專利名稱：一類具有外周鎮痛作用的κ阿片受體激動劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一類K阿片受體激動劑，可以在激活受體后產生外周鎮痛作用。
背景技術：
K阿片受體(K-opioid receptor, 0P2, K0R)屬于G蛋白偶聯的7次跨膜受體超家族成員中的一種亞型。研究表明，K阿片受體與痛覺調節、利尿作用、神經內分泌物的分泌有關。K阿片受體激活后通過Gi蛋白調節能夠抑制腺苷酸環化酶(AC)活性，降低細胞內環腺苷酸(cAMP)的水平，抑制蛋白激酶A(PKA)及其調控的蛋白質磷酸化，發揮鎮痛作用。
K阿片受體(K-opioid receptor,0P2,K0R)屬于G蛋白偶聯的7次跨膜受體超家族成員中的一種亞型。研究表明，K阿片受體與痛覺調節、利尿作用、神經內分泌物的分泌有關。K阿片受體激活后通過Gi蛋白調節能夠抑制腺苷酸環化酶(AC)活性，降低細胞內cAMP的水平，抑制蛋白激酶A(PKA)及其調控的蛋白質磷酸化。初級感覺神經元內及其外周末梢上存在著K阿片受體，在炎癥及神經損傷的情況下，K阿片受體合成增加并轉運到神經末梢或者受損部位，增加傳導痛覺沖動的神經纖維中的K阿片受體的表達，增強外周鎮痛作用。疼痛是一種復雜的生理心理活動，是臨床上最常見的癥狀之一。它包括傷害性刺激作用于機體所引起的痛感覺，以及機體對傷害性刺激的痛反應(軀體運動性反應和/或內臟植物性反應，常伴隨有強烈的情緒色彩)。痛覺可作為機體受到傷害的一種警告，引起機體一系列防御性保護反應。但另一方面，疼痛作為報警也有其局限性(如癌癥等出現疼痛時，已為時太晚)。而某些長期的劇烈疼痛，對機體已成為一種難以忍受的折磨。疼痛的感知同時涉及到感官和情感變化，尤其慢性疼痛，往往伴隨著抑郁、焦慮及生活質量的下降。因此，鎮痛是醫務工作者面臨的重要任務。阿片類藥物在急性和慢性疼痛的治療中發揮著重要的作用。雖然此類藥物的在急性疼痛的感官鑒別中的特點在動物實驗和臨床調查中已經完整詮釋，但是它們在慢性疼痛中的作用并沒有深入研究。目前，應用于臨床的外周鎮痛藥物主要為U阿片受體鎮痛藥，如芬太尼類藥物。還未有K阿片受體鎮痛藥應用于臨床。近年來，大多數研究表明K阿片受體的激活可以改變心臟功能僅有少數研究表明K阿片受體與疼痛相關。
發明內容
本發明的目的在于提供一種治療阿爾茨海默病的化合物，該化合物是K阿片受體激動劑，對阿爾茨海默病有預防或者治療作用。本發明所述的化合物包括含治療有效量的化學式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽。本發明采用高通量篩選技術，建立了 K阿片受體激動劑高通量篩選模型并應用于化合物大規模篩選，通過篩選一批從CHEMDIV公司購買的化合物并進行功能性驗證尋找到了具有化學式(I)的K阿片受體激動劑，同時對其進行相關的AD藥效學和機制研究。本發明的技術方案為在中國倉鼠卵巢癌細胞(CHO)內穩定轉染K阿片受體，建立K阿片受體激動劑高通量篩選模型，進行初篩，復篩，構效關系分析，在此基礎上進行動物整體藥效學實驗，得到一類具有外周鎮痛作用的候選藥物。具體步驟如下步驟一建立及培養穩定轉染K阿片受體的CHO細胞株。步驟二 標準曲線的測定及最佳細胞數確定。步驟三陽性藥驗證。步驟四采用穩轉細胞株和摸索的最佳檢測條件對化合物進行K阿片受體激動劑的高通量篩選，得到有明顯量效關系的化合物。 步驟五進行動物整體鎮痛實驗，得到一類具有外周鎮痛作用的候選藥物。
圖I :標準曲線及最佳細胞數曲線圖2 :陽性藥(K阿片受體特異性激動劑U50，488)量效關系曲線圖3:化合物量效關系曲線圖4 :化合物8對小鼠冰醋酸扭體試驗扭體次數的影響圖5 :化合物8對小鼠冰醋酸扭體試驗潛伏期的影響
具體實施例方式以下結合
本發明的
具體實施例方式I.建立及培養穩定轉染K阿片受體的CHO細胞株。應用重組酶介導的盒交換技術(Recombinase-MediatedCassette Exchange,RMCE)批量構建G蛋白偶聯受體細胞株，并使其穩定轉染K阿片受體，培養CH0-0P2細胞使其達到穩定生長狀態。2.標準曲線的測定及最佳細胞數確定。為驗證實驗體系的正確性以及能篩選出可靠的K阿片受體激動劑，在建立模型時需要測定標準曲線并確定最佳細胞數。待CH0-0P2細胞生長到80%的時用0. 5mM EDTA的PBS消化細胞，離心去除上層液體，最后將細胞用刺激緩沖液重懸用于確定最佳細胞數。使用PerkinElmer公司的LANCE cAMP 384Kit試劑盒，配制標準cAMP梯度稀釋液及腺苷酸環化酶激活劑(forskolin)梯度稀釋液。標準曲線測定方法將cAMP的標準溶液4 y mol/L(LANCEtS) cAMP檢測試劑盒自帶)，用刺激緩沖液逐級稀釋為終濃度4倍的工作濃度，cAMP與抗體溶液各5 ill加入384孔板中共同孵育45分鐘，加入10 U I終止液，孵育一個小時后檢測；最佳細胞數檢測方法將5mM的forskolin母液用刺激緩沖液逐級稀釋為終濃度2倍的工作濃度，forskolin與含有細胞的抗體溶液各51加入384孔板中共同孵育45分鐘，加入10 ill終止液，孵育一個小時后在EnVision微孔板測讀儀上檢測。根據forskolin量效曲線窗口(性噪比S/B)及曲線與cAMP標準曲線斜率相近的細胞濃度作為最佳細胞數。標準曲線及最佳細胞數確定見圖I。3.選用K阿片受體選擇性激動劑U50，488對所建立的高通量篩選模型進行驗證并且根據量效曲線計算其的ec5Q。
陽性藥測定方法將23. 8mM的U50，488母液，用刺激緩沖液逐級稀釋為終濃度4倍的工作濃度，配置能引起最佳細胞數Ratio EC9tl效應的forskolin稀釋液。陽性藥U50, 4882. 5 U I與含有最佳細胞數的抗體溶液5 加入384孔板中共同孵育15分鐘，再將forskolin稀釋液2. 5ul加入384孔板中孵育30分鐘，加入10 U I終止液再孵育一個小時后用EnVision微孔板測讀儀檢測。陽性藥量效曲線見圖2。4.在上述的最佳檢測條件下進行K阿片受體激動劑的的初篩和復篩。初篩與復篩過程相同，初篩只選用一個濃度對8萬個化合物進行初步篩選，再選擇初篩有效的化合物梯度稀釋8個濃度進行復篩，過程如下用Janus全自動加樣工作站稀釋化合物并吸取5 u I轉移到384孔板中，再用Multidrop自動加樣儀將含有最佳細胞數的抗體溶液5 ill加入384孔板中，兩者共同孵育45分鐘后，Multidrop自動加樣儀將10 U I終止液加入384孔板中，再次孵育一個小時，用EnVision微孔板測讀儀檢測。復篩得到一系列具有K阿片受體激動作用的化合物，各個化合物的EC5tl見圖3。復篩實驗結果篩選得到的化合物可以根據母核的結構總結為一類，結構式與EC5tl如下
權利要求
1.下式化合物或其藥學上可以接受的鹽
2.權利要求I要求保護的式(I)的化合物或其藥學上可以接受的鹽用于制備K阿片受體激動劑的用途。
3.按照權利要求2的用途，作為K阿片受體激動劑，用于治療外周疼痛。
全文摘要
本發明涉及式(I)的κ阿片受體激動劑或其藥學上可接受的鹽。此類化合物有很強的體外激動κ阿片受體的活性，EC50均為nM水平，其中活性最強的化合物的EC50為9.57±0.19nM，可用于外周鎮痛。鎮痛試驗的結果表明，扭體抑制率與化合物濃度存在劑量依賴關系。
文檔編號C07D487/04GK102977106SQ20121054376
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月12日 優先權日2012年12月12日
發明者嚴明, 何玲, 張陸勇, 楊歡 申請人:中國藥科大學