專利名稱：具有長效化作用的胰高血糖素樣肽-1(glp-1)類似物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有長效化作用的胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)類似物及其應用。
背景技術：
糖尿病是繼腫瘤、心血管疾病之后第三大嚴重威脅人類健康的慢性非傳染性疾病。目前，全球約有3億糖尿病患者，預計到2025年將增加至5億。2010年，中國有9200萬糖尿病患者，中國已經成為僅次于印度的糖尿病第二大國，其中2型糖尿病約占糖尿病患者總人數的90%。現在治療2型糖尿病最有效的方法是注射胰島素。在臨床上采用胰島素強化治療的方法來延緩糖尿病進程，胰島素治療在降低血糖的同時可以一定程度上逆轉胰島細胞功能損害。但是使用胰島素會出現低血糖的危險。受到劑量大小、注射部位、注射途徑、個體差異或注射后未進食等因素的影響，如果使用胰島素稍有不慎，就會出現嚴重的低血糖副作用。胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)是一種葡萄糖依賴性腸降血糖多肽激素，GLP-1刺激胰島素分泌而不出現低血糖，這種葡萄糖依賴性的促胰島素分泌特性，避免了糖尿病治療中常存在的產生低血糖癥的危險，這些生理功能使開發GLP-1作為一種2型糖尿病治療藥物具有廣闊的前景。胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)主要由末端空腸、回腸和結腸的L細胞所分泌的葡萄糖依賴性腸降血糖多肽激素，在體內有多種存在形式。胰高血糖素原基因位于2號染色體長臂，由6個外顯子和5個內含子組成，在胰腺和腸道L細胞內表達，生成由160個氨基酸組成的胰高血糖素原(progluca gon, PG)。胰高血糖素原在胰腺和腸道中裂解后轉化的產物不同。PG在腸道中主要裂解為:腸高血糖素(Glicentin:PG1 69),腸高血糖素分子繼續裂解為GRPP (PGl 30)和胃泌酸調節素(Oxyntomodulin:PG33 69);插入肽-2(IP_2:PGlll 123);胰高血糖素樣肽-2(GLP-2:PG126 158);和 GLP-1 (I 37)_0H(PG 72 108)。GLP-Ul 37)-0H是無活性的肽鏈，需酶解切除N端6肽，成為具有生理活性的GLP-1 (7 37)-0H，其C末端甘氨酸可以作為酰胺化酶的底物，因此GLP-1 (7 37)-OH的C末端酰胺化后即生成具有高度活性的GLP-1 (7 36)-N ，氨基酸序列是HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGR-NH2 ；GLP-1 (7 37)-OH 的氨基酸序列是 HAEGTFTSDVSSLEGQAAKEFIAWLVKGRG-COOHo GLP-1 (7 36) -NH2是人體內GLP-1主要的天然形式，約占80%，其促進胰島素分泌的作用在GLP-1肽中最強。另外GLP-1 (7 37) -OH約占20%，兩者具有相同的生理功倉泛。GLP-1通過作用于胰島β -細胞膜上的受體GLP-1受體(GLP-1R)，促進胰島素的分泌。GLP-1R在胰腺β -細胞膜上高度表達，是由463個氨基酸組成，屬于七次跨膜的G-蛋白偶聯受體家族，與GLP-1高度特異性結合。GLP-1與其受體結合后可以增加胰島細胞腺苷酸環化酶的活性，刺激細胞內的第二信使cAMP的增加，導致細胞膜K+通道關閉，細胞去極化，誘發電壓依賴性的Ca2+通道開放，細胞外Ca2+內流，細胞漿Ca2+濃度升高觸發胰島素的釋放。此外cAMP水平升高，又激活cAMP依賴的蛋白激酶A和磷酸化酶，進而刺激β-細胞胰島素基因的轉錄和翻譯，刺激β -細胞的增值和分化。胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)具有多種生物學效應。如下:1、具有血糖依賴性的腸促胰島素分泌作用；2、阻止胰腺β -細胞退化，刺激β -細胞的增值和分化；3、誘導前胰島素基因的轉錄，促進前胰島素的生物合成；4、增加胰島素的敏感性；5、增加生長抑素分泌，抑制胰高血糖素的產生(此作用也是血糖依賴性)；6、抑制胃酸分泌，延遲胃排空；7、通過作用于丘腦下部的中樞抑制食欲，降低食物攝取量等作用。然而，雖然天然GLP-1在治療糖尿病上有以上諸多優點，但它在體內卻會被二肽基肽酶 IV(dip^tidyl peptidase IV，DPP_IV)快速降解。DPP-1V 可特異性識別 GLP-1 的N末端第二位丙氨酸(Ala)殘基，從肽鏈N末端第2位丙氨酸(Ala)處切除二肽，使其轉變為無活性的形式，其體內半衰期僅5分鐘左右。GLP-1分子N端是與GLP-1受體的結合部位，其組氨酸殘基喪失，導致GLP-1完全失去生物活性。另外天然的GLP-1會被腎臟快速濾過代謝，所以這需要我們對天然GLP-1進行改造，以期望尋找到能夠抵抗DPP-1V降解，避免腎臟快速濾過代謝的GLP-1類似物。這里，我們設計了一類具有長效化作用GLP-1類似物，將8位的Ala替換，使其不易被DPP-1V快速降解，同時改變肽 鏈的側鏈，引入脂肪鏈修飾的半胱氨酸，增加肽鏈與血清白蛋白的結合，避免了 GLP-1的腎臟快速濾過和代謝失活，從而顯著延長半衰期及體內降糖作用時間。
發明內容
本發明涉及一類胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)類似物，其序列為:His-Xaal-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Xaa2-Xaa3-Tyr-Leu-Glu-Gly-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Phe-1Ie-Xaa9-Trp-Leu~Val-XaaIO-Gly-Arg-Xaa11(SEQ.1DNO:1)其中:Xaal:Ala, Leu, Val, Met, He, Tyr, Phe, Arg, Asn, Lys, Thr, Asp, His, Trp, Gin,Glu, Ser 或 Gly ；Xaa2:脂肪鏈修飾的Cys或Ser ；Xaa3:脂肪鏈修飾的Cys或Ser ；Xaa4:脂肪鏈修飾的Cys或Gln ；Xaa5:脂肪鏈修飾的Cys或Ala ；Xaa6:脂肪鏈修飾的Cys或Ala ；Xaa7:脂肪鏈修飾的Cys或Lys ；Xaa8:脂肪鏈修飾的Cys或Glu ；Xaa9:脂肪鏈修飾的Cys或Ala ；
XaalO:脂肪鏈修飾的Cys或Lys ；Xaal1:脂肪鏈修飾的 Cys-NH2 或-NH2 ；前提是所述序列不是His-Xaal-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-1Ie-Ala-Trp-Leu-Val-LyS-Gly-Arg-NH2 ο其中脂肪鏈修飾的Cys選自
權利要求
1.種含有式I(SEQ.1D NO:1)結構的胰高血糖素樣肽_1 (GLP-1)類似物，其序列為:His-Xaal-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Xaa2-Xaa3-Tyr-Leu-Glu-Gly-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Phe-1le-Xaa9-Trp-Leu-Val-XaalO-Gly-Arg-Xaall(SEQ.1D NO:1) 其中:Xaal:Ala，Leu, Val，Met，He, Tyr, Phe, Arg，Asn, Lys，Thr, Asp，His，Trp, Gin, Glu，Ser 或 Gly ； Xaa2:脂肪鏈修飾的Cys或Ser ； Xaa3:脂肪鏈修飾的Cys或Ser ； Xaa4:脂肪鏈修飾的Cys或Gln ； Xaa5:脂肪鏈修飾的Cys或Ala ； Xaa6:脂肪鏈修飾的Cys或Ala ； Xaa7:脂肪鏈修飾的Cys或Lys ； Xaa8:脂肪鏈修飾的Cys或Glu ； Xaa9:脂肪鏈修飾的Cys或Ala ； XaalO:脂肪鏈修飾的Cys或Lys ； Xaall:脂肪鏈修飾的Cys-NH2或-NH2 ；前提是所述序列不是 His-Xaal-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-1Ie-Ala-Trp-Leu-Val-LyS-Gly-Arg-NH2 ο
2.據權利要求1所述的肽，其中脂肪鏈修飾的Cys選自
3.據權利要求2所述，其中優選的脂肪鏈修飾的Cys結構為
4.據權利要求1所述的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物，優選的序列為:
5.種藥物組合物，包括治療有效量的權利要求1中所述的胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)類似物和其藥學上可接受的鹽。
6.種藥物組合物，包括治療有效量的權利要求1中所述的胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)類似物和藥學上可接受的載體或稀釋劑。
7.利要求1中所述的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物和其藥學上可接受的鹽在制備用于糖尿病的藥物中的運用。
8.利要求1中所述的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物和藥學上可接受的載體或稀釋劑在制備用于糖尿病的藥物中的運用。
9.利要求1中所述的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物的制備方法，包括生物表達、液相合成和固相合成制備方法。
全文摘要
本發明涉及具有長效化作用的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物及其合成方法。通過對天然的GLP-1的17，26，34，37位氨基酸進行替換修飾得到具有更長藥理作用時間的GLP-1類似物，目標多肽的合成是通過微波促進固相合成方法快速實現，粗品經純化，凍干得到GLP-1類似物。
文檔編號C07K14/605GK103087180SQ20121051326
公開日2013年5月8日 申請日期2012年11月30日 優先權日2012年11月30日
發明者黃文龍, 錢海, 韓京, 孫李丹, 李政, 褚瑩瑩 申請人:中國藥科大學