專利名稱：一種降低煙草尼古丁含量的基因及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及煙草尼古丁的合成及調控相關基因，特別涉及調控煙草尼古丁合成的基因在降低煙草尼古丁含量方面的應用。
背景技術：
吸煙嚴重危害人的身體健康，因而如何減少吸煙的危害已成為各國政府、醫學專家、植物學家傾カ關注、研究的課題之一。許多世界頂級煙草公司投入巨資對煙草次生代謝物的代謝途徑、調控機制進行研究。尼古丁是ー種吡啶類生物堿，主要存在于茄科煙草屬(Nicotiana)植物中，是煙草體內的ー種重要的次生代謝產物。目前對尼古丁生物合成的研究主要集中在克隆其代謝相關的酶并分析其生理和生化特性方面。尼古丁是在植物的根部形成并經過木質部轉運到葉片沉積下來。尼古丁合成的前體是基本的氨基酸精氨酸和鳥氨酸以及天門冬氨酸。它們經一系列的代謝合成途徑中的關鍵酶PMT，QPT和MPO等催化 最終生成尼古」一 I Chintapakorn and Hamili, 2003. Antisense-mediated down-r e gu I at i onof putrescine N-methyItransferase activity in transgenic Nicotiana tabacumLean lead to elevated levels of anatabine at the expense of nicotine. PlantMolecular Biology 53:87-105.)。尼古丁生物合成受多種因素的調控，發育調控的激素信號就是很重要的ー類。茉莉素(JAs)是茉莉酸及其衍生物的統稱，是植物體內起全局調控作用的植物生長調節物質，廣泛分布于植物的幼嫩組織、花和發育的生殖器官中。并且在植物受到生物脅迫和非生物脅迫吋，JAs還能改變細胞內基因表達和介導植物的防御反應。研究證明尼古丁代謝途徑上的關鍵酶，如MPT，QPT和MPO均受植物傷誘導激素-茉莉素的誘導而表達，從而形成尼古丁。自1962年發現茉莉酸至今，人們對茉莉酸的合成途徑已經非常了解，但對茉莉素的信號傳導途徑及其調控植物的生長發育和應激反應的分子機制并不清楚。2007年三個課題組相繼報道在擬南芥中發現了ー類新的轉錄抑制調節子，被命名為榮莉素ZIM結構域蛋白家族(簡稱JAZ蛋白)。它通過抑制榮莉素響應基因的表達而發揮其生 功倉泛(Chini et al. , 2007. The JAZ family of repressors is the missing linkin jasmonate signalling. Nature 448:U664-U664;Thines et al. , 2007. JAZ repressorproteins are targets of the SCFCOllcomplex during jasmonate signalling. Nature448:U661-U662. ;Yan et al. ,2007. A Downstream Mediator in the Growth RepressionLimb ofthe Jasmonate Pathway. Plant Cell 19，2470-2483.)。當沒有茉莉素時，JAZ 蛋白的C-端結合在MYC2轉錄因子的N-端，抑制茉莉素誘導基因的表達；當植物體內有茉莉素存在時，JAZ蛋白同SCFam復合物相互作用，從而導致JAZ蛋白的聚泛素化而被26S蛋白酶體降解，釋放出MYC2轉錄因子激活茉莉素誘導基因的表達。研究尼古丁的代謝調控是非常有意義的ー項工作。尼古丁對人體有很強的生理刺激作用，是煙草商業性使用的物質基礎。對煙草而言，尼古丁是ー種抵御昆蟲侵害的防御性物質。在沒有受到傷害的煙草植株中，尼古丁含量大約為0.1%-1.0%。受到植食性昆蟲侵害或機械損傷后，煙草植株內茉莉素含量可以增加到原來的9倍(Ziegler etal.，200丄 Herbivore—induced allene oxide synthase transcripts and jasmonic acidin Nicotiana attenuata. Phytochemistry 58:729-738.),而尼古丁含量可以達到 4-10倍(Baldwin, 1998. Jasmonate-1nduced responses are costly but benefit plants underattack in native populations. Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America 95, 8113-8118.)，這個濃度會使大多數食葉性昆蟲立即死亡，從而保護受害蟲侵害的組織，達到抗蟲的目的。實驗結果證明茉莉素可以調控尼古丁的生成，但是其分子機制并不清楚。目前，對于JAZ蛋白的研究，在擬南芥中一共發現12個成員，這不難使我們思考，煙草中有沒有這樣的JAZ蛋白，以及這些蛋白是 否參與了茉莉素誘導的煙草尼古丁的合成。
發明內容
本發明的目的在于尋找與煙草尼古丁含量相關的功能基因，進而提供ー種降低煙草尼古丁含量的方法，為低尼古丁含量煙草育種提供技術手段。本發明的研究發現，煙草中的某些NtJAZs是受茉莉素的誘導而表達。通過RNAi技術在煙草中干擾其各自的表達，獲得轉基因細胞系，檢測發現這些轉基因細胞系中尼古丁的含量相對野生型要低很多。由此推測，利用轉基因技術，干擾、沉默或敲除某些NtJAZs，可為獲得低尼古丁含量煙草育種提供重要的科學依據。鑒于該類基因的應用價值及其利用潛力的應用前景，有必要通過專利加以保護。本發明提供的用于降低煙草尼古丁含量的基因屬于JAZ家族蛋白基因，來源于煙草(Nicotiana tabacum),命名為NtJAZ3,編碼下述蛋白質(i)或(ii)⑴序列表中的SEQ ID No 1所示氨基酸序列的蛋白質；(ii)序列表中的SEQ ID No :1所示氨基酸序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而衍生的蛋白質，并且所衍生的蛋白質具有與(i)所述蛋白質相同的功能。序列表中的SEQ ID No 1序列由207個氨基酸殘基組成，其中第93位至第98位氨基酸殘基是TIFY結構域，第158位至第176位氨基酸殘基是jas結構域。所述取代、缺失或添加的一至十個氨基酸殘基可以是非上述結構域中的氨基酸殘基，其改變不會對該蛋白的功能產生影響。對氨基酸殘基進行取代、缺失或添加，以及對相關功能的檢測可以通過本領域的常規技術來實現。本發明的煙早JAZ蛋白基因NtJAZ3可以是其cDNA序列，也可以是基因組DNA序列，或者是與這些序列具有90 %以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列。例如序列表中SEQ ID NO 2所示的DNA序列。通過對煙草轉錄組測序結果進行de novo拼接，利用所獲得的煙草轉錄組數據以及NCBI公布的煙草基因組序列片段和EST片段進行擬南芥同源JAZ的Blast分析，本發明的相關研究獲得了一系列煙草JAZ蛋白(NtJAZs)成員。其中，設計引物克隆了 NtJAZ3的ORF全長序列(SEQ ID NO :2)，其編碼的蛋白序列如序列表中的SEQ ID No:l所示。序列分析結果表明，該蛋白含有保守的TIFY結構域和jas結構域。其次，利用通過RT-PCR及Real-time PCR發現該基因是受茉莉素誘導而表達的(圖1)。
基于上述研究，本發明通過RNAi技術構建了 NtJAZ3基因的RNAi轉基因載體，成功獲得了抑制NtJAZ3在煙草細胞中表達的轉基因細胞系，所獲得的轉基因煙草細胞系擁有尼古丁含量相對對照明顯降低的特異表型。可見，利用轉基因技術，干擾、沉默或敲除NtJAZ3基因能夠獲得尼古丁含量降低的轉基因煙草，這使得低尼古丁含量煙草育種成為可能，為降低煙草尼古丁含量提供了一種有效的技術手段。在本發明的ー個具體實例中，首先，為構建NtJAZ3的RNAi雙元表達載體，選擇此基因中較特異的一段核酸片段(序列表SEQ ID NO 2的第l-499bp序列)為RNAi的引導序列，設計引物獲得此序列。然后，將此核酸片段以正反兩個方向插入到植物表達載體pHZPR1-Hyg中構建成為NtJAZ3的RNAi雙元表達載體。如圖2所示，該載體中的兩個NtJAZ3特異片段由一段⑶S序列隔開，由CaMV 35S啟動子引導表達。之后，將此質粒轉入農桿菌LBA4404，并經由農桿菌將此質粒轉入煙草BY-2懸浮細胞中。進而，通過Real-time PCR方法對RNAi的效率進行了檢測。結果顯示，所獲得的轉基因細胞系中NtJAZ3的表達被有效 抑制(圖3)。針對NtJAZ3_RNAi轉基因煙草細胞系，利用氣質聯用質譜分析技術測定了茉莉素處理72小時后細胞中尼古丁的含量。相比對照野生型煙草細胞，轉化細胞系的尼古丁含量有明顯的降低(圖4)。因此，本發明為獲得低尼古丁含量煙草育種提供重要的科學依據和技術支撐。
圖1、Real-time PCR檢測茉莉素誘導下NtJAZ3的表達變化，其中左圖顯示了NtJAZ3基因受茉莉素(JA)誘導，井隨著JA作用的延長表達量逐漸增加的表達情況；右圖是正對照，尼古丁合成途徑中的關鍵酶PMT在JA誘導處理下的表達情況；以Actin為內參。圖2、NtJAZ3-RNAi植物表達載體構建示意圖，該載體中，NtJAZ3的RNAi引導序列以正反兩個方向插入植物表達載體⑶S序列的兩側；圖中，RB、LB示序列的左右邊界；2X35S示啟動子，Hyg示潮霉素抗性基因。圖3、煙草轉基因細胞系的分子鑒定所示為轉化NtJAZ3_RNAi表達載體的煙草懸浮細胞轉錄水平的Real-time PCR鑒定結果，其中WT為煙草野生型BY-2細胞。圖4、煙草轉基因細胞系尼古丁含量檢測利用RNAi技術反義抑制NtJAZ3在煙草BY-2細胞中的表達，收集未經MeJA處理和MeJA處理72小時樣品，利用氣質聯用質譜分析技術(GC-MS)進行尼古丁含量檢測，反義抑制NtJAZ3后尼古丁含量大幅度降低，WT為煙草野生型BY-2細胞對照。
具體實施例方式下述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實驗方法所用的試劑，如無特殊說明，均為自常規生化試劑公司購買得到。植物材料煙草懸浮細胞系BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2)1、實驗材料的獲得和RNA的提取■不同時間MeJA處理BY_2細胞的取材方法煙草懸浮細胞BY-2 在 MS (4. 3g/l MS, 100mg/l 肌醇，30g/l 蔗糖，200mg/l 磷酸ニ氫鉀，lmg/1 VB1，0. 2mg/l 2，4_D，pH=5. 8)的液體培養基中24。C，120rpm搖床中懸浮培
養，7天ー個周期。Real-time PCR實驗所用材料在進行茉莉素(Me JA)處理時，將生長4天的懸浮細胞傳至無2，4-D的MS培養基中，24小時后，加入50 u M茉莉素(終濃度)進行處理，分別在0、0. 5、2、6、12、24小時收集樣品，裝入預冷的離心管中。液氮速凍后，轉移到_80°C低溫冰箱中保存，以用于Real-time PCR分析。尼古丁含量檢測實驗所用材料同上Real-time PCR實驗所用材料處理，在MeJA處理72小時收集樣品，_80°C低溫冰箱中保存，以用于尼古丁含量檢測。■玻璃制品、塑料制品和電泳槽的去RNA酶處理RNA相關實驗過程中所用的玻璃制品在使用前于180°C烘烤8h。塑料制品，包括 各種類型的槍頭和離心管，用0. 1%DEPC水溶液浸泡過夜，高壓滅菌后置于80°C干燥箱中干燥。用于RNA電泳的電泳槽經清洗后,用無水こ醇中浸泡30min,然后在30%H202中浸泡30min，最后用滅菌的DEPC處理水沖洗5次。 ■不同時間MeJA處理BY-2細胞總RNA的提取Trizol法提取細胞總RNA，首先取分裝于1. 5ml離心管的植物材料(約0.1g),液氮研磨，每管加入1ml Trizol液，迅速混勻，室溫下靜置5_10分鐘以利于核酸蛋白質復合體的解離，離心12000g, IOmin,取新離心管加入Iml的氯仿,加入上一步的上清液,小心不要吸到下層沉淀，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15s，室溫靜置5min，12000g離心10分鐘，取上清液(水相)轉入一新的離心管，加入等體積異丙醇，_20°C放置2h，4°C，12000g離心IOmin,棄去上清液,加入Iml 75%こ醇,緩慢顛倒離心管,離心棄上清,重復一次。室溫干燥。加適量DEPC處理水溶解RNA。■ RNA質量檢測在GBC Cintra IOe紫外分光光度計上測RNA樣品在260nm和280nm的光吸收值，通過吸收值計算RNA樣品的濃度和判斷RNA樣品的純度。RNA光吸收值和濃度換算公式10D26(l=40ii g/mL。純度判斷方法純的RNA，其OD26tlAD28tl為2. 0，若污染了蛋白質或酚，OD26tl/OD280比值明顯低于此值。然后通過I %瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。■ RNA樣品中少量DNA的去除通過無RNase的DNase消化RNA樣品中殘留的DNA，反應體系包括Ix RQlRNase-free DNase Buffer^RNase inhibitor 20 unit、RQl RNase-free DNase luL、RNA樣品50 u g，用DEPC-H2O補足體系至50 uし上述體系于37°C溫育30min。DNA酶解反應結束后，用酚/氯仿抽堤，こ醇沉淀回收RNA樣品。2、NtJAZ3 全長 cDNA 的克隆提取茉莉素處理2小時的BY-2細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，并以此cDNA為模板PCR擴增Nt JAZ3全長序列。具體流程如下利用Fermentas 公司的 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 進行逆轉，獲得cDNA,配制反應體系I如下2 ii g總RNA、1 ii L Oligo dT及加DEPC處理水補齊至12 ii L,于65°C溫育5min后迅速置于冰上。然后加入反應體系I1:4 y L 5Xreactionbuffer、I u L RNase inhibitor、2 u L IOmM dNTP Mix 和 I u L M-MuLV reversetranscriptase。混勻反應體系I和II，42°C逆轉錄反應60min, 70°C處理5min,置于冰上2min，分裝并保存于-20°C。PCR擴增NtJAZ3編碼基因根據Blast分析序列，設計全長引物，使用高保真DNA聚合酶pfu擴增NtJAZ3編碼基因。反應體系如下2XPCR pfu Mix 25 y L、上游引物I y M、下游引物luM、cDNA 1.0iiL，_dd H2O補充反應體系至50. OiiしPCR反應條件95 °C預變性 5min ;95°C變性 45sec, 55°C退火 45sec, 72°C延伸 2min, 30 個循環；最后 72°C延伸 7min。其中引物序列如下上游引物5’-CACCATGGCATCATCGGAGATTGTGGA-3’ (SEQ ID No 3)；下游引物5’-CTAGAATTGCTCAGCTTTCACTGG-3’(SEQ ID No :4)。PCR產物連入ENTY載體克隆利用博邁德生物的多功能DNA純化回收試劑盒，對PCR產物進行回收，并使用pENTR/D-TOPO cloning kit試劑盒將克隆的基因與pENTR/D-TOPO 載體相連,使用連接體系如下PCR product 0. 5-4 u I, Salt solution In I, T0P0vetor I V-1, Sterile water補至6 ii I體系。輕輕混合均勻，25°C連接過夜,此后進行DH5 a轉化，得到質粒pENTY-NtJAZ3。質粒PENTY_NtJAZ3的小量提取使用北京索萊寶公司質粒小提試劑盒，接菌至l-5mlLB/Kan培養基中培養過夜，次日離心13000rpm Imin收集菌體。加入250 y L溶液I(請先檢查是否已加入RNaseA)，振蕩混勻后，加入250 U I溶液II，溫和地上下翻轉6_8次使菌體充分裂解，加入350 u I溶液III，立即溫和地上下翻轉6-8次，充分混勻，此時會出現白色絮狀沉淀。12000rpm離心lOmin，用移液器小心地將上清轉移到吸附柱中(吸附柱加入收集管中)，室溫放置2分鐘，12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中，加入500 u l漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水こ醇)，12000rpm離心I分鐘，棄廢液，將吸附柱放入收集管中，重復一次，然后12000rpm空離2min。室溫干燥，向吸附膜中央懸空滴加50 ul經65°C水浴預熱的H2O,室溫放置5min，12000rpm離心2min，得到質粒。質粒pENTY-Nt JAZ3的PCR鑒定通過PCR對Nt JAZ3的全長進行電泳鑒定，將得到有全長插入片段的陽性克隆，送公司進行測序，最終鑒定得到NtJAZ3基因ORF的全長序列。3、茉莉素誘導NtJAZ3基因的表達■ NtJAZ3保守區序列分析NtJAZ3保守區序列分析對克隆得到的NtJAZ3蛋白進行序列比對和結構域分析，發現其N端含有保守的tify結構域(第93位至第98位氨基酸殘基)和C末端含有Jas結構域(第158位至第176位氨基酸殘基)，與擬南芥JAZs蛋白的保守結構域相同。■ Real time-PCR 引物設計同一家族基因序列類似性比較高，因此根據NtJAZ3與其它NtJAZs的序列比對情況，挑取特異序列片段進行Real time-PCR引物設計，具體引物序列如下上游引物5’-GGTTCCTTTGGAGATCTCAGC-3，(SEQ ID No 5)；下游引物5’-GACCGCCGTAGAATATCGTC-3’(SEQ ID No :6)。同吋，以尼古丁合成途徑中的關鍵酶PMT在JA誘導處理下的表達情況為正對照，對其進行Real time-PCR的引物如下上游引物5’-TATGCACACAGGCTGAAAGC-3’ (SEQ ID No 7)；下游引物5，-AGTCAACTTCTGGCCCTTCA-3’(SEQID No :8)。
以Actin為內參，對其進行Real time-PCR的引物如下上游引物5’-AGCACCTCTTAACCCGAAGG-3’ (SEQ ID No 9)；下游引物5’-GGACAGTGTGGCTAACACCA-3’(SEQ ID No :10)。■ BY-2細胞不同時間下NtJAZ3的表達檢測取材煙草BY-2懸浮細胞時間50μΜMeJA 處理 0、0· 5、2、6、12、24 小時Real-time PCR :使用 Trizol Plant 試劑盒(Invitrogen)提取總 RNA,去 DNA 后逆轉錄為cDNA，將cDNA稀釋5倍并保存于-20°C待用。在8聯定量PCR管中加入IOyL2 X ABI powerSYBR green PCR master mix,上、下游引物(10 μ Μ)和 cDNA 各 I μ L,加 ddH2O補足反應體系至20 μ L，混勻并短暫離心。將上述反應體系置于ABI 7500實時熒光定量PCR儀中，按標準流程進行PCR反應。循環條件為50°C 2min，94°C預變性IOmin ;95°C變性15sec,60°C退火及延伸Imin,40個循環；最后添加一個溶解曲線測定循環。反應結束后應用軟件ABI 7500 Software v2. O分析實驗結果。以尼古丁合成途徑中的關鍵酶PMT為正對照，以ACTIN (GenBank:ACH69153.1)的表達為內參。結果如圖1所示，用50 μ M MeJA處理煙草ΒΥ-2細胞，分別在Oh、O. 5h、2h、6h、12h和24h收集細胞材料，提取RNA，通過Real_timePCR發現NtJAZ3基因受茉莉素誘導而表達，并隨著JA作用時間的延長，基因的表達量逐漸增加，在12h達到最大值，正對照PMT的表達量在受茉莉素處理后被顯著誘導。4、NtJAZ3基因沉默的轉基因煙草細胞系的獲得■基因沉默trigger序列的克隆及測序根據序列比對，在NtJAZ3的ORF框中選取特異性較高的片段(引物設計如下)，以茉莉素處理2小時的樣品材料為模板，進行PCR克隆，得到用作RNAi的DNA片段，連接ENTY載體并測序。將測序正確的基因沉默trigger序列利用Gateway LR Clonase II EnzymeMix試劑盒進行LR重組反應連接至雙元載體pHZPR1-Hyg中形成RNAi載體NtJAZ3_RNAi。引物序列如下上游引物5’-CACCATGGCATCATCGGAGATTGTGGA-3’ (SEQ ID No 11)；下游引物5’-TTCTTTTCTCTAAAAACCTAGT-3’(SEQ ID No :12)。應用農桿菌侵染法將構建好的NtJAZ3基因沉默轉基因載體(NtJAZ3_RNAi)轉入煙草BY-2懸浮細胞中。5、轉基因煙草細胞系的鑒定及尼古丁含量測定■煙草轉基因細胞系的分子鑒定將農桿菌侵染后的BY-2懸浮細胞在潮霉素抗性培養基上篩選培養，待2-4周后，挑取抗性愈傷組織進行再篩選，之后進行懸浮培養及繼代培養并通過RT-PCR及Real-timePCR的方法對轉基因愈傷進行篩選鑒定，獲得的陽性愈傷組織。具體操作為將篩選后的陽性愈傷組織進行懸浮細胞，并進行茉莉素處理，收集Ohour和12hour樣品提取RNA并逆轉錄為cDNA，通過Real-time PCR檢測NtJAZ3的表達(圖3)，篩選得到轉基因陽性細胞系。■煙草轉基因細胞系尼古丁含量檢測 將篩選后的陽性愈傷組織進行懸浮細胞，并進行茉莉素處理，收集72h樣品進行尼古丁含量的檢測(圖4)，具體操作如下-80°C冰箱取出收集保存的72h處理材料，放入液氮備用，液氮預冷鉆頭，用電鉆將細胞研碎。取1. 5ml離心管，稱量約O. Γ0. 15g研碎的細胞放入，加入1. 5mol/L的氫氧化鈉1. 25mL，再加入0. 0002 u g/ml的喹啉內標溶液20 u L,超聲波處理Imin(總超聲時間lmin，超聲2s，間隔8s，強度36%)。37°C孵育4h，取出加入5ml的ニ氯甲烷和甲醇的混合溶劑(體積比3:1)，震搖5min。靜置，待分層。取下層有機相
2.5ml于新離心管中，加入冰こ酸20 yl，混勻。用氮氣將有機相吹干，加入0. 2ml ニ氯甲烷溶解待測物，漩渦混勻，2000rpm，5min離心，吸出溶液放入色譜管中待上機檢測。
利用氣質聯用質譜分析技術(GC-MS)檢測樣品中尼古丁含量，結果表明，反義抑制NtJAZ3后尼古丁含量有很大幅度的降低(如圖4所示)，WT為煙草野生型BY-2細胞。
權利要求
1.一種煙草JAZ蛋白，是下述蛋白質⑴或(ii)(i)序列表中的SEQ ID No I所不氣基酸序列的蛋白質；( )序列表中的SEQ ID No :1所示氨基酸序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而衍生的蛋白質，并且所衍生的蛋白質具有與(i)所述蛋白質相同的功能。
2.—種煙草JAZ蛋白基因，命名為NtJAZ3，編碼下述蛋白質⑴或(ii)(i)序列表中的SEQID No I所不氣基酸序列的蛋白質；(ii)序列表中的SEQID No :1所示氨基酸序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而衍生的蛋白質，并且所衍生的蛋白質具有與(i)所述蛋白質相同的功能。
3.如權利要求2所述的煙草JAZ蛋白基因，其特征在于，所述煙草JAZ蛋白基因是所述蛋白質基因的cDNA序列或基因組DNA序列。
4.如權利要求3所述的煙草JAZ蛋白基因，其特征在于，所述煙草JAZ蛋白基因的序列如序列表中SEQ ID No :2所示。
5.權利要求2所述的煙草JAZ蛋白基因在降低煙草尼古丁含量中的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于，通過轉基因技術干擾、沉默或敲除所述煙草JAZ蛋白基因，獲得尼古丁含量降低的煙草轉化植株。
7.如權利要求6所述的應用，其特征在于，構建所述煙草JAZ蛋白基因的RNAi載體并轉化煙草，獲得尼古丁含量降低的轉基因煙草。
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述煙草JAZ蛋白基因的RNAi載體通過下述方法構建以所述煙草JAZ蛋白基因的特異性核酸片段作為引導序列，將該特異性核酸片段以正反兩個方向插入到植物表達載體中。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述煙草JAZ蛋白基因的特異性核酸片段是序列表中SEQ IDNo 2的第1-499位核苷酸序列。
10.如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述煙草JAZ蛋白基因的RNAi載體中，兩個插入方向相反的所述煙草JAZ蛋白基因特異性核酸片段由一段GUS基因序列隔開，并由CaMV 35S啟動子引導表達。
全文摘要
本發明公開了一種降低煙草尼古丁含量的基因及其應用。所述基因是一種煙草JAZ蛋白基因，命名為NtJAZ3，該基因編碼的蛋白具有典型的TIFY結構域和jas結構域，且受茉莉素的誘導表達。通過構建NtJAZ3基因的RNAi轉基因載體并轉化煙草，成功抑制了NtJAZ3在煙草細胞中的表達，所獲得的轉基因煙草細胞系的尼古丁含量較野生型明顯降低。本發明為獲得低尼古丁含量煙草育種提供了重要的科學依據和技術支撐。
文檔編號C07K14/415GK103012572SQ20121051755
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月5日 優先權日2012年12月5日
發明者韓生成, 王英典, 趙和平, 楊玉萍 申請人:北京師范大學