專利名稱：桑黃菌中尿嘧啶的分離技術的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程制藥領域。
背景技術：
桑黃(Phellinus)，子實體無柄，菌蓋扁半球形或馬蹄形，2_12*3_21厘米，厚
1.5-10厘米，木質，淺肝褐色至暗灰色或黑色，老時常龜裂，無皮殼，初期有細微絨毛，后變無毛，有同心環棱.邊緣鈍，深肉桂色至淺咖啡色，下側無子實層.菌肉深咖啡色，硬，木質.菌管與菌肉近同色，多層，但層次不明顯，年老的菌管層充滿白色菌絲.管口銹褐色至醬色，圓形，每毫米4-5個.孢子近球形，光滑，無色，5-6*3-4微米.剛毛頂端尖銳，基部膨大，10-25*5-7微米.菌絲不分枝，無橫隔，直徑3-5微米。目前，真菌產物的純化方法較多，主要有分級沉淀法、制備性高效液相層析、柱層析法、超濾法、離心沉淀色譜法、等幾種方法。而其中應用最多的當屬柱層析法，分為兩類一是只有分子篩作用的凝膠柱層析，常用的凝膠有葡聚糖凝膠及瓊脂糖凝膠。二是離子交換層析。但，主要用于分離多糖，透明質酸等，多數分離后得到的產物為混合物。本發明使用多種層析技術相結合，分離度高，應用此發明可以精致到純品。
發明內容
本發明公開了一種桑黃菌中尿嘧啶的分離方法。首先制備桑黃粗提物，然后進行正相硅膠層析，采用石油醚與丙酮梯度洗脫，進行TLC檢測，再次使用正相硅膠層析，然后是甲醇凝膠層析，經PLC檢測后適當合并洗脫液，減壓干燥，既得尿嘧啶。本發明的技術方案如下
桑黃粗提物，由下述方法制得
(1)發酵培養基配方以克/100毫升計是
玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5%
蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5%
硫酸鎂 O. 1-0. 5%磷酸二氫鉀O. 01-0. 05%
(2)將桑黃菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內，以20 35°C溫度，搖瓶轉速為80 280r/min，pH 3 8條件下，震動培養7 15天；培養中當pH值降到
2.5 4時，將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中，以溫度20 35°C，發酵罐壓力O.1 O. 2公斤/平方厘米，pH 3 8，通氣量O. 5 1.1vvm,攪拌速度100 280轉/分的條件，培養7 15天，即可利用桑黃菌絲體發酵全液制備桑黃粗提物；
(3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發酵全液，將其以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2 1/5 ；
(4)用體積百分比為60 95%的乙醇對 上述步驟(3)濃縮后的發酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2 5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到60 90% ；
(5)對步驟(4)所得提取液在50 70°C條件下，加熱I 2小時；以常規方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 1/10 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得桑黃粗提物。分離尿嘧啶的方法
桑黃菌粗提物一正相硅膠層析一氯仿與甲醇梯度洗脫一TLC檢測一正相硅膠層析一甲醇凝膠層析一TLC檢測一TLC檢測一減壓蒸干一白色粉末(尿嘧啶)。具體方法為
(1)制備桑黃菌粗提物；
(2)將上述步驟(I)所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌，并干燥，進行硅膠正相柱層析，用洗脫劑洗脫2-7次；
(3)收集步驟(2)中最后一次洗脫液，減壓干燥，與等體積硅膠拌樣，再次進行正相硅膠層析，用洗脫劑洗脫；
(4)收集上述步驟(3)中的洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫；
(5)TLC檢測 步驟(4)的洗脫液，適度合并洗脫液，加壓干燥，即為尿嘧啶。本發明由桑黃菌中尿嘧啶的分離技術的顯著優勢本方法采用多種層析技術相結合，可以精致到結構明確，純度大于95%的尿嘧啶。技術路線成熟明確，高效精確。
圖1為本發明尿嘧啶的結構式；
圖2為尿嘧啶的一維核磁共振H譜 具體實施方式
實例1:
桑黃粗提物，由下述方法制得
(1)發酵培養基配方以克/100毫升計是
玉米淀粉 1%葡萄糖 1%
蛋白胨 O. 1%酵母膏 O. 1%
硫酸鎂 O. 1%磷酸二氫鉀0.01%
(2)將桑黃菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內，以25°C溫度，搖瓶轉速為110r/min，pH 7條件下，震動培養7天；培養中當pH值降到3時，將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中，以溫度25°C，發酵罐壓力O.1公斤/平方厘米，pH 3，通氣量O. 5-1. lvvm，攪拌速度100轉/分的條件，培養7天，即可利用桑黃菌絲體發酵全液制備桑黃粗提物；
(3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發酵全液，將其以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/3 ；
(4)用體積百分比為70%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到55% ；
(5)對步驟(4)所得提取液在70°C條件下，加熱I小時；以常規方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ；(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得桑黃粗提物。將上述粗提物稱取200g與等體積100目正相硅膠混勻攪拌，進行硅膠正相柱層析。層析固定相為200-300目正相硅膠，柱高lm，直徑20cm，洗脫劑為分別為氯仿，氯仿甲醇=100:1,氯仿甲醇=50:1,氯仿甲醇=10:1,氯仿甲醇=5:1,分別洗脫3,4,4,4，4個柱體積。并將所得洗脫液分別命名為Fr-l，Fr-2，Fr_3，Fr_4，Fr_5。將Fr_5等體積硅膠拌樣，使用娃膠為100目正相娃膠,五倍體積娃膠層析,使用的娃膠為200—300目正相娃膠。洗脫劑為氯仿與甲醇。減壓濃縮洗脫液，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析，用甲醇洗脫。使用TLC檢測收集的洗脫液適當合并，得到白色粉末，進行ID-HNMR核磁共振分析，頻率為400MHZ，分析結果為δ 7.41，7.39，5.62，5.61.證明其為尿嘧啶。實例2:
桑黃粗提物，由下述方法制得
(1)發酵培養基配方以克/100毫升計是
玉米淀粉 3%葡萄糖 2%
蛋白胨 0.5%酵母膏 0.5%
硫酸鎂 0.5%磷酸二氫鉀0.05%
(2)將桑黃菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內，以30°C溫度，搖瓶轉速為180r/min，pH6條件下，震動培養15天；培養中當pH值降到2. 5時，將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中，以溫度30°C，發酵罐壓力0.2公斤/平方厘米，pH 3，通氣量O. 5-1.1vvm,攪拌速度180轉/分的條件，培養15天，即可利用桑黃菌絲體發酵全液制備桑黃粗提物；
(3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發酵全液，將其以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ；
(4)用體積百分比為90%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的4倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到70% ；
(5)對步驟(4)所得提取液在55°C條件下，加熱2.5小時；以常規方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/10 ;
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得桑黃粗提物。
將上述粗提物稱取IOOg與等體積100目正相硅膠混勻攪拌，進行硅膠正相柱層析。層析固定相為200-300目正相硅膠，柱高O. 7m，直徑10cm，洗脫劑為分別為氯仿，氯仿甲醇=100:1,氯仿甲醇=50:1,氯仿甲醇=10:1,氯仿甲醇=5:1。將Fr_5等體積娃膠拌樣，使用硅膠為100目正相硅膠，五倍體積硅膠層析，使用的硅膠為200— 300目正相硅膠。洗脫劑為氯仿與甲醇。進行甲醇凝膠柱層析。TLC檢測收集的洗脫液適當合并，減壓干燥，進行ID-HNMR核磁共振分析，頻率為400MHZ，分析結果為δ 7.41, 7.39，5.62，5. 61.證明其為尿嘧啶。
權利要求
1.桑黃菌中尿嘧啶的分離方法，其步驟順序如下 (1)制備桑黃粗提物； (2)將上述步驟(I)所得的こ醇沉淀物與正相硅膠混勻攪拌，并干燥，進行硅膠正相柱層析，用洗脫劑洗脫2-7次； (3)收集步驟(2)中最后一次洗脫液，減壓干燥，與等體積硅膠拌樣，再次進行正相硅膠層析，用洗脫劑洗脫； (4)收集上述步驟(3)中的洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫； (5)TLC檢測步驟(4)的洗脫液，適度合并洗脫液，加壓干燥，即為尿嘧啶。
2.如權利要求1所述的ー種從桑黃菌中分離苯こ醇的方法，其特征在于所述桑黃粗提物，由下述方法制得 (1)發酵培養基配方以克/100毫升計是 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸鎂 0. 1-0. 5%磷酸ニ氫鉀0. 01-0. 05% (2)如權利要求1所述桑黃粗提物的發酵培養方法是，將桑黃菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內，以20 35°C溫度，搖瓶轉速為80 280r/min，pH 3 8條件下，震動培養7 15天；培養中當pH值降到2. 5 4時，將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中，以溫度20 35°C，發酵罐壓カ0.1 0. 2公斤/平方厘米，pH 3 8，通氣量0. 5 1.1vvm,攪拌速度100 280轉/分的條件，培養7 15天，即可利用桑黃菌絲體發酵全液制備桑黃粗提物； (3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發酵全液，將其以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2 1/5 ； (4)用體積百分比為60 95%的こ醇對上述步驟(3)濃縮后的發酵液進行提取，其中，加入こ醇的量是濃縮液體積的2 5倍，能夠使提取液中こ醇濃度達到60 90% ； (5)對步驟(4)所得提取液在50 70°C條件下，加熱I 2小吋；以常規方法進行分離，并通過ニ級過濾除去雜質，分離獲得こ醇提取液；將上述こ醇提取液以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 1/10 ； (6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得桑黃粗提物。
3.如權利要求1所述的桑黃菌中尿嘧啶的分離方法，其特征在于，步驟(I)中所述的こ醇濃度為95%食用こ醇,所用體積為5倍體積。
4.如權利要求1所述的桑黃菌中尿嘧啶的分離方法，其特征在于，步驟(I)中所述的拌樣硅膠為100-200目正相硅膠。
5.如權利要求1所述的桑黃菌中尿嘧啶的分離方法，其特征在于，步驟(2)中所述的層析硅膠為正相200-300目，洗脫劑為氯仿和/或甲醇。
6.如權利要求1所述的桑黃菌中尿嘧啶的分離方法，其特征在于，步驟(3)中所述的硅膠用量為等體積，洗脫劑為氯仿與甲醇。
7.(請確定是否需要加入氯仿與甲醇的比例,如果加入,應相應修改實施例) 如權利要求1所述的桑黃菌中尿嘧啶的分離方法，其特征在于，步驟(4)中所述的凝膠為 Sephadex LH-20, Sephadex LH-15,洗脫劑為甲醇。
8.如權利要求1所述的桑黃菌中尿嘧啶的分離方法，其特征在于，步驟(5)所述的TLC檢測，展開劑為氯仿甲醇=4:1-5:1。
全文摘要
本發明公開了一種桑黃菌(火木層孔菌Phellinusigniarius(LexFr)Quel、裂蹄木層孔菌phellinuslinteus(BerketCurt)Teng、鮑氏層孔菌、哈蒂針層孔菌Phellinushartigii(AlleschetSchnabl)Imaz)中尿嘧啶的分離方法。首先制備桑黃菌粗提物，然后進行正相硅膠層析，采用石油醚與丙酮梯度洗脫，進行TLC檢測，再次使用正相硅膠層析，然后是甲醇凝膠層析，經PLC檢測后適當合并洗脫液，減壓干燥，既得尿嘧啶。
文檔編號C07D239/54GK103044340SQ20121054645
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月15日 優先權日2012年12月15日
發明者趙晨, 宋愛榮, 孫效樂, 王進平, 秦丹 申請人:青島農業大學