pTrc99A 與 pKK223_3。一典型哺乳動物細胞載體質體pSVL可購自Pharmacia (Piscataway, NJ, USA)。此載體使用SV40晚期啟動子驅動克隆基因的表達，在T抗原表達細胞-如C0S-1細胞，發現最高程度表達。PMSG是一個可誘發表達的哺乳動物細胞載體，亦可購自Pharmacia。這個載體使用小鼠乳癌病毒長終端重復的啟動子，其可由糖皮質激素驅動克隆基因的表達。有用的酵母菌質體載體如 pRS403_406 與 pRS413_416 可購自 Stratagene Cloning Systems, LaJolla, CA 92037，USA。質體 pRS403、pRS404、pRS405 與 pRS406 是酵母菌的插入質體(YeastIntegrating plasmids)，其中包含酵母菌可選擇的標志 HIS3、TRP1> LEU2 與 URA3。質體pRS413_416是酵母菌中心體質體(YeastCentromere plasmids)。還由其它此領域熟知的可用于許多不同宿主細胞的載體與表達系統。本發明也與以帶有本發明的多核苷酸的載體轉型宿主細胞有關。宿主細胞可以是原核或真核細胞。原核宿主細胞在某些情況下使用細菌細胞是優選的選擇，通常會使用大腸桿菌，例如可由 BethesdaResearch Laboratories Inc. , Bethesda, MD, USA 購得的 DH5菌株，以及可由 American Type Culture Collection (ATCC) of Rockville, MD, USA 購得的菌株RRl (編號ATCC 31343)。優選的真核宿主細胞包含酵母菌、昆蟲與哺乳動物細胞，優選的選擇是來自脊椎動物如小鼠、大鼠、猴子或人類纖維或腎臟細胞株。酵母菌宿主細胞包括 YPH499、YPH500 與 YPH501 等一般可由 Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA92037，USA所購得。優選的哺乳動物細胞包括中國蒼鼠卵巢細胞(CHO)CCL6可自ATCC取得、NIH瑞士小鼠胚胎細胞株NIH/3T3可以CRL 1658編號自ATCC取得、猴子腎臟細胞株C0S-1可以CRL 1650編號自ATCC取得以及人類胚胎腎臟細胞293細胞株。優選的昆蟲細胞是Sf9細胞株其可為枯草桿菌表達載體所轉染(transfect)。以本發明的DNA構成以 轉型適當宿主細胞是藉由所熟知的方法達成，而這些一般是由所用的載體類別來決定。以轉型原核細胞宿主為例Cohen等人所著的(1972)PrOC.Natl. Acad. Sc1. USA 69，2110 以及 Sambrook 等人所著的(1989) Molecular Cloning, ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY。針對酵母菌細胞的轉型描述于Sherman等人所著的(1986)Methods In Yeast Genetics, ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY。Beggs 于(1978) Nature275, 104-109 所提的方法也很有用處。針對脊椎動物細胞，用于此類細胞轉型的試劑，如磷酸鈣與DEAE-dextran或脂肪微粒配方，可自 Stratagene Cloning Systems, or Life TechnologiesInc.，Gaithersburg, MD20877, USA取得。電穿孔也是極佳用于轉型與/或轉染(transfect)細胞，此法也是本領域所熟知用于轉型酵母菌細胞、細菌細胞、昆蟲細胞與脊椎動物細胞。成功轉型的細胞，即包含本發明的DNA結構的細胞，可以熟知的技術鑒定。例如，導入本發明的架構的細胞，可以成長以產出本發明的多肽。經收集并融解的細胞，其DNA成分可以用Southern于1975年發表(J. Mol. Biol. 98，503)或Berent等人于1985年發表(Biotech. 3，208)的方法檢測DNA的存在。另外，懸浮液中蛋白質的存在可以如以下所述用抗體檢測。除了直接檢測重組DNA存在外，當重組DNA可以指揮蛋白質表達時，可以用免疫學的方法鑒定成功轉型的細胞。例如，經一可表達適當抗原性的表達載體成功轉型的細胞。疑似被轉型的細胞樣本經收集與以適當抗體測試蛋白質存在。此外，除了轉型宿主細胞本身夕卜，本發明亦仔細考慮這些細胞的在培養基中培養，最優選的是單株(均質性培養)，或來自單株培養的細胞。 大家將了解本發明的某些宿主細胞，對制備本發明的肽很有用處，例如細菌細胞，酵母菌細胞與昆蟲細胞。然而，其它宿主細胞在某些治療方法更為有用。例如，抗原呈現細胞，如樹突狀細胞，適用于表達本發明的肽，因為這些肽會被裝載于適當的MHC分子。
本發明的進一步的觀點是提供一方法生產肽以作為血管內注射(iv)、皮下注射、皮間注射、腹腔注射、肌肉注射。肽優選的注射方式為皮下注射、皮間注射、腹腔注射、肌肉注射與血管內注射。DNA優選的注射方式為皮間注射、肌肉注射、皮下注射、腹腔注射與血管內注射。DNA或肽注射劑量介于I至500微克。本發明的進一步的觀點是關于使用根據本發明的腫瘤相關抗原、根據本發明的核苷酸或者是根 據本發明的表達載體于醫學上。本發明的進一步的觀點是提供一個殺傷病人體內異常地表達包含本發明氨基酸序列的多肽的標的細胞，此法包含施予病人一有效劑量的本發明的肽、或一有效劑量的多肽，或一可產出本發明肽的表達載體；其中該肽或該多肽或該表達載體的量是足以引發該病人的抗標的細胞的免疫反應。代表性地該標的細胞可為腫瘤或癌細胞。此肽或編碼肽的核酸組成腫瘤或癌疫苗。疫苗可直接施予病人，直接打入受影響的器官或全身性，或以活體細胞培養方式施予得自病人的或人類細胞株隨后再打入并人體內，或用于離體中以篩選出病人免疫細胞的次群體然后再施打予病人。如果此核苷酸是于離體施予細胞，較有用的方式是轉染細胞以使細胞一起表達激發免疫反應的細胞激素，如白細胞介素-2。此肽可以是純化的或與一激發免疫反應的佐劑混合，如DET0X，或與激發免疫反應的細胞激素混合，或與適當的傳遞系統如脂肪微粒一同施予。此肽可以連接于適當的攜帶者如鑰孔蟲戚血藍蛋白(keyhole limpet haemocyanin,KLH)或甘露聚糖(參見WO95/18145 與 Longenecker et al (1993) Ann. NY Acad. Sc1. 690，276—291)。此肽亦可以被標示或形成融合蛋白或雜合分子。本發明的肽序列是被預期可以刺激CD4陽性的T細胞毒殺反應。然而，此反應在CD4陽性的T細胞存在協助下反應更有效。因此，融合的另一組成分或適當的雜合分子提供抗原表位以刺激CD4陽性的T細胞。CD4陽性刺激抗原表位為此領域所熟知并包含那些在破傷風類毒素中所發現。此多核苷酸可是純化的或是涵括在適當載體或傳遞系統。適當的載體與傳遞系統包括病毒的如基于腺病毒、痘苗病毒、反轉錄病毒、皰疹病毒、線病毒相關病毒或包含來自多種病毒成份的雜合病毒。非病毒的傳遞系統包括脂質體與陽離子聚合物是此領域熟知的傳遞DNA的技術。物理性傳遞如亦可使用基因槍。此肽或此核酸編碼的肽可以是融合蛋白如與可刺激CD4陽性T細胞的抗原表位形成融合蛋白。用于癌癥疫苗的肽可以是任何適當的肽，特別是，適當的9個氨基酸肽或適當的7個或8個或10個或11個或12個氨基酸肽。較長的肽可能比較適合，但附表I中所描述的9個氨基酸肽或10個氨基酸肽是表較適當。任何施打于病人的核苷酸是無菌的或無產熱原。裸露DNA可以肌肉間或皮間或皮下施打。肽可以肌肉間或皮間或腹腔或血管或皮下施打(亦可參考關于生產肽的方法)。優選地，此肽可作為活性藥學成分與佐劑如IL-2、11-12、GM-CSF、弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑或脂微粒配方一同施予。最優選的佐劑可參考Brinkman JA, Fausch SC, WeberJSjKast WM. Peptide-based vaccines for cancer immunotherapy. Expert Opin BiolTher. 2004Feb;4(2):181-98。施打疫苗導致的CTL反應是由專業的抗原呈現細胞刺激而得。一但CTL被激發，增強腫瘤細胞表達MHC分子是會是一個優點。將疫苗的目標對準特殊的細胞族群也是有用的，例如，抗原呈現細胞，藉由使用注射、標的載體、傳遞系統、或篩選病人體內的這一群細胞然后經活體培養中加入肽或核苷酸(如樹突細胞可以 Zhou 等人(1995)Blood 86, 3295-3301 與 Roth 等人(1996) Scand.J.1mmunology 43，646-651所描述方法分離)。例如，標的載體可包含組織特異或腫瘤特異的啟動子可以指揮抗原于適當的地方表達。本發明進一步的觀點是提供一有效抗癌、或癌/腫瘤細胞的疫苗,該疫苗包含根據本發明的有效劑量的肽或者是有效劑量的可編碼該肽的核酸。優選的疫苗是核酸疫苗。已知接種核酸疫苗，如DNA疫苗，轉譯成的蛋白質可以激發T細胞反應。多數優選的疫苗是含一(合成)肽或數種肽(亦即，單一種或合并1、2、3、4、5、6、11或甚至更多肽，詳述如下)。方便地，該核苷酸疫苗可包含任一適當核苷酸攜帶方式。此核苷酸，優選的是DNA，可以是裸露的(亦即基本上接種時不含其它成份)或其本身可藉由脂微粒攜帶或是病毒載體系統的一部分。咸信核苷酸經由樹突細胞吸收并表達此轉譯多肽是促成免疫反應活躍的機制；然而樹突細胞可不經轉入作用而仍扮演重要角色，因為它們仍可獲得組織中轉入細胞表達的肽。如果是DNA疫苗，肌肉接種是較合宜的。經由皮膚接種也是較好的方式。核苷酸疫苗可以不加佐劑接種，或者與佐劑如BCG或alum—起接種。其它適合的佐劑包括Aquila’sQS21stimulon(Aquila Biotech, Worcester, MA, USA),這是由阜苷(saponin)、結合桿菌萃取物與合成細菌細胞壁模擬物衍生與適當的佐劑如Ribi’s Detox而得。另一種由阜苷(saponin)衍生的佐劑,QuiI A (Superfos, Denmark),也可以使用。核苷酸疫苗如果不與佐劑一同接種是較合宜的。其它佐劑如弗氏佐劑也可使用。將肽連接于鑰孔蟲戚血藍蛋白也是有用的，最好與佐劑一同施用。多核苷酸介導的癌癥免疫療法描述于Conry等人(1996)于Seminars in Oncol ogy 23， 135-147;Condon 等人(1996)于 NatureMedicine2,1122-1127;Gong 等人(1997)于 Nature Medicine3, 558-561;Zhai 等人(1996)于 J.1mmunol. 156，700-710;Graham 等人(1996)于 Int J.Cancer 65，664-670;andBurchell 等人(1996)于 pp309_313In:Breast Cancer, Advances in biology andtherapeutics, Calvo等人(eds)，John Libbey Eurotext,以上文獻全文均為本文的參考數據。本發的進一步觀點是提供本發明肽、或者是轉譯該肽的多核苷酸或表達該肽的載體的使用；以制造可殺傷病人體內異常地表達含本發明的氨基酸序列的多肽的標地細胞。本發明的更進一步觀點是提供一個使用根據本發明的肽、可表達根據本發明肽的核苷酸，或者是可表達根據本發明肽的表現載體于制造一可誘發一種免疫反應-特別是細胞性免疫反應-的藥劑；更特別指一 T細胞介導的免疫反應,此反應針對于細胞表面表達人類MHCII類分子并呈現包含本發明氨基酸序列的實體瘤細胞。本發明中很驚人的發現實體瘤的腫瘤細胞，相對于同一組織中的正常細胞，于其細胞表面表達人類HLA II類分子。本發明的進一步觀點是提供于活體中或離體中產生活化細胞毒性T細胞的方法，此法是于離體中讓CTL與表現于適當抗原呈現細胞表面且裝載抗原的人類MHC I類分子一段足夠時間后以抗原特異地活化該CTL，該抗原即為本發明的肽。
適當地，此CTL是⑶4陽性的輔助細胞，優選的是THl類型。MHC II類分子可表達于任何適當細胞，優選的是，如果該細胞在自然狀況下不表達MHC II類分子(在此狀況下該細胞是藉由轉染而表達此分子)，或者是該細胞在抗原呈現或是抗原呈現路徑有缺陷。以此方式，細胞表達MHC II類分子基本上可以在活化CTL前完全用選擇的肽抗原預先裝載。該抗原呈現細胞(或激活細胞)基本上表達MHC II類分子于細胞表面且根本上本身無法將所選的抗原裝載該MHC II類分子上。如以下所詳述，該MHC II類分子可于離體中裝載所選擇的抗原。使用哺乳動物細胞缺乏或有較低或其TAP肽傳遞功能低下是較適宜的。無TAP肽傳遞功能的細胞包含T2、RMA-S與果蠅細胞。TAP是“抗原處理相關的轉運蛋白，，(Transportor associated with antigenprocessing)。可裝載人類肽的缺陷細胞株T2可由美國典型培養物保藏中心(簡稱ATCC)，12301Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA 以目錄編號 CRL 1992 取得；果蠅細胞株Schneider line 2可由ATCC以目錄編號CRL 19863取得；小鼠細胞株RMA-S 描述于 Karre andLjunggren (1985) J. Exp. Med. 162, 1745。便利上來說，在轉入前宿主細胞基本上無MHC I類分子表達。若刺激者細胞表達一個協同刺激T細胞的分子如B7.1、B7. 2、ICAM-1與LFA 3是較好的。許多MHC II類分子的核苷酸序列以及協同激活分子可由GenBank與EMBL數據庫公開取得。更進一步的實施例，合并HLA分子也可被使用，如此處表A與表B中MHC II類分子。使用重組多抗原表位疫苗以攜帶多組⑶8陽性CTL抗原表位描述于Thomson等人
(1996)J.1mmunol. 157,822-826與WO 96/03144，兩者均為本文的參考數據。與本發明相關，可以用一包含本發明氨基酸序列的肽(或一轉譯該肽的核苷酸)，以任何順序，與另一激活CD8陽性T細胞抗原表位混合作為單一疫苗。此種疫苗將會對癌癥治療特別有用。這種“在線的珠子”疫苗是典型的DNA疫苗。此種同時啟動依賴MHC II類分子免疫反應與依賴MHC I類分子免疫反應，有導致區域的CD4陽性T細胞的似THlT細胞反應的優勢，因而支持依賴MHC I類分子的⑶8陽性T細胞。有一些可在離體中產生CTL的其它方法，如Peoples等人于(1995) Proc.Natl. Acad. Sc1. USA 92, 432-436 與 Kawakami 等人于(1992)J.1mmunol. 148，638643所提出使用自體浸潤于腫瘤的淋巴細胞于產生CTL。Plebanski等人于(1995) Eur.J.1mmunol. 25，1783-1787利用自體外周血液的淋巴細胞制備CTL。Jochmus等人于(1997)J. Gen. Virol. 78，1689-1695描述使用肽或多肽規律地裝載于樹突細胞以產生自體的CTL，或Hill等人于(1995) J. Exp. Med. 181，2221-2228描述藉由感染重組病毒，與Jerome等人(1993) J.1mmunol. 151，1654-1662描述使用B細胞產生自體的CTL。此外，使用肽或多肽規律地裝載于或經感染重組病毒的巨噬細胞，可用于制備自體的CTL。S. Walter等人(Walter S，Herrgen L, Schoor 0, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, StevanovicS. Cutting edge:predetermined avidity ofhuman CD8T cells expanded on calibratedMHC/ant1-CD28-coatedmicrospheres. J Immunol. 2003Nov 15; 171 (10) : 4974-8)描述離體中使用人工處理的抗原呈現細胞激活T細胞，此法亦適于 產生對抗所選的肽的T細胞。異種細胞也可使用于制備CTL，此法描述于WO 97/26328并涵括于本文的參考數據。例如，除使用果蠅與T2細胞外，其它細胞，如CHO細胞、桿狀病毒感染的昆蟲細胞、細菌、酵母菌、痘苗病毒感染的標地細胞，亦可被使用于呈現抗原。此外植物病毒亦可被使用(參見Porta等人于(1994) Virology 202，449-955描述開發豇豆嵌紋病毒使成為高產量呈現外來肽的系統)。直接對抗本發明肽的活化CTL也被使用于治療。因此，本發明進一步的觀點是提供由先前方法所獲得的活化CTL。本發明更進一步的觀點是提供活化的CTL，該CTL可特異地識別細胞異常地表達含本發明氨基酸序列的多肽。優選的是此CTL藉由與HLA/肽復合物反應(也就是“結合”)識別該細胞。該CTL對使用于殺傷病人標的細胞很有用，該標的細胞異常地表達含本發明的氨基酸序列的多肽，而且該病人被施與有效量活化的CTL。施予病人的CTL可從病人體內取得并以上述方法活化(亦即，這些是自體的CTL)。另外，這些CTL可以是來自病人以外的其它個體。當然，最好是來自健康人的。本發明人所謂”健康個體”是指此個體一般健康狀況良好，優選的是有正常的免疫系統，并且最好并無罹患任何可立即檢測到的疾病。該活化的CTL表達T細胞受體(TCR)，此T細胞受體與識別異常地表達本發明多肽的細胞有關。如果轉譯該TCR的cDNA是由活化的CTL克隆而得并且轉移至一 CTL中表達是有用的。在活體中，根據本發明的CD4陽性CTL的標的細胞可以是腫瘤細胞(表達MHC II類分子)以及/或環繞腫瘤或腫瘤細胞的間質細胞(有時也會表達MHC II類分子)。特異識別本發明的肽的CTL細胞株的T細胞受體已經被克隆。這些CTL細胞株的T細胞受體使用下述方法確定(i)針對T細胞受體變動區的特異單株抗體，以及(ii)使用Va與Vp基因家族特異的引子作反轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)。由這些CTL細胞株所萃取的poly-A mRNA建立一 cDNA文庫。針對T細胞受體C端部分a與P鏈與N端部分Va與P片段的引子被使用。T細胞受體a鏈的完整的cDNA是利用超高忠實性DNA聚合酶擴增，此擴增產物被克隆至適當的克隆載`體。a與P鏈的基因克隆可以組合成單鏈T細胞受體藉由用下述方法Chung 等人(1994)Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 91,12654-12658。在這單鏈的構成中，其VDJ片段緊跟在VaJ片段之后，其后有Cp片段與CD3鏈的跨膜與胞質片段。此單鏈T細胞受體隨后插入反轉錄病毒載體(依據其感染成熟的人類CD8陽性T淋巴細胞以及介導基因表達的能力，有一系列的載體可供使用，其中反轉錄病毒載體系統Kat是較適宜的-參見Finer等人(1994)Blood 83,43)。高效價的假型的雙向性(amphotrophic)反轉錄病毒使用于感染分離自腫瘤患者外周血液純化的CD8陽性或CD4陽性淋巴細胞(操作步驟出版于1994由Roberts等人所著的Blood 84，2878-2889，涵括于本文參考數據)。抗CD3抗體被用于啟動純化的CD8陽性T細胞增生，此舉亦促進反轉錄病毒的插入并穩定表達單鏈TCRs。反轉錄病毒的轉導功效是以針對此單鏈TCR的抗體染色于CD8陽性T細胞而測定。離體中分析轉導的CD8陽性T細胞發現他們表達相同的腫瘤特異的毒殺作用，如同最初TCR鏈克隆自異種限制的(allo-restrictecOCTL細胞株。轉導的CD8陽性T細胞攜帶所預期的特異性可以用于過繼免疫治療腫瘤患者。病人可以施予IO8至IO9自體轉導的CTL0相似于⑶8陽性，經導入的攜有相關構成⑶4陽性T輔助細胞亦可被產生。其它導入基因至CTL的適當系統描述于Moritz等人(1994) Proc. Natl. Acad. Sc1.USA 91, 4318-4322,含括于本文參考數據 Eshhar 等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sc1. USA90，720-724 與 Hwu 等人(1993) J. Exp. Med. 178，361-366 也描述 CTL 的轉入。因此，本發明的進一步觀點提供一 T細胞受體可識別細胞異常地表達包含本發明氨基酸序列的多肽，該T細胞受體可由活化的CTL細胞取得。除了 T細胞受體，功能相同于T細胞受體的分子也涵蓋于本發明中。包括任何分子功能相同于T細胞受體可以執行與T細胞受體相同功能。特別是指經基因工程制成的三結構域單鏈(three domain singlechain)T細胞受體,其制法描述于本發明參考數據并于前文中提及Chung 等人(1994)Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 91，12654-12658。本發明亦包含一可轉譯T細胞受體的多核苷酸或功能相同的分子，以及一轉譯T細胞受體的多核苷酸或功能相同的分子的表達載體。本發明的T細胞受體的適當表達載體包含前文有關于本發明的肽所描述。然而，較適合的表達載體是可以于轉入CTL中表達T細胞受體者。本發明更進一步的觀點是提供一方法殺傷患者體內異常地表達包含本發明氨基酸序列的多肽的標地細胞，此方法包含以下步驟(I)由患者取得CTL; (2)于該細胞轉導入一轉譯T細胞受體的多核苷酸或功能相同的分子，如前文所定義；(3)將(2)所述細胞導入病人體內。本發明更進一步的觀點是提供一方法殺傷患者體內異常地表達包含本發明氨基酸序列的多肽的標的細胞，該氨基酸序列定義于本發明的第一或第二或第三觀點，此方法含以下步驟(I)由該患者取得抗原呈現細胞，如樹突細胞；(2)于活體培養中，以本發明定義于第一或第二或第三觀點的肽、或 可轉譯該多肽的多核苷酸，接觸該抗原呈現細胞；(3)將處理后的抗原呈現細胞導入病人體內。優選的抗原呈現細胞是樹突細胞。適當的，該樹突細胞是曾規律地裝載過抗原性肽的自體樹突細胞。該抗原性肽可以是任一適當肽可以激發適當T細胞反應。使用曾規律地裝載過腫瘤相關肽的自體樹突細胞的T細胞療法描述于Murphy等人(1996) TheProstate29, 371-380 與 Tjua 等人(1997) The Prostate 32，272-278。在一進一步的實施例中，其抗原呈現細胞(如樹突細胞)，是與一可轉譯本發明肽的多核苷酸接觸。該多核苷酸可以是任何適當的多核苷酸，而優選可以轉導至樹突細胞，以致肽被呈現且弓I發免疫反應。便利的，此多核苷酸可以是病毒的多核苷酸或病毒的組成。例如，腺病毒轉導的樹突細胞被顯示可以引起抗原特異的抗腫瘤反應關于MUCl (參見Gong等人(1997)Gene Ther. 4，1023-1028)。相似地，可以使用基于腺病毒的系統(參見如Wan等人(1997)Hum. Gene Ther. 8, 1355-1363);反轉錄病毒系統亦可被使用(Specht 等人(1997) J. Exp.Med. 186，1213-1221與Szabolcs等人(1997);于血液中藉由顆粒介導轉入樹突細胞也可被使用(Tuting 等人(1997) Eur. J. Tmmuno1. 27, 2702-2707) ;RNA 也可被使用(Ashley 等人
(1997)J. Exp. Med. 186，11771182)。可以了解，關于殺傷病人體內的標的細胞的方法，較好的標的細胞是癌癥細胞，最好是腎臟或結腸的癌細胞。特別適宜的是，若以本發明的方法治療的病人有HLA-DR。因而，在一優選的實施例中該病人HLA的單元型在治療前就被確認。HLA的單元型定性可以任何適用的方法進行，這些方法為此領域所熟知。
本發明特別包含本發明肽的使用(或可轉譯該多肽的多核苷酸)于活化活體疫苗接種；于離體中操縱自體樹突細胞隨后將該樹突細胞導入活體中激活CTL反應；于離體中活化自體CTL隨后進行過繼治療(亦即，該活化自體CTL被導入患者體內)；于離體中活化健康捐贈者的CTL (MHC相配的或不相配的)隨后進行過繼治療。在一較合宜的實施例中，本發明的疫苗單獨或與其它癌癥治療方法合并施予宿主以防止或抑制腫瘤形成。本肽疫苗可以無須佐劑而施予病人。本肽疫苗也可與佐劑如BCG或明帆(alum) 一并給予病人。其它適當的佐劑包含Aquila’s QS21stimulon (AquilaBiotech, Worcester, MA, USA)是阜苷的衍生物、結合桿菌萃取物與合成細胞壁模擬物、與專利的佐劑如Ribi’s Detox. Quil A(另一種阜苷的衍生物)也可使用(Superfos, Denmark)。其它的佐劑如CpG寡核苷酸、穩定的RNA、Imiquimod (可以商標名Aldara 購自3M Pharma, U.S.A.)、不完全弗氏佐劑(可以商品名Montanide ISA-51購自SeppicS. A.，Paris, France)、脂微粒配方或GM-CSF也是有用的。將肽連接于鑰孔蟲戚血藍蛋白也是有用的，最好與佐劑一同施用。依據本發明的肽可以作為診斷試劑。將本肽用于分析在病人CTL族群中是否存在或被治療所激活可特異對抗該肽的CTL。更進一步，可用此肽測定T細胞前身是否對所使用的肽有反應。進而，可用此肽作為標識以監視表達該含此肽的抗原的腫瘤的進展。在附件表一中，所發現的肽均被列出。此外，在該表中這些肽的來源蛋白質被標示出，并且在相對的蛋白質中該肽位置被標示出。其相對應的索引號(Acc-Numbers)更被標出，該索引號與 NationalInstitute of Health(參見 http://www. ncb1. nlm. nih. gov)的^NationalCentre for Biotechnology Information〃的 Genbank 中資料相關連。在另一較合宜的實施例中，這些肽被用于白細胞染色，特別指T淋巴細胞。這是特別有優點如果他可以證實在C TL族群中是否存在可特異對抗該肽的CTL。進一步，該肽可作為標志測定腫瘤的治療狀況。在另一較合宜的實施例中，本發明的肽被用于制備抗體。多株抗體可以一標準方式獲得，藉由注射該肽免疫動物的后純化免疫球蛋白。單株抗體可以標準步驟制備如于Methods Enzymol. (1986), 121, Hybridoma technology and monoclonal antibodies 所描述。本發明的更進一步觀點與藥學成分有關，其中包含一或多個本發明的肽。該組成用于非口服方式施予，如皮下、皮間、肌肉、或口服。為此，這些肽是溶于或懸浮于藥學上可接受，優選水狀載體。此外，該成分可包含賦形劑如緩沖物、爆破劑、釋劑、調味品、潤滑劑等等。該肽也可與免疫激活物質如細胞間質素一同施予。可用于此成份的一賦形劑名單由 A. Kibbe 所著文獻中所提出，Handbook ofPharmaceutical Excipients, 3. Ed. , 2000,由American PharmaceuticalAssociation and pharmaceutical 出版。這些組成可用于癌癥疾病的預防(prevention)、預防法(prophylaxis),與/或治療。藥學的制備包含至少包含本發明的肽，該肽由任一 SEQ ID No.1至SEQ ID No. 49組成被給予一罹患與相關肽或抗原有關的癌癥病人。由此，一 CTL特異的免疫反應可被啟動。本發明的另一觀點，兩種或以上本發明肽的組合可作為疫苗，不論直接混合或用同樣的療法。更進一步，與其它肽混合，如MHC II類特異的肽可被使用。技術人員有能力以測試方式選擇優選的肽組合，如離體中產生T細胞以及其有效性與整體存在、增生、親合力，如藉由分析IFN-Y (參見以下例子)、IL-12或穿孔素(Perforin)。通常最有效的肽會被混合成疫苗，以達成前述的目的。一適合的疫苗將包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15種不同肽，優選4、
5、6或7種不同肽，最優選6種肽。最后，此疫苗可依據患者所罹患的特殊型態的癌癥以及癌癥的狀態、早期治療方法、患者的免疫系統狀況，以及該病人的HLA單元型。已經發現Ii的N端的80個氨基酸就足以將蛋白質導引至第二型的處理路徑(Sanderson, S.，Frauwirth, K. &Shastri, N. (1995) Proc. Natl. Acad. Sc1.U. S. A92, 7217-7221, Wang, R. F. , Wang, X. , Atwood, A. C. , Topalian, S. L. &Rosenberg, S.A. (1999) Science 284,1351-1354)。腫瘤相關抗原其T輔助細胞抗原表位的確認在抗癌免疫療法中是一個重要的工作。于此，本發明人報導了一個一般可行的方法，以及一類衍生自由MS所分析的不同肽，該分析是用以鑒定出MHC II類腫瘤相關抗原配合體的天然的處理與呈現。此法綜合以表達融合蛋白的載體第一次轉染抗原呈現細胞的步驟，該融合蛋白介于Ii鏈與有興趣的抗原間；沖提出與HLA結合的肽后，以MS分析轉染細胞呈現的抗原衍生肽并與未轉染細胞比較。雖然鑒定出的肽其免疫反應產生能力仍需經活體測試，這個方法可對經天然處理的MHC II類配合體做確切的定性研究。因此，本發明人避開測試或合成腫瘤相關抗原的重迭肽，或是由抗原表位預測出的廣泛范圍的肽所選出-此法與I類抗原表位預測相較準確度較低。相對于費勁的T細胞分析-可能鑒定出隱密的但于活體中無法誘發T細胞活化的T細胞抗原表位(Anderton, S.M. , Viner, N. J. , Matharu, P. , Lowrey, P. A. &ffraith, D. C. (2002) Nat.1mmunol. 3, 175-181),本發明可聚焦于少數所發現被呈現的肽。此外，使用此方法就不需制造重組抗原或擁有表達抗原的腫瘤細胞株以證明該抗原是經天然處理所產生。本發明人使用Ii的N端將腫瘤相關抗原導引至EBV轉型細胞的第二型的處理內體區室。為達成這個方法，本發明人建構一個能變通的載體，于該載體我們可以將任一抗原與Ii形成融合蛋白表達，以方便用西方墨點分析法鑒定融合蛋白于轉染細胞中的表達量。已經發現Ii的N端就足以將標的蛋白質導引至第二型的處理路徑的內體區室；然而直到目前，這僅被描述于使用白蛋白的模式中(Sanderson, S. , Frauwirth, K. &Shastri, N. (1995)Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A92, 7217-7221)，使用于可轉譯融合蛋白的 cDNA library 以鑒定未知抗原(Wang, R. F. , Wang, X. , Atwood, A. C. , Topalian, S. L. &Rosenberg, S. A. (1999)Science 284, 1351-1354)、或確認以知 T 細胞株的特異性(Chaux, P. , Vantomme, V. , Stroobant, V. , Thielemans, K. , Corthals, J. , Luiten, R. , Eggermont, A. M. , Boon, T. &van der, B.P. (1999) J. Exp. Med. 189,767-778)。依據本發明人所知，此法從未被使用于鑒定可被MHCII類自然呈現的、來自已知腫瘤抗原的肽。以MALD1-MS作轉染或未轉染細胞其第二型配合體的差示分析，并進一步ES1-MS對不同表達的肽作定性分析,形成一個直接鑒定感興趣的抗原其第二型配合體的方法。以角質蛋白(keratin) 18的融合蛋白轉染細胞證明本發明者的方法一般適用于感興趣的抗原，再一次，本發明人亦可將HLA-DR呈現的肽以此模式轉植基因-角質蛋白(keratin) 18-描述。腫瘤相關抗原其T輔助細胞抗原表位的確認在抗癌免疫療法中是一個重要的工作。直到目前，用于鑒定來自腫瘤相關抗原的第二型肽的不同方法被使用，從將感興趣的抗原與抗原呈現細胞一起培育以使抗原被細胞攜入并處理(Chaux, P.，V. Vantomme, V.Stroobant，K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A. M. Eggermont, T. Boon, and B. P. vander Bruggen. 1999.1dentification of MAGE_3epitopes presented byHLA-DR moleculesto(D4 (+) T lymphocytes. J. Exp. Med. 189:767-778)，到以融合蛋白轉染的不同方法(Dengjel, J.，P. Decker, 0. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk，H. G. Rammensee, andS.Stevanovic. 2004.1dentification of a naturally processed cyclin DIT-helperepitope by a novel combination of HLA class II targeting anddifferential massspectrometry. Eur. J.1mmunol. 34:3644-3651)。前述所有方法不僅耗時，而且經常無法確認所鑒定出的HLA配合體是否真正于人體組織中表達。本發明人是第一個展示能從切片的實體瘤中分離出HLA II類配合體，因此，鑒定于活體的腫瘤或其周圍組織中所呈現的肽，且該肽可為具有適當T細胞受體且同時于細胞表面表達協同剌激配合體CD4的T細胞所識另IJ。在作為內生性處理的HLA II類配合體來源的蛋白質中，數種看家基因以及免疫相關蛋白被鑒定出。然而，來自腫瘤相關抗原的肽也被發現，形成一個于活體中鑒定來自腫瘤相關抗原的HLA II類配合體直接方法。本發明人鑒定出三種配合體負責(accounting for) 一核心序列來自IGFBP3與一來自MMP7的配合體。本發明人發現這些蛋白質于腎臟癌中過度表達，此外，這些蛋白質也被發現與腫瘤有關(Miyamoto, S.，K. Yanoj S. Sugimoto, G.1shii, T.Hasebe,Y.Endoh,K.Kodama, M. Goya, T. Chiba, and A. Ochia1. 2004. Matrix metalloproteinase_7facilitatesinsulin—like growth factor bioavailability throughits proteinase activity oninsulin~like growth factor binding protein3. Cancer Res. 64 : 665-671; Sumi，T. , T. Nakatani，H. Yoshida，Y. Hyun，T. Yasui，Y.Matsumoto，E. Nakagawa, K. Sugimura，H. Kawashima, and 0.1shiko. 2003. Expressionofmatrix metalloproteinases 7and 2in human renal cell carcinoma. Oncol.Rep. 10:567-570; Cheung, C. W.，D. A. Vesey，D. L. Nicol，andD. W. Johnson. 2004. Theroles of IGF-1 and IGFBP_3in the regulation ofproximal tubule, and renal cellcarcinoma cell proliferation. Kidney Int. 65:1272-1279)。這些妝混雜地結合于 HLAII類分子并可活化來自不同健康捐贈者的CD4陽性T細胞。因此，本發明人的方法將對鑒定新的來自TAA的第二型的候選肽以使用于臨床疫苗方法是有幫助的。本發明更進一步的觀點是關于一個方法可殺傷患者體內表達包含本處所提及氨基酸序列的多肽的標地細胞，此方法含施予病人有效劑量的基于本發明的肽、或基于本發明的核苷酸、或基于本發明的表達載體，在此該肽、該核苷酸、該表達載體用量是足以激發該病人的抗標的細胞免疫反應。本發明更進一步的觀點是關于一個可殺傷患者體內表達包含本處的氨基酸序列的多肽的標地細胞的方法，該方法包含 施予病人有效劑量的本發明定義的細胞毒性T細胞。本發明更進一步的觀點是關于一個可殺傷患者體內表達包含本處的氨基酸序列的多肽的標地細胞的方法，此方法包含以下步驟(I)由患者取得細胞毒性T細胞(CTL)；(2)于該細胞轉導入一轉譯T細胞受體的核苷酸或功能相同的分子如本發明所定義；(3)將
(2)所述細胞導入病人體內。優選的是，該標地細胞是癌癥細胞。更好的是，該癌癥是可表達包含本發明的氨基酸序列的多肽的白血病或淋巴瘤。本發明的一驚人發現是相對于相同組織的健康細胞，實體瘤的腫瘤細胞于細胞表面表達人類HLA II類分子。這個現象僅于Brasanac等人的文獻中被報導過一次(BrasanacD, Markovic-Lipkovski J, Hadz1-Djokic J, Muller GA, Muller CA.1mmunohistochemicalanalysis ofHLA class II antigens and tumor infiltrating mononuclear cells inrenalcell carcinoma:correlation with clinical and histopathological data.Neoplasma. 1999; 46 (3) : 173-8.)，于該文獻中，37個腎細胞癌(RCC)冷凍切片，其中有25個透明細胞癌型(clear cell type)、10個顆粒細胞癌型(granular)、2個嫌色細胞癌型(chromophobe),施以針對HLA-DR、-DP> -DQ抗原的單株抗體間接免疫過氧化酶(immunoperoxidase)分析HLA II類抗原，以及以抗⑶14、⑶3、⑶4與⑶8單株抗體分析浸潤于腫瘤中的單核細胞(TIM)。陽性細胞被半定量(semiquantitatively),且免疫組織化學調查結果與腎細胞癌的臨床資料(患者的年齡、性別、腫瘤大小與 m期別)與組織病理學特性(細胞學、組織學、等級)相關聯。所有腎細胞癌表達HLA-DR，92%表達HLA-DQ，73%表達HLA-DP抗原，其表達多寡為DR>-DQ>-DP，但該組織病理學或臨床上的參數間并無統計學上的重要相關。該文獻中報導，單核細胞(monocyte)較T細胞多，且⑶4陽性T細胞較⑶8陽性T細胞多，其中T細胞較多且⑶4陽性T細胞與⑶8陽性T細胞數目大致相當的腫瘤有較大的直徑。一些相關數據顯示HLA II類抗原異常表達的腎細胞癌卻較有侵略性，沒被腫瘤細胞足夠活化的T細胞(不論抗原表達能力)可能是導致這個現象的原因。需了解此處提及集揭示的本發明特點，其使用不限于所提及的相關組合也包含不悖離本發明所指范圍的單一狀 態。本發明將會藉由參考以下圖、序列表與例子作更詳細的敘述。接下來的例子是僅供展示目的而非限制本發明。SEQ ID No.1至SEQ ID No. 49顯示T細胞抗原表位的肽序列包含基于本發明的MHC I類呈現的肽。SEQ ID No. 50 至 SEQ ID No. 79 為表 3 中的肽序列。
圖1顯示三位腎細胞癌患者的HLA II類分子表達。其中在腎細胞癌患者RCC132中，其HLA陽性細胞較集中于邊界(A、B)，而腎細胞癌患者RCC 190與在腎細胞癌患者RCC211其HLA II類分子表達型態揭示一更均勻分布的管狀架構(C、E、G)。連續的組織切片中可見CD68陽性的巨噬細胞揭示浸潤腫瘤的單核免疫細胞與表達HLA II類分子的腫瘤細胞在一封閉空間的關系。以小鼠IgG而非其它特異抗原一致地顯示陰性結果(H)。大寫T標示出腫瘤。圖2 顯示 FACS 分析 CD4 陽性 T 細胞對 IGFBP3169_181、MMP7247_262、CCNDl198^212 特異。此處所示的點代表細胞內IFN y與抗⑶4-FITC染色。圖3展示概要的顯示在每個捐贈者針對每個肽可檢測到抗原專一且可生產IFN y的⑶4陽性T細胞。圖中顯示每個捐贈者其可生產IFNy的⑶4陽性T細胞的百分比，以及所用于刺激的肽。細胞于96洞的培養皿中培育-每一捐贈者與每一肽7個洞。框線內的值是視為陽性可生產IFNy的⑶4陽性T細胞的百分比是沒有加肽的陰性控制組的2倍以上。以不相關的肽刺激后可檢測到的可生產IFNy的CD4陽性T細胞的百分比是與沒有加肽的陰性控制組相關的(correlatewith)，除了 I號捐贈者于第3次以IGFBP3169_181刺激。然而這個效果在第4次刺激時就看不到。圖4展示于CCA165(中度分化的結腸腺癌)中HLA II類分子的表達。于正常結腸黏膜的固有層(c panel范圍與a范圍左邊以星號標示)一般可觀察到一些HLA II類陽性的巨噬細胞，但上皮細胞是一致地不表達HLA II類。然而，來自腫瘤不同區域的上皮細胞，可注意到HLAII類顯著的表達，顯示于范圍a的右側，范圍b與范圍d。圖5A與5B顯示以質 譜儀分析由初期人類腫瘤組織所分離出HLA II類分子后所沖提出的肽的序列。圖5A:來自MMP7經自然處理與呈現的HLA II類配合體片段與SEQ IDNo. l(SQDDIKGIQKLYGKRS)肽序列符合。標示的片段展示于表5。圖5B:來自包含SEQ IDNo.1合成肽片段。合成與天然處理的肽相同的片段模式并可推斷與確認的這個來自人類MMP7HLA II類配合體先前未定性的肽序列(SEQ ID No.1)其一級氨基酸序列。
權利要求
1.腫瘤相關肽，所述肽選自包含任意的SEQID No. 33、SEQID No. 43、SEQ ID No. 31、SEQ ID No.1 至 SEQ ID No. 32、SEQID No. 34 至 SEQ ID No. 41 及 SEQ ID No. 44 至 SEQ IDNo. 49或前述肽的變體中的至少一個序列的肽，條件是所述肽不是完整的人類腫瘤相關多肽。
2.如權利要求1所述的腫瘤相關肽，其中所述肽基本上包含任一的SEQID No.1至SEQID No. 41及SEQ ID No. 43至SEQ IDNo. 49或其變體的氨基酸序列。
3.如權利要求1或2所述的腫瘤相關肽，其中所述肽具有9至100個氨基酸，優選為9至30個氨基酸的總長度。
4.如權利要求1-3中任一權利要求所述的腫瘤相關肽，所述肽包含任一的SEQIDNo.1 至 SEQ ID No. 41 及 SEQ ID No. 43 至 SEQ ID No. 49 的氨基酸序列。
5.如權利要求1-4中任一權利要求所述的腫瘤相關肽，所述肽具有結合于人類主要組織相容復合體(MHC)II類分子，特別是HLA-DRB 1*0101的能力。
6.如權利要求5所述的腫瘤相關肽，所述肽具有結合于至少一種人類主要組織相容復合體(MHC)II類的其它分子的能力。
7.如權利要求1-6中任一權利要求所述的腫瘤相關肽，其中所述肽包含非肽鍵。
8.如權利要求1-7中任一權利要求所述的腫瘤相關肽，其中所述肽是融合蛋白，特別是包含HLA-DR抗原相關不變鏈(Ii)的N端氨基酸。
9.核酸，其編碼權利要求1-8中任一權利要求所述的肽。
10.如權利要求9所述的核酸，其是DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA或前述的混合。
11.能夠表達權利要求9或10所述核酸的表達載體。
12.包含權利要求9或10的核酸或權利要求11的表達載體的宿主細胞。
13.如權利要求12所述的宿主細胞，其是重組的RCC或Awells細胞。
14.生產權利要求1-8中任一權利要求的腫瘤相關肽的方法，所述方法包括培養權利要求13所述的宿主細胞以及從所述宿主細胞或其培養基中分離所述肽。
15.藥物組合物，其包含權利要求1-8中任一權利要求的腫瘤相關肽、權利要求9或10的核酸或權利要求11的表達載體，及制藥學上可接受的載體。
16.如權利要求15所述的藥物組合物，其為癌癥疫苗形式，任選包含至少一種適合的佐劑。
17.權利要求1-8中任一權利要求的腫瘤相關肽、權利要求9或10的核酸或權利要求11的表達載體在醫學中的用途。
18.殺傷患者的靶細胞的方法，所述患者的靶細胞異常表達包含權利要求1-6中任一權利要求給出的氨基酸序列的多肽，所述方法包括給予所述患者有效量的權利要求1-8中任一權利要求的肽、權利要求9或10的核酸或權利要求11的表達載體，其中所述肽的量或所述核酸的量或所述表達載體的量，對激發所述患者中抗祀細胞的免疫反應是有效的。
19.權利要求1-8中任一權利要求的腫瘤相關肽、權利要求9或10的核酸或權利要求11的表達載體在制造用于殺傷患者的靶細胞的藥物中的用途，其中所述患者的靶細胞異常表達包含權利要求1-6中任一權利要求給出的氨基酸序列的多肽。
20.權利要求1-8中任一權利要求的腫瘤相關肽、權利要求9或10的核酸或權利要求11的表達載體在制造用于誘導抗實體腫瘤細胞的免疫反應、特別是細胞性免疫反應、尤其是T細胞介導的免疫反應的藥物中的用途，所述實體腫瘤細胞在其表面表達人類MHC II類分子，并呈現權利要求1-6中任一權利要求給出的氨基酸序列的多肽。
21.體外產生活化的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的方法，所述方法包含將體外接觸抗原加載的在適合的抗原提呈細胞表面表達的人類MHC II類分子足夠的時間，從而以抗原特異的方式活化所述CTL，其中所述抗原為權利要求1-8中任一權利要求所述的肽。
22.如權利要求21所述的方法，其中所述抗原通過將充足量的所述抗原與抗原提呈細胞接觸，加載于在適合的抗原提呈細胞表面表達的MHC II類分子上。
23.如權利要求21所述的方法，其中所述抗原提呈細胞包含權利要求11所述的表達載體。
24.如權利要求21-23中任一權利要求所述的方法，其中所述MHCII類分子是HLA-DRB1*010I。
25.權利要求21-24中任一權利要求所述的方法產生的活化的細胞毒性T淋巴細胞(CTL),其選擇性識別異常表達包含權利要求1-6中任一權利要求給出的氨基酸序列的多肽的細胞。
26.T細胞受體(TCR)，其識別異常表達包含權利要求1-6中任一權利要求給出的氨基酸序列的多肽的細胞，所述TCR獲得自權利要求24或25的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)或是所述TCR的功能等價分子。
27.編碼權利要求25或26的T細胞受體(TCR)的核酸。
28.能夠表達權利要求25或26的T細胞受體(TCR)的表達載體。
29.殺傷患者的靶細胞的方法，所述患者的靶細胞異常表達包含權利要求1-6中任一權利要求給出的氨基酸序列的多肽，所述方法包含給予所述患者有效數量的權利要求25或26定義的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。
30.殺傷患者的靶細胞的方法，所述患者的靶細胞異常表達包含權利要求1-6中任一權利要求給出的氨基酸序列的多肽，所述方法包括以下步驟 (1)從所述患者獲得細胞毒性T淋巴細胞(CTL)； (2)將編碼權利要求25或26定義的T細胞受體(TCR)或功能等價分子的核酸引入所述細胞； (3)將步驟(2)中產生的細胞引入所述患者。
31.如權利要求18、29或30中任一權利要求所述的殺傷患者的靶細胞的方法，其中所述靶細胞是癌癥細胞，特別是實體腫瘤細胞，所述實體腫瘤細胞在其表面表達人類MHC II類分子，并呈現權利要求1-6中任一權利要求給出的氨基酸序列的多肽。
32.權利要求25或26定義的細胞毒性T淋巴細胞在制造用于殺傷患者的靶細胞的藥物中的用途，所述患者的靶細胞異常表達包含權利要求1-6中任一權利要求給出的氨基酸序列的多肽。
全文摘要
本發明涉及免疫治療方法，以及用于免疫治療方法中的分子與細胞。本發明特別涉及腫瘤的免疫治療方法。本發明更進一步涉及T輔助細胞肽抗原表位-單獨或與其它癌癥細胞肽結合而作為疫苗混合物的活性藥物成分以刺激抗腫瘤的免疫反應。本發明特別涉及衍生自人類腫瘤細胞株的HLA(人類白細胞抗原)II類分子的49種新型肽序列，所述肽可用于誘發抗癌免疫反應的疫苗組合物中。
文檔編號C07K19/00GK103059104SQ20121056063
公開日2013年4月24日 申請日期2006年9月5日 優先權日2005年9月5日
發明者約恩·登扎爾 申請人:伊瑪提克斯生物技術有限公司