專利名稱：利用大腸桿菌制備fgf1全長蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及重組人酸性成纖維細胞生長因子(FGF1)，具體是利用大腸桿菌制備FGFl全長蛋白的方法。
背景技術：
人酸性成纖維生長因子(FGFl)是已知FGF家族中的成員，為中胚層和神經外胚層來源的有絲分裂原，具有促進血管生成、神經元再生和存活、骨或軟骨組織修復及成肌細胞分化等多種生物學功能。一般來說，FGFl的化學特征是可與肝素緊密結合，其等電點呈酸性。已知肝素可通過幾種方式調節FGF分子的功能，例如肝素或肝素樣分子可直接作用于FGF,激活或增強FGFl的活性。另外，發現可溶性肝素的增效作用似乎對FGFl有選擇性，同時，肝素樣物質也是FGF特別是FGFl的優選穩定劑。FGF I的獨特的血管成活性和細胞增殖活性使之特別適用于促進組織特別是深部傷口的愈合。FGFl也在待治療的損傷部位，特別是在大部分處于酸性環境的損傷部位，FGFl可發揮其溫和而持久的生物學活性，從而有利于其在臨床上的應用。目前存在多種以重組DNA技術生產FGFl的方法，如一些已構建了很多改良的重組表達系統，還有一些具有提高生物學活性和穩定性的FGF I類似物或突變體，但整合形式的全長度FGFl的活性要比去除了 N末端部分氨基的其他形式的FGFl的活性高，且這些現有技術的FGFl蛋白有些含有融合標簽，可溶性不高，產品純度也較低。
發明內容
本發明的主要目的在于提供一種不含有融合標簽，可溶性較高，產品純度較高的利用大腸桿菌制備FGFl全長蛋白的方法。本發明解決上述技術問題采用的技術方案為利用大腸桿菌制備FGFl全長蛋白的方法，包括(I)利用PCR方法，從人胎腦的Quick Clone cDNA中擴增人FGFl的全編碼序列，擴增后得到目的片段大小為468bp，用瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產物；(2)將上述PCR產物用內切酶酶切，得到N端有BamH I、C端有Hind III粘性末端的酶切片段，回收后將該酶切片段連接至BamH I和Hind III消化好的pMAL_p5X表達載體；(3)將上述連產物轉化至大腸桿菌DH5a，經培養抽提、測序、分析后，得到測序正確的人FGFl全長cDNA序列的重組質粒；(4)將測序正確的重組質粒轉化至大腸桿菌BL21，進行培養、誘導表達后離心、洗滌、裂解并收集細菌沉淀；(5)重懸上述細菌沉淀，加入MgCl2溶液，離心得到上清，在上清中加入TriS-Cl后用過濾器過濾、透析，得到含有MBP融合標簽的FGFl全長蛋白；(6)將透析后的液體上到直鏈淀粉瓊脂糖柱上，用洗滌緩沖液沖洗后用洗脫緩沖液洗脫結合的融合蛋白，收集洗脫的蛋白；(7)將上述收集到的蛋白進行TEV酶切，孵育后將酶切蛋白液又一次上到直鏈淀粉瓊脂糖柱上，收集上樣后流出的液體；(8)將上述上樣后流出的液體再次上樣于Ni-NTA層析柱，過濾再次上樣后流出的液體，得到純化后的FGFl全長蛋白。作為優選，步驟(3)的連接產物轉化至大腸桿菌DH5a，平板倒置培養16h后，挑取單克隆培養；質粒抽提后，用BamH I進行克隆鑒定,酶切鑒定正確的克隆進行sanger法測序，得到測序正確的重組質粒。作為優選，步驟(4)是在37°C培養4h后進行誘導表達。作為優選，所述誘導表達是在0D500為0. 6、IPTG為ImM的條件下進行。作為優選，所述誘導表達后進行離心，將細菌沉淀重懸于細胞洗滌緩沖液中，在4°C、5500rpm條件下離心；再將沉淀重懸于細胞裂解液中，加入PMSF室溫攪動，于4°C以 12000rpm離心后，收集細菌沉淀。作為優選，步驟(5)在重懸收集的細菌沉淀時，加入4°C預冷的MgCl2溶液，4°C攪動，12000rpm離心，在離心得到的上清中加入Tri s-Cl (pH7. I)至pH達到7. 1，上清用過濾器過濾后，在4°C的條件下透析，得到含有MBP融合標簽的FGFl全長蛋白。從以上技術方案可知，本發明將人酸性成纖維細胞生長因子全長基因克隆至pMAL-p5X表達載體上，重組質粒在大腸桿菌中高效表達含有MBP融合標簽的FGFl全長蛋白，該蛋白為可溶性表達，利用MBP親和層析柱，將帶有MBP融合標簽的蛋白純化出來，再利用TEV酶的結合位點，用TEV消化純化后的融合蛋白，得到完整的不含融合標簽的FGFl蛋白，不僅可溶性較高，而且產品純度較高。
圖I中M為蛋白質分子量標準；1為經過MBP標簽純化,并去除標簽后的FGFl蛋白。
具體實施例方式下面對本發明作進一步地詳細說明本方法首先根據NCBI的genbank數據庫中NM_000800. 4設計兩條FGFl的引物，如下F-gccgtctcggatccgaaaacctgtattttcagggcatggctgaaggggaaatcaccR-gccgtctcaagcttaatcagaagagactggcagggggag利用PCR方法，從人胎腦的Quick Clone cDNA中擴增人FGFl的全編碼序列，擴增條件為95°C 5min, (94°C lmin,52°C 30sec,72°C 30sec) 35 個循環，72°C 7min。擴增后得到目的片段大小為468bp，用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產物。接著將上述PCR產物用內切酶酶切，得到N端有BamH I、C端有Hind III粘性末端的酶切片段，回收后將該酶切片段連接至BamH I和Hind III消化好的pMAL_p5X表達載體。然后將上述連接產物轉化至大腸桿菌DH5a，平板倒置培養16h后，挑取單克隆培養；質粒抽提后，用BamH I進行克隆鑒定,酶切鑒定正確的克隆進行sanger法測序,對比測序序列，得到測序正確的人FGFl全長cDNA序列的重組質粒，其基因序列如下I ATGGCTGAAGGGGAAATCACCACCTTCACAGCCCTGACCGAGAAGTTTAATCTGCCTCCAI -M-A—E—G—E—I—T—T—F—T—A—L—T—E—K—F—N—L—P—P-6I GGGAATTACAAGAAGCCCAAACTCCTCTACTGTAGCAACGGGGGCCACTTCCTGAGGATC
21 -G-N—Y—K—K—P—K—L—L—Y—C—S—N—G—G—H—F—L—R—1-I2I CTTCCGGATGGCACAGTGGATGGGACAAGGGACAGGAGCGACCAGCACATTCAGCTGCAG41 -L—P—D—G—T—V—D—G—T—R—D—R—S—D—Q—H—I—Q-L-Q-181 CTCAGTGCGGAAAGCGTGGGGGAGGTGTATATAAAGAGTACCGAGACTGGCCAGTACTTG
61 -L-S—A—E—S—V—G—E—V—Y—I—K—S—T—E—T—G—Q—Y—L-24I GCCATGGACACCGACGGGCTTTTATACGGCTCACAGACACCAAATGAGGAATGTTTGTTC81 -A—M—D—T—D—G—L—L—Y—G—S—Q—T—P—N—E—E—C—L—F-30I CTGGAAAGGCTGGAGGAGAACCATTACAACACCTATATATCCAAGAAGCATGCAGAGAAG101 -L-E—R—L—E—E—N—H—Y—N—T—Y—I—S—K—K—H—A-E-K-36I AATTGGTTTGTTGGCCTCAAGAAGAATGGGAGCTGCAAACGCGGTCCTCGGACTCACTAT
121 -N—W—F—V—G—L—K—K—N—G—S—C—K—R—G—P—R—T-H-Y-421 GGCCAGAAAGCAATCTTGTTTCTCCCCCTGCCAGTCTCTTCTGATTAA141 -G--Q--K--A--I--L--F--L--P--L--P--V--S--S--D--*-接著將測序正確的重組質粒轉化至大腸桿菌BL21，37°C培養4h后，在0D500為0.6，IPTG為ImM條件下誘導表達細菌。在實施過程中，為了進行分析，可將溫度降至30°C培養6h，取細菌離心，加入PBS (pH7. 2)超聲破碎，取其上清進行12%SDS-PAGE蛋白表達分析，發現在64kD處有目的蛋白條帶。實施例按照上述步驟將測序正確的重組質粒轉化至大腸桿菌BL21，在37°C條件下培養該細菌2L，4h后在0D500為0. 6，IPTG為ImM條件下誘導表達該細菌，離心后將細菌沉淀重懸于50mL 4°C預冷的細胞洗滌緩沖液中，4°C、5500rpm離心15min，再將沉淀重懸于25mL 4°C預冷的細胞裂解液中，加入PMSF至終濃度lmmol/L，室溫攪動15min，于4°C以12000rpm離心IOmin后，收集細菌沉淀；再次重懸收集的細菌沉淀，加入4°C預冷的
0.lmmol/L的MgCl2溶液200mL,4°C攪動IOmin, 12000rpm離心IOmin后，在離心得到的上清中加入10mmol/L的Tris-Cl (pH7. I)至pH達到7. I,上清用過濾器過濾后，在IOmmol/LTris-Cl (pH7. I)、4°C的條件下透析，得到含有MBP融合標簽的FGFl全長蛋白；隨后，將透析后的液體上到直鏈淀粉瓊脂糖柱上，用IOOmL柱洗滌緩沖液沖洗，然后用洗脫緩沖液洗脫結合的融合蛋白，逐滴收集洗脫的蛋白。在實施過程中，可通過Bradford溶液檢測洗脫蛋白的情況，并用SDS-PAGE凝膠電泳對收集的蛋白進行分析，以確認含有融合蛋白的組分。接著，將上述收集到的蛋白按每mg加入10 ii g TEV酶的比例進行TEV酶切，4°C孵育16h后，將酶切蛋白液又一次上到直鏈淀粉瓊脂糖柱上，收集上樣后流出的液體，其中含有FGFl蛋白和TEV蛋白酶；然后，將上樣后流出的液體再次上樣于Ni-NTA層析柱，由于TEV酶帶有HIS純化標簽，過柱后將與Ni-NTA柱結合，過濾再次上樣后流出的液體，得到純化后的FGFl全長蛋白。在實施時，采用SDS-PAGE分析，蛋白條帶為17. 5kD，為不含標簽序列的全長人FGFl蛋白。
上述實施方式僅供說明本發明之用，而并非是對本發明的限制，有關技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明精神和范圍的情況下，還可以作出各種變化和變型，因此所有等同的技術方案也應屬于本發明的范疇。權利要求
1.利用大腸桿菌制備FGFl全長蛋白的方法，包括(1)利用PCR方法，從人胎腦的QuickClone cDNA中擴增人FGFl的全編碼序列，擴增后得到目的片段大小為468bp，用瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產物；(2)將上述PCR產物用內切酶酶切，得到N端有BamHI、C端有Hind III粘性末端的酶切片段，回收后將該酶切片段連接至BamH I和Hind III消化好的pMAL_p5X表達載體；(3)將上述連接產物轉化至大腸桿菌DH5a，經培養抽提、測序、分析后，得到測序正確的人FGFl全長cDNA序列的重組質粒；(4)將測序正確的重組質粒轉化至大腸桿菌BL21，進行培養、誘導表達后離心、洗滌、 裂解并收集細菌沉淀；(5)重懸上述細菌沉淀，加入MgCl2溶液，離心得到上清，在上清中加入Tris-Cl后用過濾器過濾、透析，得到含有MBP融合標簽的FGFl全長蛋白；(6)將透析后的液體上到直鏈淀粉瓊脂糖柱上，用洗滌緩沖液沖洗后用洗脫緩沖液洗脫結合的融合蛋白，收集洗脫的蛋白；(7)將上述收集到的蛋白進行TEV酶切，孵育后將酶切蛋白液又一次上到直鏈淀粉瓊脂糖柱上，收集上樣后流出的液體； (8)將上述上樣后流出的液體再次上樣于Ni-NTA層析柱，過濾再次上樣后流出的液體，得到純化后的FGFl全長蛋白。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(3)的連接產物轉化至大腸桿菌 DH5a，平板倒置培養16h后，挑取單克隆培養；質粒抽提后，用BamH I進行克隆鑒定，酶切鑒定正確的克隆進行sanger法測序，得到測序正確的重組質粒。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(4)是在37°C培養4h后進行誘導表達。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述誘導表達是在0D500為O.6、IPTG為 ImM的條件下進行。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述誘導表達后進行離心，將細菌沉淀重懸于細胞洗滌緩沖液中，在4°C、5500rpm條件下離心；再將沉淀重懸于細胞裂解液中，加入 PMSF進行室溫攪動，于4°C以12000rpm離心后，收集細菌沉淀。
6.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(5)在重懸收集的細菌沉淀時，加入4°C預冷的MgCl2溶液，并在4°C條件下攪動，然后以12000rpm離心，在離心得到的上清中加入Tris-Cl (pH7. I)至pH達到7. 1，上清用過濾器過濾后，在4°C的條件下透析，得到含有MBP融合標簽的FGFl全長蛋白。
全文摘要
本發明涉及重組人酸性成纖維細胞生長因子(FGF1)，具體是利用大腸桿菌制備FGF1全長蛋白的方法，其包括利用PCR方法擴增后得到人FGF1全長基因PCR產物；將PCR產物用內切酶酶切。本發明將人酸性成纖維細胞生長因子全長基因克隆至pMAL-p5X表達載體上，重組質粒在大腸桿菌中高效表達含有MBP融合標簽的FGF1全長蛋白，該蛋白為可溶性表達，利用MBP親和層析柱，將帶有MBP融合標簽的蛋白純化出來，再利用TEV酶的結合位點，用TEV消化純化后的融合蛋白，得到完整的不含融合標簽的FGF1蛋白，不僅可溶性較高，而且產品純度較高。
文檔編號C07K14/50GK102978212SQ201210478808
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月22日 優先權日2012年11月22日
發明者潘藝, 熊丹, 劉金蕾 申請人:趙謙