專利名稱：傳染病病原體全人源化抗體的制備方法
技術領域：
本發明涉及抗體的制備技術領域，具體涉及一種傳染病病原體全人源化抗體的制備方法。
背景技術：
單抗藥物發展經歷了鼠源性單抗，嵌合性單抗、人源化單抗和全人源化單抗四個階段。1975年德國學者Kohler和英國學者Milstein將小鼠骨髓瘤細胞和經綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞在體外進行兩種細胞融合，形成雜交瘤(hybridoma)細胞，這種細胞繼承兩種親代細胞的特性，既具有骨髓瘤細胞無限繁殖的特性，又具有合成和分泌抗體的能力。用這種來源于單個融合細胞增殖的細胞群，可制備針對一種抗原決定簇的特異單克隆抗體。經過雜交瘤技術得到的鼠源性抗體，用于人體治療時存在一些問題。首先，由于鼠源性單抗對于人體是異種蛋白，因此，應用于人體后，很容易引發針對異種蛋白的免疫反應，影響單抗的治療效果。其次，鼠單抗通常不能有效地激活人體的生物效應功能，如補體依賴的細胞毒(CDCC)及抗體依賴的細胞毒(ADCC)作用。此外，鼠單抗在人體內的半壽期也比較短。這些都限制了鼠源性單抗的治療作用。人源化的抗體可以解決這些問題，通過用DNA重組技術將鼠單抗的輕、重鏈可變區基因插入含有人抗體恒定區的表達載體中而構建的嵌合抗體，其人源化程度達到70%左右。表面重塑抗體是通過對鼠抗體表面氨基酸殘基進行人源化改造而構建。該方法的原則是僅替換與人抗體表面氨基酸殘基(surface aminoacidresidues, SAR)差別明顯的區域，在維持抗體活性并兼顧減少異源性基礎上選用與人抗體SAR相似的氨基酸替換。重構抗體通過將異源抗體中的抗原結合相關殘基與人抗體重新拼接而構建， 包括互補決定區(⑶R)移植，部分⑶R移植和特定決定區(SDR)轉移。近年來最有希望的是全人抗體，即抗體的輕重鏈都是來源于人的抗體。目前比較成熟的獲得全人抗體技術是抗體庫篩選技術，主要包括噬菌體抗體庫和核糖體展示技術。目前噬菌體抗體庫技術也存在不足之處，如從未經免疫動物的抗體庫獲得的抗體親和力不高、受外源基因轉化率的限制、抗體庫的庫容不足以涵蓋一些動物的抗體多樣性等；而對于核糖體展示技術而言，如何進一步地提高該系統的穩定性，特別是如何防止mRNA的降解和形成穩固的蛋白質-核糖體HRNA三聚體無疑是該技術的關鍵問題，如何提高大分子蛋白質在核糖體上的展示也是未來研究需要關注的問題。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種篩選時間短，成本低，無需免疫的傳染病病原體全人源化抗體的制備方法。為解決上述技術問題，本發明采用了以下技術方案
首先從傳染病患者或疫苗免疫者外周血分離單核細胞，通常采用密度梯度離心純化；當B細胞數量較低時，可采用抗CD19磁珠富集B細胞；重組抗原蛋白在真核或原核細胞中生產純化，純化后的抗原蛋白可直接耦合到熒光素異硫氰酸酯(FITC)，藻紅蛋白(PE)^iJ藻藍蛋白(APC)或生物素；之后在低溫下與B細胞特異性的結合；最后以流式細胞儀分離單個標記的B細胞于96孔板中。或者從傳染病患者或疫苗免疫者外周血分離出單核細胞并純化后不對抗原特異性B細胞進行任何標記，由流式細胞儀直接分離出單個B細胞于96孔板中，而B細胞的抗原特異性采用其它方法鑒定，如收集上清液測定抗體中和活性等。其次，RT-PCR擴增重鏈和輕鏈的可變區基因。例如，cDNA合成在96孔板15ul反應體系中進行，采用150納克的隨機六聚體引物，O. 5微升的IOmM的dNTP混合物，及50 U逆轉錄酶，反轉錄反應在42°C下進行10分鐘，25°C下為10分鐘，50°C 60分鐘，最后94°C5分鐘；IgH，IgA和IgK輕鏈可變區基因采用巢式PCR分別擴增，PCR反應在96孔板50微升體系中，每孔含20 nM的每個引物或引物組合(所用系列引物的序列如表I所示)，300nM dNTP和1. 2 U HotStar Taq DNA聚合酶。HotStar Taq DNA聚合酶錯誤率低，適用于單細胞的低拷貝模板的擴增。巢式PCR擴增45個循環，94°C 30秒，59°C 30秒，72°C下為55秒。然后，進行人源抗體瞬時表達載體的構建。在克隆之前，PCR產物首先采用PCR純化試劑盒進行純化，之后采用相應的限制性內切酶消化。之后克隆入含有多克隆位點的Igy, IgK或IgX輕鏈的恒定區的載體中。連接反應的總體積為10微升，含I U T4 DNA連接酶，7. 5微升純化的PCR產物和25 ng的線性化載體。成功連接后轉化活化的大腸桿菌株。正確克隆的鑒定采用PCR擴增法，根據預期片段大小確定克隆的成功與否。含有正確克隆的細菌在培養液中培養16小時，離心收集細菌采用質粒DNA純化試劑盒純化DNA。最后，重組抗體的瞬時高效表達與純化。可采用磷酸鈣共沉淀法瞬時轉染對數生長期的293T細胞，20微克的表達載體DNA與CaCl2混合至終濃度250mM，孵育室溫下攪拌10分鐘。之后沉淀混合物均勻地分布于培養皿中，12小時后，用IOml無血清DMEM洗滌細胞，然后收集上清液，并用酶聯免疫吸附試驗( ELISA)分析重組抗體的抗原特異性。離心除去細胞碎片，重組抗體采用蛋白G顆粒純化。每25毫升細胞培養上清液中加入25 μ I蛋白G珠，在4°C的條件下旋轉至少14小時。離心后去除上清液10分鐘，裝柱后用兩輪PBS洗滌,用O.1M甘氨酸(pH 3. O)洗脫重組抗體。之后對重組抗體濃度采用ELISA方法測定。本發明具有積極有益的效果1.采用一種獨特的單細胞人源抗體克隆篩選技術，篩選生產國內流行的主要傳染病的完全人源化抗體，這些人源抗體主要有兩個用途一是作為傳染病診斷試劑的原料；二是作為傳染病治療性抗體用于相應傳染病的治療。2.本發明篩選生產的傳染病抗體具有完全人源化的特點，基本沒有排異反應，具有不可替代的優勢。3.本發明篩選抗體時間短(無需免疫)，成本低，抗體完全人源化，可快速滿足對突發傳染病診斷和治療的需要。
具體實施例方式以下結合具體實施例進一步闡述本發明。下述實施例中的各檢測測定方法或具體實施步驟，如無特別說明，均為常規方法或步驟。實施例1丙型肝炎病毒El蛋白人源單克隆抗體的克隆
丙型肝炎病毒El蛋白是病毒的主要保護性抗原，針對El蛋白的中和性單克隆抗體可用于丙型肝炎和肝癌患者的治療，篩選克隆丙肝病毒El中和性單克隆抗體具有重大的臨床應用價值。首先挑選了 15個丙型肝炎康復患者用于篩選中和單克隆抗體，經過對這15個丙型肝炎患者血清中和抗體的篩選，其中的一例患者的血清試驗證明可以中和95%以上的中國丙型肝炎Ib和2a的假病毒株，最終確定從這例患者中篩選丙型肝炎病毒高度保守的中和抗體。首先從這例患者的外周血采用密度梯度離心分離純化單核細胞。重組El抗原蛋白耦合到熒光素異硫氰酸酯(FITC)，之后在低溫下與B細胞特異性的結合，之后流式細胞儀分離單個標記的B細胞于96孔板中。RT-PCR擴增重鏈和輕鏈的可變區基因，PCR產物首先采用PCR純化試劑盒進行純化，之后酶切消化克隆入含有多克隆位點的IgY，IgK輕鏈的恒定區的載體中。轉化活化的大腸桿菌株，含有正確克隆的細菌在培養液中培養16小時，離心收集細菌采用質粒DNA純化試劑盒純化DNA。DNA磷酸鈣共沉淀法瞬時轉染對數生長期的293T細胞，離心除去細胞碎片，重組抗體采用蛋白G柱純化。經病毒中和活性實驗測定，所篩選的單克隆抗體中和譜與同一丙肝病人血清的一致。證明采用這種方法成功的篩選克隆了抗原特異性的丙型肝炎El抗體。 表1:系列克隆用PCR引物_
權利要求
1.一種傳染病病原體全人源化抗體的制備方法，包括以下步驟 (1)傳染病病原體抗原的制備以常規方法在真核或原核細胞中生產并純化重組傳染病病原體抗原蛋白； (2)抗體的標記將上步純化的重組傳染病病原體抗原蛋白以熒光或生物素標記； (3)B細胞的獲取、富集與純化從傳染病患者或疫苗免疫者外周血分離單核的B細胞，采用密度梯度離心純化； (4)標記抗原與特異性B細胞的結合將步驟(2)中標記的重組傳染病病原體抗原蛋白與步驟(3)中的B細胞進行特異性結合； (5)抗原特異性B細胞的獲取根據標記，以流式細胞儀篩選、分離出上步中抗原特異性的單個B細胞，即單個標記的B細胞； (6)擴增抗體可變區基因采用核苷酸序列如SEQID NO:1 SEQ ID N0:58所示系列特異性的混合引物，應用單細胞巢式RT-PCR從所述單個標記的B細胞中克隆輕鏈和重鏈的可變區基因； (7)構建表達載體將上步所克隆的輕鏈和重鏈可變區基因插入包含人輕鏈和重鏈恒定區基因的載體，構建人源抗體真核高效表達載體，成功連接后轉化活化的大腸桿菌株，培養含有正確克隆的細菌，離心收集細菌并采用質粒DNA純化試劑盒純化表達載體DNA ； (8)重組抗體表達與純化以上步純化后的表達載體DNA轉染真核細胞，培養使其獲得表達后經分離純化得重組抗體。
2.一種傳染病病原體全人源化抗體的制備方法，包括以下步驟 (1)外周血B細胞的富集與純化從傳染病患者或疫苗免疫者外周血分離單核細胞，采用密度梯度離心純化； (2)B細胞分離由流式細胞儀直接分離單個B細胞； (3)B細胞特異性鑒定對流式細胞儀單個B細胞的上清液首先進行功能性的鑒定，篩選出具備特異性的單個B細胞； (4)擴增抗體可變區基因采用一系列特異性的混合引物，應用單細胞巢式RT-PCR從上述具備特異性的單個B細胞中克隆輕鏈和重鏈的可變區基因； (5)構建表達載體將上步所克隆的輕鏈和重鏈可變區基因插入包含人輕鏈和重鏈恒定區基因的載體，構建人源抗體真核高效表達載體，成功連接后轉化活化的大腸桿菌株，培養含有正確克隆的細菌，離心收集細菌并采用質粒DNA純化試劑盒純化表達載體DNA ； (6)重組抗體表達與純化以上步純化后的表達載體DNA轉染真核細胞，培養使其獲得表達后經分離純化得重組抗體。
3.根據權利要求1或2所述的傳染病病原體全人源化抗體的制備方法，其特征在于，在權利要求1所述步驟(3)或權利要求2所述步驟(I)中，當B細胞數量較低時，采用抗CD19磁珠富集B細胞。
4.根據權利要求1或2所述的傳染病病原體全人源化抗體的制備方法，其特征在于，權利要求I所述步驟(6)或權利要求2所述步驟(4)的具體操作過程為cDNA合成在96孔板15ul反應體系中進行，采用150納克的隨機六聚體引物、O. 5微升的IOmM的dNTP混合物及50 U逆轉錄酶，反轉錄反應在42°C下進行10分鐘，25°C下為10分鐘，50°C 60分鐘，最后940C 5分鐘；IgH，Ig λ和Ig K輕鏈可變區基因采用巢式PCR分別擴增，PCR反應在96孔板50微升體系中，每孔含20nM的每個引物或引物組合，300 nM (1見？和1.2 U HotStar TaqDNA聚合酶，巢式PCR擴增45個循環，94°C 30秒，59°C 30秒，72°C下為55秒。
5.根據權利要求1或2所述的傳染病病原體全人源化抗體的制備方法，其特征在于，權利要求I所述步驟(7)或權利要求2所述步驟(5)的具體操作過程為在克隆之前，對上步所得PCR產物首先采用PCR純化試劑盒進行純化，之后采用相應的限制性內切酶消化，然后克隆入含有多克隆位點的IgY，IgK或IgX輕鏈的恒定區的載體中，連接反應的總體積為10微升，含I U T4 DNA連接酶，7. 5微升純化的PCR產物和25 ng的線性化載體，成功連接后轉化活化的大腸桿菌株，含有正確克隆的細菌在培養液中培養16小時，離心收集細菌采用質粒DNA純化試劑盒純化DNA。
6.根據權利要求1或2所述的傳染病病原體全人源化抗體的制備方法，其特征在于，在權利要求1所述步驟(8)或權利要求2所述步驟(6)中，采用磷酸鈣共沉淀法瞬時轉染對數生長期293T細胞，取20微克的上步所得表達載體DNA與CaCl2混合至終濃度250mM，孵育室溫下攪拌10分鐘，之后將沉淀混合物均勻地分布于培養皿中，12小時后，用IOml無血清DMEM洗滌細胞，然后收集上清液,并用酶聯免疫吸附試驗分析重組抗體的抗原特異性,離心除去細胞碎片，重組抗體采用蛋白G顆粒純化，離心后去除上清液10分鐘，裝柱后用兩輪PBS洗滌，用O.1M甘氨酸洗脫重組抗體。
7.根據權利要求1或2所述的傳染病病原體全人源化抗體的制備方法，其特征在于，所述傳染病病原體抗原為甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、流行性感冒、手足口病、狂犬病、流行性出血熱、結核病、瘧疾、腹瀉輪狀病毒病原體抗原中的任意一種。
全文摘要
本發明涉及一種傳染病病原體全人源化抗體的制備方法。該方法主要包括以下步驟傳染病病原體抗原的制備；傳染病病原體抗體的熒光標記；傳染病患者外周血B細胞的富集與純化；標記的病原體抗原與抗原特異性B細胞的結合；流式細胞儀篩選抗原特異性的單個B細胞；單細胞RT-PCR擴增抗體重鏈和輕鏈可變區基因；與重鏈和輕鏈恒定區連接構建人源抗體的真核表達載體；重組抗體在真核細胞中的高效表達與純化。本發明所制備的人源單克隆抗體既可以用于傳染病的診斷，也可用于傳染病的治療。
文檔編號C07K16/10GK103045607SQ201210489839
公開日2013年4月17日 申請日期2012年11月27日 優先權日2012年11月27日
發明者李福勝 申請人:李福勝