專利名稱：一種融合蛋白的純化和復性方法
技術領域：
本發明涉及一種融合蛋白的制備方法，尤其涉及一種適合工業化且低成本的 Mtb72f融合蛋白包涵體的制備方法。
背景技術：
目前來說，高效表達質粒構建的大腸桿菌工程菌在大量合成異源蛋白質時，一般情況下以包涵體的形式存在于細菌內。包涵體由高度聚集的外源蛋白質、核酸及蛋白質合成酶及核糖體組成。其中大部分(50%以上)是克隆外源基因的表達產物，它們具有工程菌表達的外源基因的正確的氨基酸序列，但空間構象往往是錯誤的，因而沒有生物活性。由于包涵體位于細菌細胞內且沒有生物活性，需經細胞裂解后經提取洗滌后變性復性及純化步驟方能得到有活性的蛋白質。發明內容
為了解決以上技術問題，本發明提供了一種融合蛋白的純化和復性方法，包括以下幾個步驟蛋白質的純化、樣品稀釋、膜包準備、濃縮和置換步驟。
優選的,所述蛋白質的純化步驟包括將包涵體變性液上樣到含Q-Sepharose F. F 柱子，用平衡緩沖液A清洗后，用洗脫緩沖液B洗脫目標峰，再將來自Q-Sepharose F. F柱子上的洗脫峰上樣到事先用平衡緩沖液C平衡好的含有陶瓷基質羥基磷灰石的柱子，收集含有Mtb72f的穿透峰；其中，所述平衡緩沖液A為50mM NaCl, 20mM Bis-Tris, 6M尿素， pH=7. O ；緩沖液 B 為90 mM NaCl, 20mM Bis-Tris, 6M 尿素，pH=7. O ;平衡緩沖液 C 為250mM NaCl, 20mM Bis-Tris, 6M 尿素，ρΗ=7· O。
優選的，所述樣品稀釋步驟包括用紫外分光光度計測定穿透峰的濃度，用洗脫緩沖液 B稀釋至O. 2-0. 3g/L。
優選的,所述膜包準備步驟包括用NaOH溶液循環清洗Centramate膜包，再用 Na2HPO4清洗2次，再用平衡緩沖液C清洗至滲出液pH值為7. 0±0. 10。
優選的，所述濃縮和置換步驟包括I)將稀釋后的穿透峰濃縮至1. 1-1. 6g/L,循環流速為6L/min/ M2，每分鐘的滲析流速控制在濃縮后料液體積的1/18，將樣品超濾濃縮至濃度為3. 0-3. 8g/L。
2)將步驟I所得到的樣品用Tris緩沖液進行透析置換，透析過程中，循環速度保持在6L/min/ M2，滲析速度與第一次濃縮時一致，加緩沖液的速度與滲析速度相同。
3)將步驟2所得到的樣品濃縮至步驟I的濃縮體積的O. 38-0. 40倍。循環速度和滲析速度同前。
4)以步驟3中用Tris緩沖液透析處理，透析過程中，循環速度保持在6L/min/ Μ2。 循環速度和滲析速度同前，樣品加緩沖液速度與滲析液的速度一致。
5)收集步驟4的濃縮液，再將所述膜包用20mM、pH=7. 5的Tris緩沖液清洗，共清洗3次，收集濾出液，每次用量皆為5L/M2膜面積。將3次濾出液加至步驟4的濃縮液混勻后檢測蛋白濃度，添加20mM、pH=7. 5的Tris緩沖液，使樣品蛋白終濃度=2. Omg/mL。
優選的，還包括無菌過濾步驟將步驟5得到的樣品用O. 22 Mffl濾器進行無菌過濾即得到純化原液，純化原液分裝于無菌無熱原的PEG瓶中，-70°C以下保存。
優選的，所述NaOH溶液用量為10L/M2膜面積，濃度為O. 3M，Na2HPO4溶液的濃度為400mM，用量為10L/M2膜面積。
優選的，所述步驟2中Tris緩沖液的用量為以步驟I濃縮后的體積的2. 5倍體積20mM的Tris緩沖液進行透析置換。
優選的，所述步驟4中的用量為以步驟3濃縮后的體積9. 5倍體積、pH=7. 5、濃度為20mM的Tris緩沖液透析處理。
本發明為中國發明專利“用于治療或 防結核分枝桿菌引起的結核病的新方法” (中國專利申請號200680023551. 3)相關專利，具體涉及表達Mtb72f多肽疫苗的大腸桿菌工程菌的裂解參數的優化和相關的純化后復性工藝的優化。
200680023551. 3披露的Mtb72f生產工藝為E. coli工程菌的發酵及誘表達， 收獲工程菌，細胞裂解，包涵體收獲及洗滌，包涵體在變性條件下溶解。其后，溶解的包涵體經過濾后直接進行下游純化及用切向流過濾(超濾)進行復性。原工藝所涉及的細胞裂解步驟為使用高壓均漿機進行。其后，包涵體用離心機進行收集并進行清洗。清洗后的包涵體由包含尿素的變性緩沖液充分溶解并過濾后方能進行下一步的純化步驟。 披露的發明專利中高壓均質機細胞破碎為實驗室小型設備，處理量低；另一方面，壓力設為11， 000± IOOpsi (即在750bar-760bar之間)，為了使工程菌破碎完全，需重復處理5次。而在操作過程中，為了保存目標蛋白活性和質量，每次破碎前需將懸液預冷至10°C以下，由于破碎的低效率和過于繁瑣的操作導致整個細胞裂解時間過長，不適合大規模的工業化生產。故用工業級的高壓均質機進行工藝放大時需調整壓力參數減少破碎次數。我們在研究中發現，在使用存在一、二級分級調節閥為模式的工業級高壓均質機時，在一級閥壓力大于或等于750 bar,總壓力為IOOObar的情況下，經兩次處理工程菌細菌都能完全破碎，但將操作壓力限定在一個狹窄的范圍時(一級閥壓力為850bar-900bar，二級閥壓力為 100bar-150bar)時，經兩次破碎處理，下游制備得到的包涵體變性溶解液的澄清度顯著增力口 (濁度顯著下降)，濾器過濾容量亦明顯增加。更重要的是，下游純化結果表明目標蛋白純度顯著提高。
另外，在原工藝中純化后復性為利用切向流超濾技術進行。但僅表述為用pH=7. 5 的20mM Tris緩沖液置換料液中的尿素而復性，原工藝沒有具體規定用于濃縮和透濾處理的起始料液的濃度，也沒有規定與復性相關的透濾速度。而我們在研究中發現，在超濾回流速度為6L/M2，每分鐘的滲出速率為第一次濃縮后體積的1/18時，不同的起始濃度的復性料液得出的純化原液在穩定性方面有明顯差別經稀釋后至一定濃度的料液，在抗原活性方面有更高的穩定性。
本發明的有益效果是本方法可工業化放大、純化后得到的純度是在蛋白得率高的情況下，純度也高，并且還具有穩定的抗原活性。
具體實施方式
對本發明的較優的實施例作進一步的詳細說明實施例1:菌體復溶取Mtb72f工程菌菌株接種于發酵罐中按流加補料的方式進行高密度發酵。當發酵液 0D650nm=50時加入IPTG于37°C進行誘導，誘導5小時后收獲菌體。取一定量的菌體(彡16L 發酵收獲時的菌體量)，加入預冷的裂解緩沖液，調節菌體復溶液至0D65(lnm ^ 60。將菌體復溶液用高速均質機均質處理，均質后冷卻到< 10°C。
實施例2 菌體破碎將冷卻勻漿后的樣品用高壓勻漿機(型號為Niro Soavi的Ponny)進行菌體破碎，高壓勻漿機壓力調節為二級100-150bars、一級850-900 bars，破碎總壓力為1000±50bars ； 勻漿機入口樣品溫度應控制在彡10°C，出口樣品溫度必須彡25°C。同一批樣品破碎處理兩次，處理完畢后獲得菌體破碎液。
實施例3菌體破碎液離心及清洗在菌體破碎液中加入同體積的裂解緩沖液，混勻后用工業規模的離心機(如管式高速離心機)收集包涵體沉定，過程溫度小于15°C。離心結束后收集包涵體，添加包涵體清洗緩沖液至菌體復溶時相當的體積，用高速均質(如Ultra Turrax T50)均質處理,后用離心機收集包涵體沉淀，過程溫度同樣小于15°C。重復一次包涵體清洗和離心操作步驟。收集包涵體,添加少量清洗緩沖液體后用高速均質處理后制成包涵體懸液交純化工序。
實施例4 包涵體變性溶解及過濾緩慢將包涵體懸液樣品滴加入包涵體溶解緩沖液中(體積約為對應的菌體收獲液的 1/2)，攪拌器300rpm、室溫不斷攪拌約2h。然后進行包涵體變性液過濾。料液可直接用深層濾器(如PALL公司的Supracap系列)進行澄清過濾；亦可采用離心(如8000g離心15min) 后取上清用囊式濾器進行澄清過濾。濾液的濁度應小于10NTU，用于包涵體目標蛋白的純化。
實施例5 Mtb72f蛋白的純化將包涵體變性液上樣到事先用平衡緩沖液A (50mM NaCl, 20mM Bis-Tris, 6M尿素， pH=7. O)平衡好的含Q-S印harose F. F的柱子，用平衡緩沖液A清洗后，用洗脫緩沖液B(90 mM NaCl, 20mM Bis-Tris, 6M 尿素，ρΗ=7· O)洗脫目標峰(QSFF-E)。再將來自 Q-Sepharose F. F的洗脫峰上樣到事先用平衡緩沖液C (250mM NaCl, 20mM Bis-Tris, 6M尿素，pH=7. O) 平衡好的含有陶瓷基質羥基磷灰石(CHT) (I型，40um, Bio-rad)的柱子，收集含有Mtb72f 的穿透峰(HA-FTl)。
實施例6 Mtb72f蛋白的超濾復性(I)樣品稀釋紫外法測定HA-FTI樣品濃度，將HA-FTI用洗脫緩沖液B稀釋至O. 20-0. 30g/L.(2)膜包準備用2000ml O. 3M NaOH循環清洗O. 2M2的Centramate (30kDa分子量截止值(MWCO))膜包。其后用400mM Na2HP04清洗2次。再用平衡緩沖液C清洗至滲出液pH 值為 7. 0±0· 10。
(3)第一次濃縮將稀釋后的HA-FTl濃縮至于1. 1-1. 6g/L,其間控制循環流速為每M2膜面積6L/min，每分鐘的滲析流速控制在第一次濃縮后料液體積的1/18，將樣品超濾濃縮至約濃度約為3. 0-3. 8g/L。
(4)第一次緩沖液透析置換(復性)第一次濃縮后的樣品以2. 5倍體積20mM的 Tris緩沖液進行透析置換。透析過程中，循環速度保持在每M2膜面積6L/min，滲析速度與第一次濃縮時一致，加緩沖液的速度與滲析速度一致。
(5)第二次濃縮第一次透析置換完成后，將樣品濃縮至第I次濃縮體積的 O.38-0. 40倍之間。循環速度和滲析速度同前。
(6)第2次緩沖液替換以第二次濃縮后體積的9. 5倍體積20mM的Tris (pH=7. 5) 緩沖液透析處理，循環速度和滲析速度同前，樣品加緩沖液速度與滲析液的速度一致。
(7)收集第二次濃縮液后，膜包以IOOOmL的20mM Tris (pH=7. 5)緩沖液清洗，共清洗3次，收集濾出液。再將三次清洗的濾出液加至第二次濃縮液混勻，檢測蛋白濃度，添加一定量的20mM Tris (pH=7. 5)緩沖液，使樣品蛋白終濃度=2. Omg/mL。
(8)無菌過濾將復性樣品用O. 22 Mffl濾器進行無菌過濾即得到純化原液。純化原液分裝于無菌無熱原的PEG瓶中，_70°C以下保存。
實施例5處理16L菌液對應的菌體菌體復溶，細胞破碎參數為第一次破碎一級閥壓力750bars，二級閥壓力 200bars ;第二次破碎一級閥壓力900bars, 二級閥壓力100bars。
實施例6處理16L菌液對應的菌體菌體復溶。菌體破碎時，細胞破碎參數為一級閥壓力900bars，二級閥壓力 IOObars,破碎操作兩次。
實施例5和實施例6的包涵體所用的高壓均質機為Niro Soavi公司。
實施例5和實施例6具有相同的離心及清洗操作在菌體破碎液中加入同體積的裂解緩沖液，混勻后用管式高速離心機(型號GQ75，16500g，進料速度400ml/min)收集包涵體沉定，過程溫度小于15°C。離心結束后收集包涵體，添加包涵體清洗緩沖液至菌體復溶時相當的體積，用高速均質(如Ultra Turrax T50)均質處理,后用管式高速離心機(型號 GQ75, 16500g，進料速度200ml/min)收集包涵體沉淀，過程溫度同樣小于15°C。重復一次包涵體清洗和離心操作步驟。收集包涵體,添加少量清洗緩沖液體后用高速均質處理后制成包涵體懸液交純化工序。
包涵體清洗后進行包涵體變性溶解，實施例5和實施例6的步驟相同取相當于 8L收獲菌體來源的包涵體懸液緩慢將包涵體懸液樣品滴加入包涵體溶解緩沖液中(體積約為4L)，攪拌器300rpm、室溫不斷攪拌約2h。然后進行包涵體變性液過濾。
不同破碎壓力下的制備的包涵體變性液取樣，用深層濾器(PALL公司的TOH4，有效面積26cm2)進行過濾。過濾時,速度控制在3. 4ml/min。隨著過濾量的增加,過濾壓力漸增，當過濾壓力顯示達到15psi上限時，停止過濾。根據濾過液體積計算深層濾器單位面積的過濾容量。同時，分別對濾前、濾后液取樣，用SDS-PAGE蛋白電泳結合考馬斯亮藍染色法檢測過濾前后目標條帶的光密度值，計算回收率。結果見表I。
從表1可見實施例5和實施例6之間比較，細胞破碎總壓力都達到IOOObarsdS 一級閥壓力較高的后者制備的包涵體質量較好，相應的變性液濁度較低，提高了一次性濾器的過濾容量,降低了過濾成本。
表1不同破碎壓力下制備的包涵體變性溶解及過濾結果
權利要求
1.一種融合蛋白的純化和復性方法，其特征在于，包括以下幾個步驟蛋白質的純化、 樣品稀釋、膜包準備、濃縮和置換步驟。
2.如權利要求1所述的融合蛋白的純化和復性方法，其特征在于，所述蛋白質的純化步驟包括將包涵體變性液上樣到含Q-Sepharose F. F柱子，用平衡緩沖液A清洗后，用洗脫緩沖液B洗脫目標峰，再將來自Q-S^harose F. F柱子上的洗脫峰上樣到事先用平衡緩沖液C平衡好的含有陶瓷基質羥基磷灰石的柱子，收集含有Mtb72f的穿透峰；其中，所述平衡緩沖液 A 為50mM NaCl, 20mM Bis-Tris, 6M 尿素，pH=7. O ；緩沖液 B 為90 mM NaCl, 20mM Bis-Tris, 6M 尿素，pH=7. O ;平衡緩沖液 C 為250mM NaCl, 20mM Bis-Tris, 6M 尿素，ρΗ=7· O。
3.如權利要求1所述的融合蛋白的純化和復性方法，其特征在于，所述樣品稀釋步驟包括用紫外分光光度計測定穿透峰的濃度，用洗脫緩沖液B稀釋至O. 20-0. 30g/L。
4.如權利要求1所述的融合蛋白的純化和復性方法，其特征在于，所述膜包準備步驟包括用NaOH溶液循環清洗Centramate膜包，再用Na2HPO4清洗2次，再用平衡緩沖液C 清洗至滲出液PH值為7. O ±O. 10。
5.如權利要求1所述的融合蛋白的純化和復性方法，其特征在于，所述濃縮和置換步驟包括1)將稀釋后的穿透峰濃縮至1.1-1. 6g/L,循環流速為6L/min/ M2，每分鐘的滲析流速控制在濃縮后料液體積的1/18，將樣品超濾濃縮至濃度為3. 0-3. 8g/L ；2)將步驟I所得到的樣品用Tris緩沖液進行透析置換，透析過程中，循環速度保持在 6L/min/ M2，滲析速度與步驟I濃縮時一致，加緩沖液的速度與滲析速度相同；3)將步驟2所得到的樣品濃縮至步驟I的濃縮體積的O.38-0. 40倍，循環速度和滲析速度與步驟I相同；4)以步驟3中用Tris緩沖液透析處理，透析過程中，循環速度保持在6L/min/M2，循環速度和滲析速度與步驟I相同，加緩沖液速度與滲析液的速度相同；5)收集步驟4的濃縮液，再將所述膜包用一定量的20mM、pH=7.5的Tris緩沖液清洗， 共清洗3次，收集濾出液，加入濃縮液混合檢測蛋白濃度后，添加20mM、pH=7. 5的Tris緩沖液，使樣品蛋白終濃度為2. Omg/mL。
6.如權利要求1至5任一項所述的融合蛋白的純化和復性方法，其特征在于，還包括無菌過濾步驟將步驟5得到的樣品用O. 22 Mffl濾器進行無菌過濾即得到純化原液，純化原液分裝于無菌無熱原的PEG瓶中，_70°C以下保存。
7.如權利要求3所述的融合蛋白的純化和復性方法，其特征在于，所述NaOH溶液用量為10L/M2膜面積，濃度為O. 3M，Na2HPO4溶液的濃度為400mM，用量為10L/M2膜面積。
8.如權利要求5所述的融合蛋白的純化和復性方法，其特征在于，所述步驟2中Tris 緩沖液的用量為以步驟I濃縮后的體積的2. 5倍體積，且濃度為20mM的Tris緩沖液進行透析置換。
9.如權利要求5所述的融合蛋白的純化和復性方法，其特征在于，所述步驟4中的用量為以步驟3濃縮后的體積9. 5倍體積、pH=7. 5、濃度為20mM的Tris緩沖液透析處理。
全文摘要
本發明提供一種融合蛋白的純化和復性方法，包括以下幾個步驟蛋白質的純化、樣品稀釋、膜包準備、濃縮和置換步驟。本發明的有益效果是本方法可工業化放大、純化后得到的純度是在蛋白得率高的情況下，純度也高，并且還具有穩定的抗原活性。
文檔編號C07K1/34GK102993266SQ20121050269
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月30日 優先權日2012年11月30日
發明者丘力功, 魏榮華, 韋劍, 黃明 申請人:廣州白云山拜迪生物醫藥有限公司